JP5725394B2 - 造血幹細胞の培養方法 - Google Patents
造血幹細胞の培養方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5725394B2 JP5725394B2 JP2009074133A JP2009074133A JP5725394B2 JP 5725394 B2 JP5725394 B2 JP 5725394B2 JP 2009074133 A JP2009074133 A JP 2009074133A JP 2009074133 A JP2009074133 A JP 2009074133A JP 5725394 B2 JP5725394 B2 JP 5725394B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- culture
- hematopoietic
- hematopoietic stem
- stem cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
再生医療には、未分化細胞の調達が一番の重要課題ではあるが、細胞を再生医療に用いるためには、生体外で、組織を構成する種々の細胞を個々増殖させ、異種の細胞塊を互いに接着させ、三次元的に生体内と同様の組織を組み上げる技術の確立が必要となる。
また、二種類以上の増殖速度の異なる細胞を従来の方法による同時に培養しても、増殖速度の速い細胞が急速に数を増やし、増殖速度の遅い細胞は淘汰されてしまうため、共培養は困難である。
自己再生能(自己複製能)及び多分化能を有する幹細胞(例えば、造血幹細胞)は、培養により自己再生能及び多分化能を消失してしまい、両能力を維持したままで培養することは、通常困難である。
本発明は、造血幹細胞について、自己複製を繰り返しつつ、血液細胞への分化を継続的に維持させることを目的とした。
本発明はまた、造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する粒子からなる三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなることを特徴とする、三次元共培養物を提供する。
本発明はまた、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径50〜2,000μmの複数の粒子からなり、該粒子がエポキシ基を0.5×10-3〜2.0×10-3mol/g基体の量で有する、造血幹細胞と造血支持細胞との共培養用の培養担体を提供する。
また、本発明の共培養物によれば、造血幹細胞の維持システム及び/又は血液細胞の提供システムが可能となる。
また、本発明の培養キット及び培養担体によれば、体外での造血幹細胞の維持・分化誘導が容易に可能となる。
(基体)
本発明において使用し得る基体(固体状支持体)は、その外表面に後述するグラフト鎖を有することができるものであれば、材質について何ら限定されず、無機材料からなるものであっても、有機材料からなるものであってもよい。ここで、「外表面」とは、外部からのアクセス(接近)が容易な外周面をいい、例えば多孔質体における孔のような内部空間を形成している表面を含まない。
有機材料からなる基体としては、例えば、(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体(例えば、エチレン又はプロピレン(共)重合体)、スチレン(共)重合体、ウレタン(共)重合体のような樹脂からなるものや、乳酸(共)重合体、グリコール酸(共)重合体、εカプロラクトン(共)重合体のような生分解性樹脂からなるものなどが挙げられる。
好ましくは、基体は、(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体又はスチレン(共)重合体からなる。
粒子状の基体は、好ましくは50〜2,000μm、より好ましくは100〜2,000μm、より好ましくは200〜2,000μm、より好ましくは300〜2,000μm、より好ましくは500〜2,000μmの体積平均粒径を有する。
基体は多孔質であってもよいが、多孔質でないほうが好ましい。
重合体からなる基体は、(コ)モノマー(例えば、前述のもの)を公知の方法で重合反応させることにより作製することができる。なかでも、モノマー(必要に応じて、高分子性分散安定剤)を溶媒中に分散させて重合固化させる懸濁重合法は、一段階で基体を作製でき、また後述する重合開始基を容易に導入できる点で、好ましい。
基体を作製するための重合反応に使用する重合開始剤は、任意の公知の重合開始剤(例えば、アゾビスイソブチロニトリル、2,2'-アゾビス(2,4-ジメチルバレロニトリル)、過酸化ベンゾイル)を使用することができる。
ラジカル発生性アゾ化合物を使用する場合、重合反応性であれば、基体を作製するための重合反応において、該化合物をコモノマーの1つとしてそのまま用いることができる。このような重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物の具体例には、例えば、2,2'-アゾビス[N-(2-プロペニル)-2-メチルプロピオンアミド]が挙げられる。
導入効率の観点から、2,2'-アゾビス[N-(2-プロペニル)-2-メチルプロピオンアミド]のような重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物をそのままモノマーの1つとして用いることが好ましい。
エポキシ基含有モノマーは、エポキシ基を含む重合反応性モノマーであれば限定されないが、例えば、不飽和グリシジルエステル及び不飽和グリシジルエーテルであり得る。
グラフト鎖は、エポキシ基を含む限り特定の形態に限定されない。エポキシ基は、グラフト鎖の主鎖(側鎖の有無は問わず)に存在してもよいし、側鎖に存在していてもよい。
グラフト鎖は、好ましくは、少なくともエポキシ基含有モノマー由来のモノマー単位を含む(共)重合体である。例えば、グラフト鎖は、エポキシ基含有モノマー(任意に、他のコモノマーと)の(共)重合体であり得る。グラフト鎖はまた、エポキシ基含有モノマーを含まない主鎖の重合体に、側鎖としてエポキシ基含有モノマーを重合(又は付加)させたものであり得る。
グラフト鎖中のエポキシ基と親水性官能基との割合(エポキシ基:親水性官能基)は、好ましくは10:1〜1:10の範囲である。親水性官能基は、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基及び2-オキソピロリジニルからなる群より選択される。親水性官能基は、グラフト鎖の主鎖に存在してもよいし、側鎖に存在してもよい。
不飽和グリシジルエステルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にC2〜C4)不飽和炭化水素のグリシジルエステルであり、具体例には、(メタ)アクリル酸グリシジル、イタコン酸のモノ及びジグリシジルエステル、アリルグリシジルエステルが挙げられる。
脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルとしては、例えば、置換又は未置換の(C1〜C4)アルキレンジオールグリシジルエーテルであり、具体例には1,4-エタンジオールジグリシジルエーテル(エチレングリコールジグリシジルエーテル)、1,3-プロパンジオールジグリシジルエーテル、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルが挙げられる。
グラフト鎖中のエポキシ基含有モノマーは、1種であっても、2種以上であってもよい。
カルボキシ基含有モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸、イタコン酸及びマレイン酸が挙げられる。
2-オキソピロリジニル基含有モノマーとしては、N-ビニルピロリドンである。
グラフト鎖は、エポキシ基を、例えば0.3×10-3〜6.0×10-3mol/g基体、好ましくは0.5×10-3〜6.0×10-3mol/g基体、より好ましくは0.5×10-3〜2.0×10-3mol/g基体の量で基体の外表面に付与される。
基体へのエポキシ基を有するグラフト鎖の付与方法には、グラフト重合によって基体の外表面上に直接、エポキシ基を有するグラフト鎖を形成する方法(本明細書中、「表面グラフト重合法」と呼ぶ)と、予め作製したグラフト鎖を基体の外表面に化学結合によりグラフトする方法(本明細書中、便宜上、「化学結合法」と呼ぶ)がある。後者の方法には、グラフト鎖がエポキシ基を有して予め作製される方法と、グラフト鎖がエポキシ基自体は有さずエポキシ基含有化合物と反応し得る官能基を有して予め作製され、基体の外表面へのグラフト後に該官能基にエポキシ基含有化合物を反応させる方法がある。
表面グラフト重合法においては、簡潔には、先ず基体の外表面に活性種(ラジカル)を発生させ、次いで該活性種を起点としてエポキシ基含有モノマー(必要に応じて、親水性官能基含有モノマー及び/又はその他のコモノマーと)を重合反応させることによって、基体の外表面にエポキシ基を含むグラフト鎖を形成する。
例えば、活性種(ラジカル)を発生させるためには、基体の外表面に電子線、放射線、プラズマなどを照射することができる。この方法は、材質に関して、無機材料又は有機材料からなる基体のいずれにも適用可能であり、形状に関しても、粒子状、板状又は発泡多孔質状のいずれにも適用可能である。
プラズマは、例えば、酸素又は窒素雰囲気下にて1.25×1023〜1.87×1024eV/kg基体のエネルギーで5〜15分間にわたって照射し得る。
エポキシ基含有モノマー、親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーには、グラフト鎖について前述したものを使用できる。親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーは、選択したエポキシ基含有モノマーと同様の条件で重合反応し得るものであれば、特に限定されず、所望により適切なものを選択すればよい。
反応終了後、室温まで放冷し、トルエン、メタノール及び蒸留水で洗浄して、エポキシ基(及び親水性官能基)を含むグラフト鎖を外表面に有する基体が得られる。
化学反応法においては、簡潔には、基体に内在する熱開裂性又は光開裂性の反応性官能基(上記「基体の作製」の項を参照)を熱又は光開裂させた後、エポキシ基を含むか又は含まないグラフト鎖を反応させて、基体の外表面にグラフト鎖をグラフトする。エポキシ基を含まないグラフト鎖を用いた場合には、その後グラフト鎖にエポキシ基を付加する。
エポキシ基含有モノマー、親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーには、グラフト鎖に関して前述したものを使用できる。親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーは、選択したエポキシ基含有モノマーと同様の条件で重合反応し得るものであれば、特に限定されず、所望により適切なものを選択すればよい。
エポキシ基含有化合物の付加に使用できる基は、例えば、カルボキシル基、イソシアナト基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基である。
ヒドロキシ基を内在するグラフト鎖としては、例えば、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコールが挙げられる。
チオール基を内在するグラフト鎖としては、例えば、チオール含有ポリビニルアルコールが挙げられる。
脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルの好ましい例には、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルが挙げられる。
エピハロヒドリンには、エピクロロヒドリンが挙げられる。
エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体(以下、「本発明に係る培養担体」とも呼び、文脈から明らかな場合には単に「培養担体」とも呼ぶ)に付着させる造血支持細胞は、骨髄、脂肪組織、血管、臍帯のような組織に含まれる細胞のうち付着性を有する細胞(間葉系付着性細胞)及びその株化細胞である。造血支持細胞は、例えば、骨髄ストローマ細胞、骨髄線維芽細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞及びこれらの前駆細胞並びにこれら細胞由来の株化細胞から選択できる。
造血支持細胞は、1種類を単独で用いてもよいし、2種類以上を組み合わせて用いてもよい。
株化細胞としては、ヒト子宮頸部由来上皮細胞株Hela、ヒト由来軟骨細胞株Ch-8、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞株MC 3T3-E1、マウス骨髄ストローマ細胞株MS-5、ST2、HESS-5、M2-10B4などが挙げられる。
造血支持細胞を本発明に係る培養担体に付着させる方法は、特に限定されないが、例えば以下の方法により行うことができる。培養担体を含む生理学的溶液と、生理学的溶液中に造血支持細胞を懸濁させた細胞懸濁液とを細胞接着性の低い容器(例えば、疎水性外表面を有する組織培養ディッシュ)に入れて静置する。
生理学的溶液としては、生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、下記「造血幹細胞と造血支持細胞との共培養」の項で説明するような液体培養培地などが挙げられる。
培養培地及びその添加剤には、下記「造血幹細胞と造血支持細胞との共培養」の項で説明するような培地と同様な液体培養培地を使用できる。
具体例としては、5%の炭酸ガス雰囲気下で、10%のウシ胎仔血清を含むD-MEM中で37℃にて培養を行う。
「造血幹細胞」とは、自己再生能及び全ての系統の血液細胞への分化能(全能性)を有する細胞(未分化細胞)をいう。造血幹細胞は、特徴的には、CD34陽性の非付着性細胞である。本発明において使用し得る造血幹細胞は、由来する組織について限定されないが、例えば骨髄血、臍帯血又は末梢血に由来し得る。
「造血幹細胞を含有する細胞集団」は、少なくとも造血幹細胞を含む限り、他の細胞を含んでいてもよいが、好ましくは造血幹細胞と造血前駆細胞や(成熟)血液細胞などの非付着性細胞とからなり、より好ましくは造血幹細胞及び造血前駆細胞からなる細胞集団である。
培養培地には、任意の液体培養培地、好ましくは哺乳動物細胞用培地を使用できる。細胞培養培地としては、例えば、イーグル培地のような最小必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(D-MEM)、α-MEM、ハムF-12及びF-10培地、D-MEM/F-12培地、ウィリアムE培地、RPMI培地(例えばRPMI-1640)、MCDB培地、199培地、199/F-12培地、フィッシャー培地、イスコフ改変ダルベッコ培地(I-MDM)、マッコイ5A及び7A培地、Methocult培地(メチルセルロース培地)が挙げられる。
生物由来の添加剤(例えば、血清)は、造血幹細胞及び/又は造血支持細胞と同種又は同一個体に由来する血清であることが好ましいが、他の種の動物由来(例えば、ウシ胎仔血清、ウシ血清、ウマ血清)であってもよい。
培養担体が粒子である場合、該粒子は培養容器中で三次元集積体を形成していることが好ましい。ここで、「三次元集積体」とは、形状を問わず、複数の粒子が三次元的に集積して構成される構造体をいう。
共培養物から、公知の方法を用いて、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を回収することができる。回収法には、密度勾配遠心法(例えば、フィコール法)、血液凝集法、パンニング法、(例えば、アフィニティーカラムやFACSのようなセルソーティングにおいて)適切な表面マーカー(例えば、CD34、lin)又はその組合せについてポジティブ及び/又はネガティブ選択を行う方法などが挙げられる。
培養担体の製造には、1000ml容のガラス製セパラブルフラスコに三口セパラブルフラスコカバーを取り付けたものを反応容器として使用した。反応液の撹拌は、テフロン(登録商標)製攪拌翼が先端に取り付けられた攪拌棒を攪拌モーター(スリーワンモーター、新東科学製)により回転させて行った。反応容器は、温度コントローラー(NTT-1000、東京理化)により温度制御された恒温水槽内に設置した。反応の間のモノマーや溶媒の蒸発を防ぐために、長さ30cmのジムロート式又はアリン式冷却管をフラスコに取り付け、16℃の冷却水を流した。
(基体の製造)
反応液が入っていない上記三口フラスコを恒温水槽に設置し、予め攪拌翼を300rpmで回転させた。
反応容器に、メタクリル酸メチル(MMA;和光純薬工業)を38g、トリアクリル酸ペンタエリスリトール(PETA;Sigma Aldrich、米国)を38g、2,2'-アゾビス[N-(2-プロペニル)-2-メチルプロピオンアミド](APMPA;和光純薬工業)を0.75〜11.4g(下記表1を参照)、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN;和光純薬工業)を2g、ポリビニルピロリドン(PVP;K-90、ナカライテスク)を5.64g、蒸留水を590g入れ、70℃にて2時間、次いで80℃にて2時間反応させた。反応液が室温になるまで放置して、アゾ基を含む粒子状の基体(樹脂粒子)を70g得た。
反応液が入っていない上記三口フラスコを恒温水槽に設置し、予め攪拌翼を150rpmで回転させた。
反応容器に、樹脂粒子を10g、メタクリル酸グリシジル(GMA;和光純薬工業)を0〜25g(表1を参照)、コモノマーを0〜25g(表1を参照)、トルエン(ナカライテスク)を250g入れ、100℃にて8時間反応させた。ただし、培養担体11及び12の製造時には、反応時間をそれぞれ4時間及び2時間とした。
反応終了後、反応液が室温になるまで放置した後、メタノールと蒸留水及び生理食塩水にて洗浄して、グラフト鎖を外表面に有する樹脂粒子(培養担体1〜15)を20〜100gを得た(表1)。
また、得られた培養担体2〜6、8〜12は、グラフト鎖にエポキシ基及びヒドロキシ基を含む。
また、培養担体13〜15は、グラフト鎖にエポキシ基及びカルボキシル基を含む。
また、得られた培養担体7は、グラフト鎖にエポキシ基を含まない。
また、培養担体11及び12については、表面グラフト重合の反応時間が短いため、グラフト鎖の鎖長が他の培養担体と比べて短い。
上記1000ml容三口フラスコに、GMAを38g、PETAを38g、AIBNを2g、PVPを5.64g、水を590g入れ、300rpmで攪拌させながら70℃にて3時間、次いで80℃にて2時間反応させた。反応液を室温まで降温させ、蒸留水とメタノールで軽く洗浄して、エポキシ基を有する基体(樹脂粒子)を得た。
この樹脂粒子をこのまま(グラフト鎖を付与せずに)培養担体16とした。
窒素雰囲気下で、ポリスチレン製ディシュに入れたポリプロピレン(PP)板(1cm×5cm)にガンマ線を150kGy(25kGy/h×6hr)照射してPP外表面にラジカルを発生させた。次に、上記三口フラスコに、PP板(0.4g)、GMAを20g、MAを5g、ドデシル硫酸ナトリウム(和光純薬工業)を8g、蒸留水を400g入れ、窒素ガスを用いてバブリングしながら60℃にて8時間反応させた。反応後、反応液が室温になるまで放置した後、メタノールと蒸留水及び生理食塩水にて洗浄して、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有するPP板(培養担体17)を得た。
(基体の製造)
上記1000ml容三口フラスコに、GMAを20g、PETAを50g、PVPを5g、水を500g入れ、300rpmで攪拌させながら70℃にて3時間、次いで80℃にて2時間反応させた。反応液を室温にまで降温させ、蒸留水とメタノールで軽く洗浄して、エポキシ基が内在する基体(樹脂粒子)を得た。
なお、得られた樹脂粒子をこのままで培養担体18とした。
測定データを表2に示す。
簡潔には、共栓付き100ml容三角フラスコに、乾燥重量で0.4mgの培養担体と25mlの塩酸-ジオキサン溶液(濃塩酸1.6mlに対して1,4-ジオキサン100ml)を入れ、恒温振盪水槽を用いて振幅2cm、125回/分の速さで振盪させながら、60℃にて1時間反応させた。反応後、反応液を室温まで降温させ、25ml中性エタノール溶液(エタノール100ml中クレゾールレッド指示薬1ml)を加えた。0.05Nメタノール性水酸化ナトリウム溶液により残存する塩酸の定量を行った。ブランク実験を行い、補正した塩酸消費量から培養担体のグラフト鎖中のエポキシ基量を算出した。
2.1.
培養担体3[p(MMA-AP3)-g-p(HMA/GMA)3]2.0gを含む生理食塩水5mlと、生理食塩水中に造血支持細胞としてヒト上皮細胞由来細胞株(Hela細胞)、マウス骨髄由来線維芽細胞株(MS-5細胞)、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞株(MC 3T3-E1細胞)又はヒト由来軟骨細胞(Ch-8細胞)2.0×104個を懸濁させた細胞懸濁液を組織培養ディッシュに入れて37℃にて120時間静置して、培養担体3に各造血支持細胞を付着させた。
5日間の培養後の培養担体と造血支持細胞の様子を図1に示す。
図より、培養担体3(本発明に係る培養担体)には、用いた何れの造血支持細胞も良好に付着(固定化)し、担体間隙に細胞からなるバイオフィルムが形成されることが明らかとなった。細胞数が添加量から増加しており、本発明に係る培養担体上で造血支持細胞が増殖すると理解できた。
培養担体16[p(PETA-GMA1)]を含む生理食塩水2.0gを含む生理食塩水5mlと、生理食塩水中にMS-5細胞を懸濁させた細胞懸濁液組織培養ディッシュに入れて37℃にて120時間静置して、培養担体16に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した培養担体を、10%のウシ胎仔血清を含むD-MEM中、5%の炭酸ガス雰囲気下で37℃にて培養した。
図より、樹脂粒子自体にエポキシ基を含むがエポキシ基を含むグラフト鎖を有さない培養担体16には、MS-5細胞の付着(固定化)・増殖が全く見られなかった。
細胞を含む培地懸濁液と培養担体とを接触後、その時間を0分としてからの培地中の細胞数をビルゲルチュルク式血球計算盤により測定することにより、培養担体1〜7[p(MMA-AP3)-g-p(HMA/GMA)1〜7]へのMS-5細胞の付着(固定化)速度を測定した。
結果を図3に示す。
また、培養担体1〜4についての結果より、グラフト鎖がエポキシ基に加えてヒドロキシ基を含むことにより、造血支持細胞の付着性(付着速度)が更に向上することも理解できる。
培養担体8〜10[p(MMA-AP1〜3)-g-p(HMA/GMA)3]に存在するグラフト鎖の本数は、APMPAの添加量と開始剤効率からそれぞれ2.14×1018、4.03×1018、8.07×1018本/g-基体であると推定された。
また、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量したところ、それぞれ0.343、0.524及び1.63×10-3mol/g-基体となった。
図より、グラフト鎖の本数よりもむしろ絶対的なエポキシ基量が細胞の付着に影響を及ぼしていることが解る。
培養担体3と培養担体11及び12[p(MMA-AP3)-g-p(HMA/GMA)3/4及びp(MMA-AP3)-g-p(HMA/GMA)3/2]のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量することによって、グラフト鎖の平均重合度はそれぞれ411、202、100となった。
これら培養担体へのMS-5細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図5に示す。
培養担体3及び培養担体13[p(MMA-AP3)-g-p(MA/GMA)3]のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量したところ1.03及び2.04×10-3mol/gとなった。
培養担体3と培養担体13へのMS-5細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図6に示す。
培養担体3を篩にかけ、粒径に従って、5−58μm画分、58−108μm画分、108−190μm画分、210−420μm画分、及び590−840μm画分に分けた。
次に、各画分についてMS-5細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図7に示す。
また、粒子は球形であり、比重も1.19×103kg・m-3と培地の密度と大きく変わらず、僅かな衝撃でも培地中で移動してしまう。そのため、粒子の移動が細胞に応力を与え、細胞にストレスがかかると推測される。
以上の結果から考えて、粒子径は細胞の付着に影響を与えることが推定される。
表4に示す培養担体にMS-5を付着(固定化)させ、10%のウシ胎仔血清を含むD-MEM中、5%の炭酸ガス雰囲気下で37℃にて培養した。5日間の培養後、培養担体の単位表面積当たりに付着(固定化)している細胞数を培養担体から剥離した細胞をビルゲルチュルク式血球計算盤を用いて計数した。結果を表4に示す。
培養担体上での細胞の増殖に限って言えば、担体の粒径が大きな影響を及ぼしていることが解る。
培養担体13〜15[p(MMA-AP3〜5)-g-p(MA/GMA)3]へのMS-5細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。また、これら培養担体について、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量した。結果を表5に示す。
また、APMPAをHMAの場合よりも多く用いてアゾ基を含む樹脂粒子を作製すると、HMAの場合よりも多くのエポキシ基を含むグラフト鎖を作製することができたものの、培養5日目の細胞数はほとんど変わらなかった。
培養担体17[PP-g-p(MA/GMA)]又は未処理PP板と、生理食塩水中にHela細胞を懸濁させた細胞懸濁液(1〜10×104個)を疎水性外表面を有する組織培養ディッシュに入れて37℃にて120時間静置して、培養担体又は未処理PP板に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した培養担体又は未処理PP板を、10%のウシ胎仔血清を含むD-MEM中、5%の炭酸ガス雰囲気下で37℃にて培養した。
図より、未処理PP板では、Hela細胞が付着(固定化)して伸長している様子は見えないのに対して、培養担体17(本発明に係る培養担体)にはHela細胞が付着(固定化)し伸長していることが明らかとなった。
培養担体18[p(PETA-GMA0)]又は培養担体19[p(PETA-GMA0)-g-p(PAA-epoxy)]0.24gを含む生理食塩水5mlと、生理食塩水中にMS-5細胞を懸濁させた細胞懸濁液(1〜10×104個)を疎水性外表面を有する組織培養ディッシュに入れて37℃にて120時間静置して、上記両培養担体に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した両培養担体を、10%のウシ胎仔血清を含むD-MEM中、5%の炭酸ガス雰囲気下で37℃にて培養した。
図より、培養担体18には、MS-5細胞の付着(固定化)・増殖が全く見られないのに対して、本発明に係る培養担体10にはそれを取り囲むようにMS-5細胞が付着(固定化)・増殖し、培養担体間隙にもバイオフィルムが形成されていることが解る。
培養担体3[p(MMA-AP3)-g-p(HMA/GMA)3]及び培養担体19[p(PETA-GMA0)-g-p(PAA-epoxy)]にMS-5細胞を付着(固定化)させた。
先ず、50ml容のポリプロピレンチューブ内で、500mgの培養担体3又は19を5mlのD-MEM中に懸濁させた。
この細胞懸濁液5mlを、予め培養担体を懸濁しておいた50ml容のポリプロピレンチューブに添加した。そのまま、37℃にて24時間放置した後、培養担体と細胞の混合懸濁液を60mmの組織培養用ディシュに移して、更に培養を5日間続けた。
培地交換時に培養用ディッシュより回収した細胞は、造血幹細胞コロニーアッセイ用メディウム(MethoCult H4034、Stemcell Technologies Inc.、カナダ)と共に30mm培養用ディッシュに播き、37℃インキュベーター内で14日間培養後、形成されたコロニーを倒立顕微鏡下に観察して、未熟造血細胞としてCFU-Mix、BFU-E、CFU-GMの同定を行った。
造血幹細胞は、培養開始後数日で培養担体に付着したMS-5細胞層に潜り込むようにしながら増殖及び分化し、造血巣を形成した(図10左)。H-E染色より、培養担体の周りに付着・増殖した約10〜20μmの比較的大きなMS-5細胞に、5〜10μmの小さな血球細胞が潜り込むようにしながら増殖及び分化している様子が解る(図10右)。
図より、造血幹細胞を単独又は培養担体のみとの共存下で培養した場合(図中、「CD34 alone」及び「M-02beads+CD34」)、4〜6週間で造血巣から遊離してくる血球が観察されなくなった。これは、造血幹細胞が成熟血球に分化してしまい、全て死滅してしまった結果と考えられた。
次に、培地交換時に、培養液中に造血巣から遊離して回収された細胞をメイ・グリュンワルド・ギムザ染色し、その形態を観察した。染色写真を図13に示す。
図より、造血幹細胞が単独で培養された場合(図中、「CD34 alone」)、4週目に残存する細胞のほとんどが分化したマクロファージであったのに対し、造血幹細胞が本発明に係る培養担体に付着した骨髄ストローマ細胞と三次元共培養される場合(図中、「M-02beads」及び「G-02beads」)には、7週目でも培養物中に未分化細胞から分化細胞(成熟血液細胞)まで観察できた。すなわち、造血幹細胞の自己再生(自己増殖)及び血液細胞への分化が、骨髄と同様に、体外で人工的に再現された。
培養中のMS-5細胞及び造血幹細胞の発育の様子を示す。
図14に、培養担体に付着し、増殖して三次元的に発育しているMS-5細胞のH-E染色写真、アルシアン・ブルー染色写真を示す。MS-5細胞は、培養担体間にネット状構造物を形成しながら発育している。
図15に、走査型電子顕微鏡による観察写真を示す。培養担体に付着して三次元的構造を形成しながら発育するMS-5細胞と、隙間に潜り込むようにしながら増殖している造血細胞が観察できる。
Claims (15)
- 造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、3週間以上にわたって該造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させ、該基体が体積平均粒径58〜2,000μmの粒子であり且つ該エポキシ基を0.5×10 -3 〜2.0×10 -3 mol/g基体の量で有することを特徴とする、造血幹細胞の培養方法。
- 前記粒子が三次元集積体を形成している、請求項1に記載の方法。
- 前記グラフト鎖が親水性官能基を更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記グラフト鎖が、前記エポキシ基及び前記親水性官能基を10:1〜1:10の割合で含む請求項3に記載の方法。
- 前記グラフト鎖が10,000〜100,000の分子量を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記グラフト鎖が(メタ)アクリル酸グリシジル、アリルグリシジルエーテル又は1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルをエポキシ基含有モノマー単位として有する(共)重合体である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基体が(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体又はスチレン(共)重合体からなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記共培養の前に、前記基体上で前記造血支持細胞を培養する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記造血幹細胞又は前記造血幹細胞を含有する細胞集団が骨髄血、臍帯血又は末梢血に由来する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記造血支持細胞が骨髄ストローマ細胞、骨髄線維芽細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞若しくはこれらの前駆細胞又はこれら細胞由来の株化細胞である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を回収することを更に含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血液細胞を回収することを更に含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、3週間以上にわたって該造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させ、該基体が体積平均粒径58〜2,000μmの粒子であり且つ該エポキシ基を0.5×10 -3 〜2.0×10 -3 mol/g基体の量で有することを特徴とする、造血幹細胞の維持又は増幅方法。
- 造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径58〜2,000μmの粒子からなる三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなり、該粒子が該エポキシ基を0.5×10 -3 〜2.0×10 -3 mol/g基体の量で有し、3週間以上維持されていることを特徴とする、三次元共培養物。
- エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径58〜2,000μmの粒子の三次元集積体と該三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなり、該粒子が該エポキシ基を0.5×10-3〜2.0×10-3mol/g基体の量で有することを特徴とする、造血幹細胞の培養キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009074133A JP5725394B2 (ja) | 2009-03-25 | 2009-03-25 | 造血幹細胞の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009074133A JP5725394B2 (ja) | 2009-03-25 | 2009-03-25 | 造血幹細胞の培養方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010220581A JP2010220581A (ja) | 2010-10-07 |
JP5725394B2 true JP5725394B2 (ja) | 2015-05-27 |
Family
ID=43038475
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009074133A Expired - Fee Related JP5725394B2 (ja) | 2009-03-25 | 2009-03-25 | 造血幹細胞の培養方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5725394B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5935477B2 (ja) * | 2011-04-20 | 2016-06-15 | Dic株式会社 | 骨髄由来細胞の培養方法 |
FR2979110B1 (fr) | 2011-08-16 | 2013-09-27 | Etat Francais Ministere De La Defense Service De Sante Des Armees | Modelisation in vitro des niches medullaires a cellules souches hematopoietiques : un outil pour etudier la regulation de l'hematopoiese, evaluer le potentiel de nichage d'un greffon hematopoietique et tester la pharmaco-toxicologie de medicaments. |
WO2014113415A1 (en) | 2013-01-15 | 2014-07-24 | Cornell University | Reprogramming of human endothelium into hematopoietic multi-lineage progenitors by defined factors |
CN106460027B (zh) * | 2014-03-24 | 2020-07-31 | 日东纺绩株式会社 | 使用阳离子性接枝聚合物的目标物分离浓缩方法 |
CN105602891A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-05-25 | 深圳市第二人民医院 | 一种透明软骨细胞及制备方法 |
WO2020203768A1 (ja) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | 積水化学工業株式会社 | 細胞培養用足場材料及び細胞培養用容器 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3421741B2 (ja) * | 2000-05-18 | 2003-06-30 | 筑波大学長 | 人工骨髄、血球細胞の増殖方法 |
-
2009
- 2009-03-25 JP JP2009074133A patent/JP5725394B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2010220581A (ja) | 2010-10-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6943937B2 (ja) | 幹細胞培養のためのマイクロキャリア | |
US8426176B2 (en) | Synthetic microcarriers for culturing cells | |
JP5725394B2 (ja) | 造血幹細胞の培養方法 | |
JP6416206B2 (ja) | 幹細胞培養のためのポリカプロラクトン・マイクロキャリアーおよびその製造 | |
Merten | Advances in cell culture: anchorage dependence | |
JP5407345B2 (ja) | 生体組織の作製方法 | |
Chen et al. | Biomaterial-assisted scalable cell production for cell therapy | |
US9206391B2 (en) | Method for preparing biological tissue | |
US9440004B2 (en) | Method for preparing biological tissue | |
CA2657013A1 (en) | Temperature-responsive microcarrier | |
US20110129919A1 (en) | Microcarriers for Stem Cell Culture | |
EP1784481A1 (en) | Methods of generating embryoid bodies using three dimensional scaffolds | |
JP2015211688A (ja) | 胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法 | |
US11499136B2 (en) | Cell culture substrate | |
JP2020062009A (ja) | 細胞培養基材、細胞培養基材の製造方法、及びスフェロイドの製造方法 | |
JP2014023540A (ja) | 生体組織の作製方法 | |
JP7271870B2 (ja) | 多能性幹細胞の培養基材及び多能性幹細胞の製造方法 | |
WO2022114074A1 (ja) | 細胞塊の製造方法 | |
CN115315506A (zh) | 含有hepes的培养基 | |
Ayhan et al. | Cell growth on poly (EGDMA/HEMA) based microbeads | |
Chu | Expansion of Human Pluripotent Stem Cells with Synthetic Polymer PMVE-alt-MA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120315 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131203 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140203 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140805 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140905 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150303 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150319 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5725394 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |