CN102686722B - 脐带衬干细胞及其分离和培养方法和材料 - Google Patents

脐带衬干细胞及其分离和培养方法和材料 Download PDF

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Abstract

本发明描述了能够分化成中胚层谱系和外胚层谱系的细胞的人脐带衬干细胞,及分离、扩充、培养和冷冻保存此类细胞的方法。

Description

脐带衬干细胞及其分离和培养方法和材料

[0001] 对相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2009年9月23日提交的美国申请流水号61/245,123的优先权。认为在先申请的公开内容是本申请公开内容的一部分(并通过提及而将其收入本申请的公开内容)。

发明领域

[0003] 本发明涉及来自人的脐带衬干细胞(umbilical cord lining stem cell, ULSC),且更具体而言,涉及用于分离、培养、扩充、和表征ULSC的方法和材料。

[0004] 发明概述

[0005] 本发明基于来自脐带衬里(lining)的细胞群(称作脐带衬干细胞(ULSC))及用于分离此类细胞的方法和材料的发现。ULSC在细胞表面标志物⑶73、⑶90、⑶105、⑶106、SSEA-4、和STR0-1方面呈阳性,并且缺乏造血细胞表面标志物⑶34、⑶45、和HLA-DR。另外,ULSC表达多能性标志物0ct4和Nanog。ULSC可以增殖,实现至少60次群体加倍。ULSC还具有较宽的分化成生脂、生骨、软骨形成、神经源性、和生心细胞的可塑性和能力。上文所描述的结果表明ULSC可以容易地获得,并且在较短的一段时间中在培养中扩充至治疗相关数目。另外,可以冷冻保存ULSC,使细胞适合于细胞保存,供后来治疗使用。

[0006] 在一方面,本文件的特征在于一种用于自脐带分离ULSC的方法。所述方法包括获得脐带的衬里,其中所述衬里基本上没有血液、静脉组织、和动脉组织;并在存在低葡萄糖生长培养基的情况中将所述衬里的外植体在经纤连蛋白包被的固体基质上培养足以使所述ULSC粘着于所述经纤连蛋白包被的固体基质的时段,所述生长培养基包含15%胎牛血清、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、抗生素(例如,庆大霉素、或青霉素和链霉素)、和选自下组的生长因子:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、和表皮生长因子(EGF)。生长培养基可以进一步包含胰岛素、运铁蛋白、硒、和丙酮酸钠,和(在一些实施方案中)腐胺。在一些实施方案中,生长培养基包含bFGF、LIF、和EGF。每个外植体的上表面可以与固体基质(例如盖玻片)接触。所述方法可以进一步包括清洗粘着于所述经纤连蛋白包被的固体基质的所述细胞。

[0007] 在另一方面,本文件的特征在于一种用于培养ULSC的组合物。所述组合物包含低葡萄糖生长培养基;10%至20%血清;0.7至1.5% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽;1至100ng/mL选自下组的生长因子:bFGF、LIF、和EGF ;和I至3%抗生素。组合物可以进一步包含 0.lmg/mL 至 100mg/mL 胰岛素;0.lmg/mL 至 100mg/mL 运铁蛋白;0.1 μ g/mL 至100 μ g/mL硒;和0.5至1.5%丙酮酸钠。在一些实施方案中,组合物进一步包含0.05 μ g/mL至100 μ g/mL腐胺和Ing/mL至100ng/mL EGF。例如,组合物可以包含15%血清(例如,胎牛血清或人血清);1 % L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽;10ng/mL bFGF ;10ng/mLLIF ;1%抗生素;10mg/mL胰岛素;0.55mg/mL运铁蛋白;和0.5 μ g/mL硒,和任选地,10 μ g/mL 腐胺和 10ng/mL EGF。

[0008] 本文件的特征还在于一种包含纯化的ULSC群和培养基的组合物,其中所述培养基包含低葡萄糖生长培养基;10%至20%血清;0.7至1.5% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽;1至100 ng/mL选自下组的生长因子:bFGF、LIF JPEGF ;和I至3%抗生素,其中所述 ULSC 在 CD105、CD106、CD90、CD73、SSEA-4、和 STRO-1 方面呈阳性,而在 CD45、CD34、⑶19、和HLA-DR方面呈阴性。ULSC表达0CT4和Nanog,而且不表达Sox2。培养基可以进一步包含 0.lmg/mL 至 100mg/mL 胰岛素;0.lmg/mL 至 100mg/mL 运铁蛋白;0.1 μ g/mL 至100 μ g/mL硒;和0.5至1.5%丙酮酸钠,和任选地,0.05 μ g/mL至100 μ g/mL腐胺和lng/mL至100ng/mL EGF。组合物可以进一步包含冷冻保护剂。

[0009] 在另一方面,本文件的特征在于纯化的ULSC群,其中所述细胞在⑶105、⑶106、CD90、CD73、SSEA-4、和 STR0-1 方面呈阳性,在 CD45、CD34、CD19、和 HLA-DR 方面呈阴性,表达0CT4和Nanog,而且不表达Sox2。所述细胞能够分化成中胚层谱系(lineage)(例如,生脂细胞、骨原细胞、软骨形成、和生心细胞)或外胚层谱系(例如,神经源性细胞)的细胞。在一些实施方案中,细胞已经在培养中经历至少50、60、70、80、或90次加倍(doubI ing)。细胞可以包含外源核酸,例如编码多肽的外源核酸。细胞可以纳入支架内。在一些实施方案中,支架是生物可降解的。生物可降解的支架可以由胶原组成。

[0010] 本文件的特征还在于一种用于培养ULSC群的方法,所述方法包括自人脐带获得ULSC 群,其中所述 ULSC 在 CD105、CD106、CD90、CD73、SSEA-4、和 STRO-1 方面呈阳性,在⑶45、⑶34、⑶19、和HLA-DR方面呈阴性,表达0CT4和Nanog,而且不表达Sox2 ;并在存在低葡萄糖生长培养基的情况中培养所述细胞,所述低葡萄糖生长培养基含有10%至20%血清;0.7至1.5%L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽;1至100ng/mL选自下组的生长因子:bFGF、LIF、和EGF ;和I至3%抗生素。低葡萄糖生长培养基可以进一步包含0.lmg/mL至 100mg/mL 胰岛素;0.lmg/mL 至 100mg/mL 运铁蛋白;0.1 μ g/mL 至 100 μ g/mL 硒;和 0.5 至1.5%丙酮酸钠。在一些实施方案中,低葡萄糖生长培养基进一步包含0.05 μ g/mL至100 μ g/mL 腐胺和 Ing/mL 至 100ng/mL EGF。

[0011] 除非另有定义,本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同意义。虽然可以使用本文中所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料来实施本发明,但是下文描述了合适的方法和材料。通过提及而完整收录本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献。在矛盾的情况中,应当以本说明书(包括定义)为准。另外,材料、方法、和例子仅是例示性的,而并不意图为限制性的。

[0012] 本发明的其它特征和优点从详细描述及从权利要求书看会是显而易见的。

[0013] 附图简述

[0014]图1 含有进行关于细胞表面标志物 CD105, CD166, CD19, CD34, HLA-DR, LIN, CD106,CD117, CD133, CD73, CD44, CD45, CD90, HLA-ABC, SSEA-4 和 STR0-1 的 FACS 的产前(左侧小图)或成人(右侧小图)ULSC的柱状图。

[0015] 图2含有来自对NT2对照细胞(第I道)、性腺组织(第2道)、产前脐带组织(第3道)、成人脐带组织(第4道)、产前ULSC传代3 (第5道);产前ULSC传代2 (第6道)、产前ULSC传代I (第7道)、成人ULSC传代I (第8道)、成人ULSC传代2 (第9道)、和成人ULSC传代3 (第10道)中的OCT-4、Nanog、S0X-2、和葡萄糖-6-磷酸的RT-PCR分析的凝胶的代表性图像。

[0016] 各图中相似的参照符号标示相似的元件。

[0017] 发明详述

[0018] 一般而言,本公开内容提供了来自人脐带的纯化的脐带衬干细胞(ULSC)群及用于获得此类细胞的方法和材料。本文中所描述的ULSC具有自我更新和分化成来自多种多样的组织类型的细胞,包括生脂细胞(adipogenic cell)、骨原细胞(osteogenic cell)、软骨形成(chondrogenic)、神经源性细胞(neurogenic cell)、和生心细胞(card1geniccell)的能力。本文中所描述的方法和材料容许将ULSC分离并在小于3周中扩充至治疗有效数目,使所述方法和细胞特别可用于再生医学。也可以修饰ULSC,从而细胞可以生成一种或多种多肽或其它感兴趣的治疗性化合物。

[0019] ULSC的群体和克隆系

[0020] 可以自人脐带的衬里获得纯化的ULSC群。如本文中所使用的,“纯化的”意指群体内至少90%(例如,91,92,93,94,95,96,97,98或99%)的细胞是ULSC0如本文中所使用的,“ULSC” 在 CD105, CD106, CD90, CD73, SSEA-4 和 STR0-1 方面呈阳性、在 CD45, CD34, CD19和HLA-DR方面呈阴性,表达0CT-4和Nanog,而不表达Sox2的人细胞。“ULSC群”指自人脐带样品获得的原代培养物及其未克隆的后代。“克隆系”指源自单细胞的细胞系。如本文中所使用的,“细胞系”指能够在合适的培养条件下在体外自身更新延长的时段的细胞群。然而,术语“系”并不指示细胞可以无限增殖。

[0021] 可以自在知情同意情况下获得的脐带分离ULSC群。通常,在医院或诊所中获得脐带后,将脐带在低温保存溶液,诸如来自B1life Solut1ns (产品目录编号#HTS-FRS)的FRS溶液中放置,并于4° C贮存。为了开始分离ULSC,通过在缓冲液,诸如汉克(Hank)氏基础盐溶液(其没有Mg2+、Ca2+,且无酚)中清洗来除去低温保存溶液。可以将脐带在存在缓冲液的情况中切成横切片,然后可以将横切片在纵向切成两份,同时避免任何静脉或动脉组织。若在切割脐带时将任何血液释放入缓冲液中,则用新鲜缓冲液更换受污染的缓冲液。可以将脐带的纵向部分切开以除去静脉和动脉组织,从而所得的脐带衬里(即,胶状脐带材料)基本上没有静脉和动脉组织。如本文中所使用的,“基本上没有静脉和动脉组织”指示在手工切开情况中已经除去尽可能多的静脉和动脉组织。

[0022] 可以通过将脐带衬里的纵向部分在经纤连蛋白包被的固体基质(例如,塑料培养装置诸如有室的载玻片或培养烧瓶)上培养自切开的脐带衬获得ULSC。可以将脐带衬里的胶状表面放置得与经纤连蛋白包被的固体基质接触,同时可以用固体基质诸如盖玻片覆盖上表面(即,不与经纤连蛋白包被的固体基质接触的表面)。可以添加低葡萄糖(即,(lg/L葡萄糖)生长培养基,并将培养装置温育足以使细胞从脐带衬里迁移至经纤连蛋白包被的固体基质的时间(例如,7至10天)。除非另有指示,将细胞于37° C在包含5%C02的标准气氛中培养。将相对湿度维持于约100%。在ULSC已经粘着于经纤连蛋白包被的固体基质表面后,可以除去盖玻片,并可以将粘着的细胞在缓冲液诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗。

[0023] 可以用于培养ULSC的生长培养基是低葡萄糖Dulbecco氏改良必需培养基(DMEM),其含有维生素(氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟碱、盐酸哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、和i_肌醇)、和非必需氨基酸(甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸)。低葡萄糖DMEM可以补充有10%至20%血清(例如,胎牛血清(FBS)或人血清)、一种或多种抗生素(例如,庆大霉素、青霉素、或链霉素)、和谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽(例如,来自Invitrogen的GlutaMax)。在一个实施方案中,生长培养基可以包含低葡萄糖DMEM,其含有维生素和非必需氨基酸、15%FBS、I至3%抗生素(例如,2%或2X庆大霉素)、和0.7至1.5% (例如,1%)谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽。此类生长培养基可以进一步补充有I至100ng/mL生长因子(例如,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、或表皮生长因子(EGF)。

[0024] 在一些实施方案中,生长培养基进一步包含胰岛素、运铁蛋白、硒、和丙酮酸钠。特别有用的生长培养基可以包含低葡萄糖DMEM,其含有维生素和非必需氨基酸、15%血清、I至3%抗生素(例如,2%或2X庆大霉素)、0.7至1.5%谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽(例如,1%或IXGlutaMax)、I至100ng/mL生长因子(例如,10ng/mL bFGF和10ng/mL LIF)、0.lmg/mL 至 lOOmg/mL 膜岛素(lOmg/mL)、0.lmg/mL 至 lOOmg/mL 运铁蛋白(例如,0.55mg/mL 运铁蛋白 g)、0.I μ g/mL 至 100 μ g/mL 硒(例如,0.5 μ g/mL 硒)、和 0.5至1.5%丙酮酸钠(例如,1%丙酮酸钠)。在一些实施方案中,此类生长培养基进一步包含0.05 μ g/mL至100 μ g/mL腐胺(例如,10 μ g/mL腐胺)和10ng/mL EGF。对于期望无动物(成分)培养基的实施方案中,可以使用人血清(例如,15%人血清)替换胎牛血清。

[0025] 为了传代培养ULSC,可以使用TrypZean (Sigma Chemical C0.)来自固体基质释放细胞。可以将所得的细胞悬浮液沉淀,并用PBS清洗,然后以在生长培养基中的1000个细胞/cm2接种入细胞培养烧瓶中。

[0026] 可以铺板高稀释度的细胞,并使用克隆环(例如,来自Sigma)来分离源自单细胞的单克隆,从而建立ULSC的克隆系。使用胰蛋白酶自克隆环内获得细胞,然后在多孔板(例如,6孔板)的一个孔中再分配。在细胞达到>60%汇合(例如,>70%汇合)后,可以将细胞转移至更大的培养烧瓶 ,用于进一步扩充。

[0027] 可以使用本领域中已知的技术来对ULSC评估存活力、增殖潜力、和寿命(longevity)。例如,可以使用锥虫蓝排阻测定法、荧光素二乙酸酯吸收测定法、或碘化丙啶吸收测定法来评估存活力。可以使用胸苷吸收测定法或MTT细胞增殖测定法来评估增殖。可以通过测定延长培养物的群体加倍的最大数目来评估寿命。

[0028] 可以使用已知的技术在免疫表型上表征ULSC。例如,可以将细胞固定(例如,在低聚甲醛中),透化,并封闭反应性位点(例如,用血清清蛋白),然后与对细胞表面抗原诸如 CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, SSEA-4, STR0-1 和 HLA-DR,或任何其它细胞表面抗原具有结合亲和力的抗体一起温育。可以将抗体可检测标记(例如,在荧光或酶方面)或可以使用可检测标记的二抗来检测。在一些实施方案中,可以使用流式细胞术和经荧光标记的抗体来表征ULSC上的细胞表面抗原。

[0029] 也可以基于一种或多种基因的表达来表征ULSC。用于检测基因表达的方法可以包括例如,测量感兴趣的mRNA或蛋白质的水平(例如,通过Northern印迹、逆转录酶(RT)-PCR、微阵列分析、Western印迹、ELISA、或免疫组织化学染色来进行)。

[0030] 如上文所描述的,ULSC 一般在细胞表面标志物CD105,CD106,CD90,CD73,SSEA-4和STR0-1方面呈阳性,而在⑶45,⑶34,⑶19和HLA-DR方面呈阴性,表达0CT-4和Nanog,而不表达Sox2。如本文中所使用的,短语“不表达”指示与相似条件下加工和分析的合适阳性和阴性对照相比未检出mRNA。可以使用此套细胞表面标志物(其包括⑶19,⑶34,⑶45,CD73, CD90, CD105, CD106, STRO-1, SSEA-4 和 HLA-DR)及 0ct4, Nanog 和 Sox2 的表达概况来鉴定ULSC,并区别ULSC与其它干细胞类型。

[0031] 可以通过在冷冻保护剂诸如二甲亚砜(DMS0,通常10%)中悬浮细胞(例如,多至5x 16个细胞/mL)来冷冻保存ULSC。在一些实施方案中,使用冷冻介质诸如来自B1lifesolut1ns的CryoStor来冷冻保存细胞。在添加冷冻保护剂后,可以将细胞冷冻(例如,至-90° C)。在一些实施方案中,将细胞以受控的速率冷冻(例如,用电子控制或通过将细胞在70%乙醇浴中悬浮,并在液氮贮存罐的蒸汽相中放置。在将细胞冷却至-90° C时,可以将在它们在液氮贮存罐的蒸汽相中放置,用于长期贮存。冷冻保存可以容许长期贮存这些供治疗使用的细胞。

[0032] ULSC 的分化

[0033] ULSC能够分化成多种中胚层谱系细胞,包括生脂细胞、骨原细胞、软骨形成细胞、和生心细胞以及外胚层谱系细胞(例如,神经源性细胞)。如本文中所使用的,“能够分化”意指给定的细胞,或其后代在合适的培养条件下能向分化表型行进。可以使用一种或多种分化剂,包括任何化学品、细胞因子、蛋白质、肽、或任何其它能够诱导细胞分化的物质来诱导分化。分化剂的非限制性例子包括但不限于Ca2+、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(TOGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子(TGF)、细胞因子诸如白介素、干扰素、或肿瘤坏死因子、视黄酸、运铁蛋白、激素(例如,雄激素、雌激素、胰岛素、催乳激素、三碘甲状腺氨酸、氢化可的松(hydrocortisone)、或地塞米松(dexamethasone))、丁酸钠、TPA、DMS0、NMF(N_甲基甲酰胺)、DMF( 二甲基甲酰胺)、或基质元件诸如胶原、层粘连蛋白、或硫酸乙酰肝素。

[0034] 可以使用已知的方法来评估测定ULSC已经分化成特定细胞类型,所述方法包括测量形态学和细胞表面标志物的变化(例如,通过流式细胞术或免疫组织化学)、通过光学或共聚焦显微术来检查形态学、或通过使用诸如PCR或基因表达序型分析等技术来测量基因表达变化。

[0035] 例如,可以使用诱导培养基(例如,AdvanceSTEMTM生骨分化培养基,来自HyClone的产品目录编号SH30881.02或来自Lonza的生骨分化培养基,产品目录编号PT-3002)来诱导ULSC分化成骨原细胞。通常,生骨诱导培养基含有地塞米松、L-谷氨酰胺、抗坏血酸盐、和甘油磷酸(Jaiswal 等,J.B1l.Chem.64(2):295-312 (1997)),和(在一些实施方案中)抗生素诸如青霉素和链霉素。可以测试生骨标志物的存在来检测生骨分化,所述生骨标志物包括但不限于骨桥蛋白(OP)、骨钙蛋白(osteocalcin,0C)、骨粘连蛋白(osteonectin, 0N)、骨唾液蛋白(bone sialoprotein)、和不太远的同源框 5 (DLX5)。也可以通过使用von Kossa染料(Jaiswal等,见上文)和/或菌素红染料(Wan等,Chin.J.Traumatol.5:374-379(2002))(其检出钙沉积物的存在)来检测骨发生。

[0036] 可以使用诱导培养基(例如,来自HyClone的AdvanceSTEMTM生脂分化培养基,产品目录编号SH30886.02 ;或来自Lonza的生脂分化培养基,产品目录编号PT-3004)来诱导ULSC分化成生脂细胞。通常,生脂分化培养基含有人胰岛素、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛(indomethacin)、和3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。例如,可以将ULSC在脂肪生成分化培养基中培养3天(于37° C,5%C02),接着在含有人胰岛素和L-谷氨酰胺的脂肪生成维持培养基(产品目录编号PT-3102A,来自Lonza)中培养I天。在3个完整的诱导/维持周期后,可以将细胞在脂肪生成维持培养基中再培养7天,每2-3天更换培养基。

[0037] 生脂细胞含有可以用油红(oil red)染料显现的充满脂质的脂质体(Conget和 Minguell, J.Cellular Phys1logy 181:67-73,(1999))。此类细胞还含有甘油三酯,其在尼罗红染料的情况中发绿色突光(Fowler和Greenspan, Histochem.Cytochem.33:833-836 (1985))。生脂分化也可以通过测试生脂转录因子PPARy2 (过氧化物酶体增殖物激活受体gamma)和/或CEBPI (CCAAT/增强子结合蛋白alpha)的存在来评估,或者通过诸如免疫组织化学和RT-PCR等方法来评估脂蛋白脂肪酶。

[0038] 可以使用诱导培养基(例如,来自HyClone的AdvanceSTEMTM软骨形成分化培养基,产品目录编号SH30889.02,或来自Lonza的软骨形成分化培养基,产品目录编号PT-3003)来诱导ULSC分化成软骨形成细胞。通常,软骨形成分化培养基含有地塞米松、抗坏血酸盐、丙酮酸钠、脯氨酸、L-谷氨酰胺、和TGF-β 3。软骨形成细胞含有硫酸蛋白聚糖,其可以用阿辛蓝(Alcian Blue)染料显现。此类细胞还含有II型胶原。也可以通过测试聚集蛋白聚糖和/或连接蛋白的存在来评估软骨形成分化。

[0039] 可以使用诱导培养基来诱导ULSC分化成神经源性细胞。通常,神经源性分化培养基含有生长因子诸如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和EGF;或Sonic Hedgehog(SHH)、FGF、和bFGF;EGF或脑衍生的神经营养因子(BDNF)、和神经胶质衍生的神经营养因子(⑶NF))。神经源性分化培养基中还可以包含视黄酸(RA)和抗坏血酸。例如,可以将ULSC在存在腐胺和生长因子(bFGF和EGF、或SHH、FGF8、和bFGF)的培养基的情况中在经纤连蛋白或基质胶包被的板上培养12天,其中从第10天-第12天将RA添加至培养物。在此类培养基中温育12天后,用含有EGF或BDNF、GDNF、和抗坏血酸的培养基替换培养液,并将细胞再温育14天。可以通过测试巢蛋白(neStin)、III类beta-微管蛋白(微管蛋白β _4)、神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP)、神经特异性烯醇酶(NSE)、微管结合蛋白2(ΜΑΡ2)、或半乳糖脑苷脂(GalC)的存在来评估神经源性分化。

[0040] 可以使用诱导培养基来诱导ULSC分化成生心细胞。通常,生心分化培养基含有5-ΑΖΑ-2’-脱氧胞苷(Aza)。可以通过测试心脏标志物诸如结蛋白(demin)、肌钙蛋白1、肌钙蛋白T、或心房钠尿因子(ANF)的存在来评估生心分化。

[0041] 在一些实施方案中,可以将ULSC培养或接种至生物相容的支架上。此类支架可以充当支持多层中的细胞生长的框架。可以将支架塑造成期望的形状以便于形成组织类型。例如,可以将细胞在支架上接种,并诱导分化成骨原细胞或软骨形成细胞,如上文所描述的。

[0042] 通常,支架由胶原或聚合材料形成。生物可降解支架是特别有用的,从而在植入动物中后,支架随时间而被吸收入动物物质中。合适的聚合支架可以由单体诸如乙醇酸、乳酸、延胡索酸丙酯、己内酯、透明质烷、透明质酸及其组合形成。其它支架可以包含蛋白质、多糖、多羟基酸、多正酯、聚酐、聚膦腈、合成聚合物(特别是生物可降解聚合物)及其组合形成。支架还可以包含激素、生长因子、细胞因子、和成形素(例如,视黄酸)、期望的胞外基质分子(例如,纤连蛋白)、或其它材料(例如,DNA、病毒、其它细胞类型等)。见例如美国专利 N0.7,470,537。

[0043] 可以通过将支架在含有ULSC的溶液或悬浮液中浸泡来加载ULSC,或者可以将ULSC输注或注射入支架中。在其它实施方案中,可以通过交联包含期望的聚合物和ULSC的悬浮液,容许ULSC遍及支架分散来形成水凝胶。为了引导期望的结构生长和分化,在适当时,可以将含有ULSC的支架在生物反应器或培养箱中离体培养。在其它实施方案中,可以将含有ULSC的支架直接在宿主动物内在期望培养组织或结构的部位处植入。在又一个实施方案中,可以将含有ULSC的支架在宿主(通常是动物诸如猪)上嫁接,其中它可以生长并成熟,直至准备好使用。

[0044] 修饰的ULSC群

[0045] 可以将ULSC修饰为使得细胞可以生成一种或多种多肽或其它感兴趣的治疗性化合物。为了将分离的细胞修饰为使得生成多肽或其它感兴趣的治疗性化合物,可以将合适的外源核酸投递至细胞。在一些实施方案中,将细胞瞬时转染,这指示外源核酸是附加体的(即,未整合入染色体DNA中)。在其它实施方案中,将细胞稳定转染,即将外源核酸整合入宿主细胞的染色体DNA中。如本文中所使用的,术语“外源的”就核酸和特定细胞而言指并非源自如自然界中找到的所述特定细胞的任何核酸。另外,术语“外源的”包括天然存在的核酸。例如,自人细胞分离的编码多肽的核酸指一旦所述核酸被导入第二人细胞就第二人细胞而言的外源核酸。通常投递的外源核酸是载体的一部分,其中调节原件诸如启动子与感兴趣的核酸可操作连接。

[0046] 可以使用病毒载体诸如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、疱疹病毒、或牛乳头状瘤病毒载体来工程化改造细胞。关于病毒和非病毒载体的综述,见 Kay 等 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:12744-12746 (1997)。也可以使用机械手段诸如脂质体或化学介导的DNA摄取来导入载体。例如,可以通过本领域中已知的方法,包括例如,转染、转化、转导、电穿孔、感染、显微注射、细胞融合、DEAE右旋糖苷、磷酸钙沉淀、脂质体、LIP0FECTIN、脂质体融合、合成阳离子脂质、使用基因枪或DNA载体转运体来将载体导入ULSC中。

[0047] 载体可以包含编码选择标志的核酸。选择标志的非限制性例子包括嘌呤霉素、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo,G418,APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)、和叶黄素-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。此类标志物可用于选择培养中的稳定转化子。

[0048] ULSC也可以具有靶向性基因修饰。用于引入靶向性基因修饰的同源重组方法是本领域中已知的。为了创建同源重组ULSC,可以制备同源重组载体,其中感兴趣的基因在其5’和3’端侧翼有对于靶定细胞的基因组而言内源的基因序列,以容许由载体携带的感兴趣基因与靶定细胞基因组中的内源基因间发生同源重组。其它侧翼核酸序列具有足够的长度,从而与靶定细胞的基因组中的内源基因成功同源重组。通常,载体中包含几千碱基的侧翼DNA (在5’和3’末端)。用于构建同源重组载体的方法和来自重组干细胞的同源重组动物是本领域中公知的(见例如,Thomas 和 Capecchi, Cell 51:503 (1987) ; Bradley, Curr.0pin.B1/Technol.2:823-29(1991);及 PCT 公开文本 Nos.W090/11354, WO 91/01140 及 WO93/04169。

[0049] 组合物和制品

[0050] 本文件的特征还在于含有纯化的ULSC群或ULSC克隆系的组合物和制品。在一些实施方案中,将纯化的ULSC群或克隆系纳入容器(例如,管形瓶或袋)内。在其它实施方案中,组合物或制品中包含培养基(例如,无动物生长培养基)。在又一些实施方案中,组合物或制品可以包含一种或多种冷冻保护剂。在一些实施方案中,可以将ULSC或克隆系配制为药物组合物。

[0051] 一般地,药物组合物包含药学可接受载体、添加剂、或赋形剂,并且为了意图的投递模式,例如静脉内、皮下、或肌肉内施用,或本文中所描述的任何其它施用路径而配制。例如,静脉内施用的药物组合物可以包含生理溶液,诸如生理盐水和水、Ringers乳酸盐、水中的右旋糖、汉克s平衡盐溶液(HBSS)、Isolyte S、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、或无血清细胞培养基(例如,RPMI)。药物组合物还可以包含例如抗细菌剂诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂诸如乙二胺四乙酸;缓冲液诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力(tonicity)的药剂诸如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱诸如氢氯酸或氢氧化钠来调节组合物的pH。

[0052] 药物组合物在加工和贮存条件下应当是稳定的,并且必须提供针对微生物诸如细菌和真菌污染的防护。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂,例如抗生素诸如氨基糖苷类(例如,卡那霉素、新霉素、链霉素、和庆大霉素)、安沙霉素(ansaycin)、和喹诺酮来实现对微生物污染的预防。

[0053] 可以将药物组合物配制成包含一种或多种其它治疗剂。例如,可以将组合物配制成包含一种或多种生长因子和/或一种或多种抗炎剂,包括非类固醇抗炎药、地塞米松或其它类型糖皮质类固醇、PDGF, EGF、成纤维细胞生长因子_2、干细胞因子、骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein, BMP)诸如 BMP-2 或BMP-7、甲基磺酰甲烧(MSM)、葡糖胺、或硫酸软骨素。

[0054] 可以将纯化的ULSC群或克隆ULSC系与包装材料组合并以试剂盒出售。试剂盒中包含的包装材料通常含有描述可以如何将纯化的ULSC群或克隆ULSC系培养、分化、或使用的指令或标签。用于生产此类试剂盒的组分和方法是公知的。

[0055] 制品或试剂盒还可以包含一种或多种用于表征纯化的ULSC群或克隆ULSC系的试剂。例如,试剂可以是用于检测基因诸如0ct4、Nanog、或Sox2表达的核酸探针或引物。可以将此类核酸探针或引物标记(例如,在荧光上或用放射性同位素)以便于检测。试剂也可以是对细胞表面标志物诸如 CD19,CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, STRO-1, SSEA-4或HLA-DR具有特异性结合亲和力的抗体。可以将抗体可检测标记(例如,在荧光或酶方面)。其它组分诸如支架(例如,由胶原组成的支架)也可以包含在组合物或制品中。可以用ULSC接种支架,如上文所描述的。

[0056] 使用ULSC的方法

[0057] 可以使用ULSC群或ULSC克隆系来治疗患有多种病症或损伤的受试者。可以以适合于投递干细胞的多种方式将ULSC或克隆系投递至受试者,包括但不限于口服或胃肠外施用路径诸如静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、鞘内、动脉内、或鼻。在一些实施方案中,可以使用两种或更多种施用路径来投递干细胞。在其它实施方案中,对损伤部位投递细胞。

[0058] 考虑各种因素,诸如总体健康状态、体重、性别、饮食、施用次数和路径、其它药物及任何其它相关因素,内科医生可以确定有效量的ULSC或克隆系。在一些实施方案中,可以对受试者总共投递 500, 000-2,000,000 (例如,500,000 至 I, 000,000; 500,000 至750,000; 750,000 至 I, 000,000; 750,000 至 2,000,000; 750,000 至 I, 500,000; I, 000,000至 2,000,000; I, 000,000 至 I, 500,000;或 I, 500,000 至 2,000,000)个干细胞 /kg 受试者重量。在一些实施方案中,对受试者投递约1.2x 16个ULSCs/kg受试者重量。

[0059] 在一些实施方案中,可以对受试者总共投递500,000-500, 000, 000 (例如,5x

105, 6x 15, 7x 15, 8x 15, 9x 15, Ix 16, 2x 16, 3x 16, 4x 16, 5x 16, 6x 16, 7x

106, 8x 16, 9x 16, Ix 17, 2x 17, 3x 17, 4x 17, 5x 17, 6xl07,7x 17, 8x 17, 9x 17, Ix18, 2x 18, 3x 18, 4x 18,或 5x 18)个 ULSCs/kg 受试者重量。

[0060] 在一些实施方案中,仅对受试者投递ULSC一次。在一些实施方案中,进行多次(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或20或更多)投递。例如,可以在连续几(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、21、28、或31或更多)天的过程里进行多次ULSC投递(例如,每天投递一次达7天或者每隔一天投递一次达7天)。可以对受试者投递ULSC达几个月(例如,每个月投递一次达6个月,或每周投递一次达2个月)。

[0061] 可以在损伤或疾病诊断后的多个时间点对受试者投递ULSC。例如,可以在损伤后立即投递细胞(例如,损伤后发生后I至8诸如1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,5.5,6,6.5,7,7.5或8小时)。可以在损伤发生后小于10 (例如,9,8,7,6,5,4,3,2或I)天对受试者投递细胞。可以在损伤发生后小于6 (例如,5,4,3,2或I)周对受试者投递细胞。在一些实施方案中,可以在损伤发生后多至10年(例如,9,8,7,6, 5,4, 3,2或I)年对受试者投递ULSC。可以在损伤后的任何时间或慢性损伤的过程期间使用本文中所描述的组合物和方法。

[0062] 应当理解,不管部位、部位组合、施用路径、路径组合,对受试者投递治疗有效量的ULSC(或包含ULSC的组合物)。如本文中所使用的,“有效量”或“治疗有效量”的组合物或ULSC是足以对接受组合物或细胞投递的受试者提供有益效果的量。有效量可以是足以实现改善的存活率、更快速的恢复、生命质量的改善、或与受试者状况有关的一种或多种症状的改善或消除的量。

[0063] 给定处理在治疗特定病症或损伤中的功效可以定义为将病症或损伤的一种或多种症状改善至少5% (例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或更多)。在一些情况中,可以自与损伤有关的一种或多种恶化的症状的稳定化来测定用ULSC处理的功效(即,治疗减弱损伤的一种或多种症状的恶化)。可以与另一种治疗,例如针对骨损伤的治疗组合对受试者施用ULSC或含有ULSC的药物组合物。例如,可以对受试者施用一种或多种其它药剂,其对患有骨损伤的受试者提供治疗益处。其它治疗剂包括例如生长因子和/或抗炎剂(例如,非类固醇抗炎药、地塞米松或其它类型的糖皮质类固醇、PDGF, EGF、成纤维细胞生长因子-2、干细胞因子、骨形态发生蛋白(BMP)诸如BMP-2或BMP-7、甲基磺酰甲烷(MSM)、葡糖胺、或硫酸软骨素。可以同时或序贯施用ULSC或药物组合物和一种或多种其它药剂。

[0064] 本发明在以下实施例中进一步描述,所述实施例并不限制权利要求书中描述的本发明的范围。

实施例

[0065] 实施例1-用于培养和扩充ULSC的组合物

[0066] 制备以下组合物以用于培养并扩充ULSC:

[0067] 组合物I (ULSC生长培养基):

[0068] DMEM、低葡萄糖且无酹(产品目录编号11054-020,Invitrogen)

[0069] 15%胎牛血清(FBS),其是得到表征或优质选择(premium select)(产品目录编号SH30611.02, HyClone)的

[0070] IX 或 l%GlutaMAX(产品目录编号 35O5O-O6I, Invitrogen)

[0071] 2X或2%庆大霉素(硫酸庆大霉素60、80、或lOOmg,分别是来自Hospira的产品目录编号0409-3400-01、0409-3401-01、或0409-3402-01 ;或庆大霉素细胞培养物50mg,产品目录编号 I575O-O6O, Invitrogen)

[0072] IX或1%MEM维生素溶液(产品目录编号11120-052,Invitrogen)

[0073] IX 或 1%MEM NEAA(非必需氨基酸)(产品目录编号 11140-050,Invitrogen)。

[0074] 组合物2:

[0075] DMEM低葡萄糖(无酚)

[0076] 15%胎牛血清(FBS),其是得到表征或优质选择的

[0077] IX 或 l%GlutaMAX

[0078] 2X或2%庆大霉素

[0079] IX或1%MEM维生素溶液

[0080] IX 或 1%MEM N EAA

[0081] 10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(产品目录编号1008,CellGenix,重组人 bFGF)

[0082] 10ng/mL白血病抑制因子(LIF)(产品目录编号L5283,Sigma,重组人LIF)。

[0083] 组合物3:

[0084] DMEM低葡萄糖(无酚)

[0085] 15% 人血清 A/B (HS-A/B) (HS-A/B,获自 Sigma,产品目录编号 H4522; AtlantaB1logicals,产品目录编号 S40110;或 Gemini B1Products,产品目录编号 100-512)

[0086] IX 或 l%GlutaMAX

[0087] 2X或2%庆大霉素

[0088] IX或1%MEM维生素溶液

[0089] IX 或 1%MEM NEAA

[0090] 1.0mg/mL胰岛素(人胰岛素,来自酿酒酵母的重组物,产品目录编号19278,Sigma;人胰岛素,来自大肠杆菌的重组物,产品目录编号Huminilin N, Eli Lilyand C0.;或产品目录编号12585-014,Invitrogen, 4mg/mL重组人胰岛素溶液)

[0091] 0.55mg/mL 运铁蛋白(人全运铁蛋白,Meb1pharm C0., Ltd.)

[0092] 0.5 μ g/mL硒(亚硒酸钠,产品目录编号S9133, Sigma)

[0093] IX 或 1% 丙酮酸钠(hybrid-Max,产品目录编号 P3662-100G,Sigma;或 10mM 溶液,产品目录编号S8636-100ML,Sigma)

[0094] 10ng/mL bFGF

[0095] 10ng/mL LIF。

[0096] 组合物4:

[0097] DMEM低葡萄糖(无酚)

[0098] 15% 人血清 A/B

[0099] IX 或 l%GlutaMAX

[0100] 2X或2%庆大霉素

[0101] IX或1%MEM维生素溶液

[0102] IX 或 1%MEMNEAA

[0103] 1.0mg/mL 胰岛素

[0104] 0.55 μ g/mL 运铁蛋白

[0105] 0.5 μ g/mL 硒

[0106] IX或1%丙酮酸钠

[0107] 10 μ g/mL 腐胺(产品目录编号 ΡΘΟΜ,Sigma)

[0108] 10ng/mL bFGF

[0109] 10ng/mL LIF

[0110] lOng/mL表皮生长因子(EGF)(产品目录编号E9644,Sigma,重组人EGF)。

[0111] 实施例2-获得、培养、并扩充ULSC

[0112] 经由IRB批准的方案在来自诊所或医院的适当知情同意的情况下获得脐带(UC)。制备好培养UC的外植体 ,将Iml人纤连蛋白(I μ g/ml,产品目录编号F0895, Sigma)添加至6孔皿(产品目录编号140675,Nunc)的每孔。将经包被的皿于室温保持至少30分钟或者直至外植体准备好培养。在下文所描述的实验中使用其它细胞培养烧瓶,包括T25、T75、和 Τ225 烧瓶(分别为产品目录编号 353109、353136、和 353139,BD Falcon) ;HYPERFlask1700cm2 (产品目录编号10024,Corning);细胞栈(cell stack)(单一或多重)(产品目录编号3268,Corning);和1cm细胞培养皿(产品目录编号150350,Nunc)。在一些实验中,使用细胞培养袋(产品目录编号PL325,OriGen B1medical)。

[0113] 获得约7cmUC,将其于4 ° C放入具有无菌FRS溶液(产品目录编号HTS-FRS1B1life Solut1ns)的50mL管中,并转运至实验室。到达实验室中后,除去FRS溶液,并用汉克氏基础盐(basic salt)溶液(HBBS)(其是Mg2+、Ca2+、且无酚)(产品目录编号SH30588, HyClone)将UC清洗3X。然后,将UC在具有HBSS的10%Betadine溶液中放置I分钟,接着在HBSS中清洗三次或者直至除去所有Betadine。将UC放入具有HBSS的1cm皿中。使用具有10或11号刀口(产品目录编号371619,BD)的切开刀将组织切成0.5-lcm切片。将横截切片放入具有新鲜HBSS的新1cm皿中,并纵向地切开,同时避免静脉和两个动脉。若在切开组织的情况中将任何血液释放入皿中,则用新鲜的HBSS替换受污染的HBSS。将两个纵向部分放入具有新鲜HBSS的新1cm皿中,确保知道胶状材料(脐带衬)的位置。凭借精细镊,将静脉和两个动脉切开出来,并弃去。同样地小心除去静脉和动脉组织,因为此组织会污染具有内皮细胞的培养物。

[0114] 将切开的脐带衬在新鲜的HBSS中放置。获得无菌盖玻片(22mm x 22mm,产品目录编号12-565-28,Nunc)、手术钳(产品目录编号12576-934,VffR)、和6孔板以接种外植体。将组织的一个纵向部分在胶状侧向上的情况中切成3-4条。用精细镊挑起每条,并放入经纤连蛋白包被的6孔板的孔中,胶状侧向下,其中在将外植体放入孔中后吸出人纤连蛋白。将3至4条放入单孔中。将无菌盖玻片小心地放置于脐带衬上方,并将2mL生长培养基放入孔中。在将所有外植体处于适当位置后立即将6孔板于5%0)2和37° C温育。

[0115] 为了建立ULSC,每隔一天实施一半培养基改变,同时小心不干扰盖玻片或外植体。在开始培养后第7天时(并且不长于10天),对外植体周围的区域显现细胞迁移。若存在着实质量的迁移出外植体的细胞,则除去盖玻片和外植体,小心不要干扰粘着的细胞。在除去盖玻片和外植体后,将细胞在PBS (Mg2+、Ca2+、无酚,产品目录编号SH30256,HyClone)中清洗,并用2mL新鲜培养基于37° C补料。培养细胞,直至板是约60%汇合的。

[0116] 为了传代培养ULSC,使用前预热试剂,包括培养基、PBS、人血清A/B型(HS-A/B,获自 Sigma,产品目录编号 H4522;Atlanta B1logicals,产品目录编号 S40110;或 GeminiB1Products,产品目录编号 100-512)、和 TrypZean (产品目录编号 T349_500mL, Sigma)。另外,通过在使用前至少0.5小时将人纤连蛋白添加至烧瓶来制备细胞培养烧瓶。吸出来自要传代培养的细胞的培养基,并用PBS清洗细胞。在除去PBS后,将TrypZean添加至每孔,并将烧瓶在5%C02培养箱中于37° C温育约5分钟。然后,在显微镜下检查细胞以确保留下细胞(cells are lifted)。取出细胞悬浮液,并放入50mL管中。将PBS添加至烧瓶以清洗细胞的剩余部分,然后,放入含有细胞悬浮液的相同的50mL管中。为了停止TrypZean的反应,将FBS (产品目录编号SH30611.02, HyClone)或HS-A/B添加至10%溶液,并旋转混合。将细胞悬浮液以400x g于4° C旋转5分钟以沉淀细胞,然后,将其在5mL培养基中重悬。将人纤连蛋白自培养烧瓶取出,然后将细胞以1000个细胞/cm2在培养基1,2,3或4中接种。可以将细胞的剩余部分(约1x 16个细胞)以2.5x 16个细胞/mL在四个不同的管形瓶中冷冻。

[0117] 使用不超过5xl06个细胞/mL冷冻培养基(CryoStor CS-10,产品目录编号CS-1O1B1life Solut1ns)来冷冻ULSC。将细胞悬浮液以400x g于4° C温育5分钟,然后逐滴添加CS-1O冷冻培养基。在添加和适量的CS-1O后,将细胞等分入冷冻管形瓶中,其在速率控制冷冻器中放置以开始冷冻保存。对于长期贮存,将细胞转移至液氮(LN2)杜瓦瓶。

[0118] 在融化ULSC时,将培养基预热,并培养前将人纤连蛋白在细胞培养烧瓶上包被至少0.5小时。自LN2快速取出冷冻管形瓶,在37° C水浴中放置,并用力摇动。自冷冻管形瓶取出细胞悬浮液,并放在15mL管中。以每分钟ImL的速率逐滴添加预热的培养基以清洗细胞。将细胞悬浮液以400x g于4° C旋转5分钟,并吸出培养基。将细胞团粒在培养基中重悬,并对细胞计数。在自烧瓶取出人纤连蛋白后将细胞以1000个细胞/cm2接种入细胞培养烧瓶中。

[0119] 实施例3-ULSC的表征

[0120] 获得脐带,并作为外植体培养至6孔包被皿上,如实施例2中所描述的。用人纤连蛋白(lμg/ml)处理所有板,除非另有规定。简言之,一旦6孔皿变为60-70%汇合,将脐带衬干细胞(ULSC)用酶分开,并使用ULSC生长培养基(DMEM低葡萄糖(无酚)、得到表征或优质选择的15%FBS、Glutamax(IX或1%)、庆大霉素(2x或2%)、MEM维生素溶液(Ix或1%) JPMEM NEAA (Ix或1%))以每Cm2100个细胞传代至T225烧瓶中。在第3次传代时,在FACS方面获得约8.0x 16个细胞,并在8个不同管中染色以使用16种标志物(⑶105,⑶166,CD19, CD34, HLA-DR, LIN, CD106, CDl 17,CD133, CD73, CD44, CD45, CD90, HLA-ABC, SSEA-4和 STRO-1)分析。如图1 中所显示的,ULSC 在 CD105, CD166, LIN, CD106, CD73, Cd44, CD90, HLA-ABC, SSEA-4 和 STR0-1 方面呈阳性,而在 CD19, CD34, CD45, CD117 和 CD133 方面呈阴性。在成人ULSC中,存在着作为限定的间充质干细胞标志物的标志物STR0-1的上调。白细胞标志物CD45上还有可忽略的升高。通过对照细胞、生殖细胞、产前脐带组织(即,获自自然流产的脐带组织)、和成人脐带组织(即,在分娩足月婴儿后获得的脐带组织)中的RT-PCT来评估OCT-4、Nanog、SOX-2、和葡萄糖-6-磷酸表达。来自产前或成人脐带血液的血液表达0CT-4和Nanog而非Sox2。见图2。对两种类型的脐带的FACS分析表明标志表达的略微变化。

[0121] 在第3次传代时,将细胞分开,并以每孔的50,000个细胞的密度分配至12孔板上以进行心脏分化。神经分化、脂肪分化、生骨分化、软骨细胞分化、和集落形成单位测定法。在每次传代时及对于每次分化,采集等分试样的细胞来对不用条件进行RNA分析。每个分化条件中包括合适的对照。所使用的培养基是上文所描述的ULSC生长培养基。

[0122] 心脏分化使用ULSCs生长培养基来将细胞铺板,并在次日,添加1TM 5_氮杂胞苷以温育24小时。次日,添加新鲜的ULSC生长培养基。在I周时,将细胞用1TM 5-氮杂胞苷再处理24小时,如上文所描述的。在5-氮杂胞苷第一次处理后21天时,收集一些孔以进行RNA分析,并将剩余部分用于ICC。通过肌球蛋白重链、肌钙蛋白1、肌节肌动蛋白、结蛋白、和连接蛋白43染色来确认心脏分化。

[0123] 神经分化-使用ULSC生长培养基的50/50混合物来铺板细胞,并且神经分化培养基由 KO DMEM(Knockout™ DMEM,产品目录编号 10829-018,Invitrogen)、10% 血清替换、Ix MEM维生素、NEAA、Pen Str印、glutaMAX、N2、和ITS预混合物组成。将所有细胞铺板至经基质胶包被的板上。添加至神经培养基的生长因子是20ng/ml bFGF和EGF或SHH(sonichedgehog) (100ng/ml)、FGF8 (100ng/ml)和 bFGF (20ng/ml)。在 24 小时后,将细胞清洗,并用100%神经培养基补料。在7天时,直接对培养添加3uM视黄酸(RA)达连续3天。在第3天,将50%培养基更换成DMEM:F12 (产品目录编号10565,Gibco),其与上文所描述的KODMEM具有相同补充剂。次日,使用100%DMEM: F12神经生长培养基,并如下为了末端分化改变生长因子。将SHH、FGF8和bFGF上的细胞转变成⑶NF(20ng/ml)、BDNF(20ng/ml)、和抗坏血酸(200TM)。对于bFGF+EGF上的细胞,为了末端分化仅除去bFGF。让细胞再进行末端分化达10-14天,同时每3-4天补料。采集一些孔以进行RNA分析,并固定剩余部分已进行ICC。通过巢蛋白、A2B5、04、和β -微管蛋白III染色来确认向神经细胞的分化。

[0124] 脂肪分化-在接种细胞后,让它们变为90%汇合,此时依照制造商的方案将它们转变为Lonza氏生脂分化培养基。诱导3天,并维持2天,总共21天。通过脂肪空泡的油红染色来确认向脂肪的分化。

[0125] 生骨分化-在接种后,让细胞变为90%汇合,此时依照制造商的方案将它们转变为生骨分化培养基达21天。使用茜素红S (其染色钙沉积物)来确认向骨原细胞的分化。

[0126]软骨分化-将细胞以每15ml锥形管500,000个细胞沉淀,并依照制造商的方案用Hyclone软骨形成分化培养基补料28天。使用1%阿辛蓝(其染色硫酸化的蛋白聚糖)来确认软骨细胞分化。

[0127] 集落形成单位测定法:获得20,000个细胞的等分试样,并使用20mLULSC生长培养基来重悬细胞。将1mL等分试样添加至预包被的1cm皿,并标记为对照,10, 000个细胞。将500 μ L等分试样(500个细胞)放入49.5mL培养基中。将细胞重悬,并接种(1mL)入5-10cm皿中。每个1cm皿标记为每个皿100个细胞。在14天时,自培养箱取出皿,用PBS清洗细胞,并添加3%结晶紫。在温育里不需要培养基更换。克隆效力以自总细胞数/皿生成克隆的细胞百分比评估。

[0128] 其它实施方案

[0129] 虽然已经结合前文详述的描述和实施例描述了本发明,但是前述描述和实施例意图例示而不限制本发明的范围,其由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点、和修饰在权利要求书的范围内。

Claims (31)

1.一种用于自脐带分离脐带衬干细胞(ULSC)的方法,所述方法包括: a)获得脐带的衬里,其中所述衬里基本上没有血液、静脉组织、和动脉组织;和 b)在存在含< lg/L葡萄糖的生长培养基的情况中将所述衬里的外植体在经纤连蛋白包被的固体基质上培养足以使所述ULSC粘着于所述经纤连蛋白包被的固体基质的时段,所述生长培养基包含15%胎牛血清、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、抗生素、维生素,非必需氨基酸,和任选地选自下组的生长因子:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、和表皮生长因子(EGF)。
2.权利要求1的方法,所述生长培养基进一步包含胰岛素、运铁蛋白、硒、和丙酮酸钠。
3.权利要求2的方法,所述生长培养基进一步包含腐胺。
4.权利要求3的方法,所述生长培养基包含bFGF、LIFjP EGF。
5.权利要求1的方法,其中所述抗生素是庆大霉素。
6.权利要求1的方法,其中所述抗生素是青霉素和链霉素。
7.权利要求1的方法,其中每个所述外植体的上表面与固体基质接触。
8.权利要求1的方法,所述方法进一步包括清洗粘着于所述经纤连蛋白包被的固体基质的所述细胞。
9.一种用于培养ULSC的组合物,所述组合物包含: a)含< lg/L葡萄糖,维生素,和非必需氨基酸的生长培养基; b) 10%至20%的胎牛血清或人血清; c) 0.7至1.5% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽; d)任选地I至lOOng/mL选自下组的生长因子:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、和表皮生长因子(EGF);和 e)l至3%抗生素。
10.权利要求9的组合物,其进一步包含: f)0.lmg/mL 至 100mg/mL 胰岛素; g)0.lmg/mL 至 100mg/mL 运铁蛋白; h) 0.1 μ g/mL 至 100 μ g/mL 砸;和 i)0.5至1.5%丙酮酸钠。
11.权利要求10的组合物,其进一步包含0.05 μ g/mL至100 μ g/mL腐胺。
12.权利要求10的组合物,所述组合物包含15%血清;1%所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽;10ng/mL bFGF、10ng/mL LIF ; I %所述抗生素;10mg/mL 胰岛素;0.55mg/mL运铁蛋白;和0.5 μ g/mL硒。
13.权利要求12的组合物,其进一步包含10 μ g/mL腐胺和10ng/mL EGF。
14.一种包含纯化的ULSC群和培养基的组合物,其中所述培养基包含含< lg/L葡萄糖,维生素,和非必需氨基酸的生长培养基;10%至20%胎牛血清或人血清;0.7至1.5%L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽;任选地I至100 ng/mL选自下组的生长因子:bFGF、LIFJ EGF;和 I 至 3%抗生素,其中所述 ULSC 在 CD105、CD106、CD90、CD73、SSEA-4、和STRO-1方面呈阳性,而在⑶45、⑶34、⑶19、和HLA-DR方面呈阴性。
15.权利要求14的组合物,其中所述培养基进一步包含0.lmg/mL至100mg/mL胰岛素;.0.lmg/mL 至 100mg/mL 运铁蛋白;0.1 μ g/mL 至 100 μ g/mL 硒;和 0.5 至 1.5%丙酮酸钠。
16.权利要求15的组合物,其中所述培养基进一步包含0.05 μ g/mL至100 μ g/mL腐胺和Ing/mL至100ng/mL表皮生长因子。
17.权利要求14的组合物,其中所述组合物进一步包含冷冻保护剂。
18.一种纯化的脐带衬干细胞群,其中所述细胞在CD105、CD106、CD90、CD73、SSEA-4、和STRO-1方面呈阳性,在⑶45、⑶34、⑶19、和HLA-DR方面呈阴性,表达0CT4和Nanog,而且不表达Sox2。
19.权利要求18的纯化的ULSC群,其中所述细胞能够分化成生脂细胞、骨原细胞、软骨形成、和生心细胞。
20.权利要求18的纯化的ULSC群,其中所述细胞已经在培养中经历至少60次加倍。
21.权利要求18的纯化的ULSC群,其中所述细胞已经在培养中经历至少70次加倍。
22.权利要求18的纯化的ULSC群,其中所述细胞已经在培养中经历至少90次加倍。
23.权利要求18的纯化的ULSC群,其中所述细胞包含外源核酸。
24.权利要求23的纯化的ULSC群,其中所述外源核酸编码多肽。
25.权利要求18的纯化的ULSC群,其中所述细胞纳入支架内。
26.权利要求25的纯化的ULSC群,其中所述支架是生物可降解的。
27.权利要求26的纯化的ULSC群,其中所述生物可降解的支架由胶原组成。
28.权利要求18的纯化的ULSC群,其中所述细胞能够分化成神经源性细胞。
29.一种用于培养ULSC群的方法,所述方法包括自人脐带获得ULSC群,其中所述ULSC在 CD105、CD106、CD90、CD73、SSEA-4、和 STR0-1 方面呈阳性,在 CD45、CD34、CD19、和 HLA-DR方面呈阴性,表达0CT4和Nanog,而且不表达Sox2 ;并在存在含< lg/L葡萄糖,维生素,和非必需氨基酸的生长培养基的情况中培养所述细胞,所述低葡萄糖生长培养基含有10%至20%胎牛血清或人血清;0.7至1.5% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽;任选地I至100ng/mL选自下组的生长因子:bFGF、LIFjP EGF ;和I至3%抗生素。
30.权利要求29的方法,其中所述低葡萄糖生长培养基进一步包含0.lmg/mL至100mg/mL 胰岛素;0.lmg/mL 至 100mg/mL 运铁蛋白;0.1 μ g/mL 至 100 μ g/mL 硒;和 0.5 至1.5%丙酮酸钠。
31.权利要求30的方法,其中所述培养基进一步包含0.05 μ g/mL至100 μ g/mL腐胺和Ing/mL至100ng/mL表皮生长因子。
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