CN115315506A - 含有hepes的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明旨在提供在使用高浓度的HEPES缓冲液时，不呈毒性而能细胞培养的细胞培养用培养基、该培养基的制造方法、及使用该培养基的细胞培养方法。由以30mM以上的浓度含有4‑(2‑羟乙基)‑1‑哌嗪乙磺酸(HEPES)，并且渗透压是220～340mOsm/kg的细胞培养用培养基及使用该培养基的细胞培养方法，使细胞增殖率的提升变得可能。
Description
【技术领域】
本发明涉及细胞培养用培养基、特别是，含有HEPES的细胞培养用培养基及该培养基的制造方法。
【背景技术】
细胞培养是指将从生物体组织分离的细胞在培养液中增殖·维持，选择对应于各细胞的适合的培养环境、培养液、基材，整备生存环境重要。在生存环境中大分而有物理化学环境(例：温度、pH、渗透压、氧分压及二氧化碳分压)及生理学环境(例：激素及营养素的浓度)，这些环境(温度以外)可通常由培养基的成分控制。正常的哺乳类细胞系的大部分在pH7.4前后(pH7.3～7.5)良好地生长。一般而言，此缓冲作用通过在培养基中含缓冲剂/缓冲液而达成。作为细胞培养用培养基中所含的缓冲剂/缓冲液，使用各种，二氧化碳-碳酸氢盐基的缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸-醋酸钠基的缓冲液、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液、柠檬酸缓冲液、三-盐酸缓冲液等单独或组合使用。由于二氧化碳-碳酸氢盐基的缓冲液在5％CO2(细胞培养中的常套的二氧化碳浓度)气氛下调整pH，通过从温育器出入细胞而pH易变动。一方面，HEPES缓冲液，无论气体分压，能保持pH6.8～8.2这样的一定的pH。由于有这样优良的缓冲作用，HEPES缓冲液以其他缓冲液、例如碳酸氢钠的辅助的作用广泛使用。但是，担心其毒性(非专利文献1～5)，多以10～25mM的范围的HEPES浓度使用(例、DMEM_Lonza 12-708F、DMEM/F-12_Lomza 12-719F、mTeSRSTEMCELL Technologies ST-85850)。近年确证，在指向再生医疗的实用化而探索高密度培养法之中，在以往的缓冲液处方中pH缓冲作用变得不充分的可能性高。另外，在如iPS细胞一样要求用需要高的缓冲能的培养基的培养时也增加。
【现有技术文献】
【非专利文献】
非专利文献1：Poole CA,et al.,In Vitro.1982Sep；18(9):755-65。
非专利文献2：ZiglerJS Jr,et al.,In Vitro Cell Dev Biol.1985May；21(5):282-7。
非专利文献3：Bowman CM,et al.,In Vitro Cell Dev Biol.1985Mar；21(3Pt1):140-2。
非专利文献4：Hanrahan JW,et al.,J Membr Biol.1990Jun；116(1):65-77。
非专利文献5：R Depping,Analytical and Bioanalytical Chemistry,2019,Volume 411,Issue 4,pp 797-802
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
本发明旨在提供期待缓冲化作用的强化而在以以往使用的浓度以上的浓度使用HEPES缓冲液时，不呈毒性而能细胞培养的细胞培养用培养基。再者，本发明旨在提供这样的细胞培养用培养基的制造方法、及使用所述培养基的细胞培养方法。
【用于解决课题的手段】
本发明人，首先，期待缓冲作用的强化而尝试了用比细胞培养推荐的浓度高的HEPES浓度的细胞培养。结果，如担心，细胞的生长变恶。一方面得知，在用高的HEPES浓度培养时随着细胞的生长变差而培养基的渗透压超最适范围。基于涉及的见解，鉴于上述课题进行锐意探讨的结果，发现即使在高浓度的HEPES环境下培养时也可通过将渗透压调整到最适范围内而抑制毒性的表达，从而完成本发明。即，本发明如下。
[1]细胞培养用培养基，其以30mM以上的浓度含有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，并且，渗透压是340mOsm/kg以下。
[2]上述[1]所述的培养基，其中渗透压是220mOsm/kg以上。
[3]上述[1]或[2]所述的培养基，其中HEPES浓度是190mM以下。
[4]上述[1]～[3]之任一项所述的培养基，其中HEPES浓度是30mM以上190mM以下。
[5]上述[1]～[4]之任一项所述的培养基，其中细胞是多能性干细胞。
[6]上述[5]所述的培养基，其中多能性干细胞是iPS细胞。
[7]细胞培养用培养基的制造方法，其包括：向基础培养基中添加HEPES以使其最终浓度为30mM以上，进一步调节渗透压以使其为340mOsm/kg以下。
[8]上述[7]所述的方法，其中渗透压是220mOsm/kg以上。
[9]上述[8]所述的方法，其中渗透压的调整由培养基中的氯化钠浓度的调整实施。
[10]上述[7]～[9]之任一项所述的方法，其中HEPES浓度是190mM以下。
[11]上述[7]～[10]之任一项所述的方法，其中HEPES浓度是30mM以上190mM以下。
[12]上述[7]～[11]之任一项所述的方法，其中细胞是多能性干细胞。
[13]上述[12]所述的方法，其中多能性干细胞是iPS细胞。
[14]细胞的培养方法，其特征在于，用上述[1]～[4]之任一项所述的培养基培养。
[15]上述[14]所述的方法，其中细胞是多能性干细胞。
[16]上述[15]所述的方法，其中多能性干细胞是iPS细胞。
[17]含有细胞的组合物，其含有上述[1]～[4]之任一项所述的培养基和细胞。
[18]上述[17]所述的组合物，其中细胞是多能性干细胞。
[19]上述[18]所述的组合物，其中多能性干细胞是iPS细胞。
[20]细胞的调制方法，其包括在上述[1]～[4]之任一项所述的培养基中培养增殖细胞的工序。
[21]上述[20]所述的方法，其中细胞是多能性干细胞。
[22]上述[21]所述的方法，其中多能性干细胞是iPS细胞。
【发明的效果】
由本发明，由高的HEPES浓度导致的优良的缓冲作用提升pH的稳定性的培养基的提供变得可能。再者，由于由本发明的细胞培养用培养基及细胞培养方法等细胞增殖率的提升变得可能，可得到更多的细胞、特别iPS细胞等的多能性干细胞，为了在研究或医疗等中使用而大量地供给该细胞变得可能。
【附图的简单的说明】
【图1】图1是显示全部剥离1孔内的细胞而悬浮于1ml的培养基而计数的活细胞数的坐标图。(a)使用培养基A1～A3(VTN-N)的培养中的d6时间点的计数(n＝3)、(b)培养基B1～B4(iMatrix)、(c)培养基C1～C4(VTN-N)、(d)使用培养基C1～C4(iMatrix)的培养中的d7时间点的计数(n＝3)。纵轴表示活细胞数，横轴表示培养基的种类。VTN-N表示使用包被rh-VTN-N的培养容器，iMatrix表示使用包被iMatrix-511的培养容器。
【图2】图2是显示培养基更换前刻的培养上清的pH值的坐标图。显示使用培养基B1～B4的培养的结果。纵轴表示pH值，横轴表示培养时间(h)。
【图3】图3是显示使用培养基B1或B3的人iPS细胞培养中的d7时间点的CD30抗原阳性率的坐标图(n＝3)。
【图4】图4是显示对于将使用培养基B1或B3培养3周的人iPS细胞切换为分化培养基进一步培养2周而得到的细胞各自研究未分化标志物及分化标志物的表达量的结果的坐标图(n＝3)。以以培养基B1中培养的细胞的分化培养前的状态作为基准的相对表达量显示。未分化标志物：Nanog、分化标志物：SOX1、SNAI2、SST。
【图5】图5是显示对培养基B1及B3的pH缓冲容量进行测定的结果的坐标图。
【图6】图6是显示培养基更换前刻的培养上清的pH值的坐标图。显示使用培养基B1'或B3'的悬浮培养的结果。纵轴表示pH值，横轴表示培养时间(h)。
【图7】图7是显示对悬浮培养后的细胞悬浮液进行离心分离，除去培养上清，由Accumax处理单细胞化后，用培养基再悬浮而计数的活细胞数的坐标图。使用培养基B1'或B3'的培养中的d4时间点的计数(n＝3)。纵轴表示活细胞数，横轴表示培养基的种类。
【图8】图8是表示研究使用培养基B1'或B3'的人iPS细胞的悬浮培养中的d4时间点的未分化标志物的表达量的结果的坐标图(n＝3)。抗原：CD30抗原、TRA-1-60抗原、SSEA-4抗原。
【图9】图9是显示使用培养基B1'或B3'的人iPS细胞的悬浮培养中的d4时间点的各抗原(表面标志物)阳性率的坐标图(n＝3)。未分化标志物：Nanog、POU5F1。
【图10】图10是显示在包被iMatrix-511的培养容器中使用培养基E1～E4接种人iPS细胞，进行传代培养，对传代每的增加倍率进行测定的结果的坐标图。
【具体实施方式】
以下，对本发明进行说明。在本说明书中使用的用语只要是不特别言及，就具有通常在本领域中使用的含意。
【1.细胞培养用培养基及其制造方法】
本发明提供细胞培养用培养基(以下，有时称为“本发明的培养基”)及该培养基的制造方法(以下，有时称为“本发明的制造方法”)，所述培养基以30mM以上的浓度含有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，并且，渗透压是340mOsm/kg以下。本发明的制造方法，具体而言，通过向基础培养基中添加HEPES以使其最终浓度为30mM以上，进一步调节渗透压以使其为340mOsm/kg以下来实施。在基础培养基作为缓冲剂，含HEPES时，本发明的培养基中的HEPES浓度含基础培养基中所含的HEPES。
在本发明中使用的HEPES的pKa是7.55(20℃)，在大概pH6.8～8.2的范围具有缓冲作用的化合物。由于长时间暴露于光，则呈来源于过氧化氢的毒性(非专利文献2)，避免过氧化氢的发生，HEPES及含HEPES的液体(例，含HEPES的培养基)优选尽可能保存在暗处。本发明的培养基中的HEPES浓度的特征在于，期待由缓冲作用的pH的稳定性的提升而30mM以上的浓度。还优选35mM以上、40mM以上。从渗透压调整的观点来看，本发明的培养基中的HEPES浓度优选为190mM以下。还优选180mM以下，170mM以下，160mM以下，150mM以下，140mM以下，130mM以下，120mM以下，110mM以下，100mM以下。本发明的培养基中的HEPES浓度优选为30mM以上190mM以下。还优选35mM以上180mM以下，40mM以上170mM以下，40mM以上160mM以下，40mM以上150mM以下，40mM以上140mM以下，40mM以上130mM以下，40mM以上120mM以下，40mM以上100mM以下。特别优选为本发明的培养基中的HEPES浓度是40mM以上160mM以下。
在本说明书中，“基础培养基”是指含有细胞的培养必须的碳源、氮源及无机盐等的培养基。在本发明的培养基中可作为其构成成分使用的基础培养基不特别限定，只要是对应于培养的细胞种适宜选择即可。基础培养基可由公知的方法调制，也可使用市售品。
作为能使用的基础培养基，可举出公知的，优选为通常在本领域中使用的动物细胞培养用培养基。例如，可举出Dulbecco改变Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)(DMEM)、HamF12培养基(Ham's Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy5A培养基(McCoy's 5A medium)、最小必须培养基(Minimum Essential Medium)(MEM)、Eagle最小必须培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM)、α改变型Eagle最小必须培养基(αModified Eagle's Minimum Essential Medium)(αMEM)、Roswell Park记念研究所(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI)1640培养基、Iscove改变Dulbecco培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM)、MCDB131培养基、William培养基E(William's Medium E)、Fisher培养基(Fischer's Medium)等。
另外，作为作为特别干细胞(特别是多能性干细胞)的培养用调制本发明的培养基时使用的基础培养基，可举出STEMPRO(注册商标)hESC SFM培养基(Life Technologies公司)、mTeSR1培养基(STEMCELL Technologies公司)、TeSR2培养基(STEMCELL Technologies公司)、TeSR-E8培养基(STEMCELL Technologies公司)、Essential 8培养基(LifeTechnologies公司)、HEScGRO(商标)Serum-Free Medium for hES cells(Millipore公司)、PluriSTEM(商标)Human ES/iPS Medium(EMD Millipore公司)、NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(Biological Industries Israel Beit-Haemek公司)、NutriStem(商标)XF/FF Culture Medium(Stemgent公司)、AF NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(Biological Industries Israel Beit-Haemek公司)、S-medium(DSPharmaBiomedical株式会社)、StemFit(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)、hESF9培养基、hESF-FX培养基、CDM培养基、DEF-CS 500Xeno-Free 3D Spheroid Culture Medium(Cellartis公司)、StemFlex培养基(Thermo Fisher Scientific公司)等。
另外，本发明的培养基，除了基础培养基之外，也可再向细胞增殖添加优选的成分。作为涉及的成分，可举出例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等的糖；天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸等的氨基酸；白蛋白、转铁蛋白等的蛋白质；甘氨酰甘氨酰甘氨酸、大豆肽等的肽；血清；胆碱、维生素A、维生素B组(硫胺素、核黄素、吡哆素、氰基钴胺、生物素、叶酸、泛酸、烟酰胺等)、维生素C、维生素E等的维生素；油酸、花生四烯酸、亚油酸等的脂肪酸；胆甾醇等的脂质；氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钠等的无机盐；锌、铜、硒等的微量元素；N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES))、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine(Tricine))等的缓冲剂；两性霉素B、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素等的抗生物质；Type I胶原、Type II胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸等的细胞接附因子及细胞外基质成分；白细胞介素、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)-α、转化生长因子(TGF)-β、血管内皮生长因子(VEGF)、激活素A等的细胞因子及生长因子；地塞米松、氢化可的松、雌二醇、黄体酮、胰高血糖素、胰岛素等的激素等，可选择使用对应于培养的细胞的种类适合的成分。
本发明的培养基通过向基础培养基中添加HEPES以使其最终浓度为30mM以上，进一步调节渗透压以使其为340mOsm/kg以下来实施。在基础培养基中作为缓冲剂，含HEPES时，添加减去该分的量的HEPES。本发明的培养基向基础培养基中添加HEPES以使其最终浓度为30mM以上来制造。优选还使最终浓度成为35mM以上、40mM以上。从渗透压调整的观点来看，向基础培养基添加HEPES优选以最终浓度成为190mM以下的方式实施。还优选180mM以下，170mM以下，160mM以下，150mM以下，140mM以下，130mM以下，120mM以下，110mM以下，100mM以下。本发明的培养基通过向基础培养基中添加HEPES以使其最终浓度为30mM以上190mM以下来制造。还优选35mM以上180mM以下，40mM以上170mM以下，40mM以上160mM以下，40mM以上150mM以下，40mM以上140mM以下，40mM以上130mM以下，40mM以上120mM以下，40mM以上100mM以下。特别优选为，本发明的培养基通过向基础培养基中添加HEPES以使其最终浓度为40mM以上160mM以下来制造。
在优选的一实施方式中，也可向本发明的培养基追加添加D-葡萄糖及5种氨基酸(色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸(或者胱氨酸)、甲硫氨酸、精氨酸)。这些成分的添加量也可参考以下的“2.细胞的培养方法”中的对应记载，根据培养的目的或各种培养条件(例、细胞密度、培养基更换的频度)等适宜设定。
另外，在将本发明的培养基适用于干细胞(特别是多能性干细胞)时，也可在优选的一实施方式中，向本发明的培养基追加添加bFGF和/或胆碱。
本发明的培养基的特征在于，以至今推荐的浓度以上的浓度含有HEPES的同时，渗透压调整到最适范围。
培养基的渗透压的测定使用公知的方法即可，在渗透压的测定原理中，有沸点升高法、蒸气压降低法、冰点降低法等。作为测定装置，使用由冰点降低法或蒸气压降低法的间接测定、隔膜式的渗透压测定装置。本发明的培养基只要是以至今推荐的浓度以上的浓度含有HEPES的同时，渗透压调整到最适范围，渗透压的测定原理/测定装置就不特别限定，至少，由冰点降低法的测定原理测定的渗透压、具体而言，由实施例中记载的方法测定的渗透压调整到一定的范围。由冰点降低法的测定原理测定的本发明的培养基的渗透压只要是340mOsm/kg以下，就不特别限定，优选为330mOsm/kg以下，更优选为320mOsm/kg以下，特别优选为310mOsm/kg以下，更优选是300mOsm/kg以下。另外，渗透压的下限只要是上限如上述，就不特别限定，通常220mOsm/kg、优选为230mOsm/kg、更优选为240mOsm/kg、特别优选为250mOsm/kg。在一实施方式中，本发明的培养基的渗透压可设为通常220～340mOsm/kg、优选为230～330mOsm/kg、更优选为240～320mOsm/kg、再优选为250～310mOsm/kg、特别优选为250～300mOsm/kg。在本发明的别的一实施方式中，本发明的培养基的渗透压是238～340mOsm/kg。
在调整培养基的渗透压中，可举出例如，能减少贡献于渗透压的升高的培养基成分(HEPES以外)的量的方法。例如，只要是通过使基础培养基中的氯化钠等的成分的量适量减少，使渗透压降低至期望的水平即可。在作为HEPES以外的贡献于渗透压的升高的培养基成分，可使用氯化钠时，通常以最终浓度0～150mM的范围添加到培养基中。优选为最终浓度2～145mM、更优选为3～140mM、更优选以3～130mM的浓度范围使用氯化钠。或者，即使通过将基础培养基用适量的水稀释，也可容易地进行渗透压的调整。
可适用本发明的培养基的细胞种不特别限定。作为涉及的细胞种，可举出植物细胞及动物细胞，优选为动物细胞。作为动物细胞，含例如，精子或卵子等的生殖细胞、构成生物体的体细胞、干细胞(多能性干细胞等)、前体细胞、从生物体分离的癌细胞、从生物体分离而获得永生化能而在体外稳定而维持的细胞(细胞株)、从生物体分离而人为形成基因改变的细胞、从生物体分离而人为更换核的细胞等。作为构成生物体的体细胞的例，尽管不限于下列的，含成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、周皮细胞、树突细胞、角质化细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经系细胞、神经胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、微神经胶质、星状胶细胞、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如，平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰腺β细胞、黑色素细胞、造血前体细胞(例如，来源于脐带血的CD34阳性细胞)、及单核细胞等。所述体细胞含从例如皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰腺、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液(含脐带血)、骨髓、心脏、眼、脑或神经组织等的任意的组织采集的细胞。
干细胞是指兼备复制自身的能力和分化为其他多个系统的细胞的能力的细胞，作为其例，尽管不限于下列的，含胚性肿瘤细胞、多能性干细胞、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛包干细胞等。
“多能性干细胞”是指具有自身复制能及分化/增殖能，并且具有可向构成生物体的全部组织或细胞分化的能力的细胞。作为多能性干细胞，可举胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、人工多能性干细胞(iPS细胞)、由应激或细胞刺激诱导·挑选的多能性干细胞等。通过对通过核移植体细胞的核而制作的初期胚进行培养而建立的干细胞也作为多能性干细胞优选(Nature,385,810(1997)；Science,280,1256(1998)；NatureBiotechnology,17,456(1999)；Nature,394,369(1998)；Nature Genetics,22,127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14984(1999)；Nature Genetics,24,109(2000))。在本发明中，作为多能性干细胞优选的是iPS细胞。确认为iPS细胞可以起因于iPS细胞的未分化的性质的未分化标志物指标进行。作为未分化标志物，可举出碱性磷酸酶、Oct3/4、Sox2、Nanog、ERas、Esgl等。作为检测这些未分化标志物的方法，可举出检测mRNA的方法(引物或探针的利用)、免疫学检测法(抗体或标记的利用)等。
细胞株是指由生物体外的人为的操作获得无限的增殖能的细胞，作为其例，尽管不限于下列的，含CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)、HCT116、Huh7、HEK293(人胎儿肾细胞)、HeLa(人子宫癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、UT7/TPO(人白血病细胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、HT-29、AE-1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(注册商标)、Vero等。
在优选的一实施方式中，细胞是干细胞、特别多能性干细胞，更优选为iPS细胞。
本发明的培养基也可在液体的状态下提供，另外，在比使用时的浓度浓缩的状态或冷冻干燥的粉末等的固体的状态下调制，使用时用水等的溶剂稀释，或也可溶解或分散于水等的溶剂而使用的实施方式。
【2.细胞的培养方法及细胞的调制方法】
本发明还提供细胞的培养方法(以下，有时称为“本发明的培养方法”)，其特征在于，用本发明的培养基(上述)进行培养。通过使用本发明的培养基，可提升细胞的增殖效率。从而，本发明还提供细胞的调制方法(以下，有时称为“本发明的调制方法”)，其包括在本发明的培养基(上述)中培养增殖细胞的工序。
在本说明书中，“接附培养”是指接附在培养容器，在即使在培养中轻摇培养器，细胞在培养液中也不浮起的状态下培养，具体而言，是指使用进行适宜于细胞接附的表面加工的培养容器或用细胞外基质包被处理的培养容器而支架依赖性地培养的方法。作为包被剂，可举出例如，基质胶(BD Biosciences)、Synthemax(Corning)、明胶、细胞外蛋白质(例如，胶原、层粘连蛋白(例如，层粘连蛋白111、411或511)、乙酰肝素硫酸蛋白聚糖、及巢蛋白等)、或者所述细胞外蛋白质的片段、及这些的组合。
在本说明书中，“悬浮培养”是指在细胞不接附于培养容器的状态下进行的细胞培养方法。悬浮培养是三维培养法的一例。在本发明中，悬浮培养可伴随对于液体培养基的自外部的压力或振动、或者，所述液体培养基中的振荡或旋转操作，也可不伴随。尽管不特别限定，可以不以提升与细胞的接附性的目的人工处理(例如，由细胞外基质等的包被处理)的，或者，人工抑制接附的处理(例如，由聚羟基乙基甲基丙烯酸(poly-HEMA)或2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的聚合物的包被处理)的作为培养容器使用而进行。
作为三维培养法，除了悬浮培养之外，可举出使用软琼脂、甲基纤维素、胶原凝胶作为基质的包埋培养、使用空心纤维型生物反应器或辐射流型生物反应器的培养方法等。
在本说明书中，“高密度培养”是指用比一般的细胞培养中推定的细胞密度(通常密度)高的细胞密度的培养。高密度的基准是，细胞彼此接触即可，可因培养方法(接附培养/悬浮培养)或细胞的种类等而也不同，例如，在对iPS细胞进行悬浮培养时，在本说明书中例示用6×105个细胞/mL以上(优选为2×106个细胞/mL以上)的密度的培养。
细胞培养中的培养基更换的频度，一般而言，综合考虑细胞密度(通常密度/高密度)、培养方法(接附培养/悬浮培养)、培养的细胞种、培养基的组成、培养条件(温度、气体浓度)、更换的培养基的量(全量/一部分的量)、培养基的成本、作业者的生活方式等的多种条件而确定，通常是每2～3天1次、1天1次、或者1天多次(例、2次)程度，在本发明的方法中，也可由这样的频度进行培养基更换。因培养的细胞种而也不同，在细胞成为一常数以上、通常，约80％以上汇合的状态下进行传代，在传代后的细胞培养中，也优选可使用本发明的培养基，另外使用。
一方面，着眼于将培养基的渗透压维持在对于细胞增殖优选的范围这样的本发明的一侧面，也可将渗透压脱离一定水平(340mOsm/kg以下，330mOsm/kg以下，更优选为320mOsm/kg以下，特别优选为310mOsm/kg以下，更优选为300mOsm/kg以下，或者220～340mOsm/kg、优选为230～330mOsm/kg、更优选为240～320mOsm/kg、再优选为250～310mOsm/kg、特别优选为250～300mOsm/kg，或者238～340mOsm/kg)的时间点设定为培养基更换的时机。
作为可适宜地应用本发明的方法的一实施方式，可举出使用生物反应器等的高密度培养。具体而言，在使用生物反应器等进行高密度培养时，可发生起因于多数的细胞的生命活动的培养基的pH的降低。在本发明的培养方法中，由于以使用含有高浓度的HEPES的缓冲能优良的本发明的培养基作为特征，与以往的培养法相比难发生pH的降低。
在本发明的培养方法中，由本发明的培养基的更换可更换使用中的培养基的全量，也可更换一部分(例如，相对于使用中的培养基的全量而10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或者90％等)。对于更换的培养基量，培养基更换后的渗透压只要是可设为适宜于细胞培养的范围(即，340mOsm/kg以下，330mOsm/kg以下，更优选为320mOsm/kg以下，特别优选为310mOsm/kg以下，更优选为300mOsm/kg以下；或者220～340mOsm/kg、优选为230～330mOsm/kg、更优选为240～320mOsm/kg、再优选为250～310mOsm/kg、特别优选为250～300mOsm/kg；或者238～340mOsm/kg)，就不特别限定。
在优选的一实施方式中，也可向本发明的培养基追加添加D-葡萄糖及5种氨基酸(色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸(或者胱氨酸)、甲硫氨酸、精氨酸)。
葡萄糖(或者其盐)可以换算为葡萄糖的浓度而成为通常0.1g/L/天～900g/L/天、优选为1g/L/天～200g/L/天、更优选为1g/L/天～20g/L/天的方式添加到本发明的培养基中。
另外，5种氨基酸(色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸(胱氨酸)、甲硫氨酸及精氨酸)可以相对于培养基，作为色氨酸的浓度(换算为游离体的色氨酸的浓度)，成为通常0.1mg/L/天～11000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天，作为丝氨酸的浓度(换算为游离体的丝氨酸的浓度)，成为通常0.1mg/L/天～425000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天，作为半胱氨酸或胱氨酸的浓度(换算为游离体的半胱氨酸的浓度)，成为通常0.1mg/L/天～280000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天，作为甲硫氨酸的浓度(换算为游离体的甲硫氨酸的浓度)，成为通常0.1mg/L/天～55000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天，作为精氨酸的浓度(换算为游离体的精氨酸的浓度)，成为通常0.1mg/L/天～150000mg/L/天、优选为1mg/L/天～2000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～200mg/L/天的方式添加到本发明的培养基中。
另外，在将本发明的培养方法适用于干细胞时，也可在优选的一实施方式中，向本发明的培养基追加添加bFGF和/或胆碱。
在本发明的培养方法中，培养条件不特别限定，只要是对应于细胞种、细胞密度(通常密度/高密度)、培养方法(接附培养/悬浮培养等)等而选择公知的方法即可。例如，培养温度可通常为25℃～39℃、优选为33℃～39℃。作为二氧化碳浓度，可通常为4体积％～10体积％、优选为4体积％～6体积％。作为氧浓度，可通常为1体积％～25体积％、优选为4体积％～20体积％。
【3.含有细胞的组合物】
本发明还提供含有本发明的培养基(上述)和细胞的含有细胞的组合物(以下，有时称为“本发明的含有细胞的组合物”)。其中，含的细胞是活细胞，在本发明的培养基中成为的培养的对象的细胞。作为该细胞，可举出上述“1.细胞培养用培养基及其制造方法”中例示的。优选为动物细胞、更优选为干细胞、特别优选为多能性干细胞(特别是iPS细胞)。也可为本发明的培养基中的培养前及培养后之任一者的细胞。
接下来，显示实施例，对本发明更详细地进行说明，这些不以任何方式限定本发明的范围。
【实施例】
在本实施例中，渗透压使用GONOTEC公司OSMOMAT(注册商标)030用MilliQ水、100及500mOsmol/kg Calibration Standard(GONOTEC公司)进行校正后测定。本测定装置基于冰点降低法的测定原理。
【实施例1】
【培养基调制】
【不调整渗透压，使HEPES浓度改变的培养基(表1)】
将DMEM/F-12(ThermoFisher SCIENTIFIC,12500)(10g)和MilliQ水、Essential8TM Supplement(ThermoFisher SCIENTIFIC)(10ml)混合。添加NaHCO3水溶液(SigmaAldrich)至成为最终浓度20.75mM，添加HEPES水溶液(Sigma Aldrich)至成为最终浓度15～60mM。使用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸，将pH调整到7.4±0.15。pH使用METTLER TOLEDO公司SevenExcellence于室温测定。
【表1】
| 培养基名 | HEPES最终浓度(mM) | 渗透压(mOsm/kg) |
| A1 | 15 | 292 |
| A2 | 36 | 317 |
| A3 | 60 | 351 |
【进行渗透压调整，使HEPES浓度改变的培养基(表2)】
向StemFit(注册商标)AK03N(味之素株式会社)添加HEPES水溶液至成为最终浓度12～153mM。使用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸而将pH调整到7.4±0.15。此时，以渗透压成为表2中所示的任意的值的方式调整氯化钠浓度。
【表2】
【试验方法】
向包被rh-VTN-N(Gibco(注册商标))或iMatrix-511(nippi)的培养容器添加受试培养基(A1～A3、B1～B4、C1～C4、D1～D4)(1.5ml/孔)、Y-27632(Wako)10μM，以2.0×104或1.3×104个细胞/孔接种人iPS细胞(iPSAcademia日本、201B7株)。培养在37℃、5％CO2的条件下进行。接种起24小时后，更换为未添加Y-27632的受试培养基，其后在1～3天以内进行1次培养基更换。每回在培养基更换前刻采样培养上清，在10分钟以内于室温测定pH。在第6天(d6)或第7天(d7)使用TrypLETMselect CTSTM(Gibco(注册商标))剥离各孔的细胞，将悬浮液中的细胞由生死细胞自动分析仪Vi-CELL(BECKMAN COULTER)进行计数。
【形态观察】
在对于使用不进行渗透压调整地改变HEPES浓度的培养基(A1～A3)时，及在使用由氯化钠浓度进行渗透压调整而改变HEPES浓度的培养基(B1～B4、C1～C4、D1～D4)时，从由共聚焦显微镜(OLYMPUS CKX41)的观察，在任何组中，细胞或集落的形态均未见到大的异常。
【活细胞数】
使用培养基A1～A3的培养中的d6时间点的活细胞数示于图1(a)。见到随着使HEPES浓度变高，即伴随渗透压升高而活细胞数减少的倾向。在添加60mM的HEPES的培养基(A3)中，渗透压升高至351mOsm/kg。使用调整到各种各样的渗透压的培养基B1～B4、C1～C4、D1～D4的培养中的d7时间点的活细胞数示于图1(b)、(c)及(d)。在一边保持渗透压低，一边调制时，在添加43、73mM的HEPES的培养基(B2、B3)中，得到了比12mM(B1)高的活细胞数。在添加153mM的HEPES的培养基(B4)中，渗透压也抑制到310mOsm/kg，得到了充分高的活细胞数。以上证实，即使向培养基添加高浓度的HEPES，通过调节渗透压，抑制细胞毒性而由pH稳定化效果提升细胞增殖率。在显示高的渗透压373mOsm/kg的培养基D4中，与其他组比较而细胞增殖率低。
【pH变化】
在使用培养基B1～B4的细胞培养中，对培养基更换前刻的培养上清的pH进行测定，相对于培养时间标绘而示于图2。见到HEPES浓度越变高，对于培养时间而pH值越稳定的样式。一般而言，细胞数越变多，乳酸产生量增大，pH降低，在活细胞数最多的B2、B3培养基中也显示稳定的pH值，确认到高的缓冲作用。
【未分化率的评价】
向包被iMatrix-511(nippi)的6孔板添加培养基B1及B3(1.5mL/孔)、Y-27632(10μM)，以1.3×104个细胞/孔接种人iPS细胞(201B7株)。培养在37℃、5％CO2的条件下，以n＝3实施。接种起24小时后，更换为未添加Y-27632的培养基，其后在1～3天以内进行1次培养基更换。在第7天，根据以下的程序而进行表面标志物分析。使用Accutase剥离各孔的细胞，将拣取的2.0×105个细胞用缓冲液清洗之后，加20μL的稀释5倍的PE Mouse Anti-HumanCD30(BD PharmingenTM)或PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl(ICFC)Antibody(Biolegend)，静置20分钟。其后用缓冲液清洗数次而使用Guava(注册商标)easyCyteTM流式细胞仪(Luminex)来进行分析。从得到的CD30抗原阳性率(图3)，显示用培养基B1及B3培养的细胞均维持高的未分化率。
【三胚层分化潜力的评价】
对于将使用培养基B1及B3培养3周的iPS细胞(201B7株)切换为分化培养基进一步培养2周而得到的细胞而评价未分化标志物及分化标志物表达量的变化。分化培养根据以下的程序而实施。在分化培养基中使用将通用分化培养基StemFit for Differentiation(味之素株式会社,AS401)和DMEM/F12(1:1)(Thermo Fisher Scientific)以1:4的体积比混合的。对于96孔板(住友Bakelite株式会社、PrimeSurface(注册商标)96Slit-wellPlate)，通过添加悬浮于含10μM的Y-27632的分化培养基的细胞至成为2×104个细胞/孔而使胚层体形成，在37℃、5％CO2的条件下培养2周。培养以n＝3实施。在接种起2天后7成更换为未添加Y-27632的分化培养基，其后在1～3天以内进行1次7成培养基更换。从分化培养前的细胞及分化培养第14天(d14)得到的胚层体，使用Maxwell(注册商标)16LEV simplyRNAPurification Kits(Prω)提取及纯化RNA。再者，使用PrimeScript(注册商标)RT MasterMix(宝生物)进行逆转录。作为未分化标志物，使用Nanog，作为三胚层分化标志物，使用SOX1、SNAI2、SST的SYBR(注册商标)Green用引物，由实时PCR热循环仪评价各基因的表达量。以用培养基B1培养的细胞的分化培养前的状态作为基准的相对表达量示于图4。图4显示，在分化培养前用培养基B3培养的细胞与培养基B1中培养的细胞表达同程度的未分化标志物。另外，确认到由形成胚层体的分化培养而未分化标志物减少，三胚层分化标志物升高的倾向。以上提示培养基B3中培养3周的细胞与培养基B1具有同样的未分化度及三胚层分化潜力。
【pH缓冲容量(缓冲能)的比较】
对于50mL量取的培养基B1或B3，使用自动滴定装置(平沼产业、COM-1600)进行由0.1N盐酸(纯正化学)的滴定。相对于盐酸滴下量的pH值的变化示于图5。在pH 7.4～6.6的范围中，相对于盐酸滴下量而pH直线性地减少，其斜率提示，培养基B3具有B1的约3.5倍的pH缓冲容量。
【实施例2】
【悬浮培养】
以与实施例1同样的方法进行渗透压调整而制作使HEPES浓度改变的培养基B1'及B3'。
【表3】
| 培养基名 | HEPES最终浓度(mM) | 渗透压(mOsm/kg) |
| B1' | 12 | 265 |
| B3' | 71 | 266 |
向30-mL生物反应器(Biott,BWV-S03A)添加培养基B1'及B3'(30mL)、Y-27632(10μM)，接种1.8×107个细胞的iPS细胞(1210B2株)。在37℃、5％CO2的条件下以120rpm的速度搅拌培养。培养以n＝3实施。在接种起2天后及3天后使用未添加Y-27632的培养基进行7成培养基更换。在第2天的培养基更换时测量培养上清的pH(图6)。在接种起4天后由离心分离除去培养上清，由Accumax处理单细胞化后，再悬浮于培养基中，由Vi-CELL测量活细胞数(图7)。对于接种起4天后的细胞，根据以下的程序而进行表面标志物分析。将拣取的细胞样品2×105个细胞用缓冲液清洗之后，各自添加20μL稀释10倍的PE Mouse Anti-Human CD30(BDPharmingenTM)、PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl(ICFC)Antibody(Biolegend)、稀释5倍的Alexa Fluor(注册商标)647Mouse anti-Human TRA-1-60Antigen(BD PharmingenTM)、Alexa Fluor(注册商标)647Mouse IgG1κIsotype Control(BD PharmingenTM)，静置20分钟。其后用缓冲液清洗数次，使用Attune NxT Flow Cytometer(Thermo FisherScientific)进行分析。另行，将拣取的细胞样品2×105个细胞用缓冲液清洗之后，使用BDCytofix/CytopermTM Fixation/PermeablizationKit进行固定处理，各自添加20μL稀释10倍的Alexa Fluor(注册商标)647Mouse anti-SSEA-4(BD PharmingenTM)、Alexa Fluor(注册商标)647Mouse IgG1κIsotype Control(BD PharmingenTM)，静置20分钟。其后用缓冲液清洗数次，同样地进行分析。各标志物阳性率示于图8。对于qPCR测定，作为未分化标志物，使用Nanog及POU5F1的TaqMan探针，以与前项同样的程序实施。以培养基B1'作为基准的各对象基因的相对表达量示于图9。图7显示，在4天的培养中通过使用高浓度含HEPES的培养基(B3')而得到了B1的约1.9倍的活细胞数。另外，图6显示，在第2天时间点培养基B3'保持比B1'上清的pH高。图8～9提示，由于培养基B1'和B3'的各表面标志物阳性率是同程度，及未分化基因表达量是同程度，无由HEPES高浓度化对未分化率的影响。
【实施例3】
【增强缓冲能的Essential 8TM】
通过代替Essential 8TM的基础培养基而使用DMEM/F-12(不含NaCl、HEPES、NaHCO3)(Thermo Fisher Scientific)，向其中添加Essential 8TM Supplement而调制低渗透压Essential 8TM培养基。添加碳酸氢钠至成为最终浓度21mM。再者，以成为表4中所示的HEPES最终浓度、渗透压的方式添加HEPES及氯化钠，得到培养基E1～E4。
【表4】
| 培养基名 | HEPES最终浓度(mM) | 氯化钠最终浓度(mM) | 渗透压(mOsm/kg) |
| E1 | 15 | 94 | 293 |
| E2 | 30 | 84 | 292 |
| E3 | 75 | 48 | 291 |
| E4 | 140 | 1.6 | 292 |
向包被iMatrix-511的6孔板添加培养基E1～E4(1.5mL/孔)、Y-27632(10μM)，以1.3×104个细胞/孔接种人iPS细胞(201B7株)。培养在37℃、5％CO2的条件下，以n＝3实施。接种起24小时后，更换为未添加Y-27632的培养基，其后在1～3天以内进行1次培养基更换。7天后通过使用TrypLETMselectCTSTM剥离各孔的细胞，接种到新的6孔板上来进行传代。从传代每的增加倍率(图10)，含75mM的HEPES的培养基E3显示比含15mM的HEPES的培养基E1高的增加倍率，3次传代累计得到了约7.6倍的活细胞数。以上提示，由HEPES浓度的增加而细胞增殖率提升。
【产业上的利用可能性】
由本发明，由高的HEPES浓度导致的优良的缓冲作用提升pH的稳定性的培养基的提供变得可能。再者，由于由本发明的细胞培养用培养基及细胞培养方法等细胞增殖率的提升变得可能，可得到更多的细胞、特别iPS细胞等的多能性干细胞，为了在研究或医疗等使用而大量地供给该细胞变得可能。本申请以2020年3月25日期申请的特愿2020-054572作为基础，通过其中言及而其内容全部包含在本说明书中。
Claims (22)
1.细胞培养用培养基，其
以30mM以上的浓度含有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，并且
渗透压是340mOsm/kg以下。
2.权利要求1所述的培养基，其中渗透压是220mOsm/kg以上。
3.权利要求1或2所述的培养基，其中HEPES浓度是190mM以下。
4.权利要求1～3之任一项所述的培养基，其中HEPES浓度是30mM以上190mM以下。
5.权利要求1～4之任一项所述的培养基，其中细胞是多能性干细胞。
6.权利要求5所述的培养基，其中多能性干细胞是iPS细胞。
7.细胞培养用培养基的制造方法，其包括：
向基础培养基中添加HEPES以使其最终浓度为30mM以上，
进一步调节渗透压以使其为340mOsm/kg以下。
8.权利要求7所述的方法，其中渗透压是220mOsm/kg以上。
9.权利要求8所述的方法，其中渗透压的调整通过培养基中的氯化钠浓度的调整实施。
10.权利要求7～9之任一项所述的方法，其中HEPES浓度是190mM以下。
11.权利要求7～10之任一项所述的方法，其中HEPES浓度是30mM以上190mM以下。
12.权利要求7～11之任一项所述的方法，其中细胞是多能性干细胞。
13.权利要求12所述的方法，其中多能性干细胞是iPS细胞。
14.细胞的培养方法，其特征在于，用权利要求1～4之任一项所述的培养基进行培养。
15.权利要求14所述的方法，其中细胞是多能性干细胞。
16.权利要求15所述的方法，其中多能性干细胞是iPS细胞。
17.含有细胞的组合物，其含有权利要求1～4之任一项所述的培养基和细胞。
18.权利要求17所述的组合物，其中细胞是多能性干细胞。
19.权利要求18所述的组合物，其中多能性干细胞是iPS细胞。
20.细胞的调制方法，其包括在权利要求1～4之任一项所述的培养基中培养增殖细胞的工序。
21.权利要求20所述的方法，其中细胞是多能性干细胞。
22.权利要求21所述的方法，其中多能性干细胞是iPS细胞。
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