ES2559937T3

ES2559937T3 - Células madre de revestimiento del cordón umbilical y métodos y material para aislar y cultivar las mismas

Info

Publication number: ES2559937T3
Application number: ES10819470.5T
Authority: ES
Inventors: Francisco J. Silva; Rafael Gonzalez
Original assignee: Davinci Biosciences LLC
Current assignee: Davinci Biosciences LLC
Priority date: 2009-09-23
Filing date: 2010-09-23
Publication date: 2016-02-16
Anticipated expiration: 2030-09-23
Also published as: MX2012003475A; US8778679B2; CA2774612A1; CA3049393C; CR20120132A; EP2483392A2; US20130065302A1; EP2483392B1; CN102686722A; CA3049393A1; MX337480B; CA2774612C; CN102686722B; WO2011038133A2; IN2012DN02532A; WO2011038133A3; EP2483392A4

Abstract

Un método in vitro para aislar células madre de revestimiento del cordón umbilical (ULSCs) de un cordón umbilical, comprendiendo dicho método a) obtener el revestimiento de un cordón umbilical, en donde el revestimiento está sustancialmente libre de sangre, tejido venoso y tejido arterial; y b) cultivar explantes de dicho revestimiento sobre un sustrato sólido recubierto de fibronectina en presencia de un medio de crecimiento de bajo contenido en glucosa durante un período de tiempo suficiente para que las ULSCs se adhieran a dicho sustrato sólido recubierto de fibronectina, comprendiendo dicho medio de crecimiento suero bovino fetal al 15%, un dipéptido estabilizado de L-alanil-L-glutamina, antibiótico y un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF).

Description

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DESCRIPCION

Celulas madre de revestimiento del cordon umbilical y metodos y material para aislar y cultivar las mismas CAMPO TECNICO

Esta invencion se refiere a celulas madre de revestimiento del cordon umbilical (ULSCs) de seres humanos, y mas particularmente a metodos y materiales para aislar, cultivar, expandir y caracterizar ULSCs.

ANTECEDENTES

El documento WO 2007/046775 A1 describe el aislamiento y cultivo de celulas progenitoras a partir de la membrana amniotica del cordon umbilical, que subsiguientemente pueden ser estimuladas para diferenciarse en fibroblastos y queratinocitos.

El documento WO 2006/019357 A1 describe el aislamiento de celulas progenitoras a partir de la membrana amniotica del cordon umbilical. Estas celulas se cultivan a continuacion en condiciones que permitan la diferenciacion de dichas celulas en celulas epiteliales y/o celulas mesenquimales.

Kita et al. informaron en Stem Cells and Development (abril 2010; 19(4):491-502) sobre la caracterizacion de las celulas madre del cordon umbilical con respecto a patrones de expresion de factores de transcripcion y marcadores de la superficie celular.

SUMARIO

La presente invencion se define por la reivindicacion 1 independiente que describe un metodo para aislar celulas madre de revestimiento de un cordon umbilical a partir de cordon umbilical, y por la reivindicacion 8 independiente que describe una poblacion purificada de celulas madre de revestimiento de cordon umbilical. Las reivindicaciones dependientes describen realizaciones preferidas de la invencion.

Esta invencion se basa en el descubrimiento de una poblacion de celulas del revestimiento del cordon umbilical, denominada celulas madre de revestimiento del cordon umbilical (ULSCs) y metodos y materiales para aislar este tipo de celulas. Las ULSCs son positivas para marcadores de la superficie celular CD73, CD90, CD105, CD106, SSEA-4 y STRO-1 y carecen de marcadores hematopoyeticos de la superficie celular CD34, CD45 y HLA-DR. Ademas, las ULSCs expresan marcadores pluripotentes Oct4 y Nanog. Las ULSCs se pueden propagar durante al menos 60 duplicaciones de poblacion. Las ULSCs tambien tienen una amplia plasticidad y la capacidad de diferenciarse en celulas adipogenicas, osteogenicas, condrogenicas, neurogenicas y cardiogenicas. Los resultados descritos en esta memoria demuestran que las ULSCs se pueden obtener y expandir facilmente en cultivo a numeros terapeuticamente relevantes en un corto penodo de tiempo. Ademas, las ULSCs se pueden crioconservar, haciendo a las celulas adecuadas para su almacenamiento en bancos de celulas para usos terapeuticos posteriores.

En un aspecto, este documento presenta un metodo para aislar ULSCs de un cordon umbilical. El metodo incluye obtener el revestimiento de un cordon umbilical, en donde el revestimiento esta sustancialmente libre de sangre, tejido venoso y tejido arterial; y cultivar explantes del revestimiento sobre un sustrato solido recubierto de fibronectina en presencia de un medio de crecimiento de bajo contenido en glucosa durante un penodo de tiempo suficiente para que las ULSCs se adhieran al sustrato solido recubierto de fibronectina, en donde el medio de crecimiento incluye suero bovino fetal al 15%, un dipeptido estabilizado de L-alanil-L-glutamina, antibiotico (p. ej., gentamicina, o penicilina y estreptomicina), y un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF) y factor de crecimiento epidermico (EGF). El medio de crecimiento puede incluir, ademas, insulina, transferrina, selenio y piruvato sodico, y en algunas realizaciones, putrescina. En algunas realizaciones, el medio de crecimiento incluye bFGF, LIF y EGF. La superficie superior de cada uno de los explantes puede estar en contacto con un sustrato solido (p. ej., cubreobjetos). El metodo puede incluir, ademas, el lavado de las celulas adheridas al sustrato solido recubierto de fibronectina.

En otro aspecto, este documento presenta una composicion para el cultivo de ULSCs. La composicion incluye un medio de crecimiento con bajo contenido en glucosa; suero al 10% a 20%; 0,7 a 1,5% de un dipeptido estabilizado de L-alanil-L-glutamina; 1-100 ng/mL de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en bFGF, LIF

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y EGF; y de 1 a 3% de un antibiotico. La composicion puede incluir, ademas, 0,1 mg/mL a 100 mg/mL de insulina; 0,1 mg/mL a 100 mg/mL de transferrina; 0,1 pg/mL a 100 pg/mL de selenio; y 0,5 a 1,5% de piruvato sodico. En algunas realizaciones, la composicion incluye, ademas, 0,05 pg/mL a 100 pg/mL de putrescina y 1 ng/mL a 100 ng/mL de EGF. Por ejemplo, la composicion puede incluir suero al 15% (p. ej., suero bovino fetal o suero humano); 1% del dipeptido estabilizado de L-alanil-L-glutamina; 10 ng/mL de bFGF; 10 ng/mL de LIF; 1% del antibiotico; 10 ng/mL de insulina; 0,55 mg/mL de transferrina; y 0,5 pg/mL de selenio y, opcionalmente, 10 pg/mL de putrescina y 10 ng/mL de EGF.

Este documento tambien presenta una composicion que incluye una poblacion purificada de ULSCs y un medio de cultivo, en donde el medio de cultivo incluye un medio de crecimiento con bajo contenido en glucosa; suero al 10% a 20%; 0,7 a 1,5% de un dipeptido estabilizado de L-alanil-L-glutamina; 1-100 ng/mL de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en bFGF, LIF y EGF; y 1 a 3% de un antibiotico, en donde las ULSCs son positivas para CD105, CD106, CD90, CD73, SSEA-4 y STRO-1, y negativas para CD45, CD34, CD19 y HLA-DR. Las ULSCs expresan OCT4 y Nanog, y no expresan SOX2.El medio de cultivo puede incluir, ademas, 0,1 mg/mL a 100 mg/mL de insulina; 0,1 mg/mL a 100 mg/mL de transferrina; 0,1 pg/mL a 100 pg/mL de selenio; y 0,5 a 1,5% de piruvato sodico y, opcionalmente, 0,05 pg/mL a 100 pg/mL de putrescina y 1 ng/mL a 100 ng/mL de EGF. La composicion puede incluir, ademas, un crioconservante.

En otro aspecto, este documento presenta una poblacion purificada de ULSCs, en donde las celulas son positivas para CD105, CD106, CD90, CD73, SSEA-4 y STRO-1, negativas para CD45, CD34, CD19 y HLA-DR, expresan OCT4 y Nanog, y no expresan Sox2. Las celulas son capaces de diferenciarse en celulas de linaje mesodermico (p. ej., celulas adipogenicas, celulas osteogenicas, celulas condrogenicas y cardiogenicas) o de linaje ectodermico (p. ej., celulas neurogenicas). En algunas realizaciones, las celulas han sufrido al menos 50, 60, 70, 80 o 90 duplicaciones en cultivo. Las celulas pueden incluir un acido nucleico exogeno, p. ej., un acido nucleico exogeno que codifica un polipeptido. Las celulas pueden estar alojadas dentro de un armazon. En algunas realizaciones, el armazon es biodegradable. Un armazon biodegradable puede estar compuesto de colageno.

Este documento tambien presenta un metodo para cultivar una poblacion de ULSCs. El metodo incluye obtener una poblacion de ULSCs de cordon umbilical humano, en donde las ULSCs son positivas para CD105, CD106, CD90, CD73, SSEA-4 y STRO-1, negativas para CD45, CD34, CD 19 y HLA-DR, expresan oCt4 y Nanog, y no expresan Sox2; y cultivar las celulas en presencia de un medio de crecimiento con bajo contenido en glucosa, suero al 10% a 20%; 0,7 a 1,5% de un dipeptido estabilizado de L-alanil-L-glutamina; 1-100 ng/mL de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en bFGF, LIF y EGF; y 1 a 3% de un antibiotico. El medio de crecimiento con bajo contenido en glucosa puede incluir, ademas, 0,1 mg/mL a 100 mg/mL de insulina; 0,1 mg/mL a 100 mg/mL de transferrina; 0,1 pg/mL a 100 pg/mL de selenio; y de 0,5 a 1,5% de piruvato sodico. En algunas realizaciones, el medio de crecimiento con bajo contenido en glucosa incluye, ademas, 0,05 pg/mL a 100 pg/mL de putrescina y 1 ng/mL a 100 ng/mL de EGF.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos y expresiones tecnicos y cientfficos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el que se entiende comunmente por un experto ordinario en la tecnica a la que esta invencion pertenece. Aunque pueden utilizarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria para poner en practica la invencion, metodos y materiales adecuados se describen mas adelante. En caso de conflicto, regira la presente memoria descriptiva, incluyendo definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son unicamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Otras caractensticas y ventajas de la invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y de las reivindicaciones.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 contiene histogramas de ULSCs prenatales (paneles de la izquierda) o adultas (paneles de la derecha) sometidos a FACS para los marcadores de superficie celular CD105, cD166, Cd19, CD34, HLA-DR, LIN, CD106, CD117, CD133, CD73, CD44, CD45, CD90, HLA-ABC, SSEA-4 y STRO-1.

La FIG. 2 contiene una imagen representativa de un gel a partir del analisis RT-PCR de OCT-4, Nanog, SOX-2 y glucosa-6-fosfato en celulas control NT2 (pista 1), tejido gonadal (pista 2), tejido de cordon umbilical prenatal (pista 3), tejido de cordon umbilical adulto (pista 4), ULSCs prenatales pasaje 3 (pista 5); ULSCs prenatales pasaje 2 (pista 6), ULSCs prenatales pasaje 1 (pista 7), ULSCs adultas pasaje 1 (pista 8), ULSCs adultas pasaje 2 (pista 9), y ULSCs adultas pasaje 3 (pista 10).

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Los s^bolos de referencia iguales en los diversos dibujos indican elementos iguales.

DESCRIPCION DETALLADA

En general, este documento proporciona poblaciones purificadas de celulas madre de revestimiento del cordon umbilical (ULSCs) de cordon umbilical humano y metodos y materiales para la obtencion de dichas celulas. Las ULSCs descritas en esta memoria tienen la capacidad de auto-renovarse y diferenciarse en celulas de diversos tipos de tejidos, incluyendo celulas adipogenicas, celulas osteogenicas, celulas condrogenicas, neurogenicas y celulas cardiogenicas. Los metodos y materiales descritos en esta memoria permiten aislar y expandir ULSCs a numeros terapeuticamente eficaces en menos de 3 semanas, haciendo que los metodos y las celulas sean particularmente utiles para la medicina regenerativa. Las ULSCs tambien se pueden modificar de manera que las celulas pueden producir uno o mas polipeptidos u otros compuestos terapeuticos de interes.

Poblaciones y Ineas clonales de ULSCs

Poblaciones purificadas de ULSCs pueden obtenerse a partir del revestimiento de un cordon umbilical humano. Tal como se utiliza en esta memoria, "purificadas" significa que al menos 90% (p. ej., 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%) de las celulas dentro de la poblacion son ULSCs. Tal como se utiliza en esta memoria, "ULSCs" se refiere a celulas humanas que son positivas para CD105, CD106, CD90, CD73, SSEA-4 y STRO-1, negativas para CD45, CD34, CD19 y HLA-DR, expresan OCT-4 y Nanog y no expresan Sox2. "Poblacion de ULSC" se refiere al cultivo primario obtenido a partir de la muestra de cordon umbilical humano y la progenie no clonada de la misma. "Lmea clonal" se refiere a una lmea celular derivada de una sola celula. Tal como se utiliza en esta memoria, una "lmea celular" es una poblacion de celulas capaces de renovarse por sf mismas durante penodos prolongados de veces in vitro bajo condiciones de cultivo apropiadas. El termino "lmea", sin embargo, no indica que las celulas puedan propagarse indefinidamente.

Poblaciones de ULSC pueden aislarse a partir de cordones umbilicales obtenidos con consentimiento informado. Tfpicamente, despues de obtener un cordon umbilical en un hospital o clinica, el cordon se coloca en una disolucion de conservacion hipotermica tal como una disolucion de FRS de Biolife Solutions (n° de catalogo HTS-FRS) y se almacena a 4°C. Para comenzar el aislamiento de ULSCs, la disolucion de conservacion hipotermica puede separarse por lavado en un tampon, tal como una disolucion de sal basica de Hank, que este libre de Mg2+, Ca2+ y libre de fenol. El cordon umbilical se puede cortar en secciones transversales en presencia de un tampon, y luego las secciones transversales se puede cortar longitudinalmente en dos trozos, evitando al mismo tiempo cualquier tejido venoso o arterial. Si se libera algo de sangre en el tampon durante el corte el cordon, el tampon contaminado es reemplazado por tampon reciente. Los trozos longitudinales de cordon pueden ser disecados para separar el tejido venoso y arterial de manera que el revestimiento de cordon resultante (es decir, el material de cordon gelatinoso) este sustancialmente libre de tejido venoso y arterial. Tal como se utiliza en esta memoria, "sustancialmente libre de tejido venoso y arterial" indica que con una diseccion manual se ha separado lo mas posible tejido venoso y arterial visible.

Las ULSCs se pueden obtener del revestimiento de cordon diseccionado mediante el cultivo de trozos longitudinales de revestimiento de cordon sobre un sustrato solido recubierto de fibronectina (p. ej., un dispositivo de cultivo de plastico tal como un matraz de deslizamiento o de cultivo con camaras). La superficie gelatinosa del revestimiento del cordon se puede colocar en contacto con el sustrato solido recubierto de fibronectina, mientras que la superficie superior (es decir, la superficie no en contacto con el sustrato solido recubierto de fibronectina) puede ser cubierta con un sustrato solido, tal como un cubreobjetos. Se puede anadir medio de crecimiento con bajo contenido en glucosa (es decir, < 1 g/L de glucosa) y el dispositivo de cultivo se puede incubar durante un tiempo suficiente para que las celulas migren desde el revestimiento del cable al sustrato solido recubierto de fibronectina (p. ej., 7 a 10 dfas). A menos que se indique lo contrario, las celulas se cultivan a 37°C en una atmosfera estandar que incluye 5% de CO2. La humedad relativa se mantiene a aproximadamente 100%. Despues de que las ULSCs se hayan adherido a la superficie del sustrato solido recubierto de fibronectina, el cubreobjetos se puede retirar, y las celulas adheridas se pueden lavar en un tampon tal como solucion salina tamponada con fosfato (PBS).

Un medio de crecimiento que puede utilizarse para el cultivo de ULSCs es medio esencial modificado por Dulbecco (DMEM) con bajo contenido en glucosa que contiene vitaminas (cloruro de colina, pantotenato de D-calcio, acido folico, nicotinamida, hidrocloruro de piridoxal, riboflavina, hidrocloruro de tiamina e i-inositol), y aminoacidos no esenciales (glicina, L-alanina, L-asparagina, acido L-aspartico, acido L-glutamico, L-prolina y L-serina). DMEM con bajo contenido en glucosa puede ser suplementado con suero al 10% a 20% (p. ej., suero bovino fetal (FBS) o suero humano), uno o mas antibioticos (p. ej., gentamicina, penicilina o estreptomicina) y la glutamina o un dipeptido

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estabilizado de L alanil-L-glutamina (p. ej., GlutaMax de Invitrogen). En una realizacion, un medio de crecimiento puede incluir DMEM con bajo contenido en glucosa que contiene vitaminas y aminoacidos no esenciales, FBS al 15%, antibiotico al 1 a 3% (p. ej., gentamicina al 2% o 2X) y 0,7 a 1,5% (p. ej., 1%) de glutamina o un dipeptido estabilizado de L-alanil-L-glutamina. Un medio de crecimiento de este tipo se puede suplementar, ademas, con 1 a 100 ng/mL de un factor de crecimiento (p. ej., factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF) o factor de crecimiento epidermico (EGF).

En algunas realizaciones, un medio de crecimiento incluye, ademas, insulina, transferrina, selenio y piruvato sodico. Un medio de crecimiento particularmente util puede incluir DMEM con bajo contenido en glucosa que contiene vitaminas y aminoacidos no esenciales, suero al 15%, antibiotico al 1 a 3% (p. ej., gentamicina al 2% o 2X) y 0,7 a 1,5% de glutamina o un dipeptido estabilizado de L-alanil-L-glutamina (p. ej., GlutaMax al 1% o 1X), 1 a 100 ng/mL de un factor de crecimiento (p. ej., 10 ng/mL de bFGF y 10 ng/mL de LIF), 0,1 mg/mL a 100 mg/mL de insulina (10 mg/mL), 0,1 mg/mL a 100 mg/mL de transferrina (p. ej., 0,55 mg/mL de transferrina), 0,1 pg/mL a 100 pg/mL de selenio (p. ej., 0,5 pg/mL de selenio) y 0,5 a 1,5% de piruvato sodico (p. ej., piruvato sodico al 1%). En algunas realizaciones, un medio de crecimiento de este tipo incluye, ademas, 0,05 pg/mL a 100 pg/mL de putrescina (p. ej., 10 pg/mL de putrescina) y 10 ng/mL de EGF. Para realizaciones en las que se desea un medio libre de animales, se puede utilizar suero humano (p. ej., suero humano al 15%) en lugar de suero bovino fetal.

Para subcultivar ULSCs, se puede utilizar TrypZean (Sigma Chemical Co.) para liberar celulas del sustrato solido. La suspension de celulas resultante se puede sedimentar y lavar con PBS, a continuacion sembrar en matraces de cultivo celular en aproximadamente 1000 celulas/cm2en un medio de crecimiento.

Lmeas clonales de ULSCs se pueden establecer mediante la siembra de celulas a una alta dilucion y utilizando anillos de clonacion (p. ej., de Sigma) para aislar colonias individuales procedentes de una sola celula. Las celulas se obtienen de dentro del anillo de clonacion utilizando tripsina. luego se vuelven a sembrar en un pocillo de una placa de multiples pocillos (p. ej., una placa de 6 pocillos). Despues de que las celulas hayan alcanzado > 60% de confluencia (p. ej., > 70% de confluencia), las celulas se pueden transferir a un matraz de cultivo mayor para una expansion adicional.

Las ULSCs se pueden evaluar en cuanto a la viabilidad, el potencial de proliferacion y la longevidad utilizando tecnicas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, la viabilidad se puede evaluar utilizando ensayos de exclusion con azul de tripano, ensayos de captacion de diacetato de fluorescema o ensayos de captacion de yoduro de propidio. La proliferacion puede evaluarse utilizando ensayos de captacion de timidina o ensayos de proliferacion celular MTT. La longevidad se puede evaluar mediante la determinacion del numero maximo de duplicaciones de la poblacion de un cultivo extendido.

Las ULSCs pueden caracterizarse inmunofenotipicamente utilizando tecnicas conocidas. Por ejemplo, las celulas se pueden fijar (p. ej., en paraformaldehudo), permeabilizar y los sitios reactivos se pueden bloquear (p. ej., con albumina de suero), a continuacion, se pueden incubar con un anticuerpo que tiene afinidad de union por un antfgeno de la superficie celular tal como CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, SSEA-4, STRO-1 y HLA-DR o cualquier otro antfgeno de la superficie celular. El anticuerpo se puede marcar de forma detectable (p. ej., por fluorescencia o enzimaticamente) o se puede detectar utilizando un anticuerpo secundario que esta marcado de forma detectable. En algunas realizaciones, los antfgenos de la superficie celular en ULSCs se pueden caracterizar utilizando citometna de flujo y anticuerpos marcados por fluorescencia.

Las ULSCs tambien se pueden caracterizar sobre la base de la expresion de uno o mas genes. Metodos para detectar la expresion del gen pueden incluir, por ejemplo, medir los niveles de ARNm o protema de interes (p. ej., mediante transferencia Northern, PCR con transcriptasa inversa (RT), analisis de micro-matrices, transferencia Western, ELISA o la tincion inmunohistoqmmica).

Tal como se describe en esta memoria, las ULSCs generalmente son positivas para los marcadores de la superficie celular CD105, CD106, CD90, CD73, SSEA-4 y STRO-1, y negativas para CD45, CD34, CD19 y HLA-DR, expresan OCT-4 y Nanog, y no expresan Sox2. Tal como se utiliza en esta memoria, la frase "no expresan" indica que el ARNm no se detecto en comparacion con controles positivos y negativos adecuados procesados y analizados en condiciones similares. Este conjunto de marcadores de la superficie celular, incluyendo CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, STRO-1, SSEA-4 y HLA-DR, y el perfil de expresion para Oct4, Nanog y Sox2 se puede utilizar para identificar ULSCs, y para distinguir ULSCs de otros tipos de celulas madre.

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Las ULSCs se pueden crioconservar suspendiendo las celulas (p.ej., hasta 5 x 106 celulas/mL) en un crioconservante tal como dimetilsulfoxido (DMSo, tipicamente al 10%). En algunas realizaciones, se utiliza un medio de congelacion tal como CryoStor de Biolife solutions para crioconservar las celulas. Despues de anadir crioconservante, las celulas pueden congelarse (p. ej., a -90°C). En algunas realizaciones, las celulas se congelan a una velocidad controlada (p. ej., se controlan electronicamente o mediante la suspension de las celulas en un bano de etanol al 70%) y se colocan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrogeno lfquido. Cuando las celulas se enfnan bruscamente a -90°C, se pueden colocar en la fase lfquida del tanque de almacenamiento de nitrogeno lfquido para almacenamiento a largo plazo. La crioconservacion puede permitir el almacenamiento a largo plazo de estas celulas para uso terapeutico.

Diferenciacion de ULSCs

Las ULSCs son capaces de diferenciarse en una diversidad de celulas del linaje mesodermo, incluyendo celulas adipogenicas, celulas osteogenicas, celulas condrogenicas y celulas cardiogenicas, asf como las celulas del linaje ectodermo (p. ej., celulas neurogenicas). Tal como se utiliza en esta memoria, "capaz de diferenciarse" significa que una celula dada, o su progenie, puede proceder a un fenotipo diferenciado en las condiciones de cultivo apropiadas. La diferenciacion puede ser inducida utilizando uno o mas agentes de diferenciacion, incluyendo cualquier producto qmmico, citoquina, protema, peptido o cualquier otra sustancia que sea capaz de inducir la diferenciacion de una celula. Ejemplos de agentes de diferenciacion no limitantes incluyen, sin limitacion, Ca2+, un factor de crecimiento epidermico (EGF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), un factor de crecimiento transformante (TGF), citoquinas tales como una interleucina, un interferon, o factor de necrosis tumoral, acido retinoico, transferrina, hormonas (p. ej., androgenos, estrogenos, insulina, prolactina, triyodotironina, hidrocortisona o dexametasona), butirato sodico, TPA, DMSO, NMF (N- metilformamida), DMF (dimetilformamida), o elementos de la matriz tales como colageno, laminina sulfato de heparano.

La determinacion de que las ULSCs se han diferenciado en un tipo de celula particular se puede evaluar utilizando metodos conocidos, incluyendo midiendo cambios en la morfologfa y marcadores de la superficie celular (p. ej., mediante citometna de flujo o inmunohistoqmmica), examinando la morfologfa mediante microscopfa optica o confocal o midiendo los cambios en la expresion del gen utilizando tecnicas tales como PCR o el perfilado de la expresion genica.

Por ejemplo, las ULSCs pueden ser inducidas a diferenciarse en celulas osteogenicas utilizando un medio de induccion (p. ej., medio de Diferenciacion Osteogenica AdvanceSTEM™, n° de catalogo SH30881.02 de HyClone o medio de Diferenciacion Osteogenica de Lonza, n° de catalogo PT-3002). Tfpicamente, los medios de induccion osteogenica contienen dexametasona, L-glutamina, ascorbato y p-glicerofosfato (Jaiswal et al, J. Biol Chem 64(2):295-312 (1997)) y en algunas realizaciones, antibioticos tales como penicilina y estreptomicina. La diferenciacion osteogenica se puede detectar mediante ensayos en cuanto a la presencia de marcadores osteogenicos que incluyen, pero no se limitan a osteopontina (OP), osteocalcina (OC), osteonectina (ON), sialoprotema osea y Distal-less homeobox 5 (DLX5). La osteogenesis tambien se puede detectar utilizando la tincion de von Kossa (Jaiswal et al., supra y/o la tincion con rojo de alizarina (Wan et al, Chin. J. Traumatol. 5:374-379 (2002)), que detectan la presencia de depositos de calcio.

Las ULSCs pueden ser inducidas a diferenciarse en celulas adipogenicas utilizando un medio de induccion (p. ej., Medio de Diferenciacion Adipogenica AdvanceSTEM™ de HyClone, n° de catalogo SH30886.02; o Medio de Diferenciacion Adipogenica, n° de catalogo PT-3004, de Lonza). Tfpicamente, los medios de diferenciacion adipogenica contienen insulina humana, L-glutamina, dexametasona, indometacina y 3-isobutil-1-metil-xantina. Por ejemplo, las ULSCs pueden cultivarse en medio de Diferenciacion de Adipogenesis durante 3 dfas (a 37°C, 5% de CO2), seguido de 1 dfa de cultivo en Medio de Mantenimiento de Adipogenesis (n° de catalogo PT-3102A, de Lonza) que contiene insulina humana y L-glutamina. Despues de 3 ciclos completos de induccion/mantenimiento, las celulas pueden ser cultivadas durante 7 dfas adicionales en Medio de Mantenimiento de Adipogenesis, reemplazando el medio cada 2-3 dfas.

Celulas adipogenicas contienen liposomas cargados de lfpidos que pueden ser visualizados con la tincion Oil Red (Conget y Minguell, J. Cellular Physiology 181:67-73, (1999)). Celulas de este tipo tambien contienen trigliceridos que emiten fluorescencia verde con tincion de Rojo Nilo (Fowler y Greenspan, Histochem. Cytochem. 33:833-836 (1985)). La diferenciacion adipogenica tambien se puede evaluar mediante el ensayo en cuanto a la presencia de factores de transcripcion adipogenica PPARy2 (receptor activado por proliferador de peroxisoma activado gamma)

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y/o CEBPa (CCAAT/protema alfa de union al potenciador), o para la lipoprotema lipasa por metodos tales como inmunohistoqmmica y RT-PCR.

Las ULSCs pueden ser inducidas a diferenciarse en celulas condrogenicas utilizando un medio de induccion (p. ej., Medio de Diferenciacion Condrogenica AdvanceSTEM™ de HyClone, n° de catalogo SH30889.02, o Medio de Diferenciacion Condrogenica de Lonza, n° de catalogo PT-3003). ^picamente, los medios de diferenciacion condrogenica contienen dexametasona, ascorbato, piruvato sodico, prolina, L-glutamina y TGF-p3. Celulas condrogenicas contienen sulfato proteoglicanos que pueden ser visualizados con tincion Azul de Alcian. Celulas de este tipo tambien contienen colageno de Tipo II. La diferenciacion condrogenica tambien se puede evaluar mediante el ensayo en cuanto a la presencia de agrecano y/o protema de enlace.

Las ULSCs pueden ser inducidas a diferenciarse en celulas neurogenicas utilizando un medio de induccion. Tfpicamente, los medios de diferenciacion neurogenica contienen factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) y EGF; o sonic hedgehog (SHH), FGF y bFGF; EGF o factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF) y factor neurotrofico derivado de glia (GDNF)). El acido retinoico (RA) y acido ascorbico tambien se pueden incluir en un medio de diferenciacion neurogenica. Por ejemplo, las ULSCs pueden cultivarse en placas revestidas con fibronectina o Matrigel™ en presencia de medios que contienen putrescina y factores de crecimiento (bFGF y EGF, o SHH, FGF8 y bFGF) durante 12 dfas, en donde RA se anade a los cultivos de los dfas 10-12. Despues de la incubacion en dichos medios durante 12 dfas, los medios pueden ser reemplazados por medios que contienen EGF o BDNF, GDNF y acido ascorbico, y las celulas se pueden incubar durante otros 14 dfas. La diferenciacion neurogenica puede evaluarse mediante ensayo en cuanto a la presencia de nestina, beta-tubulina clase III (tubulina p-4), protema de caracter acido fibrilar glial (GFAP), enolasa neuro-espedfica (NSE), protema asociada a microtubulos 2 (MAP2) o galactocerebrosido (GalC).

Las ULSCs pueden ser inducidas a diferenciarse en celulas cardiogenicas utilizando un medio de induccion. Tfpicamente, los medios de diferenciacion cardiogenica contienen 5-AZA-2'-desoxicitidina (Aza). La diferenciacion cardiogenica se puede evaluar mediante el ensayo en cuanto a la presencia de marcadores cardiacos tales como demin, troponina I, troponina T o factor natriuretico atrial (ANF).

En algunas realizaciones, las ULSCs pueden cultivarse o sembrarse en armazones biocompatibles. Armazones de este tipo pueden actuar como un marco que soporta el crecimiento de las celulas en multiples capas. Los armazones se pueden moldear en la forma deseada para facilitar el desarrollo de tipos de tejidos. Por ejemplo, las celulas pueden ser sembradas en un armazon y pueden ser inducidas a diferenciarse en celulas osteogenicas o celulas condrogenicas tal como se comento anteriormente.

Tfpicamente, el armazon se forma a partir de colageno o un material polimerico. Armazones biodegradables son particularmente utiles, de manera que despues de la implantacion en un animal, el armazon puede ser absorbido en la materia animal con el tiempo. Armazones polimericos adecuados se pueden formar a partir de monomeros tales como acido glicolico, acido lactico, fumarato de propilo, caprolactona, hialuronano, acido hialuronico y combinaciones de los mismos. Otros armazones pueden incluir protemas, polisacaridos, acidos polihidroxilados, poliortoesteres, polianhudridos, polifosfacenos, polfmeros sinteticos (en particular, polfmeros biodegradables) y combinaciones de los mismos. El armazon tambien puede incluir hormonas, factores de crecimiento, citoquinas y morfogenos (p. ej., acido retinoico), moleculas de la matriz extracelular deseadas (por ejemplo, fibronectina), u otros materiales (p. ej., ADN, virus, otros tipos de celulas, etc.). Vease, p. ej., la patente de EE.UU. N° 7.470.537.

Las ULSCs se pueden cargar en el armazon empapando el armazon en una disolucion o suspension que contiene las ULSCs, o las ULSCs se pueden infundir o inyectar en el armazon. En otras realizaciones, se puede formar un hidrogel reticulando una suspension que incluye el polfmero deseado y las ULSCs, permitiendo que las ULSCs se dispersen por todo el armazon. Para dirigir el crecimiento y la diferenciacion de la estructura deseada, el armazon que contiene las ULSCs puede cultivarse ex vivo en un biorreactor o incubadora, segun sea apropiado. En otras realizaciones, el armazon que contiene las ULSCs puede ser implantado dentro de un animal huesped directamente en el sitio en el que se desea que crezca el tejido o la estructura. En todavfa otra realizacion, el armazon que contiene las ULSCs puede ser injertado en un huesped (tfpicamente un animal tal como un cerdo), en donde puede crecer y madurar hasta que este listo para su uso.

Poblaciones modificadas de ULSCs

Las ULSCs pueden ser modificadas de manera que las celulas puedan producir uno o mas polipeptidos u otros compuestos terapeuticos de interes. Para modificar las celulas aisladas de tal manera que se produzca un

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polipeptido u otro compuesto terapeutico de interes, el acido nucleico exogeno apropiado debe ser suministrado a las celulas. En algunas realizaciones, las celulas son transfectadas de forma transitoria, lo que indica que el acido nucleico exogeno es episomal (es decir, no esta integrado en el ADN cromosomico). En otras realizaciones, las celulas son transfectadas de forma estable, es decir, el acido nucleico exogeno esta integrado en el ADN cromosomico de la celula huesped. El termino "exogeno", tal como se utiliza en esta memoria con referencia a un acido nucleico y, en particular, una celula, se refiere a cualquier acido nucleico que no se origina a partir de esa celula particular tal como se encuentra en la naturaleza. Ademas, el termino "exogeno" incluye un acido nucleico que se produce de forma natural. Por ejemplo, un acido nucleico que codifica un polipeptido que es aislado a partir de una celula humana es un acido nucleico exogeno con respecto a una segunda celula humana, una vez que el acido nucleico se introduce en la segunda celula humana. El acido nucleico exogeno que se suministra tfpicamente es parte de un vector en el que un elemento regulador tal como un promotor esta unido operativamente al acido nucleico de interes.

Las celulas pueden tratarse mediante ingeniena genetica utilizando un vector viral tal como un vector de adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), retrovirus, lentivirus, virus vacuna, virus del sarampion, virus herpes o virus del papiloma bovino. Vease, Kay et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12744-12746 (1997) para una revision de los vectores virales y no virales. Un vector tambien puede introducirse utilizando medios mecanicos tales como captacion liposomal o mediada por compuestos qmmicos del ADN. Por ejemplo, un vector puede ser introducido en ULSCs por metodos conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, transfeccion, transformacion, transduccion, electroporacion, infeccion, micro-inyeccion, fusion celular, DEAe dextrano, precipitacion con fosfato de calcio, liposomas, LIPOFECTIN™, fusion de lisosomas, lfpidos cationicos sinteticos, uso de una pistola de genes o un transportador de vectores de ADN.

Un vector puede incluir un acido nucleico que codifica un marcador seleccionable. Ejemplos no limitantes de marcadores seleccionables incluyen puromicina, adenosina desaminasa (ADA), aminoglicosido fosfotransferasa (neo, G418, APH), dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa, timidina quinasa (TK) y xantina- guanina fosforribosiltransferasa (XGPRT). Marcadores de este tipo son utiles para la seleccion de transformantes estables en cultivo.

Las ULSCs tambien pueden tener una modificacion de genes dirigida. Metodos de recombinacion homologa para introducir modificaciones de genes espedficos son conocidos en la tecnica. Para crear ULSCs homologas recombinantes, se puede preparar un vector de recombinacion homologa en el que un gen de interes esta flanqueado en sus extremos 5' y 3' por secuencias de genes que son endogenas al genoma de la celula diana, para permitir que se produzca una recombinacion homologa entre el gen de interes portado por el vector y el gen endogeno en el genoma de la celula diana. Las secuencias de acidos nucleicos flanqueantes adicionales son de longitud suficiente para una recombinacion homologa con exito con el gen endogeno en el genoma de la celula diana. Tfpicamente, varias kilobases de ADN flanqueante (tanto en el extremo 5' como 3') se incluyen en el vector. Metodos para construir vectores de recombinacion homologa y animales recombinantes homologos a partir de celulas madre recombinantes se conocen comunmente en la tecnica (vease, p. ej., Thomas y Capecchi, Cell 51:503(1987); Bradley, Curr. Opin. Bio/Technol. 2:823-29 (91); y Publicaciones PCT N°s. WO 90/11354, WO 91/01140 y WO 93/04169.

Composiciones y Artculos de Manufactura

Este documento tambien presenta composiciones y artmulos de manufactura que contienen poblaciones purificadas de ULSCs o lmeas clonales de ULSCs. En algunas realizaciones, la poblacion purificada de ULSCs o lmea clonal esta alojada dentro de un recipiente (p. ej., un vial o bolsa). En otras realizaciones, un medio de cultivo (p. ej., medio de crecimiento libre de animales) esta incluido en la composicion o artmulo de manufactura. En todavfa otras realizaciones, la composicion o artmulo de manufactura puede incluir uno o mas crioconservantes. En algunas realizaciones, las ULSCs o lmeas clonales se pueden formular como composiciones farmaceuticas.

Generalmente, una composicion farmaceutica incluye un soporte, aditivo o excipiente farmaceuticamente aceptable y se formula para un modo de suministro previsto, p. ej., intravenoso, subcutaneo o intramuscular, o cualquier otra via de administracion descrita en esta memoria. Por ejemplo, una composicion farmaceutica para la administracion intravenosa puede incluir una solucion fisiologica, tal como solucion salina fisiologica y agua, lactato de Ringer, dextrosa en agua, solucion salina equilibrada de Hank (HBSS), Isolyte S, solucion salina tamponada con fosfato (PBS) o medio celular exento de suero (p. ej., RPMI). Las composiciones farmaceuticas tambien pueden incluir, p. ej., agentes antibacterianos tales como alcohol bendlico o metil-parabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como acido etilendiaminotetraacetico; tampones tales como

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acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH de una composicion se puede ajustar con acidos o bases tales como acido clortudrico o hidroxido sodico.

Las composiciones farmaceuticas debenan ser estables bajo las condiciones de elaboracion y almacenamiento y deben preservarse contra la contaminacion potencial por microorganismos tales como bacterias y hongos Una prevencion de la contaminacion por microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, p. ej., antibioticos tales como aminoglucosidos (p. ej., kanamicina, neomicina, estreptomicina y gentamicina), ansaicinas (ansamicinas) y quinalonas.

La composicion farmaceutica puede formularse para que incluya uno o mas agentes terapeuticos adicionales. Por ejemplo, una composicion se puede formular para que incluya uno o mas factores de crecimiento y/o uno o mas agentes anti-inflamatorios, incluyendo farmacos no esteroides anti-inflamatorios, dexametasona u otros tipos esteroides glucocorticoides, PDGf, EGF, factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor de celulas madre, una protema morfogenetica osea (BMP) tal como BMP-2 o BMP-7, metilsulfonilmetano (MSM), glucosamina o sulfato de condroitina.

Poblaciones purificadas de ULSCs o lmeas clonales de ULSC se pueden combinar con material de envasado y venderse como un kit. El material de envasado incluido en un kit contiene tipicamente instrucciones o una etiqueta que describe como se pueden cultivar, diferenciar o utilizar las poblaciones purificadas de ULSCs o lmeas clonales. Componentes y metodos para producir este tipo de kits son bien conocidos.

Un artfculo de manufactura o kit tambien puede incluir uno o mas reactivos para la caracterizacion de una poblacion de ULSCs o una lmea clonal de ULSC. Por ejemplo, un reactivo puede ser una sonda o cebador de acido nucleico para detectar la expresion de un gen tal como Oct4, Nanog o Sox2. Una sonda o cebador de acido nucleico de este tipo puede ser marcado (p. ej., por fluorescencia o con un radioisotopo) para facilitar la deteccion. Un reactivo tambien puede ser un anticuerpo que tiene afinidad de union espedfica para un marcador de la superficie celular tal como CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, STRO-1, SSEA-4 o HLA-DR. Un anticuerpo se puede marcar de forma detectable (p. ej., por fluorescencia o enzimaticamente). Otros componentes tales como un armazon (p. ej., un armazon compuesto de colageno) tambien pueden ser incluidos en una composicion o artmulo de manufactura. El armazon puede sembrarse con ULSCs tal como se describe anteriormente.

Metodos de Uso de ULSCs

Poblaciones de ULSCs o lmeas clonales de ULSCs se pueden utilizar para tratar sujetos que tienen una diversidad de trastornos o lesiones. Las ULSCs o lmeas clonales se pueden suministrar a un sujeto de diversas maneras segun sea apropiado para suministrar celulas madre, incluyendo, pero no limitadas a las vfas de administracion oral o parenteral tales como intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutanea, intratecal, intraarterial o nasal. En algunas realizaciones, se pueden utilizar dos o mas vfas de administracion para suministrar las celulas madre. En otras realizaciones, las celulas se suministran a un sitio de la lesion.

Cantidades eficaces de ULSCs o lmeas clonales se pueden determinar por un medico, teniendo en cuenta diversos factores tales como estado general de la salud, peso corporal, sexo, dieta, tiempo y via de administracion, otras medicaciones y cualesquiera otros factores clmicos relevantes. En algunas realizaciones, entre 500.000 y 2.000.000 (p. ej., 500.000 a 1.000.000; 500.000 a 750.000; 750.000 a 1.000.000; 750.000 a 2.000.000; 750.000 a 1.500.000; 1.000.000 a 2.000.000; 1.000.000 a 1.500.000; o 1.500.000 a 2.000.000) celulas madre/kg de peso del sujeto se pueden suministrar al sujeto en total. En algunas realizaciones, aproximadamente 1,2 x 10° ULSCs/kg de peso del sujeto se suministran al sujeto.

En algunas realizaciones, entre 500.000 y 500.000.000 (p. ej

106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 10

107, 8 x 107, 9 x 107,

1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108 o 5 x 10

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al sujeto en total.

5 x 10° 6 x 10° 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 1 x 106, 2 x

1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x

3) ULSCs/kg de peso del sujeto se pueden suministrar

En algunas realizaciones, las ULSCs se suministran al sujeto solo una vez. En algunas realizaciones, se realizan multiples (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 20 o mas) suministros. Por ejemplo, se pueden realizar multiples suministros de ULSCs en el transcurso de varios (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 14, 21, 28 o 31 o mas) dfas consecutivos (p. ej., un suministro cada dfa durante

siete d^as o un suministro cada dos d^as durante siete dfas). Las ULSCs se pueden suministrar a un sujeto durante varios meses (p. ej., un suministro al mes durante seis meses, o un suministro por semana durante dos meses).

Las ULSCs se pueden suministrar a un sujeto en diversos momentos despues de un diagnostico de lesion o enfermedad. Por ejemplo, las celulas pueden ser suministradas inmediatamente despues de una lesion (p. ej., de 1 5 a 8 tal como 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 u 8 horas despues de que se produzca la lesion). Las celulas se pueden suministrar a un sujeto menos de 10 (p. ej., 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) dfas despues de que se produzca una lesion. Las celulas se pueden suministrar a un sujeto menos de 6 (p. ej., 5, 4, 3, 2 o 1) semanas despues de que se produzca una lesion. En algunas realizaciones, las ULSCs se pueden suministrar a un sujeto hasta 10 (p. ej., 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) anos despues de que se produzca una lesion. Las composiciones y los 10 metodos descritos en esta memoria se pueden utilizar en cualquier momento despues de una lesion o durante el curso de una lesion cronica.

Se entiende que, independientemente del sitio, de la combinacion de sitios, de la via de administracion, de la combinacion de vfas, se suministra al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de ULSCs (o una composicion que incluye las ULSCs). Tal como se utiliza en esta memoria, una "cantidad eficaz" o "cantidad terapeuticamente 15 eficaz" de una composicion o ULSCs es la cantidad que es suficiente para proporcionar un efecto beneficioso al sujeto al que se suministran la composicion o las celulas. La cantidad eficaz puede ser la cantidad eficaz para conseguir una tasa de supervivencia mejorada, una recuperacion mas rapida, una mejora en la calidad de vida, o una mejora o eliminacion de uno o mas smtomas asociados con el estado de un sujeto.

La eficacia de un tratamiento dado en el tratamiento de un trastorno particular o una lesion se puede definir como 20 una mejora de uno o mas smtomas del trastorno o lesion en al menos 5% (p. ej., al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65% o mas). En algunos casos, la eficacia de un tratamiento con ULSCs puede determinarse a partir de la estabilizacion de uno o mas smtomas asociados con el empeoramiento de la lesion (es decir, los tratamientos reducen el empeoramiento de uno o mas smtomas de la lesion). ULSCs o composiciones farmaceuticas que 25 contienen ULSCs se pueden administrar a un sujeto en combinacion con otro tratamiento, p. ej., un tratamiento para una lesion de hueso. Por ejemplo, al sujeto se puede administrar uno o mas agentes adicionales que proporcionan un beneficio terapeutico al sujeto que tiene una lesion de hueso. Agentes terapeuticos adicionales incluyen, p. ej., factores de crecimiento y/o agentes anti-inflamatorios (p. ej., farmacos anti-inflamatorios no esteroides, dexametasona u otros tipos de esteroides glucocorticoides, PDGF, EGF, factor de crecimiento de fibroblastos 2, 30 factor de celulas madre, un protema morfogenetica osea (BMP) tal como BMP-2 o BMP-7, metilsulfonilmetano (MSM), glucosamina o sulfato de condroitina. Las ULSCs o composiciones farmaceuticas y el uno o mas agentes adicionales se pueden administrar al mismo tiempo o secuencialmente.

La invencion se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invencion descrita en las reivindicaciones.

35 EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Composiciones para el Cultivo y la Expansion de ULSCs

Las siguientes composiciones se prepararon para su uso en el cultivo y expansion de ULSCs:

Composicion 1 (Medio de Crecimiento de ULSC):

DMEM, bajo contenido en glucosa y libre de fenol (n° de catalogo 11054-020, Invitrogen) 40 Suero Bovino Fetal (FBS) al 15% que se caracteriza o es de seleccion suprema (n° de catalogo SH30611.02, HyClone)

GlutaMAX 1X o al 1% (n° de catalogo 35050-061, Invitrogen)

Gentamicina 2X o al 2% (sulfato de gentamicina 60, 80 o 100 mg, n° de catalogo 0409-3400-01, 0409-3401-01, 0409-3402-01 o, respectivamente, de Hospira; o cultivo celular de gentamicina 50 mg, n° de catalogo 15750-060, 45 Invitrogen)

Disolucion de vitamina MEM 1X o al 1% (n° de catalogo 11120-052, Invitrogen)

NEAA (aminoacidos no esenciales) de MEM 1X o al 1% (n° de catalogo 11140-050, Invitrogen).

Composicion 2:

DMEM, bajo contenido en glucosa (libre de fenol)

Suero Bovino Fetal (FBS) al 15% que se caracteriza o es de seleccion suprema GlutaMAX 1X o al 1%

Gentamicina 2X o al 2%

5 Disolucion de vitamina MEM 1X o al 1%

NEAA de MEM 1X o al 1%

10 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) (n° de catalogo 1008, CellGenix, bFGF recombinante humano)

10 ng/mL de factor inhibidor de la leucemia (LIF) (n° de catalogo L5283, Sigma, LIF recombinante humano).

10 Composicion 3:

DMEM bajo contenido en glucosa (libre de fenol)

Suero Humano A/B (HS-A/B) al 15% (HS-A/B, obtenido de Sigma, n° de catalogo H4522; Atlanta Biologicals, n° de catalogo S40110, o Gemini BioProducts, n° de catalogo 100-512 )

GlutaMAX 1X o al 1%

15 Gentamicina 2X o al 2%

Disolucion de vitamina MEM 1X o al 1%

NEAA de MEM 1X o al 1%

1.0 mg/mL de insulina (insulina humana, recombinante de S. cerevisiae, n° de catalogo 19278, Sigma; insulina humana, recombinante de E. coli, n° de catalogo Huminilin N, Eli Lily and Co.; o n° de catalogo 12585-014,

20 Invitrogen, 4 mg/mL de disolucion de insulina humana recombinante) 0,55 mg/mL de transferrina (holo-transferrina humana, Mebiopharm Co., Ltd.) 0,5 |jg/mL de selenio (selenita de sodio, n° de catalogo S9133, Sigma) Piruvato sodico 1X o al 1% (hybrid-Max, n° de catalogo P3662-100G, Sigma; o disolucion 100 mM, n° de catalogo S8636-100ML, Sigma)

25 10 ng/mL de bFGF

10 ng/mL de LIF.

Composicion 4:

DMEM bajo contenido en glucosa (libre de fenol)

Suero humano A/B al 15%

30 GlutaMAX 1X o al 1%

Gentamicina 2X o al 2%

Disolucion de vitamina MEM 1X o al 1%

NEAA de MEM 1X o al 1%

1.0 mg/mL de insulina

35 0,55 jg/mL de transferrina

0,5 jg/mL de selenio Piruvato sodico 1X o al 1%

10 jg/mL de putrescina (n° de catalogo P6024, Sigma)

10 ng/mL de bFGF 40 10 ng/mL de LIF.

10 ng/mL de factor de crecimiento epidermico (EGF) (n° de catalogo E9644, Sigma, EGF recombinante humano) Ejemplo 2 - Obtencion, Cultivo y Expansion de ULSCs

Cordones umbilicales (UCs) se obtuvieron a traves de un protocolo aprobado por IRB con el consentimiento informado adecuado en una clinica u hospital. En la preparacion para el cultivo de explantes de UCs, 1 ml de 45 fibronectina humana (1 jg/mL, n° de catalogo F0895, Sigma) se anade a cada uno de los pocillos de una placa de 6 pocillos (n° de catalogo 140675, Nunc).La placa recubierta se mantiene durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente o hasta que los explantes estan listos para el cultivo. Otros matraces de cultivo celular se utilizaron en los experimentos descritos mas adelante, incluyendo matraces T25, T75 y T225 (n° de catalogo 353109, 353136 y 353139, respectivamente, BD Falcon); HYPERFlask 1700 cm2 (n° de catalogo 10024, Corning); pila de celulas,

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sencillo o multiple (n° de catalogo 3268, Corning); y placa de cultivo celular de 10 cm (n° de catalogo 150350, Nunc). En algunos experimentos, se utilizaron bolsas de cultivo celular (catalogo PL325, OriGen Biomedical).

Aproximadamente se obtienen 7 cm de UC, se colocan en un tubo de 50 mL con disolucion esteril de FRS (n° de catalogo HTS-FRS, Biolife Solutions) a 4°C y se transportan al laboratorio. Tras su llegada al laboratorio, se retira la disolucion de FRS y el UC se lava con disolucion de sal basica 3X Hank (HBBS) que es Mg2+, Ca2+, y libre de fenol (n° de catalogo SH30588, HyClone). El UC se coloca entonces en una disolucion de betadine al 10% con HBSS durante 1 minutos, seguido de tres lavados en HBSS o hasta que se haya eliminado toda la betadine. El UC se coloca en una placa de 10 cm con HBSS. El tejido se corta en secciones transversales de 0,5-1 cm utilizando un bisturf con cuchilla de numero de 10 u 11 (n° de catalogo 371619, BD). Las secciones transversales se colocan en una nueva placa de 10 cm con HBSS reciente y se cortan longitudinalmente, evitando al mismo tiempo la vena y las dos arterias. Si no se libera sangre en la placa durante el corte del tejido, la HBSS contaminada se reemplaza por HBSS reciente. Los dos trozos longitudinales se colocan en una nueva placa de 10 cm con HBSS reciente, asegurandose de conocer la ubicacion del material gelatinoso (revestimiento del cordon). Con unas pinzas finas, se diseccionan y se desechan la vena y las dos arterias. Se tiene cuidado de separar la mayor cantidad de tejido venoso y arterial, dado que este tejido contaminara el cultivo con celulas endoteliales.

El revestimiento del cordon diseccionado se coloca en HBSS reciente. Se obtienen cubreobjetos esteriles (22 mm x 22 mm, n° de catalogo 12-565-28, Nunc), pinzas (n° de catalogo 12576-934, VWR) y placas de 6 pocillos para la siembra de los explantes. Un trozo longitudinal de tejido se corta en 3-4 tiras con la parte gelatinosa en la cara superior. Cada una de las tiras se levanta con una pinza fina y se coloca en un pocillo de una placa de seis pocillos revestida con fibronectina, gelatinosa cara abajo, en donde la fibronectina humana es aspirada antes de colocar los explantes en el pocillo. De tres a cuatro tiras se colocan en un solo pocillo. Cubreobjetos esteriles se colocan cuidadosamente en la parte superior del revestimiento del cordon y 2 mL de medio de crecimiento se colocan en el pocillo. La placa de seis pocillos se incuba a 5% de CO2 y 37°C inmediatamente despues de colocar todos los explantes.

Para establecer las ULSCs, se realiza un cambio de la mitad del medio cada dos dfas, teniendo cuidado de no perturbar el cubreobjetos ni los explantes. El dfa 7 despues del comienzo del cultivo (y no mas de 10 dfas) se visualiza la zona alrededor de los explantes en cuanto a la migracion celular. Si existe una cantidad sustancial de celulas que migran fuera de los explantes, el cubreobjetos y los explantes se retiran, teniendo cuidado de no molestar a las celulas adheridas. Despues de retirar los cubreobjetos y los explantes, las celulas se lavan en PBS (Mg2+, Ca2+, libre de fenol, n° de catalogo SH30256, HyClone) y se alimentan con 2 mL de medio reciente a 37°C. Las celulas se cultivan hasta que la placa sea aproximadamente 60% confluente.

Para subcultivar las ULSCs, los reactivos, incluyendo el medio, PBS, suero humano de tipo A/B (HS-A/B, obtenido de Sigma, n° de catalogo H4522; Atlanta Biologicals, n° de catalogo S40110; o Gemini Bioproducts, n° de catalogo 100-512) y TrypZean (n° de catalogo T349-500 mL, Sigma) se precalientan antes de usar. Ademas, los frascos de cultivo celular se preparan anadiendo fibronectina humana al matraz un mmimo de 0,5 horas antes de su uso. Se aspira medio de las celulas que se subcultivan, y las celulas se lavan con PBS. Despues de retirar la PBS, TrypZean se anade a cada uno de los pocillos y se incuba el matraz en una incubadora con 5% de CO2 a 37°C durante aproximadamente 5 minutos. Las celulas se verifican luego bajo un microscopio para asegurar que las celulas se levanten. La suspension de celulas se retira y se coloca en un tubo de 50 mL. PBS se anade al matraz para lavar y el resto de las celulas se coloca a continuacion en el mismo tubo de 50 mL que contema la suspension de celulas. Para detener la reaccion de TrypZean, FBS (n° de catalogo SH30611.02, HyClone) o HS-A/B se anaden a 10% de la disolucion y se arremolinan para la mezcladura. La suspension de celulas se centrifuga a 400 x g durante 5 minutos a 4°C para sedimentar las celulas, que luego se resuspenden en 5 mL de medio. Fibronectina humana se retira del matraz de cultivo y luego las celulas se siembran a razon de 1000 celulas/cm2 en los medios 1, 2, 3 o 4. El resto de las celulas (~ 10 x 106 celulas) se puede congelar a 2,5 x 106 celulas/mL en cuatro viales separados.

Las ULSCs se congelan usando no mas de 5x106 celulas/mL de medio de congelacion (CryoStor CS-10, catalogo CS-10, Biolife Solutions). La suspension de celulas se centrifuga a 400 x g durante 5 minutos a 4°C y luego se anade gota a gota medio de congelacion CS-10. Despues de anadir la cantidad apropiada de CS-10, las celulas se dividen en partes alfcuotas en crioviales, que se colocan en un congelador control de la frecuencia para comenzar la crioconservacion. Para el almacenamiento a largo plazo, las celulas se transfieren a un matraz de vacfo con nitrogeno lfquido (LN2).

Cuando se descongelan las ULSCs, el medio se precalienta y la fibronectina humana se reviste en matraces de cultivo celular durante al menos 0,5 horas antes del cultivo. Los crioviales se liberan rapidamente de LN2, colocado

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en un bano de agua a 37°C y se agitan vigorosamente. La suspension de celulas se retira del criovial y se coloca en un tubo de 15 mL. Se anade gota a gota medio pre-calentado a un caudal de 1 mL por minuto para el lavado de las celulas. La suspension de celulas se centrifuga a 400 x g durante 5 minutos a 4°C y el medio se aspira. El sedimento celular se resuspende en medio y se recuentan las celulas. Las celulas se siembran a razon de 1000 celulas/cm2 en frascos de cultivo celular despues de la separacion de fibronectina humana del matraz.

Ejemplo 3 - Caracterizacion de ULSCs

Se obtuvieron cordones umbilicales y se cultivaron como explantes en placas de 6 pocillos revestidas segun se describe en el Ejemplo 2. Todas las placas fueron tratadas con fibronectina humana (1 pg/ml), a menos que se indique lo contrario. En smtesis, una vez que las placas de 6 pocillos se volvieron 60-70% confluentes, las celulas madre de revestimiento del cordon umbilical (ULSCs) se separaron enzimaticamente y se hicieron pasar a un matraz T225 a una densidad de 1000 celulas por cm2 utilizando medio de crecimiento de ULSC (DMEM con bajo contenido en glucosa (libre de fenol), FBS al 15% que se caracteriza o es de seleccion suprema, Glutamax (1X o al 1%), Gentamicina (2x o al 2%), Disolucion de Vitamina MEM (1x o al 1%), y NEAA de mEm (1x o al 1%)). En el pasaje 3, aproximadamente 8,0 x 106 celulas se obtuvieron para FACS y se tineron en 8 tubos diferentes para el analisis utilizando 16 marcadores diferentes (CD105, CD166, CD19, CD34, HLA-DR, LIN, CD106, CD117, CD133, CD73, CD44, CD45, CD90, HLA-ABC, SSEA-4 y STRO-1). Tal como se muestra en la FIG. 1, las ULSCs eran positivas para CD105, CD166, LIN, CD106, CD73, CD44, CD90, HLA-ABC, SSEA-4 y STRO-1, y negativas para CD19, CD34, CD45, CD117 y CD133. En ULSCs adultas hay una regulacion ascendente del marcador STRO-1 que es un marcador de celulas madre mesenquimales definido. Tambien hay un aumento despreciable en el marcador de leucocitos CD45. La expresion de OCT-4, Nanog, SOX-2 y glucosa-6-fosfato se evaluo mediante RT-PCT en celulas de control NT2, celulas gonadales, tejido del cordon umbilical prenatal (es decir, el tejido del cordon umbilical obtenido a partir de abortos espontaneos) y tejido del cordon umbilical adulto (es decir, el tejido del cordon umbilical obtenido despues de la entrega del bebe sin complicaciones). Las celulas de sangre de cordon umbilical prenatal o adulto expresaron OCT-4 y Nanog, pero no Sox2. Vease la FIG. 2. El analisis FACS de ambos tipos de cordon demuestra ligeros cambios en la expresion del marcador.

En el pasaje 3, las celulas se separaron y se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 50.000 celulas por pocillo para el ensayo de la diferenciacion cardiaca, la diferenciacion neuronal, la diferenciacion adiposa, la diferenciacion osteogenica, la diferenciacion de los condrocitos y de la unidad formadora de colonias. En cada uno de los pasajes y para cada una de las diferenciaciones, se tomo una parte alfcuota de las celulas para el analisis de ARN de diferentes estados. Controles apropiados se incluyeron en cada uno de los estados de diferenciacion. Los medios utilizados son los medios de crecimiento de ULSCs descritos anteriormente.

Diferenciacion Cardiaca - Se sembraron celulas utilizando medio de crecimiento ULSCs y al dfa siguiente se anadio 5-azacitidina 10 pM para la incubacion durante 24 horas. Al dfa siguiente se anadio medio de crecimiento de ULSCs reciente. En 1 semana, las celulas se trataron de nuevo con 5-azacitidina 10 pM durante 24 horas tal como se describio arriba. A los 21 dfas siguientes al primer tratamiento de 5-azacitidina, algunos pocillos se recogieron para el analisis de ARN y el resto se utilizo para la ICC. La diferenciacion cardiaca fue confirmada mediante tincion de la cadena pesada de miosina, troponina I, actina sarcomerica, desmina y conexina 43.

Diferenciacion Neural- Se sembraron celulas utilizando una mezcla 50/50 de medio de crecimiento de ULSCs y un medio de diferenciacion neural compuesto de KO DMEM (DMEM KnockOut™, n° de catalogo 10829-018, Invitrogen), suero al 10% de reemplazo, vitaminas 1x MEM, NeAA, Pen Strep, glutaMAX, N2 y premezcla ITS. Todas las celulas se sembraron en placas revestidas de Matrigel. Los factores de crecimiento anadidos a los medios neurales eran bFGF y EGF a 20 ng/ml o SHH (sonic hedgehog) (100 ng/ml), FGF8 (100 ng/ml) y bFGF (20 ng/ml). Despues de 24 horas, las celulas se lavaron y alimentaron con 100% de medios neurales. A los 7 dfas se anadio acido retinoico (RA) 3uM durante 3 dfas consecutivos directamente a los medios. Al 3er dfa, el 50% de los medios se cambio a DMEM:F12 (n° de catalogo 10565, Gibco) con los mismos suplementos que KO DMEM descrito anteriormente. Al dfa siguiente, se utilizo 100% de medio de crecimiento neural DMEM:F12 y los factores de crecimiento se cambiaron para la diferenciacion terminal de la siguiente manera. Las celulas en sHh, FGF8 y bFGF se cambiaron a GDNF (20 ng/ml), BDNF (20 ng/ml) y Acido Ascorbico (200 pM). Para las celulas en bFGF + EGF, solo el bFGF se separo para la diferenciacion terminal. Las celulas se dejaron durante la diferenciacion terminal durante un penodo adicional de 10-14 dfas, al tiempo que se alimentaban cada 3-4 dfas. Algunos pocillos se tomaron para el analisis de ARN y los restos fueron fijadas para ICC. La diferenciacion a celulas neuronales fue confirmada mediante tincion con nestina, A2B5, O4 y p-tubulina III.

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Diferenciacion en Adiposa- Despues de sembrar las celulas, se dejaron que se volvieran 90% confluentes, en cuyo momento se cambiaron a medio de diferenciacion adipogenica de Lonza de acuerdo con el protocolo del fabricante. 3 dfas inducidas y 2 dfas mantenidas durante 21 dfas en total. La diferenciacion en adiposa fue confirmada mediante tincion con Oil Red O de vacuolas de grasa.

Diferenciacion osteogenica - Despues de la siembra, se dejo que las celulas se convirtieran 90% confluentes, en cuyo momento se cambiaron a medio de diferenciacion Osteogenica de Hyclone de acuerdo con el protocolo del fabricante durante 21 dfas. La diferenciacion en celulas osteogenicas se confirmo utilizando rojo S de alizarina, que tine los depositos de calcio.

Diferenciacion condro- Las celulas se sedimentaron a razon de 500.000 celulas por tubo conico de 15 ml y se alimentaron con medio de diferenciacion condrogenica de Hyclone de acuerdo con el protocolo del fabricante durante 28 dfas. La diferenciacion de condrocitos se confirmo utilizando azul alcian al 1% que tine proteoglicanos sulfatados.

Ensayo de la Unidad Formadora de Colonias: Se obtuvo una parte alfcuota de 20.000 celulas y se utilizaron 20 mL de medio de crecimiento de ULSC para resuspender las celulas. Una parte alfcuota de 10 mL se anadio a una placa de 10 cm pre-revestida y se marco como control, 10.000 celulas. Una parte alfcuota de 500 pL (500 celulas) se coloco en 49,5 mL de medio. Las celulas se resuspendieron y se sembraron (10 mL) en placas de 5-10 cm. Cada una de las placas de 10 cm se marco como 100 celulas por placa. A los 14 dfas, las placas se retiraron de la incubadora, las celulas se lavaron con PBS y se anadio cristal violeta al 3%. No se requirio un cambio de medios durante la incubacion. La eficiencia de clonacion se estimo como el porcentaje de celulas que genero clones a partir del numero total de celulas/placa.

OTRAS REALIZACIONES

Aunque la invencion se ha descrito junto con la descripcion detallada y ejemplos anteriores, la descripcion y los ejemplos anteriores estan destinados a ilustrar y no a limitar el alcance de la invencion, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones estan dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo in vitro para aislar celulas madre de revestimiento del cordon umbilical (ULSCs) de un cordon umbilical, comprendiendo dicho metodo

a) obtener el revestimiento de un cordon umbilical, en donde el revestimiento esta sustancialmente libre de sangre, tejido venoso y tejido arterial; y

b) cultivar explantes de dicho revestimiento sobre un sustrato solido recubierto de fibronectina en presencia de un medio de crecimiento de bajo contenido en glucosa durante un penodo de tiempo suficiente para que las ULSCs se adhieran a dicho sustrato solido recubierto de fibronectina, comprendiendo dicho medio de crecimiento suero bovino fetal al 15%, un dipeptido estabilizado de L-alanil-L-glutamina, antibiotico y un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF) y factor de crecimiento epidermico (EGF).
2. El metodo de la reivindicacion 1, comprendiendo dicho medio de crecimiento, ademas, insulina, transferrina, selenio y piruvato sodico, comprendiendo dicho medio de crecimiento, ademas, putrescina, y comprendiendo dicho medio de crecimiento bFGF, LIF y EGF.
3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho antibiotico es gentamicina.
4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho antibiotico es penicilina y estreptomicina.
5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la superficie superior de cada uno de dichos explantes esta en contacto

con un sustrato solido.
6. El metodo de la reivindicacion 1, comprendiendo dicho metodo, ademas, lavar dichas celulas adheridas a dicho sustrato solido revestido con fibronectina.
7. Una poblacion purificada de celulas madre de revestimiento del cordon umbilical, en donde dichas celulas son positivas para CD105, CD106, CD90, CD73, SSEA-4 y STRO-1, negativas para CD45, CD34, CD19 y HLA-DR, expresan OCT4 y Nanog y no expresan Sox2, en donde dicha poblacion purificada de celulas se puede obtener mediante el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. La poblacion purificada de ULSCs de la reivindicacion 7, en donde dichas celulas son capaces de diferenciarse en celulas de linaje mesodermico, en donde dichas celulas son capaces de diferenciarse en celulas adipogenicas, celulas osteogenicas, celulas condrogenicas y cardiogenicas.
9. La poblacion purificada de ULSCs de la reivindicacion 7, en donde dichas celulas han sido sometidas a al menos 60 duplicaciones en cultivo, al menos 70 duplicaciones en cultivo o al menos 90 duplicaciones en cultivo.
10. La poblacion purificada de ULSCs de la reivindicacion 7, en donde dichas celulas comprenden un acido nucleico exogeno, y en donde dicho acido nucleico exogeno codifica un polipeptido.
11. La poblacion purificada de ULSCs de la reivindicacion 7, en donde dichas celulas estan alojadas dentro de un armazon, en donde dicho armazon es biodegradable, y en donde dicho armazon biodegradable esta compuesto de colageno.
12. La poblacion purificada de ULSCs de la reivindicacion 7, en donde dichas celulas son capaces de diferenciarse en celulas de linaje ectodermico, y en donde dichas celulas son capaces de diferenciarse en celulas neurogenicas.
13. Un metodo de cultivar una poblacion de ULSCs, comprendiendo dicho metodo obtener una poblacion de ULSCs de cordon umbilical humano de acuerdo con el metodo de las reivindicaciones 1-6, en donde dichas ULSCs son positivas para CD105, CD106, CD90, CD73, SSEA-4 y STRO-1, negativas para CD45, CD34, CD19 y HLA-DR, expresan OCT4 y Nanog y no expresan Sox2; y cultivar dichas celulas en presencia de un medio con bajo contenido en glucosa que contiene suero al 10% a 20%; 0,7 a 1,5% de un dipeptido estabilizado de L-alanil-L-glutamina; 1 a 100 ng/mL de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en bFGF, LIF y EGF; y 1 a 3% de un antibiotico.
14. El metodo de la reivindicacion 13, en el que dicho medio con bajo contenido en glucosa comprende, ademas, 0,1 mg/mL a 100 mg/mL de insulina; 0,1 mg/mL a 100 mg/mL de transferrina; 0,1 pg/mL a 100 pg/mL de selenio; y 0,5 a

1,5% de piruvato sodico, en el que dicho medio comprende, ademas, 0,05 pg/mL a 100 pg/mL de putrescina y 1 ng/mL a 100 ng/mL de factor de crecimiento epidermico.