JP3421741B2 - 人工骨髄、血球細胞の増殖方法 - Google Patents
人工骨髄、血球細胞の増殖方法Info
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- JP3421741B2 JP3421741B2 JP2000146102A JP2000146102A JP3421741B2 JP 3421741 B2 JP3421741 B2 JP 3421741B2 JP 2000146102 A JP2000146102 A JP 2000146102A JP 2000146102 A JP2000146102 A JP 2000146102A JP 3421741 B2 JP3421741 B2 JP 3421741B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、担体、及び当該担
体に担持して培養した造血を支持する機能を有する細胞
を備える、新規な人工骨髄に関する。更に本発明は、前
記の人工骨髄を、動物に移植をすることにより又は動物
の体外においてその人工骨髄中に血液を循環させること
によって、人工骨髄中において造血幹細胞を増殖させ、
更に造血幹細胞を血球細胞へ分化させる過程により構成
される、血球細胞の増殖方法に関する。
体に担持して培養した造血を支持する機能を有する細胞
を備える、新規な人工骨髄に関する。更に本発明は、前
記の人工骨髄を、動物に移植をすることにより又は動物
の体外においてその人工骨髄中に血液を循環させること
によって、人工骨髄中において造血幹細胞を増殖させ、
更に造血幹細胞を血球細胞へ分化させる過程により構成
される、血球細胞の増殖方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液には多種の細胞が存在し、酸素の輸
送から抗体の産生まで、多様な機能を営んでいる。血液
細胞の寿命には限りがあるので、常に再生産されている
必要がある。この様に血液細胞の機能は多様であるが、
全ての血液細胞は正常時には骨髄において産生され、骨
髄中に存在する共通の造血幹細胞から生み出されてい
る。造血幹細胞は多機能性であり、そこからいろいろな
最終分化をした血液細胞が作り出される。
送から抗体の産生まで、多様な機能を営んでいる。血液
細胞の寿命には限りがあるので、常に再生産されている
必要がある。この様に血液細胞の機能は多様であるが、
全ての血液細胞は正常時には骨髄において産生され、骨
髄中に存在する共通の造血幹細胞から生み出されてい
る。造血幹細胞は多機能性であり、そこからいろいろな
最終分化をした血液細胞が作り出される。
【０００３】よって、再生不良性貧血、白血病やリンパ
組織の疾患のために造血機能が障害されている場合には
造血幹細胞を移植することにより治療することが可能と
なる。その際に、骨髄や臍帯血に含まれている造血幹細
胞移植、およびこれらの細胞と骨髄支持細胞の同時移植
が近年行われ始めている。骨髄支持細胞の機能について
は、後に詳しく述べる。
組織の疾患のために造血機能が障害されている場合には
造血幹細胞を移植することにより治療することが可能と
なる。その際に、骨髄や臍帯血に含まれている造血幹細
胞移植、およびこれらの細胞と骨髄支持細胞の同時移植
が近年行われ始めている。骨髄支持細胞の機能について
は、後に詳しく述べる。
【０００４】造血幹細胞移植等の従来の方法において
は、通常は患者の血管内に直接細胞が移植されている。
しかし、造血機能障害などの治療の際には、患者自身の
障害された造血機能を抑制するために化学療法や放射線
治療が用いられ、これらの処置が患者自身の支持細胞層
に障害を与えるために、支持細胞層は再生が困難であ
り、造血機能の再生も不十分であった。加えて、移植し
た造血系細胞が他の臓器に捕捉されるために骨髄に生着
する細胞が少なく、更に骨髄細胞と一緒に移植できる支
持細胞の量に限りがあるため、患者の造血機能を代行す
るには不十分であった。
は、通常は患者の血管内に直接細胞が移植されている。
しかし、造血機能障害などの治療の際には、患者自身の
障害された造血機能を抑制するために化学療法や放射線
治療が用いられ、これらの処置が患者自身の支持細胞層
に障害を与えるために、支持細胞層は再生が困難であ
り、造血機能の再生も不十分であった。加えて、移植し
た造血系細胞が他の臓器に捕捉されるために骨髄に生着
する細胞が少なく、更に骨髄細胞と一緒に移植できる支
持細胞の量に限りがあるため、患者の造血機能を代行す
るには不十分であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】よって本発明の課題
は、骨髄支持細胞層の機能が低下した患者においても機
能し、造血機能を代行させることができる、新規の人工
骨髄を提供することである。
は、骨髄支持細胞層の機能が低下した患者においても機
能し、造血機能を代行させることができる、新規の人工
骨髄を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】骨髄中には、多機能性の
幹細胞、分化途中の血液前駆体細胞、および骨髄支持細
胞が存在している。骨髄支持細胞とは、結合組織細胞、
コラーゲン繊維や他の細胞外マトリックス成分ででき
た、精巧な編み目状の支持組織を構成している細胞であ
る。即ち、支持細胞とは造血細胞を支持している構造体
の総称であり、血液系の実質細胞以外を示すものであ
る。その様な支持細胞層を構成している細胞としては、
内皮細胞、繊維芽細胞、脂肪細胞、骨芽細胞があり、そ
の他にコラーゲン、フィブロネクチンなどが含まれる。
幹細胞、分化途中の血液前駆体細胞、および骨髄支持細
胞が存在している。骨髄支持細胞とは、結合組織細胞、
コラーゲン繊維や他の細胞外マトリックス成分ででき
た、精巧な編み目状の支持組織を構成している細胞であ
る。即ち、支持細胞とは造血細胞を支持している構造体
の総称であり、血液系の実質細胞以外を示すものであ
る。その様な支持細胞層を構成している細胞としては、
内皮細胞、繊維芽細胞、脂肪細胞、骨芽細胞があり、そ
の他にコラーゲン、フィブロネクチンなどが含まれる。
【０００７】骨髄支持細胞はそれ自身は造血機能を有さ
ないが、造血細胞、とりわけ造血幹細胞の機能を補助す
る役割を有しており、造血機能を発揮させるには骨髄支
持細胞が存在することが必須である。移植した造血幹細
胞を体内で増幅することを目的として、体内での造血幹
細胞の増殖に及ぼす、骨髄支持細胞の影響に関する研究
も増えつつある。
ないが、造血細胞、とりわけ造血幹細胞の機能を補助す
る役割を有しており、造血機能を発揮させるには骨髄支
持細胞が存在することが必須である。移植した造血幹細
胞を体内で増幅することを目的として、体内での造血幹
細胞の増殖に及ぼす、骨髄支持細胞の影響に関する研究
も増えつつある。
【０００８】本発明者らは、造血に及ぼす骨髄支持細胞
層の機能に注目し、骨髄支持細胞を３次元培養担体に固
定化させた状態で生体内に移植することを試みた。即
ち、従来のように造血幹細胞や骨髄支持細胞を直接血管
内に移植するのではなく、担体に骨髄支持細胞層を形成
した「担体−細胞複合体」を移植することで十分な機能
を有する骨髄支持細胞を供給し、それによってより良好
な微小環境を提供することで髄外造血を行い、造血機能
障害などの治療に応用するというものである。その様に
作製した「担体−細胞複合体」を生体内に移植したとこ
ろ、造血機能を有する血球細胞が付着して増殖している
ことが確認された。即ち、３次元培養用担体に固定化し
た骨髄支持細胞を移植することで、移植複合体内で造血
機能が再生されていると考えられた。
層の機能に注目し、骨髄支持細胞を３次元培養担体に固
定化させた状態で生体内に移植することを試みた。即
ち、従来のように造血幹細胞や骨髄支持細胞を直接血管
内に移植するのではなく、担体に骨髄支持細胞層を形成
した「担体−細胞複合体」を移植することで十分な機能
を有する骨髄支持細胞を供給し、それによってより良好
な微小環境を提供することで髄外造血を行い、造血機能
障害などの治療に応用するというものである。その様に
作製した「担体−細胞複合体」を生体内に移植したとこ
ろ、造血機能を有する血球細胞が付着して増殖している
ことが確認された。即ち、３次元培養用担体に固定化し
た骨髄支持細胞を移植することで、移植複合体内で造血
機能が再生されていると考えられた。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は、担体に動物の骨髄支持
細胞を付着させた複合体を培養することにより作製され
る、人工骨髄である。上述した様に、骨髄中に存在する
細胞として、、多機能性の幹細胞、分化途中の血液前駆
体細胞、および骨髄支持細胞が挙げられる。その様に、
骨髄細胞中には支持細胞が含まれているために、骨髄細
胞を採取して前記の担体上で骨髄細胞を培養することに
より、担体に骨髄支持細胞を付着させることができる。
そして、それを培養することにより、担体に骨髄支持細
胞層を形成した、本発明の人工骨髄を調製することがで
きる。本発明の人工骨髄は、結合組織である骨髄支持細
胞層が形成されているために、血液幹細胞を含む血球細
胞を付着させることができる。骨髄支持細胞は培養を開
始した後に比較的早期に担体に付着し、一方培養期間が
長過ぎても骨髄支持細胞の生育状態が劣化してしまう。
そのために、本発明の人工骨髄において支持細胞層を形
成するために、骨髄支持細胞を付着させた複合体を培養
する期間は１日から２カ月であり、より好ましくは複合
体の培養期間は２週間から４週間である。
細胞を付着させた複合体を培養することにより作製され
る、人工骨髄である。上述した様に、骨髄中に存在する
細胞として、、多機能性の幹細胞、分化途中の血液前駆
体細胞、および骨髄支持細胞が挙げられる。その様に、
骨髄細胞中には支持細胞が含まれているために、骨髄細
胞を採取して前記の担体上で骨髄細胞を培養することに
より、担体に骨髄支持細胞を付着させることができる。
そして、それを培養することにより、担体に骨髄支持細
胞層を形成した、本発明の人工骨髄を調製することがで
きる。本発明の人工骨髄は、結合組織である骨髄支持細
胞層が形成されているために、血液幹細胞を含む血球細
胞を付着させることができる。骨髄支持細胞は培養を開
始した後に比較的早期に担体に付着し、一方培養期間が
長過ぎても骨髄支持細胞の生育状態が劣化してしまう。
そのために、本発明の人工骨髄において支持細胞層を形
成するために、骨髄支持細胞を付着させた複合体を培養
する期間は１日から２カ月であり、より好ましくは複合
体の培養期間は２週間から４週間である。
【００１０】そして、本発明の人工骨髄を動物体内に移
植するか、又は血液を体外循環させることにより、前記
支持細胞−担体複合体に造血幹細胞を付着させ、増殖さ
せることにより造血機能を与えることができる。造血幹
細胞は未分化細胞であるために本発明の人工骨髄中で増
殖させることができ、増殖した幹細胞は種々の成熟血球
細胞へ分化して血球細胞としての機能を果たす。その様
に、骨髄支持細胞を付着させた当該複合体は、血球細胞
を増殖させるための温床とすることが可能であるため
に、造血機能を有する人工骨髄として機能させることが
できる。本発明の人工骨髄を動物に移植を行う場合に、
移植の場所は特に限定されないが、好ましくは皮下、腹
腔内あるいは血球細胞の産生に関与する脾臓である。ま
た、移植後３週間ないし６週間程度で、上記の造血機能
が認められる様になる。
植するか、又は血液を体外循環させることにより、前記
支持細胞−担体複合体に造血幹細胞を付着させ、増殖さ
せることにより造血機能を与えることができる。造血幹
細胞は未分化細胞であるために本発明の人工骨髄中で増
殖させることができ、増殖した幹細胞は種々の成熟血球
細胞へ分化して血球細胞としての機能を果たす。その様
に、骨髄支持細胞を付着させた当該複合体は、血球細胞
を増殖させるための温床とすることが可能であるため
に、造血機能を有する人工骨髄として機能させることが
できる。本発明の人工骨髄を動物に移植を行う場合に、
移植の場所は特に限定されないが、好ましくは皮下、腹
腔内あるいは血球細胞の産生に関与する脾臓である。ま
た、移植後３週間ないし６週間程度で、上記の造血機能
が認められる様になる。
【００１１】本発明の人工骨髄に用いる担体は、骨髄支
持細胞が前記担体中に保持されて、生体適合性を有し、
外部に流出せず、細胞の付着および生育がスムーズに行
われる限り、特に限定されるものではない。造血を支持
する機能を有する細胞としては、骨髄から得た骨髄支持
細胞を用いることが一般的であるが、その他臍帯血、胎
児肝臓、OP9 等の樹立された株化細胞などの間葉系の細
胞を用いることができ、造血機能を支持する役割を有し
ていれば、特にその由来は限定されない。また、前記担
体は、水及び培地中で変質せず、高圧滅菌に耐え得る様
な性質を有し、さらに弱酸やアルカリ及び多くの有機溶
媒に対して耐薬品性を示し、化学的に安定なものが好ま
しい。しかし、骨髄支持細胞を多く付着させるために、
単位面積当たりの表面積が広い、微孔性の立体網状多孔
質構造を有する粒子状の担体が好ましい。その様な好適
な担体の例として、ポリビニルフォルマール樹脂、高分
子材料を発泡又は多孔質化させたもの、ステンレスステ
ィール製の焼結金属担体、多孔質のガラスやセラミッ
ク、さらに、キトサン、セルロース、デキストランなど
の天然由来の高分子物質で多孔質構造を有するものなど
が挙げられる。
持細胞が前記担体中に保持されて、生体適合性を有し、
外部に流出せず、細胞の付着および生育がスムーズに行
われる限り、特に限定されるものではない。造血を支持
する機能を有する細胞としては、骨髄から得た骨髄支持
細胞を用いることが一般的であるが、その他臍帯血、胎
児肝臓、OP9 等の樹立された株化細胞などの間葉系の細
胞を用いることができ、造血機能を支持する役割を有し
ていれば、特にその由来は限定されない。また、前記担
体は、水及び培地中で変質せず、高圧滅菌に耐え得る様
な性質を有し、さらに弱酸やアルカリ及び多くの有機溶
媒に対して耐薬品性を示し、化学的に安定なものが好ま
しい。しかし、骨髄支持細胞を多く付着させるために、
単位面積当たりの表面積が広い、微孔性の立体網状多孔
質構造を有する粒子状の担体が好ましい。その様な好適
な担体の例として、ポリビニルフォルマール樹脂、高分
子材料を発泡又は多孔質化させたもの、ステンレスステ
ィール製の焼結金属担体、多孔質のガラスやセラミッ
ク、さらに、キトサン、セルロース、デキストランなど
の天然由来の高分子物質で多孔質構造を有するものなど
が挙げられる。
【００１２】
【実施例】（人工骨髄の作製）多孔質のポリビニルフォ
ルマール(PVF) 樹脂を高圧蒸気滅菌した後、phosphate
buffered saline (PBS) で２回洗浄した。ここで用いた
PVF 樹脂は、平均孔径130μm 、10x10x2mm であり、0.0
6％のＩ型コラーゲンで被覆されている。６週齢から８
週齢の、雄のC57BL/6Nマウスを用いて、その大腿骨、お
よび脛骨から、シリンジと25G の針を用いて、MEM 培地
でフラッシュすることにより、支持細胞を含む骨髄細胞
を得た。得られた細胞を70μm の径をもつメッシュに通
すことで、細胞凝集塊や不純物を取り除いた。
ルマール(PVF) 樹脂を高圧蒸気滅菌した後、phosphate
buffered saline (PBS) で２回洗浄した。ここで用いた
PVF 樹脂は、平均孔径130μm 、10x10x2mm であり、0.0
6％のＩ型コラーゲンで被覆されている。６週齢から８
週齢の、雄のC57BL/6Nマウスを用いて、その大腿骨、お
よび脛骨から、シリンジと25G の針を用いて、MEM 培地
でフラッシュすることにより、支持細胞を含む骨髄細胞
を得た。得られた細胞を70μm の径をもつメッシュに通
すことで、細胞凝集塊や不純物を取り除いた。
【００１３】最終的に得られた骨髄細胞 2x107個を、内
径35mmの培養用ディッシュ内に静置したPVF 樹脂の上部
から注入することにより担体に播種した。この細胞を、
下記の培地を用いて２週間培養することにより骨髄支持
細胞層をPVF 上に形成させた。ここで培養に用いた培地
は、α-MEM培地に、10％ウシ胎児血清（FBS ）、10％ウ
マ血清、10-7M デキサメタゾン、5x10-5M 2-メルカプト
エタノール及び 0.2％抗生物質を添加した組成から成る
培地である。このとき、培地交換は週に２回行った。
径35mmの培養用ディッシュ内に静置したPVF 樹脂の上部
から注入することにより担体に播種した。この細胞を、
下記の培地を用いて２週間培養することにより骨髄支持
細胞層をPVF 上に形成させた。ここで培養に用いた培地
は、α-MEM培地に、10％ウシ胎児血清（FBS ）、10％ウ
マ血清、10-7M デキサメタゾン、5x10-5M 2-メルカプト
エタノール及び 0.2％抗生物質を添加した組成から成る
培地である。このとき、培地交換は週に２回行った。
【００１４】（組織化学的解析）培養により得られたPV
F-骨髄支持細胞層複合体を、C57BL/6Nマウスの背中の皮
下に移植した。移植後６週間で複合体を摘出し、PVF 内
部の細胞をヘマトキシリンーエオジン(HE)染色により観
察した。対照実験は、骨髄細胞を播種していないPVF の
みを移植して、HE染色による観察を行った。図１は、PV
F 樹脂内で増殖した細胞のHE染色の写真である。左の２
枚は動物への移植前のものであり（図１ａ：PVF のみ、
図１ｂ：骨髄細胞を播種したもの）、右の２枚は動物へ
の移植後のものである（図１ｃ：PVF のみ、図１ｄ：骨
髄細胞を播種したもの）。図１から、PVF 上にいったん
骨髄支持細胞層を形成させたのち移植したものでは、PV
F 内に血液系細胞が多数存在しており（図１ｄ）、PVF
内で造血機能が再生されていたものであることが明らか
になった。一方、PVF のみを移植したものでは、PVF内
には繊維芽細胞由来の組織が構築されており、血液系の
細胞は全く認められなかった（図１ｃ）。
F-骨髄支持細胞層複合体を、C57BL/6Nマウスの背中の皮
下に移植した。移植後６週間で複合体を摘出し、PVF 内
部の細胞をヘマトキシリンーエオジン(HE)染色により観
察した。対照実験は、骨髄細胞を播種していないPVF の
みを移植して、HE染色による観察を行った。図１は、PV
F 樹脂内で増殖した細胞のHE染色の写真である。左の２
枚は動物への移植前のものであり（図１ａ：PVF のみ、
図１ｂ：骨髄細胞を播種したもの）、右の２枚は動物へ
の移植後のものである（図１ｃ：PVF のみ、図１ｄ：骨
髄細胞を播種したもの）。図１から、PVF 上にいったん
骨髄支持細胞層を形成させたのち移植したものでは、PV
F 内に血液系細胞が多数存在しており（図１ｄ）、PVF
内で造血機能が再生されていたものであることが明らか
になった。一方、PVF のみを移植したものでは、PVF内
には繊維芽細胞由来の組織が構築されており、血液系の
細胞は全く認められなかった（図１ｃ）。
【００１５】（FACSによる血球細胞の解析）人工骨髄に
含まれる血球細胞を、FACSにより解析を行った。なお、
FACSとは遊離した細胞を蛍光色素で染色した後に細い管
を通過させる際、レーザー光線を当てて、その細胞から
発生する蛍光の強弱により、細胞の分画を解析する方法
である。骨髄細胞を播種したPVF 樹脂を６週間培養し、
0.2 ％トリプシン−EDTAとコラゲナーゼを含む溶液を用
いて軽くピペッティングすることにより、付着している
細胞を担体から剥離した。これらの細胞を70μm のナイ
ロンフィルターに通して細胞塊を除去し、得られた細胞
を染色培地（PBS+2%FBS+0.5%アジ化ナトリウム）にて２
回洗浄した。その後、1-2x105 cells/mlとなるように、
細胞を染色用培地中に懸濁した。
含まれる血球細胞を、FACSにより解析を行った。なお、
FACSとは遊離した細胞を蛍光色素で染色した後に細い管
を通過させる際、レーザー光線を当てて、その細胞から
発生する蛍光の強弱により、細胞の分画を解析する方法
である。骨髄細胞を播種したPVF 樹脂を６週間培養し、
0.2 ％トリプシン−EDTAとコラゲナーゼを含む溶液を用
いて軽くピペッティングすることにより、付着している
細胞を担体から剥離した。これらの細胞を70μm のナイ
ロンフィルターに通して細胞塊を除去し、得られた細胞
を染色培地（PBS+2%FBS+0.5%アジ化ナトリウム）にて２
回洗浄した。その後、1-2x105 cells/mlとなるように、
細胞を染色用培地中に懸濁した。
【００１６】細胞に、以下の様な100 倍希釈した各種の
血球系細胞に特異的な抗体を加え、15分間氷温中で保持
した。ここで、血球系細胞のマーカーである抗Ly5.2 抗
体に加えて、特異的な血球細胞を認識する抗体である抗
MAC1抗体、抗Gr1 抗体、抗Ter119抗体、抗B220抗体、又
は抗CD4/CD8 抗体のいずれかを用いて、どの様な血球細
胞が存在しているか後にFACSで検出を行うための標識と
した。なお、抗MAC1抗体はマクロファージマーカー、抗
Gr1 抗体は顆粒球マーカー、抗Ter119抗体は赤血球マー
カー、抗B220抗体はＢリンパ球マーカー、CD4/CD8 抗体
はＴリンパ球マーカーである。抗Ly5.2 抗体はFITC標識
し、その他の抗体はビオチン標識して使用した。
血球系細胞に特異的な抗体を加え、15分間氷温中で保持
した。ここで、血球系細胞のマーカーである抗Ly5.2 抗
体に加えて、特異的な血球細胞を認識する抗体である抗
MAC1抗体、抗Gr1 抗体、抗Ter119抗体、抗B220抗体、又
は抗CD4/CD8 抗体のいずれかを用いて、どの様な血球細
胞が存在しているか後にFACSで検出を行うための標識と
した。なお、抗MAC1抗体はマクロファージマーカー、抗
Gr1 抗体は顆粒球マーカー、抗Ter119抗体は赤血球マー
カー、抗B220抗体はＢリンパ球マーカー、CD4/CD8 抗体
はＴリンパ球マーカーである。抗Ly5.2 抗体はFITC標識
し、その他の抗体はビオチン標識して使用した。
【００１７】その後、細胞を染色用培地で２回洗浄し、
二次抗体として200 倍希釈したstreptoavidin-phycoery
thin染色液を加えて、再度15分間氷温中で保持した。細
胞を染色用培地で洗浄し、500 倍希釈したpropidium io
dide（PI）溶液を加え、FACSによる解析を行うまで氷温
中に保存した。FACS（FACS Vantage,Becton-Dickinson,
CA,USA）を用いた解析では、まずPI（死細胞を特異的に
染色する）により死細胞を除去した。そして、Ly5.2 陽
性細胞10000 個について、前記の各種血球系細胞に特異
的なマーカーを指標としてFACSにより解析した。その結
果、６週間培養した担体における血球細胞の組成は、マ
クロファージが70.05%（上段真ん中）、顆粒球が28.83%
（上段右側）、赤血球が0.34% （下段左側）、Ｂリンパ
球が0.27% （下段真ん中）、Ｔリンパ球が0.51% （下段
右側）であり、大部分がマクロファージと顆粒球であっ
た（図２）。
二次抗体として200 倍希釈したstreptoavidin-phycoery
thin染色液を加えて、再度15分間氷温中で保持した。細
胞を染色用培地で洗浄し、500 倍希釈したpropidium io
dide（PI）溶液を加え、FACSによる解析を行うまで氷温
中に保存した。FACS（FACS Vantage,Becton-Dickinson,
CA,USA）を用いた解析では、まずPI（死細胞を特異的に
染色する）により死細胞を除去した。そして、Ly5.2 陽
性細胞10000 個について、前記の各種血球系細胞に特異
的なマーカーを指標としてFACSにより解析した。その結
果、６週間培養した担体における血球細胞の組成は、マ
クロファージが70.05%（上段真ん中）、顆粒球が28.83%
（上段右側）、赤血球が0.34% （下段左側）、Ｂリンパ
球が0.27% （下段真ん中）、Ｔリンパ球が0.51% （下段
右側）であり、大部分がマクロファージと顆粒球であっ
た（図２）。
【００１８】上述した様に、図２の結果はPVF-支持細胞
複合体を動物の皮下に移植をしないで６週間培養を行っ
て得た結果であるが、支持細胞の他にマクロファージ、
顆粒球等の分化した血球細胞が認められた。基本的には
骨髄支持細胞層が存在しないと血液幹細胞や血球前駆細
胞は増殖ができないが、支持細胞と共に担体に付着した
幹細胞や前駆細胞が増殖し、１回播種を行った場合でも
分化した血球細胞が認められたものと思われる。
複合体を動物の皮下に移植をしないで６週間培養を行っ
て得た結果であるが、支持細胞の他にマクロファージ、
顆粒球等の分化した血球細胞が認められた。基本的には
骨髄支持細胞層が存在しないと血液幹細胞や血球前駆細
胞は増殖ができないが、支持細胞と共に担体に付着した
幹細胞や前駆細胞が増殖し、１回播種を行った場合でも
分化した血球細胞が認められたものと思われる。
【００１９】また、PVF 上で骨髄細胞を２週間培養する
ことによってPVF 上にいったん骨髄支持細胞層を形成さ
せた後に、当該PVF-支持細胞複合体をマウス皮下に移植
し、その６週間後に同様にFACS解析を行った。結果を図
３に示す。その結果、血液細胞の組成はマクロファージ
＋顆粒球が70% （上段右側）、Ｂリンパ球が10% （下段
左側）、Ｔリンパ球が20% （下段右側）であり、やはり
大部分はマクロファージや顆粒球であった。しかし、図
２の結果と異なり、マウス皮下に移植した場合には、Ｂ
リンパ球やＴリンパ球もかなり認められたことから、造
血機能が再生されていることが判った。
ことによってPVF 上にいったん骨髄支持細胞層を形成さ
せた後に、当該PVF-支持細胞複合体をマウス皮下に移植
し、その６週間後に同様にFACS解析を行った。結果を図
３に示す。その結果、血液細胞の組成はマクロファージ
＋顆粒球が70% （上段右側）、Ｂリンパ球が10% （下段
左側）、Ｔリンパ球が20% （下段右側）であり、やはり
大部分はマクロファージや顆粒球であった。しかし、図
２の結果と異なり、マウス皮下に移植した場合には、Ｂ
リンパ球やＴリンパ球もかなり認められたことから、造
血機能が再生されていることが判った。
【００２０】（コロニーアッセイによる解析）マウス皮
下に移植したPVF-支持細胞複合体を取り出し、PVF 内部
の細胞をFACS解析と同様の方法によりPVF から剥離し
た。これらの細胞を70μm のナイロンフィルターに通し
て細胞塊を除去し、得られた細胞をPBS で洗浄したの
ち、サンプルあたり3x104 個となるように細胞数を調製
した。
下に移植したPVF-支持細胞複合体を取り出し、PVF 内部
の細胞をFACS解析と同様の方法によりPVF から剥離し
た。これらの細胞を70μm のナイロンフィルターに通し
て細胞塊を除去し、得られた細胞をPBS で洗浄したの
ち、サンプルあたり3x104 個となるように細胞数を調製
した。
【００２１】コロニーアッセイは、この細胞を35mmディ
ッシュ中で、1ml のコロニーアッセイ用培地を用いて１
週間培養することにより行った。コロニーアッセイ用培
地は、Stem Cell Technology社製（Vancouver,Canada）
M3334 （1%メチルセルロースを添加したIscove's MEM培
地に、15% FBS, 1% ウシ血清アルブミン(BSA) 200μg/m
lトランスフェリン、10μg/mlインシュリン、10-4M 2-
メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、3U/ml エリ
スロポエチン、を加えたもの）に500ng/ml幹細胞因子を
添加したものを用いた。１週間培養を行ったのち、それ
ぞれのコロニー形成ユニット（colony forming unit :
CFU ）は、顕微鏡下でコロニーの形態を観察することに
より判別した。
ッシュ中で、1ml のコロニーアッセイ用培地を用いて１
週間培養することにより行った。コロニーアッセイ用培
地は、Stem Cell Technology社製（Vancouver,Canada）
M3334 （1%メチルセルロースを添加したIscove's MEM培
地に、15% FBS, 1% ウシ血清アルブミン(BSA) 200μg/m
lトランスフェリン、10μg/mlインシュリン、10-4M 2-
メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、3U/ml エリ
スロポエチン、を加えたもの）に500ng/ml幹細胞因子を
添加したものを用いた。１週間培養を行ったのち、それ
ぞれのコロニー形成ユニット（colony forming unit :
CFU ）は、顕微鏡下でコロニーの形態を観察することに
より判別した。
【００２２】コロニーアッセイを行った結果を表１に示
す。表１における数字は、得られたコロニーの数を示
す。なお、BFU-E はBurst-forming unit-erythroid、CF
U-GMはColony-forming unit-granulocyte-macrophage、
CFU-GEM/GEMMはColony-formingunit-granulocyte-macro
phage-erythroid/granulocyte-macrophage-erythroid-m
egakaryocyte 、CFU-B はColony-forming unit-B lymph
ocyteの、それぞれ略称である。なお、BFU-E は赤血球
前駆細胞、CFU-GMは顆粒球とマクロファージを産生する
前駆細胞、CFU-GEM/GEMMは巨核球、顆粒球、マクロファ
ージ、赤血球を産生する前駆細胞、CFU-B はＢリンパ球
を産生する前駆体細胞である。
す。表１における数字は、得られたコロニーの数を示
す。なお、BFU-E はBurst-forming unit-erythroid、CF
U-GMはColony-forming unit-granulocyte-macrophage、
CFU-GEM/GEMMはColony-formingunit-granulocyte-macro
phage-erythroid/granulocyte-macrophage-erythroid-m
egakaryocyte 、CFU-B はColony-forming unit-B lymph
ocyteの、それぞれ略称である。なお、BFU-E は赤血球
前駆細胞、CFU-GMは顆粒球とマクロファージを産生する
前駆細胞、CFU-GEM/GEMMは巨核球、顆粒球、マクロファ
ージ、赤血球を産生する前駆細胞、CFU-B はＢリンパ球
を産生する前駆体細胞である。
【００２３】
【表１】
【００２４】移植したPVF と支持細胞層複合体には造血
機能はないことから、これらの前駆細胞は、移植された
レシピエントのマウス由来の造血因子が移植PVF 内で造
血機能を再構築した結果であると考えられる。移植した
PVF がレシピエントマウスにより免疫拒絶された場合に
は、レシピエント由来のＴリンパ球が多量に存在するこ
とになる。このＴリンパ球は成熟細胞であり、コロニー
形成能をもたない。従って、コロニーアッセイの結果CF
U は全く観察されないことになる。しかし、本実験では
以上のようにかなりの数のCFU が得られたことから、移
植したPVF と支持細胞層複合体内においてレシピエント
マウスの造血機能が再生され、いわゆる髄外造血が達成
されたことが示された。
機能はないことから、これらの前駆細胞は、移植された
レシピエントのマウス由来の造血因子が移植PVF 内で造
血機能を再構築した結果であると考えられる。移植した
PVF がレシピエントマウスにより免疫拒絶された場合に
は、レシピエント由来のＴリンパ球が多量に存在するこ
とになる。このＴリンパ球は成熟細胞であり、コロニー
形成能をもたない。従って、コロニーアッセイの結果CF
U は全く観察されないことになる。しかし、本実験では
以上のようにかなりの数のCFU が得られたことから、移
植したPVF と支持細胞層複合体内においてレシピエント
マウスの造血機能が再生され、いわゆる髄外造血が達成
されたことが示された。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、担体、及び当該担体に担
持して培養した造血を支持する機能を有する細胞を備え
る、新規な人工骨髄が与えられた。更に本発明により、
前記の人工骨髄を、動物に移植をすることにより又は動
物の体外においてその人工骨髄中に血液を循環させるこ
とによって、人工骨髄中において造血幹細胞を増殖さ
せ、更に造血幹細胞を血球細胞へ分化させる過程により
構成される、血球細胞の増殖方法が与えられた。本発明
の人工骨髄は、骨髄支持細胞の機能が低下した患者にお
いても、造血機能を代行することができる。
持して培養した造血を支持する機能を有する細胞を備え
る、新規な人工骨髄が与えられた。更に本発明により、
前記の人工骨髄を、動物に移植をすることにより又は動
物の体外においてその人工骨髄中に血液を循環させるこ
とによって、人工骨髄中において造血幹細胞を増殖さ
せ、更に造血幹細胞を血球細胞へ分化させる過程により
構成される、血球細胞の増殖方法が与えられた。本発明
の人工骨髄は、骨髄支持細胞の機能が低下した患者にお
いても、造血機能を代行することができる。
【図１】図１は、骨髄細胞を播種した又は播種しなかっ
たPVF 樹脂内で増殖した血球細胞を、皮下移植前後で検
出した写真である。
たPVF 樹脂内で増殖した血球細胞を、皮下移植前後で検
出した写真である。
【図２】図２は、骨髄細胞をPVF 樹脂に播種した後に、
６週間培養を行った後に存在する血球細胞を、FACSによ
り解析を行った結果の図である。
６週間培養を行った後に存在する血球細胞を、FACSによ
り解析を行った結果の図である。
【図３】図３は、支持細胞層を形成したPVF 樹脂をマウ
ス皮下に移植し、６週間経過した後に存在する血球細胞
を、FACSにより解析を行った結果の図である。
ス皮下に移植し、６週間経過した後に存在する血球細胞
を、FACSにより解析を行った結果の図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
特許法第30条第１項適用申請有り 2000年３月１日 Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｒｔｉｆ
ｉｃｅａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｏｒｇａｎｓ 発行の
「Ａ Ｐｅｅｒ Ｒｅｖｉｅｗｅｄ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ
2000 Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ＆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｌ Ｏｒｇａｎｓ 46ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏ
ｎｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ｔｈｅ Ｈｉｌｔｏｎ Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ−Ｊｕｎｅ 28−Ｊｕｌｙ １，2000」を
もって発表
(56)参考文献 特開 平８−336584（ＪＰ，Ａ)
特表 平４−501657（ＪＰ，Ａ)
国際公開99／25391（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61L 24/00 - 33/18
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 担体、及び前記担体に担持して培養した
造血を支持する機能を有する細胞を備える人工骨髄を、
ヒトを除く動物に移植をすることにより又はヒトを除く
動物の体外において当該人工骨髄中に血液を循環させる
ことによって、前記人工骨髄中において造血幹細胞を増
殖させ、更に当該造血幹細胞を血球細胞へ分化させる過
程により構成される、血球細胞の増殖方法。 - 【請求項２】 前記造血を支持する機能を有する細胞が
骨髄支持細胞である、請求項１記載の血球細胞の増殖方
法。 - 【請求項３】 前記担体が微孔性の立体網状多孔質構造
を有する粒子からなる、請求項１記載の血球細胞の増殖
方法。 - 【請求項４】 前記担体がポリビニルフォルマール樹脂
である、請求項３記載の血球細胞の増殖方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000146102A JP3421741B2 (ja) | 2000-05-18 | 2000-05-18 | 人工骨髄、血球細胞の増殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000146102A JP3421741B2 (ja) | 2000-05-18 | 2000-05-18 | 人工骨髄、血球細胞の増殖方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001321434A JP2001321434A (ja) | 2001-11-20 |
| JP3421741B2 true JP3421741B2 (ja) | 2003-06-30 |
Family
ID=18652512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000146102A Expired - Lifetime JP3421741B2 (ja) | 2000-05-18 | 2000-05-18 | 人工骨髄、血球細胞の増殖方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3421741B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3406272A1 (en) | 2015-01-26 | 2018-11-28 | Ube Industries, Ltd. | Cell culture method using bone marrow-like structure, and porous polymide film for healing bone injury site |
| US11298403B2 (en) | 2017-12-01 | 2022-04-12 | StemRIM Inc. | Therapeutic agent for inflammatory bowel disease |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007252393A (ja) * | 2004-04-28 | 2007-10-04 | Nippon Medical School | 脂肪組織由来幹細胞から骨髄を形成するための組成物およびその方法 |
| US9919010B2 (en) * | 2008-04-30 | 2018-03-20 | Genomix Co., Ltd. | Method for collecting functional cells in vivo with high efficiency |
| CN102076350A (zh) | 2008-04-30 | 2011-05-25 | 吉诺米克斯股份有限公司 | 将骨髓来源的多能干细胞动员到末梢循环的药物 |
| JP5725394B2 (ja) * | 2009-03-25 | 2015-05-27 | 公立大学法人大阪府立大学 | 造血幹細胞の培養方法 |
| WO2011052668A1 (ja) | 2009-10-28 | 2011-05-05 | 株式会社ジェノミックス | 骨髄間葉系および/または多能性幹細胞の血中動員による組織再生促進剤 |
| WO2012147470A1 (ja) | 2011-04-26 | 2012-11-01 | 株式会社ジェノミックス | 組織再生を誘導するためのペプチドとその利用 |
| FR2979110B1 (fr) * | 2011-08-16 | 2013-09-27 | Etat Francais Ministere De La Defense Service De Sante Des Armees | Modelisation in vitro des niches medullaires a cellules souches hematopoietiques : un outil pour etudier la regulation de l'hematopoiese, evaluer le potentiel de nichage d'un greffon hematopoietique et tester la pharmaco-toxicologie de medicaments. |
| KR102146815B1 (ko) | 2012-10-25 | 2020-08-21 | 가부시키가이샤 스템림 | Hmgb1 단편을 이용한 신규 심근경색의 치료법 |
| US9688733B2 (en) | 2012-10-25 | 2017-06-27 | Genomix Co., Ltd. | Method for treating spinal cord injury using HMGB1 fragment |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5032508A (en) * | 1988-09-08 | 1991-07-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
| JPH08336584A (ja) * | 1995-06-12 | 1996-12-24 | Natl Inst For Res In Inorg Mater | 人工骨髄用アパタイト多孔体 |
| CA2221195A1 (en) * | 1997-11-14 | 1999-05-14 | Chantal E. Holy | Biodegradable polymer matrix |
-
2000
- 2000-05-18 JP JP2000146102A patent/JP3421741B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3406272A1 (en) | 2015-01-26 | 2018-11-28 | Ube Industries, Ltd. | Cell culture method using bone marrow-like structure, and porous polymide film for healing bone injury site |
| US10508264B2 (en) | 2015-01-26 | 2019-12-17 | Ube Industries, Ltd. | Cell culture method using bone marrow-like structure, and porous polyimide film for healing bone injury site |
| US10590388B2 (en) | 2015-01-26 | 2020-03-17 | Ube Industries, Ltd. | Cell culture method using bone marrow-like structure, and porous polyimide film for healing bone injury site |
| US11298403B2 (en) | 2017-12-01 | 2022-04-12 | StemRIM Inc. | Therapeutic agent for inflammatory bowel disease |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001321434A (ja) | 2001-11-20 |
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