JP6043999B2

JP6043999B2 - ヒト多能性細胞培養のための簡易基本培地

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Publication number: JP6043999B2
Application number: JP2013523366A
Authority: JP
Inventors: ジェイムズエイトムソン; グオカイチェン
Original assignee: ウィスコンシンアラムニリサーチファンデーション
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2011-08-05
Publication date: 2016-12-14
Anticipated expiration: 2031-08-05
Also published as: US9279103B2; IL224431A; CN103180434A; JP2017018137A; DK2601288T3; KR101829488B1; WO2012019122A3; BR112013002811A2; EP2601288A2; JP2013532492A; CA2807418A1; WO2012019122A2; CN108531444A; CA2807418C; BR122020000909B1; AU2011285531B2; EP2601288B1; KR20130099927A; US20120202291A1; AU2011285531A1

Description

関連出願の相互参照
（０００１）該当なし。

連邦政府による支援を受けた研究又は開発に関する声明
（０００２）本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＥＳ０１７１６６の下で、政府の援助を受けて行なわれた。政府は、本発明における一定の権利を有する。

（０００３）胚性幹（ＥＳ）細胞及び誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの多能性細胞は、３つ全ての一次胚葉の細胞に分化する潜在能力を有する（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２，１１４５−１１４７（１９９８））。多能性細胞の優れた発生能は、基礎研究及び臨床適用に有用であることが証明されている。成長培地、プレートコーティング、及び他の条件などの、ヒト多能性細胞培養のための多くの基本的方法が開発され、洗練されている（Ｌｕｄｗｉｇｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２４，１８５−１８７（２００６）；Ｌｕｄｗｉｇｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３，６３７−６４６（２００６））。例えば、ヒトＥＳ細胞は、当初、胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）含有培地中、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で培養されたが、現在は、完全に定義された培地及び定義されたタンパク質マトリクスが利用可能である（Ｌｕｄｗｉｇｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２４，１８５−１８７（２００６））。

（０００４）過去１０年間で、多能性細胞培養法はかなり発展した。多能性細胞の生存及び拡大のための基本的な栄養及び成長因子を提供し、細胞がどのように成長し分化するのかを直接決定するいくつかの成長培地が開発された。ＴｅＳＲ（商標）は、複数回の継代培養の間、フィーダー細胞又は馴化培地の非存在下で、未分化状態での多能性細胞維持を支持する最初の規定培地のうちの１つであった（Ｌｕｄｗｉｇｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３，６３７−６４６（２００６）；米国特許第７，４４９，３３４号、これらは各々、その全体が示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる）。ＴｅＳＲ（商標）は、それ自体５２種の成分を含む基礎培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２に加えて、１８種の成分を含む（表１）。

（０００５）多能性細胞培養に利用可能な異なる成長培地の多様性は、研究結果の矛盾の一因となっている。完全に定義された培地を含め、現在、多能性細胞の誘導及び成長に用いられている培地は、様々な方法で多能性細胞に影響を及ぼし得る成分を含有している。本明細書に記載の本発明より前には、各々の培地成分が、単独で又は他の成分との組合せで、細胞培養物の生存性、多能性、又は分化などの、様々な多能性細胞機能にどのように影響を及ぼすのかということが分かっていなかった。

（０００６）例えば、ほとんどの培地中に存在する最も豊富なタンパク質成分であるアルブミンは、脂質担体であり、従って、その関連する脂質を介して分化又は多能性の維持に影響を及ぼすことができる。アルブミンの量及びその関連する脂質の量によって、それをヒト多能性細胞培養に用いることができるかどうかが決定される。しかしながら、アルブミンの質は、組換え遺伝物質から産生される場合であっても、その供給源によって大いに異なり、その他の点では同等の条件下で行なわれる実験間のばらつきの一因となる。また、クローン化されたヒト血清アルブミンが利用可能であるが、そのコストが比較的高いために、ルーチンの実験にはほとんど用いられない。

（０００７）培地からアルブミンを除去する試みはうまく行かないことが分かっている。ＴｅＳＲ中に存在するアルブミン、又は任意の他の成長因子を抜くと、ヒトＥＳＣ培養物の能力の劇的な低下、例えば、細胞の生存性、増殖、及び多能性の低下がもたらされた（Ｌｕｄｗｉｇｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２４，１８５−１８７（２００６））。

（０００８）多能性細胞の潜在能力を薬物発見、実験、及び移植療法に十分に活用するためには、完全に定義された、理想的には、異種成分(xeno-free)を含まない条件下でのこれらの細胞の誘導及び成長が望ましい。従って、多能性細胞培養条件に対する制御を維持するために、不一致をもたらす成分を含まない培地に対するまだ満たされていないニーズが当技術分野で存在する。具体的には、特定の培養目的に重要な多能性細胞機能を支持する成分のみを含有する多能性細胞培養培地に対するニーズが当技術分野で存在する。

（０００９）本発明は一般に、培地、組成物、並びに多能性細胞を誘導及び培養する方法、より具体的には、多能性細胞のための完全に定義された培地に関する。

（００１０）第一の態様では、本発明は、多能性細胞の生存性、成長、及び多能性を支持するアルブミン不含培地と要約される。

（００１１）第一の態様のいくつかの実施形態では、培地は、セレンを含有する。

（００１２）第一の態様のいくつかの実施形態では、培地は、ＮＯＤＡＬを含有する。

（００１３）第一の態様のいくつかの実施形態では、培地は、トランスフェリンを含有する。

（００１４）第一の態様のいくつかの実施形態では、培地は、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）を含有する。

（００１５）第一の態様のいくつかの実施形態では、培地は、各々、多能性幹細胞の生存性を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）とのみを含有する。

（００１６）第一の態様のいくつかの実施形態では、培地は、各々、多能性幹細胞増殖を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、ＦＧＦと、セレンと、トランスフェリンＴＧＦ−β及びＮＯＤＡＬのうちの１つとのみを含有する。

（００１７）第一の態様のいくつかの実施形態では、培地は、多能性細胞の継代後の生存と、凍結と、増殖と、多能性と、誘導と、クローン化とを支持する。

（００１８）第一の態様のいくつかの実施形態では、培地は、異種成分を含まない。

（００１９）第二の態様では、本発明は、定義された培地中で多能性幹細胞を培養する方法と要約される。第二の態様のいくつかの実施形態では、多能性細胞を培養するのに用いられる培地は、各々、多能性細胞の生存性を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、ＦＧＦとのみを含有する。第二の態様のいくつかの実施形態では、多能性細胞を培養するのに用いられる培地は、各々、多能性幹細胞増殖を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、ＦＧＦと、セレンと、トランスフェリンと、ＴＧＦ−β及びＮＯＤＡＬのうちの１つとのみを含有する。第二の態様のいくつかの実施形態では、培地は、多能性細胞の長時間の成長、多能性、クローン化、凍結、又は誘導を支持する定義された因子を含有する。第二の態様のいくつかの実施形態では、多能性細胞を培養するのに用いられる培地は、異種成分を含まない。

（００２０）第三の態様では、本発明は、β−メルカプトエタノール及びアルブミンを実質的に含まない培地中での多能性細胞のインビトロ細胞培養組成物に関する。第三の態様のいくつかの実施形態では、培養組成物は、線維芽細胞フィーダー細胞、馴化培地、及び異種成分混入(xeno-contamination)を含まない。

（００２１）第四の態様では、本発明は、完全に定義された条件下で成人個体由来のｉＰＳ細胞を誘導する方法と要約される。本方法は、全て生存性を維持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、ＦＧＦとを含有する培地中で成人個体由来の体細胞を培養する工程、及びこの細胞を、例えば、ｉＰＳ細胞を誘導するために、定義された条件でリプログラミングさせる工程を含む。

（００２２）第四の態様のいくつかの実施形態では、培地は、リプログラミングプロセスの一部又は全ての期間、ＴＧＦ−βを含有する。

（００２３）第四の態様のいくつかの実施形態では、培地は、酪酸塩(butyrate)を含有する。

（００２４）第四の態様のいくつかの実施形態では、培地は、ヒドロコルチゾンを含有する。

（００２５）第四の態様のいくつかの実施形態では、培地は、異種成分を含まない。

（００２６）第五の態様では、本発明は、アルブミン不含培地中で多能性幹細胞をクローン化する方法と要約される。本方法は、多能性幹細胞のクローン化を支持するアルブミン不含培地中に、クローン化密度で多能性幹細胞をプレーティングする工程を含む。

（００２７）第五の態様のいくつかの実施形態では、培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する。

（００２８）第五の態様のいくつかの実施形態では、培地は、ブレビスタチンを含有する。

（００２９）第五の態様のいくつかの実施形態では、培地は、各々、多能性幹細胞のクローン化を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、ＦＧＦと、セレンと、トランスフェリンと、ＴＧＦ−β及びＮＯＤＡＬのうちの１つとのみを含有する。

（００３０）第六の態様では、本発明は、アルブミン不含培地中で多能性幹細胞を凍結保存する方法と要約される。本方法は、アルブミン不含培地中で多能性幹細胞を凍結させる工程を含む。

（００３１）第六の態様のいくつかの実施形態では、培地は、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、ＦＧＦと、セレンと、トランスフェリンと、ＴＧＦ−β及びＮＯＤＡＬのうちの１つと、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とのみを含有する。

（００３２）第七の態様では、本発明は、アルブミン不含条件下で誘導されるｉＰＳ細胞と要約される。アルブミンの非存在下で誘導されるｉＰＳ細胞は、内在性アルブミンの混入を含まない。

（００３３）本明細書に記載の方法及び組成物は、多能性細胞を誘導し、培養し、かつ使用する種々の用途において有用である。意図される培養目的を支持する因子に限定される多能性細胞の短期及び長期培養条件を定義することが本発明の目的である。

（００３４）未分化状態の培養細胞のパーセンテージを最大化する多能性細胞の培養条件を提供することが本発明の別の目的である。

（００３５）様々な条件が多能性細胞にどのように影響を及ぼすかを調べるために、及び異なる培地バックグラウンドで以前に報告された実験と比較するために必要なプラットフォームの役割を果たし得る培地を提供することが本発明の別の目的である。

（００３６）本発明のこれらの及びその他の特徴、目的、及び利点は、以下の説明からより良く理解されるようになるであろう。説明においては、本明細書の一部を形成し、かつ本発明の実施形態が限定ではなく、実例として示される添付の図面を参照する。全ての変更、等価物、及び代替物を網羅するために、好ましい実施形態の説明は、本発明を限定することを意図したものではない。それゆえ、本発明の範囲を解釈するために本明細書に記載の特許請求の範囲を参照すべきである。
以下のその詳細な説明を考慮すれば、本発明がより良く理解されるであろうし、また、上に示したもの以外の特徴、態様、及び利点が明らかになるであろう。そのような詳細な説明では、以下の図面が参照される。

（００３８）
図１Ａ〜図１Ｅは、培養下におけるヒトＥＳ細胞の生存及び自己再生のための培地要素を示す。図１Ａは、様々な培地中にプレーティングされた個々の細胞の２４時間生存指数を示す。培地の省略形は表１に記載の通りである。インスリン及び線維芽細胞成長因子（ＩＦ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）の存在は「＋」で示され、不在は「−」で示されている。図１Ｂは、様々な培地中にプレーティングされた個々の細胞の２４時間又は９６時間生存指数を示す。インスリン及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の添加は「＋」で示され、除去は「−」で示されている。図１Ｃは、ビタミンＣを含むＴｅＳＲ（商標）培地（ＴｅＳＲ）、ビタミンＣを含まないＴｅＳＲ（商標）培地（ＴｅＳＲ（商標）−ＬＡＡ）、又はＤＦ５培地中で培養された個々の細胞の２４時間又は１２９時間生存指数を示す。図１Ｄは、ＤＦ５、セレンが添加されたＤＦ５（ＤＦ５＋セレン）、ＤＦ１２、又はセレンが除去されたＤＦ１２（ＤＦ１２−セレン）中での３回の継代の各々の後の細胞増殖を示す。図１Ｅは、１２種の異なる基準培地の比較解析を示す。図２Ａ〜図２Ｆは、ＤＦ５Ｓを用いたヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞培養条件の最適化を示す。図２Ａは、ＤＦ５Ｓ（下）又はＴｅＳＲ（商標）（上）のいずれかの中に低密度（約１，５００細胞／ｃｍ²）で播種され、異なるＯ₂及びＣＯ₂濃度（Ｏ１５Ｃ５：１５％Ｏ₂及び５％ＣＯ₂；Ｏ１５Ｃ１０：１５％Ｏ₂及び１０％ＣＯ₂；Ｏ５Ｃ１０：５％Ｏ₂及び１０％ＣＯ₂）で培養された個々の細胞の生存指数を示す。細胞生存を２４時間及び１２４時間で調べた。図２Ｂは、小分子ＨＡ１００の存在下（＋ＨＡ１００）又は非存在下（ＣＭ１００：１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含む馴化培地）における、様々な培地中で培養されたＨ１細胞のクローン化効率を示す。図２Ｃは、様々な培地中で包皮線維芽細胞から誘導されたＨ１細胞及びｉＰＳ細胞のクローン化効率を示す。図２Ｄは、様々な培地中で包皮線維芽細胞から誘導されたｉＰＳ細胞のクローン化効率を示す。ＤＦ５ＳｔｒＦｅは、ホロトランスフェリンが添加されたＤＦ５Ｓ培地を示す。図２Ｅは、ＨＡ１００（１０μＭ、２４時間）、ブレビスタチン（１０μＭ、４時間）、又はＹ２７６３２（１０μＭ、２４時間）の非存在下におけるクローン化効率（対照）と比べた、これらの因子の存在下における、様々な培地中で培養されたＨ１細胞のクローン化効率を示す。アステリスクは、ｐ＜０．０５を示す。図２Ｆは、正常酸素条件（濃い灰色の棒）又は低酸素(hypoxic)条件（薄い灰色の棒）下における、馴化培地（ＣＭ）、ＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ１００）を含むＣＭ、ＲＯＣＫ阻害剤を含むＴｅＳＲ、及びＲＯＣＫ阻害剤を含むＥ８中でのＨ１細胞のクローン化効率を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を示し；アステリスクはｐ＜０．０５を示す。図３Ａ〜図３Ｂは、インスリンと、トランスフェリンと、セレンと、Ｌ−アスコルビン酸と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦ−β又はＮＯＤＡＬとが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（本明細書では、それぞれ、「Ｅ８（ＴＧＦ−β）」及び「Ｅ８（ＮＯＤＡＬ）」と呼ばれる）中での多能性細胞成長及び遺伝子発現を示す。図３Ａは、ＴｅＳＲ（商標）（濃い灰色の線）又はＥ８（ＴＧＦ−β）（薄い灰色の線）中で維持されたＨ１ＥＳ細胞（上）及びｉＰＳ細胞（下）の拡大倍率を示す。図３Ｂは、Ｅ８（ＴＧＦ−β）中で成長させたＨ１ＥＳ細胞及びＴｅＳＲ（商標）中で成長させたＨ１ＥＳ細胞の全体的な遺伝子発現を示す。ＴｅＳＲ培地又はＥ８（ＴＧＦβ）培地のいずれかの中で３回の継代の間維持されたＨ１細胞のＲＮＡを、ＩｌｌｕｍｉｎａＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒＧＡＩＩＸを用いるＲＮＡ−ｓｅｑで解析した（全体的な遺伝子発現の相関Ｒ＝０．９５４（スピアマン相関））。図４Ａ〜図４Ｆは、定義された条件下でのｉＰＳ細胞の誘導を示す。図４Ａは、ＦＢＳ含有培地中での増殖と比べた、様々な線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）が添加されたＤＦ５ＳＦｅベースの培地中での包皮線維芽細胞の増殖を示す。図４Ｂは、ヒドロコルチゾンが補充された様々な培地中での線維芽細胞成長を示す。図４Ｃは、多能性マーカーＯＣＴ４（左）及びＳＳＥＡ４（右）の発現を示す。図４Ｄは、包皮線維芽細胞、ｈＥＳ細胞、フィーダー細胞上で誘導されたｉＰＳ細胞（ｉＰＳ細胞（フィーダー））、及びＥ８培地中で誘導されたｉＰＳ細胞（ｉＰＳ細胞（Ｅ８））による選択された遺伝子の発現を示す。ヒドロコルチゾンを含むＥ８中で維持された線維芽細胞を除き、全ての細胞は、ＲＮＡ解析前にＥ８（ＴＧＦβ）培地中で維持された。図４Ｅは、ヒトＥＳ細胞及びＥ８（ＴＧＦβ）培地中で誘導されたｉＰＳ細胞の全体的な遺伝子発現を示す（Ｒ＝０．９５５）。図４ＦＭＥＦ上で誘導されたｉＰＳ細胞及びＥ８（ＴＧＦβ）培地中で誘導されたｉＰＳ細胞の全体的な遺伝子発現を示す。図５Ａ〜図５Ｃは、ｉＰＳ細胞の誘導のための培地改良を示す。図５Ａは、ＴＧＦ−β又はヒドロコルチゾン又はＴＧＦ−β及びヒドロコルチゾン又はＦＧＦなしのＴＧＦ−β及びヒドロコルチゾンが補充されたＤＦ５ＳＦｅ培地中での包皮（濃い灰色の棒）及びＰＲＰＦ８−２成人線維芽細胞（薄い灰色の棒）の増殖を示す。図５Ｂは、包皮線維芽細胞のリプログラミングに対するＴＧＦ−β及び酪酸塩の効果を示す。初期のリプログラミングトランスフェクションの４〜５週間後、形質転換細胞及び真のｉＰＳ細胞のコロニー数をスコア化し、ｉＰＳコロニー対非ｉＰＳ細胞コロニーの比率を計算した。図６Ａ〜図６Ｂは、二次継代を伴わない完全に定義された条件下での成人線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の誘導を示す。図６Ａは、リプログラミングプロトコルの例を示す。図６Ｂは、インスリンと、トランスフェリンと、セレンと、Ｌ−アスコルビン酸と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦ−β又はＮＯＤＡＬとが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（「Ｅ８」）中で２０回の継代の間維持されたｉＰＳＣ株のフローサイトメトリー解析によって決定した場合の、多能性マーカーＯＣＴ４及びＳＳＥＡ４の発現を示す。影付きのピーク：ＯＣＴ４（左）及びＳＳＥＡ４（右）に特異的な抗体による染色；影なしのピーク：マウスＩｇＧ対照抗体。図７Ａ〜図７Ｃは、様々な培地中でのヒト線維芽細胞のリプログラミング効率を示す。図７Ａは、マウス線維芽細胞フィーダー細胞（ＭＥＦ）を用いた又はＥ８ベースの培地中でのリプログラミングに供した線維芽細胞８０，０００個当たりのｉＰＳ細胞コロニーの数を示す。効率を改善するために、１００μＭの酪酸ナトリウムを両方の条件に添加した。図７Ｂは、ＴｅＳＲ（商標）中又はＥ８ベースの培地中でのリプログラミングに供した線維芽細胞８０，０００個当たりのｉＰＳ細胞コロニーの数を示す。図７Ｃは、完全に定義された条件下での包皮線維芽細胞のリプログラミング効率に対するＴＧＦ−β及び酪酸塩曝露時間の効果を示す。線維芽細胞を、１００μＭの酪酸塩の存在下又は非存在下、インスリンと、トランスフェリンと、セレンと、Ｌ−アスコルビン酸と、ＦＧＦ２とが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴＧＦ−βを含まないＥ８）中又はＥ８中でリプログラミングさせた。全ての条件についてのリプログラミング効率を、リプログラミングから３０日後に解析した。アステリスクは、ｐ＜０．０５を示す。

（００４５）本発明は、様々な変更及び代替形態が許容されるが、その例示的な実施形態が、図面で例として示され、本明細書で詳細に記載されている。しかしながら、例示的な実施形態の記載は、本発明を開示されている特定の形態に限定することを意図したものではなく、逆に、その意図は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神及び範囲内に含まれる全ての変更、等価物、及び代替物を網羅することであることが理解されるべきである。

（００４６）本発明は、かつては多能性細胞を培養するのに必須であると考えられていた特定の培地成分を、特定の培養目的を達成するために調剤される多能性細胞培養培地から省くことができるという本発明者らの観察に関する。

（００４７）本明細書で使用されるように、「多能性細胞」という用語は、三胚葉全ての細胞に分化することができる細胞を意味する。多能性細胞の例としては、胚性幹細胞及び誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。本明細書で使用されるように、「ｉＰＳ細胞」は、そのそれぞれの分化した起源体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、かつ本明細書に記載されているような、より高い能力の細胞、例えば、ＥＳ細胞と同様の特徴を示す細胞を指す。この細胞は、非多能性（例えば、寡能性又は体）細胞をリプログラミングさせることによって得ることができる。

（００４８）本発明は、特定の培養目的に必須ではない因子を含まない新しい培地に関する。培養目的の例としては、細胞の生存、継代、増殖、多能性、クローン化、及びｉＰＳ細胞の誘導が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、本発明は、アルブミン不含培地に関する。

（００４９）明確にしておくと、「継代」と「クローン化」は、別個の方法である。「継代」は、培養容器中である密度にまで培養して凝集体になった細胞を分割し、その後、それを新しい培養容器に入れるプロセスを説明するものである。これらの凝集体は、任意の数の細胞、通常、１００〜１，０００個の細胞を含むことができ、これは、培養液中ですぐに成長を開始する。対照的に、「クローン化」は、単一の個々のＥＳ細胞からヒトＥＳ細胞コロニーを成長させることによって、クローン性のコロニーを発生させることを指す。本明細書で使用されるように、「クローン化効率」は、培養液中にプレーティングされた個々の細胞の数で割った新しい細胞コロニーを形成する個々の細胞の数を意味する。クローン化効率は、培養条件によってかなり異なる。例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）上での、定義され、かつ異種成分を含まない条件下での、ヒトＥＳ細胞のクローン化効率は非常に低いが（すなわち、約０．１％未満）、線維芽細胞馴化培地を用いて培養されたこれらの細胞のクローン化効率は、依然として低いものの（すなわち、約２％未満）、クローン性のＥＳ細胞コロニーを発生させる程度には十分高い。

（００５０）現在使用されている特定の培地成分は、培養細胞に損傷を与えるか、又は分化を誘導することができる。例えば、β−メルカプトエタノールは、培養多能性細胞を損傷し、死滅させることすらできる。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）などの血清培地添加物は、培養多能性細胞の分化を誘導することができる。また、市販の血清成分は、同じ供給源から供給された場合であっても、その組成が大きく異なり、予測不可能な培養のばらつきをもたらすことがあり得る。本明細書に記載の培地は、ほとんどの従来の多能性細胞培養培地中に存在する損傷を与える因子、分化させる因子、及び定義されていない因子を実質的に含まない。開示された培地は、短期（例えば、２４時間）の多能性細胞の生存性、短期（例えば、４〜５日）の増殖を支持すること、長時間の培養期間、例えば、３カ月で２５回を超える継代の間、多能性細胞を維持すること、並びにレンチウイルス及びエピソームベクターを用いて胎児と成人の両方の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を誘導することなどの、様々な培養目的で用いるのに成功している。

（００５１）特定の細胞培養目的のために特別に作られた新しい最小培地を開発した。塩類、ビタミン類、グルコース源、ミネラル、及びアミノ酸などの、様々な培地成分を単独で又は組み合わせて試験し、生存性、増殖、又は多能性に対するその個々の効果を決定した。新しい生存アッセイを開発し、それを用いて、どの成分が解離後の多能性細胞生存に必須であるかを決定した。新しい培地を、増殖を支持し、多能性を持続するその能力について試験した。これらの培地をクローン化アッセイで用いて、各々の培地が単一の細胞及びそのクローン化効率にどのように影響を及ぼすかということも明らかにした。本明細書に記載の各々の新しい培地の成分の完全なリストを表１に示す（薄い影付きの欄及び濃い影付きの欄は、培地中での成分の存在を示し、格子柄の欄は、交換可能な成分を示し、空の欄は、培地中での成分の不在を示す）。

（００５２）

（００５３）本明細書に記載の様々な培地を基本成分から調製することができる。或いは、当業者は、開示された新しい培地を調製するために基礎培地を出発材料として用いることの有利な効率性を理解している。本明細書で使用される「基礎培地」という用語は、特別な培地添加物を必要としない特定の単細胞の生物及び細胞の成長を支持する培地を意味する。典型的な基礎培地成分は当技術分野で公知であり、これには、塩類、アミノ酸、ビタミン類、及び炭素源（例えば、グルコース）が含まれる。ｐＨ指示薬のフェノールレッドなどの、培地の基本的な特徴を変化させないが、それ以外の面では望ましい、他の成分を含めることもできる。例えば、ダルベッコの改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）は、哺乳動物細胞培養のための好適な成長培地を作製するために一般に用いられる基礎培地である。ＤＭＥＭ／Ｆ１２の成分の完全なリストを表２に示す。

（００５４）

（００５５）特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試行で用いることができるが、好ましい方法及び材料を本明細書で記載する。

（００５６）実施形態を説明し、本発明を特許請求する際に、以下の専門用語を以下に示す定義に従って使用する。

（００５７）本明細書で使用されるように、「約」は、記述された濃度範囲の５％以内、又は記述された時間枠の５％以内を意味する。

（００５８）本明細書で使用されるように、「本質的に血清を含まない」は、培地が血清も血清代替物も含有しないこと、又はそれが、本質的に血清も血清代替物も含有しないことを意味する。例えば、本質的に血清を含まない培地は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の血清を含有することができ、その場合、培地の培養能力が依然として観察される。

（００５９）本明細書で使用される「定義された培養培地」又は「定義された培地」という用語は、各々の培地成分の内容及び量が公知であることを意味する。

（００６０）本明細書で使用されるように、「から本質的になる培地」は、特定の成分、及び任意に、その基本的な性質に実質的には影響を及ぼさない他の成分を含有する培地を意味する。

（００６１）本明細書で使用されるように、「有効量」は、本発明による特定の細胞効果を誘発するのに十分な薬剤の量を意味する。

（００６２）本明細書で使用されるように、「生存性」は、生存可能である状態を意味する。生存可能である多能性細胞は、細胞プレート表面に付着し、膜破壊がない限り、色素のヨウ化プロピジウムで染まらない。短期の生存性は、細胞を培養液中にプレーティングした後の最初の２４時間に関するものである。通常、細胞は、その時間では増殖しない。

（００６３）本明細書で使用されるように、「短期の成長」は、培養液中での４〜５日間の細胞増殖を意味する。

（００６４）本明細書で使用されるように、「長時間の成長」は、少なくとも５回の継代の間の成長を意味する。通常、培地は、２０回を超える継代（約２〜３カ月）の間、多能性細胞成長を支持するその能力について試験される。

（００６５）本明細書で使用されるように、「長期の培養」は、１５回を超える継代（培養液中で約２カ月）を意味する。

（００６６）本明細書で使用されるように、「多能性」は、三胚葉全ての細胞に分化する細胞の能力を意味する。

（００６７）本明細書で使用されるように、「クローン化」は、出発培養物から、理想的には、単一の多能性細胞から又は少なくともごくわずかの細胞から、細胞培養を開始するプロセスを意味する。未分化多能性細胞のクローン培養を可能にする培養条件は、通常の多能性細胞の培養及び増殖において必要とされる全ての条件の中で最も厳しい条件であり得る。

（００６８）本明細書で使用されるように、「ｉＰＳ細胞の誘導」は、多能性ではない細胞を多能性になるようにリプログラミングさせることを意味する。

（００６９）本明細書で使用されるように、「異種成分を含まない」は、その培養細胞の種以外の種のいかなる細胞も細胞産物も含まない細胞培養条件を意味する。

（００７０）本明細書で使用されるように、「正常酸素条件」は、約２０％酸素の条件を意味する。

（００７１）本明細書で使用されるように、「低酸素条件」は、約２０％未満の酸素、例えば、約５％酸素の条件を意味する。

（００７２）本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮することによって、より完全に理解されるであろう。

（００７３）実施例１：多能性細胞生存アッセイ。

（００７４）５００マイクロリットルの様々な試験培地を１２ウェルプレートの各々のウェルに充填した後、細胞を添加した。接着性多能性細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、５分間又は培養プレートから完全に剥離するまで解離させた。等量の培地を培養液に添加することによって、ＴｒｙｐＬＥを中和した。細胞をカウントし、洗浄し、３００，０００〜１，０００，０００細胞／ｍｌの濃度で新鮮な培地に再懸濁した。約１００μｌのこの細胞溶液を１２ウェルプレートの各々のウェルに添加し、細胞を３７℃、５％Ｏ₂及び１０％ＣＯ₂でインキュベートした。細胞を０．４ｍｌのＴｒｙｐＬＥを用いて様々な時点で再び解離させ、その後、それを等量のＤＭＥＭ中の１０％ＦＢＳで中和した。細胞をフローサイトメトリーでカウントした。５０００カウントの明るいビーズを各々の試料に内部対照として添加した（約２００個のビーズを各々の試料についてカウントした）。全ての実験を３つ１組で実施した。

（００７５）実施例２：生存及び短期の成長のための成長因子。

（００７６）ＴｅＳＲ培地は、基礎培地中に存在するものに加えて、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ピペコリン酸、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、及びインスリン（表１）という６つの成長因子を含有する。これら６つの成長因子を除く、全てのＴｅＳＲ（商標）成分を含有する、基本栄養培地（ＮＭ）を作製した。約２×１０⁵個のＨ１ＥＳ細胞を解離させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上にプレーティングした。２４時間後、生存指数を決定した。ＮＭだけでは、解離後の細胞生存を支持しなかった。ＮＭへのインスリンの添加は、ＴｅＳＲ（商標）で観察されるのと同様の細胞生存をもたらしたが、細胞成長は支持しなかった（図１Ａ）。インスリン（２０ｕｇ／ｍｌ）とＦＧＦ２（１００ｎｇ／ｍｌ）の両方の添加は、細胞生存を支持し、更に、ＴｅＳＲ（商標）培地を用いて観察されるのと同程度である９６時間での細胞成長をもたらした（図１Ｂ）。従って、ＦＧＦ及びインスリンが補充されたＮＭは、ヒトＥＳ細胞培養を支持する。上記のように補充された１２種の異なる基礎栄養培地は、細胞の生存及び成長を支持することができた（図１Ｅ）。

（００７７）実施例３：Ｌ−アスコルビン酸は短期の増殖を支持する。

（００７８）ＮＭは、１１種の栄養成分、すなわち、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、微量元素Ｂ、微量元素Ｃ、Ｌ−アスコルビン酸、チアミン、セレン、Ｌ−グルタミン、ＢＳＡ、ＢＭＥ、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ₃）、及びトランスフェリンを含有する（表１）。ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、基礎培地としての役割を果たし、ＮａＨＣＯ₃は、ｐＨを修飾するのに用いられる。インスリン及びＦＧＦが存在するときに、他のどの栄養成分が必須であるかを明らかにするために、各々の因子をＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＮａＨＣＯ₃、インスリン、及びＦＧＦに個々に添加した。これらの栄養因子はいずれも、継代後の生存に必須ではなかったが、Ｌ−アスコルビン酸（６４ｍｇ／Ｌ）は、継代後の細胞増殖に必要であった（図１Ｃ）。ビタミンＣとして知られるＬ−アスコルビン酸は、主な酸化防止剤であり、かついくつかの酵素の共因子である。ヒドロキシプロリンは、一部、Ｌ−アスコルビン酸の代わりになり得る。ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＮａＨＣＯ３、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、及びＦＧＦ（定義された因子５、「ＤＦ５」、表１）中にプレーティングされたヒトＥＳ細胞は、ＴｅＳＲ中にプレーティングされたヒトＥＳ細胞と同様の形態を維持した。

（００７９）実施例４：長時間の継代のための培地成分。

（００８０）ＤＦ５は、１回の継代の間しか、細胞成長を支持しなかった。２回目の経代の後、細胞はあまり付着せず、最終的に死滅した（図１Ｃ）。細胞は、ＮＭ＋インスリン＋ＦＧＦ（データは示さない）及びＤＦ１２（図１Ｄ、表１）中で継代することができ、これは、ＮＭ＋インスリン＋ＦＧＦ及びＤＦ１２中に存在する１以上の因子が長時間の継代に重要であることを示唆している。ＮＭ中に存在する各々の栄養因子をＤＦ５に個々に添加し、複数回の継代後の細胞拡大を支持するその能力を決定した。複数回の継代を通して細胞増殖を支持するのに、セレンのみの添加で十分であった（図１Ｄ、ＤＦ５＋セレン、「ＤＦ５Ｓ」、表１）。

（００８１）ＤＦ５Ｓを用いて、Ｈ１細胞を拡大した。ＤＦ５Ｓ中で成長させた細胞は、ＴｅＳＲ（商標）中で成長させた細胞よりも分化しやすい傾向があった。しかしながら、Ｈ１細胞は、数週間（１５回を超える継代）の間、成長させることができ、その間、この細胞は、ヒトＥＳ細胞形態及び高レベルのＯＣＴ４発現を維持した（図１Ｅ、図１Ｆ）。ＮＯＤＡＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はＴＧＦ−β（２ｎｇ／ｍｌ）のいずれかが添加されたＤＦ５Ｓ中で成長させたＨ１細胞は、ＤＦ５Ｓ中で培養されたＨ１細胞と比べて、有意により高いレベルのＮＡＮＯＧｍＲＮＡを発現した。多能性マーカーＯＣＴ４の高発現によって明らかにされているように、ＤＦ５Ｓ＋ＮＯＤＡＬは、試験した２つのヒトｉＰＳ細胞株の多能性も支持した。ＮＯＤＡＬ又はＴＧＦ−βのいずれかを含むＤＦ５Ｓ中で成長させた全ての細胞（ｈＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞）は、長期の継代の後に、正常な核型を維持した。

（００８２）実施例５：低酸素状態は細胞の成長及びクローン化を改善する。

（００８３）Ｈ１細胞は、ＴｅＳＲ（商標）中で成長させた細胞と比べて、ＤＦ５Ｓ培地中でより速く成長した（図１Ｃ及び２Ａ）。多能性細胞成長条件を最適化するために、細胞を、様々なオスモル濃度、ｐＨ、酸素レベル、及びＣＯ₂レベルのＤＦ５Ｓ中で成長させた。アッセイ感度を高めるために、５，０００個の細胞だけを各々のウェルに播種し、生存（２４時間）及び増殖（１２４時間）について解析した。Ｏ₂レベル及びＣＯ₂レベルを変化させたときに、最も大きい改善が認められた。通常の培養条件は、約１５％の酸素及び５％のＣＯ₂（Ｏ１５Ｃ５）を用いる。より多くのＣＯ₂は、２４時間後に、わずかにより多くの生存をもたらすことが多かった。より低い酸素レベルは、ＤＦ５ＳとＴｅＳＲ（商標）の両方での細胞成長を増大させた。１０％のＣＯ₂を伴う１５％の酸素（Ｏ１５Ｃ１０）、及び１０％のＣＯ₂を伴う５％の酸素（Ｏ５Ｃ１０）は、細胞生存を増大させた（図２Ａ）。細胞は、より高いＯ₂レベル（Ｏ１５Ｃ５及びＯ１５Ｃ１０）で成長しなかったが、それらは、より低い酸素レベル（Ｏ５Ｃ１０）で増殖した（図２Ａ）。ＤＦ５Ｓ中の細胞は、ＴｅＳＲ（商標）中で成長させた細胞よりも速く成長し、５％Ｏ₂及び１０％ＣＯ₂で最も早く成長した（図２Ａ）。２％への酸素レベルの更なる減少は、５％Ｏ₂と比べて細胞成長を低下させた。

（００８４）様々な酸素及びＣＯ₂濃度でのクローン化効率を決定するために、５００個の細胞を各々のウェルに播種した。低酸素でさえも、クローン化効率は非常に低く（＜２％）、クローン化に対する様々な条件の効果を決定することができなかった。酸素及びＣＯ₂濃度を検討するために、クローン化効率を増大させることが知られているＲＯＣＫ阻害剤のＨＡ１００を用いて、クローン化効率を増大させた。クローン化のための最良の培地であることが知られている馴化培地（ＣＭ）を対照として用いた。ＨＡ１００の添加は、Ｏ５Ｃ１０とＯ１５Ｃ５の両方のＣＭ中でのクローン化効率を有意に改善し、クローン化効率は、Ｏ１５Ｃ５よりもＯ５Ｃ１０でより高かった（図２Ｂ）。ＤＦ５Ｓ中での細胞のクローン化効率は、両方の条件下のＣＭ中での細胞のクローン化効率と同程度であった（図２Ｂ）。

（００８５）細胞生存に対する低酸素のプラスの効果のために、後の実施例のうちのいくつかでは、細胞を低密度で維持した場合に、低酸素条件が利用されている。しかしながら、細胞を低い細胞密度で培養しない場合、実験は、正常酸素条件と低酸素条件の両方の下で実施された（図２Ｂ）。

（００８６）実施例６：改善されたｉＰＳ細胞クローン化効率。

（００８７）ＤＦ５Ｓがクローン化効率にどのように影響を及ぼすかを明らかにするために、２つのｉＰＳ細胞株をＤＦ５Ｓ中で成長させ、ＨＡ１００の存在下、クローン化密度（１２ウェルプレートウェル当たり約５００細胞）でプレーティングした。ＤＦ５Ｓ中で成長させたｉＰＳ細胞のクローン化効率は、ＴｅＳＲ（商標）又はＣＭのいずれか（図２Ｃ）の中で成長させたｉＰＳ細胞のクローン化効率よりも低く、これは、クローン化効率を増強する因子が、ＴｅＳＲ（商標）培地中には存在するが、ＤＦ５Ｓには存在しないことを示唆している。そのような因子を同定するために、個々のＴｅＳＲ（商標）成分をＤＦ５Ｓに個々に添加し、クローン化効率に対する効果について試験した。ＤＦ５Ｓへのホロ−トランスフェリンの添加（ＤＦ５ＳＦｅ）は、ＴｅＳＲ（商標）を用いたクローン化効率と同程度のクローン化効率を生じさせた（図２Ｄ）。トランスフェリンは、ＤＦ５Ｓ培地中のＨ１細胞のクローン化効率の顕著な改善ももたらす。

（００８８）インスリンと、トランスフェリンと、セレンと、Ｌ−アスコルビン酸と、ＦＧＦと、ＴＧＦ−β（又はＮＯＤＡＬ；「Ｅ８」）とが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２中のＲＯＣＫ阻害剤ＨＡ１００及びＹ２７６３２、並びにブレビスタチンによって、Ｈ１細胞のクローン化効率は増大し（図２Ｅ）、これは、トランスフェリンの添加によって、及び低酸素条件下での培養によって更に増大した（図２Ｆ）。細胞は、２５回を超える継代の後、正常な核型を維持した。

（００８９）実施例７：ＮＯＤＡＬ及びＴＧＦ−βは、アルブミン不含培地中でのＨ１及びｉＰＳ細胞の多能性の長期の維持を支持する。

（００９０）実施例３に記載したように、Ｈ１、Ｈ９、及びｉＰＳ細胞などのヒト多能性細胞は、ＤＦ５Ｓ中で成長させ、１５回を超えて継代することができたが、分化しやすい傾向があったため、ＤＦ５Ｓ中で多能性を持続させるには格別の注意が必要である。多能性は、ＴｅＳＲ（商標）中でより簡単に維持することができるので、長期の多能性を支持する因子を同定するために、ＴｅＳＲ（商標）中に存在する成長因子を、それまで分化させないでＤＦ５Ｓ中で培養されたＨ１細胞を成長させるために用いられるＤＦ５ＳＦｅに個々に添加した。細胞を、コンフルエンシーに達した後、約１日間継代して、細胞分化を促進し、フローサイトメトリーによって評価されるＯｃｔ４発現を多能性の指標として用いた。

（００９１）ＤＦ５ＳＦｅ中で成長させたヒト多能性細胞は伸張し、互いに沿って並び、分化の直前に「紡錘」形に似ていた。この表現型は、ＴＧＦ−β／ＢＭＰ経路によって通常は抑制されている神経分化の開始時に観察されることが多い。従って、ＴＧＦ−β経路の組換えタンパク質を、長期の多能性を支持するその能力について試験した。ＴｅＳＲ（商標）濃度で用いられるＮＯＤＡＬが補充されたＤＦ５ＳＦｅ（「Ｅ８（ＮＯＤＡＬ）」）は、高いＯｃｔ４発現を持続させた。ＴｅＳＲ（商標）濃度（０．６ｎｇ／ｍｌ）で用いられるＴＧＦ−βが補充されたＤＦ５ＳＦｅ（「Ｅ８（ＴＧＦ−β）」）は、低レベルのＯｃｔ４発現を支持したが、より高い濃度（１ｎｇ／ｍｌ）で用いたときに、高いＯｃｔ４発現を維持することができた。

（００９２）Ｈ１及びＨ９などのヒトＥＳ細胞株は、様々な複雑な培養成分、例えば、ＦＢＳ、フィーダー細胞、及びノックアウト血清代替物への曝露を含む培養歴を有する。これらの成分への曝露は、おそらく、これらの成分への依存性を生じさせ、結果的に、簡易培地に対する細胞応答を変化させることができる。誘導条件がそれほど複雑ではないので、リプログラミングされた体細胞から誘導されるｉＰＳ細胞については、培養歴がそれほど大きな役割を果たさない可能性がある。それゆえ、ＤＦ５ＳＦｅ中で成長させた２つのもとのレンチウイルスｉＰＳ細胞株（Ｙｕ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：１９１７（２００７））を用いて、様々な因子を試験した。細胞を、１回の継代の間、ＭＥＦプレートから直接ＤＦ５ＳＦｅ培地に移し、その後、様々な成長因子条件に移行させた。ＤＦ５ＳＦｅへのＴＧＦ−β（２ｎｇ／ｍｌ）又はＮＯＤＡＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかの添加（それぞれ、「Ｅ８（ＴＧＦ−β）」及び「Ｅ８（ＮＯＤＡＬ）」）は、ｉＰＳ細胞の長期の多能性を支持した。多能性表面マーカーＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ３、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１も発現した。正常な核型を有する細胞は、２０回を超える継代の間、連続的に維持された。これらの細胞は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに注射された５〜７週間後に、奇形腫を形成することができた。

（００９３）Ｅ８（ＴＧＦ−β）及びＥ８（ＮＯＤＡＬ）は、２５回を超える継代（約３カ月）の間、分化の兆候を示すことなく、試験した全ての多能性細胞株、すなわち、２つのヒトＥＳ細胞株（Ｈ１及びＨ９）並びに５つのｉＰＳＣ株の多能性を支持した（図３）。Ｅ８培地中で成長させたＨ１ＥＳ細胞は、ＴｅＳＲ（商標）中で成長させたＨ１ＥＳ細胞と比べて同様の遺伝子発現プロファイルを有する（図３Ｂ）。

（００９４）実施例８：アルブミン不含培地中でのｉＰＳ細胞の誘導。

（００９５）利用可能なリプログラミングプロトコルは、ウイルスによる形質導入又はエレクトロポレーション後の最初の数日間のＦＢＳ中での細胞インキュベーション、その後のＵＭ１００（その全体が示されているかのように本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４３９，０６４号）又はＣＭへの細胞の移し替えを含む。先の実施例に記載された簡易培地を、リプログラミングを支持するその能力について試験した。ＥＳ由来体細胞は、ＦＢＳ含有培地中での最初の２日の培養があってもなくても、レンチウイルス又はエピソームベクターを用いて、ＤＦ５Ｓ培地中で効率的にリプログラミングさせることができた。しかしながら、ＤＦ５Ｓは、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＬｉｎ２８を用いた初代包皮細胞のリプログラミングを支持しなかった。ＤＦ５ＳＦｅは、細胞を最初にＦＢＳ含有培地中でインキュベートした場合に、改良型レンチウイルス（その全体が示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｂｅｒｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４５７（７２２７）：２７７−２８０（２００９））を用いた、Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はＭＥＦ上での包皮及び成人細胞のリプログラミングを支持した。ＤＦ５ＳＦｅは、リプログラミングの支持においてＣＭと同じぐらい効率的であったが、最初のＦＢＳへの曝露が、リプログラミングに重要であるように思われた。

（００９６）包皮細胞は、ＦＢＳ培地中よりもＤＦ５ＳＦｅ中で有意に遅く成長する。初代包皮細胞成長を助けることができる成長因子を決定するために、ＦＢＳ中に含まれる個々の成長因子を試験した。ＦＧＦファミリーの成長因子は、いくつかのメンバーを有しており、そのうちの１つ又は複数が線維芽細胞培養に一般に用いられる。ＤＦ５ＳＦｅは、１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュ組換えＦＧＦ２を含有している。各々のＦＧＦファミリーメンバーを、包皮細胞成長を支持するその能力について試験した。包皮細胞を培養プレートのウェルに分注し、ＦＧＦを含まないＤＦ５ＳＦｅ中で２４時間インキュベートした。個々のＦＧＦタイプを１００ｎｇ／ｍｌで９６時間添加した。ＦＧＦ１、ｚＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、及びＦＧＦ９は、最も効率的に包皮細胞成長を支持したが、ＦＢＳ含有培地と同じぐらいよく細胞成長を支持したものはなかった（図４Ａ）。非ＦＧＦファミリーメンバー成長因子が、ＦＢＳで見られる包皮細胞成長と同程度の包皮細胞成長を促進することができるかどうかを確認するために、いくつかの既知の線維芽細胞成長促進因子を試験した。ＦＢＳの代わりにするためにＤＦ５ＳＦｅに添加されたヒドロコルチゾン（図４Ｂ）、その誘導体、及びデキサメタゾンは、細胞成長を有意に改善した。ＤＦ５ＳＦｅ＋ヒドロコルチゾン（「ＤＦ５ＳＦｅＣ」）は、ｉＰＳ細胞クローン化効率も改善した。

（００９７）ＤＦ５Ｓベースの培地を、ウイルスを使用しないｉＰＳ細胞の誘導に用いることができるかどうかを明らかにするために、包皮細胞を、その全体が示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４：７９７（２００９）に記載されているように、ウイルスを使用しないエピソームベクターを用いて、低酸素条件（Ｏ５Ｃ１０）でリプログラミングさせた。プラスミド組合せ＃４（ｐＥＰ４ＥＰ２ＳＣＫ２ＭＥＮ２Ｌ及びｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋ、表３）、＃６（ｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＮ２Ｌ、ｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋ、及びｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＭ２Ｋ、表３）、並びに＃１９（ｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＮ２Ｋ、ｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋ、及びｐＣＥＰ４−Ｍ２Ｌ、表３）を使用し、二次継代の後、２つのクローンを１０⁶個の細胞から単離した。

（００９８）

（００９９）プラスミド組合せ＃６及び＃１９をリプログラミングに用いた。核へのプラスミド侵入を促進するために、ＥＮＢＡｍＲＮＡをプラスミドＤＮＡと一緒に電気穿孔した。約１００万個の細胞を、２枚の６ウェルプレート上に移し、ＤＦ５ＳＦｅＣ中に５日間入れた。その後、培地を、更に１８〜２５日間、ＤＦ５ＳＦｅに切り替えた。これらのウェルのうちのいくつかの細胞に、様々な時点で１：６の比率を用いて、２回目の継代を行なった。プラスミド組合せ＃１９は、プラスミド組合せ＃６よりも多くのコロニーを生じさせたが、それらの大部分は、典型的なヒトＥＳ細胞形態に似ていなかった。約２５日後、両方のプラスミド組合せについて、ヒトＥＳ細胞様コロニーが一次プレート上に出現し、プラスミド組合せ＃１９を用いて包皮細胞１００万個当たり２４個のリプログラミングされた細胞、及びプラスミド組合せ＃６を用いて包皮細胞１００万個当たり８個のリプログラミングされた細胞と推定された。ヒトＥＳ細胞様コロニーの数は、二次継代プレートの後、有意に増加し、各々のプラスミド組合せについて、＞５００個／１００万個の包皮細胞と推定された。二次継代プレート上でのｉＰＳ細胞コロニーの増加は、一次プレート上でのｉＰＳ細胞の分裂によるものである可能性が高い。場合によっては、一次プレートは、典型的なヒトＥＳ細胞形態に似たコロニーを有していなかったが、多くのｉＰＳ細胞が二次継代後に出現し、おそらくは、いくつかのｉＰＳ細胞が体細胞と混合されていたために、それらを同定することができなかったことを示唆している。

（０１００）ＤＦ５ＳＦｅ中で誘導されたｉＰＳ細胞コロニーの細胞は、わずか２回の経代の後に分化し始めた。６つのｉＰＳ細胞コロニーを一次プレートから採取し、Ｎｏｄａｌ含有ＤＦ５ＳＦｅＮ（Ｅ８（ＮＯＤＡＬ））に直接移した。これらの細胞を、１５回を超える継代の間、Ｅ８（Ｎｏｄａｌ）中で維持し、ＴｅＳＲ（商標）を用いて観察されるＥＳ細胞様形態と同様のそのＥＳ細胞様形態を維持することができた。これらの細胞は、正常な核型を有し、Ｏｃｔ４及びＳＳＥＡ４を発現し（図４Ｃ）、注射して５〜７週後に、ＳＣＩＤマウスで奇形腫を形成した。

（０１０１）包皮線維芽細胞はＥ８培地中でもリプログラミングされた。Ｅ８培地中で誘導されたｉＰＳ細胞の全体的な遺伝子発現は、フィーダー細胞上で誘導されたＨ１細胞（図４Ｄ及びＥ）又はｉＰＳ細胞（図４Ｄ及びＦ）の全体的な遺伝子発現と類似していた。多能性マーカーは、ＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の両方で高度に発現されたが、線維芽細胞特異的マーカー遺伝子は発現されなかった（図４Ｄ）。また、ｉＰＳ細胞は、例えば、レンチウイルス又はエピソームベクターを用いる、様々な戦略を用いて、Ｅ８培地中で誘導することができた。

（０１０２）実施例９：アルブミン不含培地中での患者細胞株からのｉＰＳ細胞の誘導。

（０１０３）成人ドナー由来の細胞を、簡易培地中でウイルスを使用しないエピソームベクターを用いてリプログラミングさせることができるかどうかを明らかにするために、患者細胞株ＯＡＴ又はＰＲＰＴ８の２００万個の細胞に、プラスミド組合せ＃４又は＃６を、ＥＢＮＡｍＲＮＡと一緒に電気穿孔し、これらを２枚の１０ｃｍプレート上に移した。リプログラミングを最大化するために、最初の６日間、ＦＢＳ含有培地を用いた。通常の成人細胞維持条件と一致させるために、細胞をＯ１５Ｃ５で維持した。その後、更に１４〜２１日間、培地をＤＦ５ＳＦｅに切り替えた。１枚のプレートの細胞を様々な時点で１：２の比で継代した。プラスミド組合せ＃６は、＃４よりも多くのコロニー（細胞１００万個当たり約５個）を生じさせたが、これらの細胞の大部分は、典型的なヒトＥＳ細胞形態に似ていなかった。約２２日後、プラスミド組合せ＃４について、ヒトＥＳ細胞様コロニーが一次プレート上に出現した。プラスミド組合せ＃６を用いたとき、更に多くのヒトＥＳ細胞様コロニーが二次継代プレート上に出現し、細胞１００万個当たり約４０個のコロニーと推定された。プラスミド組合せ＃４を用いたとき、ｉＰＳ細胞は生じなかった。ｉＰＳ細胞コロニーは、一次プレート上の他の密に集合した細胞の真ん中に出現し、その境界を越えて成長することができなかった。しかしながら、二次プレート上のコロニーは、コロニー単離に好適な大きいサイズに拡大した。コロニーを採取して、ＴｅＳＲ（商標）に直接移すと、採取された３２個のコロニーが生き残り、ＥＳ細胞形態を示した。遺伝子解析から、これらのコロニーがＯＡＴ細胞株に由来するものであり、正常な核型を示すことが確認された。

（０１０４）成人細胞のリプログラミング効率を改善するために、ＴＧＦ−βをリプログラミング培地に添加した。ｉＰＳクローンは有意には増加しなかったが、コロニーの総数は有意に増加した。ヒドロコルチゾン除去の時点でＴＧＦ−βを培地から除去した場合、ｉＰＳ細胞コロニーの数は有意に増加し、ＴＧＦ−βが、このプロセスの最初の数日のうちにリプログラミングを支持することを示唆した。

（０１０５）ｉＰＳではないと思われる多くのクローンは、二次継代後にｉＰＳクローンを生じさせることができ、ｉＰＳ細胞の誘導が、周囲の細胞によって阻害され得ることを示唆している。いくつかの試薬を、この効果を克服するその能力について試験した。酪酸塩はリプログラミング効率を改善した。ＴＧＦ−βと酪酸塩の両方を培地に添加したとき、包皮細胞のリプログラミング効率の約１０倍の増加が観察された（図５Ｂ）。ＴＧＦ−βは、リプログラミングの初期段階では、そのプラスの効果を示すように見えたが、酪酸塩は、より後の段階でプラスの役割を果たした。ＴＧＦ−β添加は、リプログラミング時のコロニー数の増加をもたらしたが、真のｉＰＳ細胞コロニーの数は低いままであった。酪酸塩は、コロニーの数を増加させなかったが、真のｉＰＳ細胞対非ｉＰＳ細胞コロニーの比率を有意に改善した（図５Ｃ）。

（０１０６）ＴＧＦ−β及び酪酸塩を用いることによって、エピソームベクター系を用いて、完全に定義された条件下での成人個体由来の体細胞のリプログラミングの成功が可能になった。ｉＰＳ細胞は、１×１０⁶個のＰＲＰＦ８−２細胞から１〜１００個、及び１００，０００個の細胞（ＧＲＣ１−２９）から１個の効率で、３つの独立した成人体細胞株（ＯＡＴ、ＧＲＣＭ１−２９、及びＰＲＰＦ８−２）から誘導された。

（０１０７）実施例１０．完全に定義された条件での成人個体由来のｉＰＳ細胞の誘導。

（０１０８）生検を男性成人ドナーの皮膚から採取し、抗生物質及び抗真菌剤を含むハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で数回洗浄し、２ｍｌの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（表４）又はＴｒｙｐＬＥセレクト中、４℃で一晩インキュベートした。試料を３回すすぎ、２回目のすすぎの後、トリプシン阻害剤（表４）を用いた。滅菌ピンセットを用いて真皮及び表皮を分離した。真皮を切って小片にし、規定の酵素を含む０．７５ｍｌの酵素溶液（表４）中、室温で３時間インキュベートした（１２ウェル又は２４ウェルプレート）。約３５分後、組織構造が分解し始めた。１０ｕｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む等量の培地を添加し、上下に約１０回ピペッティングすることによって、組織を機械的に解離させた。試料を、４００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、新鮮な培地／ＰＶＰで２回洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを３ｍｌの完全培地に再懸濁し、１ｍｌの細胞懸濁液を、３μｇ／ウェルのビトロネクチンをコーティングした６ウェルプレートのウェルに移した。プレートを５％ＣＯ₂、３７℃でインキュベートし、培地を毎日交換した。線維芽細胞はプレートに接着したが、非接着細胞と破片は、培地を交換するときに除去された。

（０１０９）

（０１１０）２０日後、リプログラミングプラスミドをエレクトロポレーションを用いて線維芽細胞に導入した。次の２５日以内に、複数のｉＰＳコロニーが出現し、これらを更なる解析のために採取した。リプログラミング効率は、二次継代なしでは、電気穿孔した線維芽細胞１００万個のうち約１０個であった。ｉＰＳ細胞を更に継代して、ベクターを含まない細胞株を単離した。

（０１１１）実施例１１．二次継代を伴わないアルブミン不含培地中での成人個体由来のｉＰＳ細胞の誘導。

（０１１２）成人線維芽細胞を、図６Ａに示した一般的なプロトコルに従って、Ｅ８（インスリンと、トランスフェリンと、セレンと、Ｌ−アスコルビン酸と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦ−β（又はＮＯＤＡＬ）とが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２）中でリプログラミングさせた。２０回を超える経代の間、Ｅ８中で維持されたリプログラミングｉＰＳ細胞株は、多能性マーカーＯＣＴ４及びＳＳＥＡ４を発現し続けた（図６Ｂ）。

（０１１３）Ｅ８培地は、マウス線維芽細胞フィーダー細胞（ＭＥＦ）（図７Ａ）又はＴｅＳＲ（商標）（図７Ｂ）を用いたリプログラミング効率と比べて、リプログラミング効率を有意に高めた。酪酸塩（１００μＭ）は、ＴＧＦ−βの存在下（Ｅ８）又はＴＧＦ−βの非存在下（ＴＧＦ−βを含まないＥ８、すなわち、ＤＦ５ＳＦｅ）（図７Ｃ）で、リプログラミング効率を更に高めた。

（０１１４）実施例１２．アルブミン不含培地中での多能性幹細胞の凍結保存。

（０１１５）多能性細胞を、本質的に上で記載された通りに、Ｅ８培地に入れて６ウェルプレート中で培養した。培養培地を各々のウェルから吸引し、細胞を１．０ｍＬのＥＤＴＡ／ＰＢＳ（０．５ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ、オスモル濃度３４０）で２回洗浄した。その後、細胞を、ＥＤＴＡ／ＰＢＳ中、３７℃で５分間インキュベートした。ＰＢＳ／ＥＤＴＡを除去し、細胞を１ｍｌのＥ８培地で素速くすすいだ。その後、細胞を等量の２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びＥ８培地（最終濃度：Ｅ８培地中、１０％ＤＭＳＯ）に再懸濁し、低温保存用バイアルに分注し、ＣＲＹＯＢＯＸ（商標）を用いて、−８０℃で凍結させた。その後、細胞を液体窒素タンクに移した。

（０１１６）本発明は、最も実用的でかつ好ましい実施形態と現在考えられているものに関して記載されている。しかしながら、本発明は、実例として提示されているのであって、開示された実施形態に限定されることを意図するものではない。従って、当業者であれば、本発明が、添付の特許請求の範囲に示されているような本発明の精神及び範囲内に全ての変更及び代替配置を包含することを意図するものであることを理解するであろう。

Claims

非ヒト動物由来の成分を含まない、定義されたアルブミン不含培地であって、各々、ヒト多能性幹細胞増殖を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、グルコースと、インスリンと、ＦＧＦと、セレンと、トランスフェリンと、ＴＧＦ−β及びＮＯＤＡＬのうちの１つと、を含む、アルブミン不含培地。
ヒト多能性幹細胞を培養する方法であって、以下の工程、
マトリクス上にヒト多能性幹細胞を置く工程、及び
前記細胞を、非ヒト動物由来の成分を含まない、定義されたアルブミン不含培地であって、各々、ヒト多能性幹細胞増殖を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、グルコースと、インスリンと、ＦＧＦと、セレンと、トランスフェリンと、ＴＧＦ−β及びＮＯＤＡＬのうちの１つとを含むアルブミン不含培地と接触させる工程、
を含む、方法。
前記マトリクスが、ラミニン又はビトロネクチンを含む、請求項２に記載の方法。
前記細胞を低酸素条件下で前記培地と接触させる、請求項２に記載の方法。
前記ヒト多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項２に記載の方法。
前記ヒト多能性幹細胞が、ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項２に記載の方法。
ヒト多能性幹細胞をクローン化する方法であって、以下の工程、
ヒト多能性幹細胞を、非ヒト動物由来の成分を含まない、定義されたアルブミン不含培地であって、各々、ヒト多能性幹細胞のクローン化を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、グルコースと、インスリンと、ＦＧＦと、セレンと、トランスフェリンと、ＴＧＦ−β及びＮＯＤＡＬのうちの１つとを含むアルブミン不含培地において、クローン化密度で、プレーティングする工程、
を含むことを特徴とするクローン化する方法。
前記培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を更に含む、請求項７に記載の方法。
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＨＡ１００及びＹ２７６３２からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
前記培地が、ブレビスタチンを更に含む、請求項７に記載の方法。
ヒト多能性幹細胞を凍結保存する方法であって、以下の工程、
前記ヒト多能性幹細胞を、非ヒト動物由来の成分を含まない、定義されたアルブミン不含培地であって、各々、ヒト多能性幹細胞増殖を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、グルコースと、インスリンと、ＦＧＦと、セレンと、トランスフェリンと、ＴＧＦ−β及びＮＯＤＡＬのうちの１つとを含むアルブミン不含培地中で凍結させる工程、
を含む、方法。
前記培地が、ＴＧＦ−βを含む、請求項１に記載のアルブミン不含培地。
前記培地が、ＮＯＤＡＬを含む、請求項１に記載のアルブミン不含培地。
前記培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を更に含む、請求項１に記載のアルブミン不含培地。
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＨＡ１００及びＹ２７６３２からなる群から選択される、請求項１４に記載のアルブミン不含培地。
ブレビスタチンを更に含む、請求項１に記載のアルブミン不含培地。
異種成分を含まない、請求項１に記載のアルブミン不含培地。
水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、グルコースと、インスリンと、ＦＧＦと、セレンと、トランスフェリンと、ＴＧＦ−β及びＮＯＤＡＬのうちの１つとからなる、請求項１に記載のアルブミン不含成長培地。