KR102004958B1 - 고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법 - Google Patents
고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 생물 사체의 조직을 세척 및 소독하는 단계, 상기 조직을 효소 처리하는 단계, 상기 조직을 초대세포 배양액으로 희석하여 플레이트 상에 접종하는 단계, 상기 조직으로부터 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배양된 세포를 계대 배양하는 단계를 포함하는, 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법에 관한 것이다.
멸종 복원(De-extinction)이란, 멸종한 생물을 되살리는 것을 말한다. 멸종 복원의 목표는 생물 다양성을 보존하고 서로 다른 종 간 연관관계를 밝히는 것으로, 이는 생물 복제 기술이 발전함에 따라 많은 관심을 받고 있다. 멸종된 동물들에 대한 복제 프로젝트 중의 하나인, 태즈메니아 호랑이(Tasmanian Tiger)는 비교적 최근에 멸종함에 따라 잘 보존된 표본이 박물관에 보관되어 있어, 멸종 동물 복원 대상의 우선대상이 되고 있다. 그 밖의 미국의 나그네비둘기, 도도새와 쿠바의 붉은마코앵무새, 뉴질랜드의 자이언트 모아새 등이 멸종된 종들 가운데 현재 복제가 가능한 것으로 여겨지고 있는 동물이다.
3700 여년 전에 멸종한 것으로 알려진 매머드 또한, 멸종 복원의 대상으로 여겨지고 있다. 매머드는 약 480만년 전부터 4000년 전까지 존재했던 포유류인데, 긴 코와 4미터(m) 길이의 어금니를 가지고 있다. 흡사 코끼리와 비슷한 모습을 하고 있으나, 온몸이 털로 뒤덮혀 있다는 점에서 차이가 있다. 매머드는 긴 코와 4 미터 길이의 어금니를 갖고, 코끼리와 비슷한 모습을 하고 있으나, 온 몸이 털로 뒤덮혀 있다는 점이 특징인 멸종 동물이다. 시베리아에서 매머드 사체가 발견됨에 따라, 매머드 사체로부터 DNA를 추출할 수 있다면, 매머드 복원은 가능하다는 많은 연구진들의 예측과 분석이 나왔다. 많은 전문가들이 본격적인 연구에 뛰어들면서 매머드 복원이 실제로 가능할 것이라는 기대는 점차 커지고 있다. 하지만 모든 연구가 그러하듯, 멸종한 생물을 복원하는 것은 새 생명을 탄생시키는 것만큼이나 매우 복잡하고 어려운 과정이다. 매머드를 복원하는 과정은 크게 4단계를 거치게 된다. 먼저, 얼어붙은 매머드 사체에서 손상이 덜 된 '살아있는' 체세포를 추출한다. 이어 매머드와 생물학적으로 비슷한 코끼리의 난자를 추출하여 그 난자에서 핵을 제거하는 작업을 진행한다. 그리고 핵이 제거된 코끼리의 난자에 매머드의 체세포 핵을 이식하고, 이렇게 형성된 수장란을 코끼리의 자궁에 착상시킨다. 마지막으로 임신한 코끼리가 정상적으로 매머드를 출산하게 되면 매머드 복원에 성공하는 것이다. 매머드를 복원하는 과정은 크게 4 단계를 거치게 되는데, 우선, 얼어붙은 매머드 사체로부터 살아있는 체세포를 추출하고, 매머드와 생물학적으로 비슷한 코끼리의 난자를 추출하여 그 난자에서 핵을 제거하며, 핵이 제거된 난자에 매머드의 체세포 핵을 이식하여, 이를 코끼리 자궁에 착상시켜 매머드를 출산하는 것이다. 하지만, 실질적으로는, 얼어붙은 매머드로부터 온전한 세포를 분리하여 배양하는 것조차 성공한 사례가 아직까지는 없었다.매머드는 약 480만년 전부터 4000년 전까지 존재했던 포유류인데, 긴 코와 4미터(m) 길이의 어금니를 가지고 있다. 흡사 코끼리와 비슷한 모습을 하고 있으나, 온몸이 털로 뒤덮혀 있다는 점에서 차이가 있다.
본 발명의 목적은, 고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일실시예에 따르면, 생물 사체의 조직을 세척 및 소독하는 단계, 상기 조직을 효소 처리하는 단계, 상기 조직을 초대세포 배양액으로 희석하여 플레이트 상에 접종하는 단계, 상기 조직으로부터 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배양된 세포를 계대 배양하는 단계를 포함하는, 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
일측에 따르면, 상기 생물 사체의 조직을 세척 및 소독하는 단계는, 상기 조직을 생리식염수를 이용하여 수화하고 세척하는 단계, 상기 세척된 조직을 알코올을 이용하여 소독하는 단계 및 상기 소독된 조직을 생리식염수를 이용하여 세척하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 조직을 효소 처리하는 단계는, 2 내지 24 시간 동안 수행되는 것이고, 상기 효소는, 콜라게나제 타입 I, 콜라게나제 타입 II, 콜라게나제 타입 IV, Trypsin, EDTA, Dispase, 및 Accutase 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 조직을 효소 처리하는 단계 이후에, 상기 조직을 크기 별로 분류하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 플레이트는, 마트리젤, 콜라젠, 젤라틴, 파이브로넥틴, 및 라미닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 코팅 물질로 코팅된 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 초대세포 배양액은, 사이토카인이 함유되어 있는 EGM2-MV, 사이토카인을 함유하지 않은 EBM-2, Ham F-10, F12, RPMI, DPBS, DMEM 및 MEM-α 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 초대세포 배양액은, 15 내지 30 % 농도의 혈청을 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 초대세포 배양액은 첨가제를 포함하는 것이고, 상기 첨가제는, EAA(essential amino acids), NEAA(non-essential amino acids), ITS 혼합물 (insulin, transferrin, sodium selenite), PS(penicillin/streptomycin), 및 β-머캅토에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 세포를 배양하는 단계는, 상기 플레이트 상에 5 내지 20ng/ml의 성장인자를 첨가하고, 2 내지 3일 간격으로 하프 미디어 교체를 하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 성장인자는, bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), EGF(Epidermal Growth Factor), IGF(Insulin like Growth Factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), 혈관형성 성장인자(angiogenic growth factors), 아스코르브산 및 HGF (Hepatocyte growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 배양된 세포를 계대 배양하는 단계 이후에, 상기 계대 배양된 세포를 동결 보존 용액에서 동결 보존하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 동결 보존 용액은, 혈청, 혈장, SR (Serum replacement), DMSO, 글리세린 (Glycerin), 프로판다이올(Propanediol), 및 에틸렌 글리콜 (Ethylene glycol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
일실시예에 따르면, 상기 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법으로 세포를 배양하는 단계, 상기 배양된 세포를 이용하여 체세포 핵이식을 하는 단계 및 상기 체세포로부터 복제배아를 생산하는 단계를 포함하는 복제배아 생산방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법으로 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배양된 세포를 이용하여 줄기세포를 생산하는 단계를 포함하는 줄기세포 생산방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법으로 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배양된 세포를 이용하여 복제동물을 생산하는 단계를 포함하는 복제동물 생산방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법으로 배양된 세포를 제공한다.
본 발명의 세포 배양 방법을 이용하여, 멸종 생물의 사체 또는 화석으로부터 세포를 배양할 수 있다. 본 발명의 방법으로 배양된 세포로부터 복제배아와 줄기세포를 생산하고, 궁극적으로는 멸종된 동물을 복원시킬 수 있다.
도 1은, 일실시예에 따른, 고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법의 순서도이다.
도 2는, 일실시예에 따른, 고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법의 순서도이다.
도 3은, 일실시예에 따른 획득된 조직으로부터 불순물 제거 단계를 나타낸 사진이다.
도 4는, 일실시예에 따른 세척 및 소독 단계를 나타낸 사진이다.
도 5는, 일실시예에 따른 효소처리 단계를 나타낸 사진이다.
도 6은, 일실시예에 따른 조직 및 세포층 분리 단계를 나타낸 사진이다.
도 7은, 일실시예에 따른 조직 및 세포의 접종단계를 나타낸 사진이다.
도 8은, 일실시예에 따른 배양 2일 째 세포가 배양접시에 붙어 존재함을 확인한 사진이다.
도 9는, 일실시예에 따른 초대배양세포가 건강하게 증식된 모습 과 이를 일부 확대한 사진이다.
도 10은, 일실시예에 따른 세포 내 염색체의 사진이다.
도 11은, 일실시예에 따른 조직자체 염색으로 조직 내에 특정 부위에 생존 세포가 있음을 확대해 보여주는 사진이다.
도 12a 및 12b는, 일실시예에 따른 조직의 탄소연대측정 개요 및 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은, NCBI에 등록된 매머드 미토콘드리아 염기서열 및 프라이머의 염기서열이다.
도 14는, pGEM-T 벡터를 나타낸 것이다.
도 15는, pGEM-T 벡터에 클로닝 한 후 서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은, pGEM-Cox1-1-T7의 염기서열 일부를 나타낸 것이다.
도 17a 및 17b은, NCBI에서 제공하는 BLAST 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 18은, 일실시예에 따른 체세포핵이식 과정 및 이로부터 생산된 복제배아 사진이다.
도 2는, 일실시예에 따른, 고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법의 순서도이다.
도 3은, 일실시예에 따른 획득된 조직으로부터 불순물 제거 단계를 나타낸 사진이다.
도 4는, 일실시예에 따른 세척 및 소독 단계를 나타낸 사진이다.
도 5는, 일실시예에 따른 효소처리 단계를 나타낸 사진이다.
도 6은, 일실시예에 따른 조직 및 세포층 분리 단계를 나타낸 사진이다.
도 7은, 일실시예에 따른 조직 및 세포의 접종단계를 나타낸 사진이다.
도 8은, 일실시예에 따른 배양 2일 째 세포가 배양접시에 붙어 존재함을 확인한 사진이다.
도 9는, 일실시예에 따른 초대배양세포가 건강하게 증식된 모습 과 이를 일부 확대한 사진이다.
도 10은, 일실시예에 따른 세포 내 염색체의 사진이다.
도 11은, 일실시예에 따른 조직자체 염색으로 조직 내에 특정 부위에 생존 세포가 있음을 확대해 보여주는 사진이다.
도 12a 및 12b는, 일실시예에 따른 조직의 탄소연대측정 개요 및 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은, NCBI에 등록된 매머드 미토콘드리아 염기서열 및 프라이머의 염기서열이다.
도 14는, pGEM-T 벡터를 나타낸 것이다.
도 15는, pGEM-T 벡터에 클로닝 한 후 서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은, pGEM-Cox1-1-T7의 염기서열 일부를 나타낸 것이다.
도 17a 및 17b은, NCBI에서 제공하는 BLAST 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 18은, 일실시예에 따른 체세포핵이식 과정 및 이로부터 생산된 복제배아 사진이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
일실시예에 따르면, 생물 사체의 조직을 세척 및 소독하는 단계, 상기 조직을 효소 처리하는 단계, 상기 조직을 초대세포 배양액으로 희석하여 플레이트 상에 접종하는 단계, 상기 조직으로부터 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배양된 세포를 계대 배양하는 단계를 포함하는, 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
일측에 따르면, 상기 생물 사체의 조직을 세척 및 소독하는 단계는, 상기 조직을 생리식염수를 이용하여 수화하고 세척하는 단계, 상기 세척된 조직을 알코올을 이용하여 소독하는 단계 및 상기 소독된 조직을 생리식염수를 이용하여 세척하는 단계를 각각 3 내지 7회 반복하여 수행하는 것일 수 있다.
상기 생물 사체의 조직은, 동결 건조된 것일 수 있으므로, 생리식염수를 사용하여 조직을 수화할 필요가 있다. 따라서, 조직을 수화하는 동시에 오염물 세척을 위하여, 생리식염수가 담긴 코니컬 튜브에 조직을 넣고, 상기 튜브를 뒤집어 가며 세척한다. 생리식염수의 색이 맑고 투명해질 때까지, 생리식염수를 교환하면서 세척과정을 3회 내지 7회 실시하는 것이 바람직하다. 세척된 조직은 알코올이 담긴 코니컬 튜브에, 2 내지 5분 정도, 바람직하게는 약 3분 정도 담그어, 세포 오염을 방지하기 위한 소독하는 과정을 거친다. 알코올 소독 이후에는, 알코올을 세척하기 위한 세척 과정을 더 포함할 수 있다. 종래의 방법과 달리, 일련의 세척과정과 소독과정을 각각 수 차례 반복 수행하여, 동결 건조된 조직으로부터 불순물을 제거함과 동시에 조직을 수화시킬 수 있다. 상기 방법에 따라 수화된 조직은 세포 층으로 분리될 수 있으며, 분리된 세포 층으로부터 세포가 배양될 수 있다.
일측에 따르면, 상기 세척 및 소독된 조직은 효소 처리된다. 일측에 따르면, 상기 효소는, 콜라게나제 타입 I, 콜라게나제 타입 II, 콜라게나제 타입 IV, Trypsin, EDTA, Dispase, 및 Accutase 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 효소는 조직을 구성하는 세포들 간의 결합(junction)을 끊어, 조직의 크기를 작게 하고 조직으로부터 세포 층이 분리될 수 있도록 하는 역할을 수행한다. 작은 조직 또는 조직으로부터 분리된 세포 층으로부터 세포가 배양될 수 있다. 상기 사용될 수 있는 바람직한 효소는 콜라게나제 타입 I 이다.
상기 효소는 0.1 내지 2 w/v % 농도로 준비될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소를 버퍼 용액 (Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Calcium and magnesium)에 1ml 당 1g의 비율로 녹인 후에 스톡 용액(stock solution 100U/ul) 으로 희석하여(1000X stock), 0.1 내지 2 w/v % (또는, 50 내지 500U/ml) 로 사용될 수 있다.
상기 효소가 담긴 용액에 상기 소독된 조직을 넣고 1 mm 이하의 크기로 잘게 자른 후, 37℃ shaking incubator에서 2 내지 24 시간 동안 반응시킬 수 있다. 효소 반응 시간이 2 시간보다 적으면 조직으로부터 얻는 세포 수득율이 현저히 떨어질 수 있고, 24시간보다 많으면 얻어진 세포의 상태가 불안정하여 증식 가능한 세포 배양이 불가능할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 조직을 효소 처리하는 단계 이후에, 상기 조직을 크기 별로 분류하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 조직을 크기 별로 분류하는 단계는 다음과 같다: 1) 효소 처리되어 작은 단위로 분할된 조직들은, 배양액이 들어있는 코니컬 튜브에 옮겨진다. 2) 코니컬 튜브 바닥면에 가라 않는 순서대로 조직을 수득하여, 조직을 크기 별로 분류한다. 상기 튜브 내 배양액의 조성은, 예를 들면, 20 v/v % FBS, 1% v/v NEAA, 0.1% v/v β-mercaptoethanol, 1% v/v penicillin-streptomycin이 포함된 high glucose DMEM 일 수 있으며, 15 ml 크기의 코니컬 튜브가 사용될 수 있다.
조직을 크기 별로 분류하는 방법은 다양하게 사용될 수 있으며, 예를 들면, 원심분리, 피펫팅 등이 사용될 수 있다. 일실시예에 따르면, 조직 또는 세포에 물리적인 자극을 적게 주기 위하여, 조직의 무게에 따른 침강 속도를 고려하여, 튜브 바닥면에 가라앉는 순서대로 수득하는 방법 (정치 방법)이 바람직할 수 있다. 크기 별로 분류된 조직들은, 각각 다른 플레이트 상에서 배양될 수 있다.
일측에 따르면, 상기 플레이트는, 마트리젤, 콜라젠, 젤라틴, 파이브로넥틴, 및 라미닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 코팅 물질로 코팅된 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 초대세포 배양액은, 사이토카인이 함유되어 있는 EGM2-MV, 사이토카인을 함유하지 않은 EBM-2, Ham F-10, F12, RPMI, DPBS, DMEM 및 MEM-α 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 일측에 따르면, 상기 초대세포 배양액은, 15 내지 30 v/v % 농도의 혈청을 포함하는 것일 수 있다. 혈청(예를 들면, FBS)은, 알부민, 글로불린, 세포부착을 촉진시키는 피브로넥틴 (fibronectin), 페투인 (fetuin), 안티 트립신 물질인 알파2-마크로글로불린 (α2-macroglobulin), 체내 유용단백질인 트렌스페린 (transferring)을 포함하며, 또한, 다양한 폴리펩타이드, 성장인자, 호르몬, 아미노산, 당, 케토산 등의 각종 영양소, 대사물질, 무기물질, 억제인자 등이 과량 포함하고 있다. 따라서, 혈청의 농도가 15% 미만인 경우에는, 배양액 내 영양분이 부족하여 세포가 배양되지 않을 수 있으며, 30% 초과인 경우에는, 오히려 세포의 증식을 억제하고 과도한 분화를 유발할 수 있다. 가장 바람직하게는 20% 농도의 혈청이 포함될 수 있다. 상기 사용될 수 있는 혈청은, 예를 들면, FBS(Fetal Bovine Serum), BCS(Bovine Calf Serum), 또는 HS (horse serum) 일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 초대세포 배양액은 첨가제를 포함하는 것이고, 상기 첨가제는, EAA(essential amino acids), NEAA(non-essential amino acids), ITS 혼합물 (insulin, transferrin, sodium selenite), PS(penicillin/streptomycin), 및 β-머캅토에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 세포를 배양하는 단계는, 상기 코팅 플레이트 상에 5 내지 20 ng/ml의 성장인자를 첨가하고, 2 내지 3일 간격으로 하프 미디어 교체를 하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 성장인자는, bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), EGF(Epidermal Growth Factor), IGF(Insulin like Growth Factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), 혈관형성 성장인자(angiogenic growth factors), 아스코르브산 및 HGF (Hepatocyte growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다. 상기 성장인자는, 체세포 배양을 증진시킬 수 있는 물질로서, 획득된 체세포가 조기에 안정적으로 증식될 수 있도록 배양 플레이트에 첨가될 수 있으며, 가장 바람직한 성장인자는 bFGF 일 수 있다.
상기 세포 배양방법은, 상기 세포가 배양되는 것이 확인되면, 배양된 세포를 계대배양하는 단계를 포함한다. 세포를 계대배양 하는 방법은, 세포 특성 및 증식 속도에 따라 1:3 내지 1:10으로 계대 할 수 있다. 계대 비율에 계속 차이를 두면 증식 세포 집단 수 차이에 따른 세포 특성 변화가 우려 되므로 일반적으로 계대 비율은 한번 정해지면 계속 동일하게 유지하는 것이 바람직하다. 또한, 세포가 안정적으로 증식되는 것이 확인되면, 혈청의 농도를 10% 정도로 감소시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 계대 배양이 안정화되는 2번째 계대 시점에, 농도가 감소된 혈청이 포함된 배양액이 사용될 수 있다.
일측에 따르면, 상기 배양된 세포를 계대 배양하는 단계 이후에, 상기 계대 배양된 세포를 동결 보존 용액에서 동결 보존하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 동결 보존 용액은, 혈청, 혈장, SR (Serum replacement), DMSO, 글리세린 (Glycerin), 프로판다이올(Propanediol), 및 에틸렌 글리콜 (Ethylene glycol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
일실시예에 따르면, 상기 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법으로 세포를 배양하는 단계, 상기 배양된 세포를 이용하여 체세포 핵이식을 하는 단계 및 상기 체세포로부터 복제배아를 생산하는 단계를 포함하는 복제배아 생산방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법으로 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배양된 세포를 이용하여 줄기세포를 생산하는 단계를 포함하는 줄기세포 생산방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법으로 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배양된 세포를 이용하여 복제동물을 생산하는 단계를 포함하는 복제동물 생산방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법으로 배양된 세포를 제공한다.
도 1 및 도 2는, 일실시예에 따른, 고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법의 순서도이다.
일실시예에 따르면, 생물 사체 또는 화석 조직으로부터 불순물을 제거하는 단계(110), 상기 조직을 세척 및 소독하는 단계(120), 상기 조직을 효소 처리하는 단계(130), 상기 조직을 크기 별로 분류하고, 세포층을 분리하는 단계(140). 상기 조직을 플레이트 상에 접종하여 세포를 배양하는 단계(150), 상기 배양된 세포를 계대 배양하는 단계(160) 및 상기 배양된 세포를 동결 보존하는 단계(170)를 포함하는, 생물 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 조직을 세척 및 소독하는 단계(120)는, 상기 조직을 생리식염수를 이용하여 수화하고 세척하는 단계(121), 상기 세척된 조직을 알코올을 이용하여 소독하는 단계(122), 및 상기 소독된 조직을 생리식염수를 이용하여 세척하는 단계(123)을 포함할 수 있다.
또한, 일측에 따르면, 상기 도 1 및 도 2의 순서도에서, 생물 사체 또는 화석 조직으로부터 불순물을 제거하는 단계(110), 상기 조직을 크기 별로 분류하고, 세포층을 분리하는 단계(140), 및 상기 배양된 세포를 동결 보존하는 단계(170)는, 경우에 따라서 적절하게 수정되거나 생략될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1: 불순물 제거>
획득된 고대 멸종 생물 사체 및 화석 조직의 불순물들은 포셉 및 수술용 가위 등을 이용하여 제거하였다.
도 3은, 일실시예에 따른 획득된 조직으로부터 불순물 제거 단계를 나타낸 사진이다.
<실시예 2: 세척 및 소독>
불순물이 제거된 조직은 생리식염수가 들어있는 배양접시에 넣어 3회 세척한 다음 포셉과 가위를 이용해서 작은 덩어리로 자른 후 50 ml 코니컬 튜브에 넣었으며 생리식염수가 맑은 물 상태로 보일 때까지 계속해서 튜브를 뒤집어가며 충분히 세척하였다(5회 이상 실시). 배양 시 세포 오염을 막기 위해 앞서 세척된 조직은 앱솔루트 알코올 (absolute alcohol) 이 들어있는 새로운 50 ml 코니컬 튜브로 옮겨 대략 3분 정도 처리하였으며 알코올 제거를 위해서 다시 생리식염수로 5회 이상 씻어냈다. 도 4는, 일실시예에 따른 세척 및 소독 단계를 나타낸 사진이다.
<실시예 3: 효소처리>
세척 및 소독이 끝난 조직은 0.1 w/v % 콜라게나제 타입 I 용액에 넣어 1mm 미만의 크기로 될 때까지 수술용가위를 이용하여 잘게 잘랐으며 해당 조직 및 용액은 50 ml 코니컬 튜브로 옮겨 담아 37℃ shaking incubator에서 2시간 동안 반응시켰다.
도 5는, 일실시예에 따른 효소처리 단계를 나타낸 사진이다.
<실시예 4: 조직 및 세포층 분리>
효소처리가 끝난 조직 및 세포는 10 v/v % FBS (또는 BCS(Bovine Calf Serum), HS (horse serum))이 들어있는 배양액을 2배로 넣어주어 효소반응을 중지시켰으며 이들 조직 및 세포가 들어있는 50 ml 코니컬 튜브는 랙에 꼽아 세워 놓고 5분 이상 정치시켜 분리된 조직 및 세포가 튜브 아래부위로 침전되도록 유도한 다음 상층 용액은 50ml 피펫을 이용하여 제거하였다. 이후 배양액을 충분히 추가하여 튜브를 위아래로 뒤집기를 반복하여 섞어주며 다시 랙에 꼽아 정치시켜 조직 및 세포층을 침전되기까지 두 번 정도 반복하는 세척을 실시하였다. 배양을 위해 조직 및 세포층은 크기 별로 분리가 요구된다. 이를 위해 10ml 피펫을 이용하여 50ml 코니컬 튜브로부터 일단 10ml 배양액을 넣어 15ml 코니컬 튜브로 옮긴 후 추가 배양액을 넣어 정치하여 가라앉는 속도를 보면서 대략적으로 대, 중, 소 크기의 조직과 세포층으로 4개의 튜브로 나누었다.
도 6은, 일실시예에 따른 조직 및 세포층 분리 단계를 나타낸 사진이다.
<실시예 5: 조직 및 세포의 접종>
분리된 조직 및 세포 층 4군은 각각 초대세포배양용 배양액, 즉 20 v/v % FBS, 1 v/v % NEAA, 0.1 v/v % β-mercaptoethanol, 1 v/v % penicillin-streptomycin이 들어있는 high glucose DMEM 배양액으로 적당량으로 희석한 다음 0.1% 젤라틴이 코팅된 배양접시에 접종하고 37℃ 인큐베이터에 넣어 초대 배양을 실시하였다.
도 7은, 일실시예에 따른 조직 및 세포의 접종단계를 나타낸 사진이다.
<실시예 6: 초대세포배양 성공 확인>
초대세포배양 2일 후 배양 접시에 붙어 자라는 세포를 현미경상으로 확인하였다. 조직으로부터 자라나온 세포보다 분리된 단일세포군에서 먼저 자리잡은 것으로 나타나 이들 세포의 증식을 돕기위해 10ng/ml의 bFGF 를 첨가하였으며 증식 상태를 보면서 2~3일 간격으로 배양액을 교체하였다.
도 8은, 일실시예에 따른 배양 2일 째 세포가 배양접시에 붙어 존재함을 확인한 사진이다.
<실시예 7: 계대 배양 및 세포의 동결보존>
세포 증식이 안정화되었을 때 20% 혈청이 첨가된 배양액에서 10% 혈청이 첨가된 배양액, 즉 10% FBS, 1% NEAA, 0.1% β-mercaptoethanol, 1% penicillin-streptomycin이 들어있는 high glucose DMEM 배양액으로 변경하여 배양은 계속 실시하였다. 증식된 세포는 계대를 실시하였는데 세포 분리에 사용되는 TrypLE (Trypsin like enzyme)을 사용하여 1:4의 비율로 나누어 분리 배양하였다. 또한 다수 확보된 세포의 동결보존은 10% DMSO 동해제와 70% 혈청이 포함된 동결액을 사용하였다.
도 9는, 일실시예에 따른 건강하게 증식된 배양세포모습과 이를 일부 확대한 사진이다
<실시예 8: 염색체의 확인>
고대 멸종 생물 사체 및 화석으로부터 얻은 세포의 염색체 특성을 확인하기 위하여 염색체 분석을 하였다. 확인 방법은 다음과 같다. 1) 10 ㎖의 배양액이 담긴 각 배양 용기에 100 ㎍/㎕ 농도의 콜히친 용액 20 ㎕를 첨가하고 배양용기를 약하게 흔들어 잘 섞은 후, 37℃에 2시간 방치하였다. 2) 500 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 3) 상층액을 제거하고 약간의 배양액만을 남겼다. 4) 5 ㎖의 저장액(0.075 M KCl)에 세포를 부유시킨 후 37℃ 항온수조에 25분간 방치하였다. 5) 각 튜브에 새로 준비한 고정액(methanol : glacial acetic acid=3:1, v/v)을 5방울씩 첨가하고 튜브를 1~2회 약하게 섞어준 후 1,200 rpm에서 8분간 원심분리하였다. 6) 상층액을 제거한 후 5 ㎖의 고정액에 세포를 가볍게 두드려 부유시킨 후 상온에 10분간 방치하였다. 7) 5~6 과정을 2회 반복한 후 0.5 ㎖의 고정액에 부유시켰다. 8) 차가운 70 v/v % ethanol에 담가 둔 슬라이드 글라스 위에 세포 부유액을 한방울 떨어뜨렸다. 9) 알코올 램프 위에서 슬라이드의 ethanol을 건조시킨 후 공기 중에서 물기를 말렸다. 10) 5 w/v % Giemsa 용액에 12분간 담가두었다. 11) 슬라이드 글라스를 뒤집은 후 증류수로 염색액을 씻어냈다. 12) 공기 중에서 건조한 후 커버슬립을 덮고 현미경으로 관찰하였다.
도 10은, 일실시예에 따른 세포 내 염색체의 사진이다.
<실시예 9: 조직화학염색>
조직 내 세포 존재 유무를 확인하기 위해 H&E 염색 및 DAPI 염색을 진행하여 조직 내 세포가 존재하는 것을 확인하였다.
도 11은, 일실시예에 따른 조직자체 염색으로 조직 내에 특정 부위에 생존 세포가 있음을 확대해 보여주는 사진이다.
<실시예 10: 탄소연대측정>
조직의 연대를 측정하기 위해 방사성탄소연대측정법을 사용하여 조사하였다.
도 12a 및 12b는, 일실시예에 따른 조직의 탄소연대측정 개요 및 결과를 나타낸 그래프이다.
<실시예 11: 유전자 분석>
실시예 7에서 배양된 세포가 매머드의 세포임을 확인하기 위하여, 유전자 분석을 실시하였다. 국제적으로 신뢰할 수 있는 논문인 Nature 학술지에, 2006년 독일 막스플랑크 연구소에서 개제한 매머드 유전자 분석 결과를 참고하였다. 상기 매머드 DNA 염기서열은 미국 국립생물정보연구센터 (NCBI)에도 등록되어 있다. Nature 지에 발표된 매머드 특이 염기서열 중에서, 계통 분석에 이용할 수 있는 유전자로 Cox 1 (cytochrome c oxidase subunit 1) [Mammuthus primigenius (woolly mammoth)] 를 선정하였다.
도 13은, NCBI에 등록된 매머드 미토콘드리아 염기서열 및 프라이머의 염기서열 이다.
NCBI에 등록되어 있는 염기서열을 바탕으로 Cox1 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 디자인 하였다. 실시예 7의 배양된 세포로부터 게놈 DNA를 추출한 후에, 상기 프라이머를 이용하여 PCR로 Cox 1 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 pGEN-T-벡터에 클로닝 한 후에, 서열 분석을 하였다. 보다 구체적으로는, 정방향 및 역방향으로 5개의 클론의 염기서열을 분석하여, 벡터 내에 정확하게 Cox1 유전자가 발현되는 지를 최종적으로 확인하였다.
도 14는, pGEM-T 벡터를 나타낸 것이고, 도 15는, pGEM-T 벡터에 클로닝 한 후 서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14의 분석 결과를 참고하면, pGEM-Cox1-1-T7, pGEM-Cox1-1-T9, pGEM-Cox1-1-T10의 경우, PCR로 증폭된 Cox1 유전자가 pGEM-T 벡터 내에 삽입된 것을 확인할 수 있다. 이 중에서, pGEM-Cox1-1-T7의 분석된 염기서열이 매머드 유래 Cox1 유전자와 일치하는지 NCBI의 BLAST 를 이용하여 확인하였다.
도 16은, pGEM-Cox1-1-T7의 염기서열 일부를 나타낸 것이다.
도 17a 및 17b는, NCBI에서 제공하는 BLAST 분석 결과를 나타낸 것이다.
NCBI에서 제공하는 BLAST를 이용하여, 상기 분석된 염기서열이 NCBI에 등록된 미토콘드리아 Cox1 유전자와 100% 일치하는 것을 확인하였다.
실시예 1 내지 7의 방법으로 배양된 세포로부터 추출한 DNA를 분석한 결과, 상기 DNA는 매머드 특이적 유전자 Cox 1라는 점이 확인되었으므로, 상기 세포는 매머드의 세포라는 점이 확인 되었다.
<실시예 12: 체세포핵이식 복제배아 생산>
상기 배양된 체세포를 이용하여 이종간 체세포핵이식 복제배아의 생산 및 체외 배양 가능성을 조사하였다. i) 체세포핵이식을 위한 수핵 난자는 22시간 체외성숙된 이종의 소 난자를 사용하였으며 0.1 w/v % 하이알루로니다제가 첨가된 TL-HEPES 배양액에서 난구세포를 제거한 다음 제1극체가 방출된 난자만을 선별하여 사용하였다. 탈핵을 위해 난자는 0.5㎍/ml Hoechst 33342(Sigma사 제조)와 7.5㎍/ml cytochalasin b가 첨가된 TCM-HEPES 용액에서 10분간 염색한 뒤 형광현미경 하에서 제1 극체와 핵을 제거하였다.ii) 핵이식에 사용될 공여 세포는 상기 배양된 고대 사체 체세포를 사용하였다. 핵이식 시 공여 체세포는 0.25 w/v % trypsin-EDTA 용액으로 처리하여 단일세포로 분리한 후 10% FBS가 첨가된 체세포 배양액으로 한번 세척한 후 다시 D-PBS로 세척하여 준비하였다. iii) 체세포 핵이식을 위해 공여 체세포는 10~15 ㎛ 크기만을 골라 체세포 주입용 피펫으로 핵이 제거된 수핵 난자의 투명대와 세포질 사이의 공간으로 주입하였다. iv) 세포융합을 위해 체세포가 주입된 난자를 0.3M 만니톨(mannitol) 용액 내에서 LF101 Electro Cell Fusion Generator(NEPA GENE사, 일본)를 사용하여 직류(DC)로 20 volt에서 1 pulse로 세포 융합을 실시하였다. 세포융합 여부는 전기자극 30분 후에 관찰하였다. v) 난활성을 위해 융합이 확인된 핵이식란을 10μM 칼슘 아이오노마이신이 들어있는 CR1aa 배양액에서 5분 동안 활성화를 유도하고, 2 μM 6-디메틸아미노퓨린(6-dimethylaminopurine)이 들어있는 CR1aa 배양액에서 3시간 동안 배양하였다.vi) 핵이식 후 활성화 처리된 난자는 3mg/ml fatty acid free BSA가 들어 있는 CR1aa 용액에 옮겨 배양하고, 배양. 24시간째 분열된 분할구가 보이는 배아를 10% 소혈청이 들어있는 CR1aa 배양액에 넣어 추가적으로 더 배양하였다.
또한, 본 실험에서 획득한 고대사체세포를 공여세포로 한 이종간 체세포핵이식 복제배아 생산 연구를 실시한 결과는 표 1과 같다. (표 1: 이종간 핵이식에 의한 체세포 복제 배아 생산 및 배아 발달 (r=4))
| 처리군 |
체세포 핵이식 공시난자 수 |
세포 융합 난자 수(%) |
배아 수 (%) | |
| 배양 2일 째 난할 (＞2-세포기) |
배양 4일 째 난할 (＞8-세포기)* |
|||
| M cell | 178 | 92 (51.7%) | 44 (47.8)b | 31 (33.7)b |
총 4회 반복실험에서 178개의 소 성숙난자를 사용하여 체세포핵이식을 실시하였던 바, 고대사체 세포 (M cell)와 소 난자와의 세포 융합은 51.7%를 나타냈으며 배양 2일 째 난할율은 47.8%, 배양 4일 째 8세포기 이상 분열된 세포는 33.7%를 나타내었다.
도 18은 일실시예에 따른 체세포핵이식 과정 및 이로부터 생산될수 있는 복제배아 사진이다.
<실시예 13: 복제동물을 생산하는 방법>
상기 배양된 체세포를 이용하여 복제동물을 생산하는 과정은 개략적으로 다음과 같다. 복제동물 생산은 크게 복제배아를 생산하는 과정과 생산된 복제배아를 대리모에 이식하여 착상과 임신을 유도하는 과정으로 나뉜다. 복제 배아를 생산함에 있어서도 수핵난자는 동종을 사용하는 것이 복제배아 생산에 가장 유리하나 동종의 수핵난자 획득이 어렵다면 본 연구의 실시예 12에서 나타낸 바와 같이 이종의 수핵난자를 선택해야 한다. 공여세포를 사용해서 체세포핵이식과정을 통해 복제 배아를 생산하는 방법은 실시예 12에 나타낸 바와 같다. 또한 복제동물 생산을 위해 상기의 방법으로 생산된 복제 배반포기 배아는 동기화가 유도된 대리모의 자궁이나 자연주기 대리모의 자궁에 이식하여 착상을 유도하고 발정 재개여부를 확인하며 임신이 안전하게 유지될 때 초음파 진단기를 통하여 임신 여부를 확인하게 된다.
<실시예 14: 줄기세포를 생산하는 단계>
상기 배양된 체세포를 이용하여 줄기세포를 생산하는 방법은 개략적으로 다음과 같다. 줄기세포는 체세포유래 다능성 줄기세포 생산과정으로부터 또는 체세포핵이식 복제배아 유래 줄기세포 생산방법으로부터 획득이 가능하다. i) 체세포유래 다능성줄기세포 생산은 줄기세포 유도인자인 Oct4 유전자, Sox2 유전자, Nanog 유전자, Lin 유전자, C-myc 유전자 및 Klf4 유전자들이 도입된 각각의 바이러스를 생산하는 단계, 상기 각각의 바이러스들을 농축 및 혼합하여 적정한 바이러스 농축혼합액을 준비하는 단계, 이들 바이러스 용액을 준비된 체세포에 도입하는 단계, 및 상기 유전자들이 도입된 체세포를 배양하는 단계의 과정이 포함된다. ii) 체세포핵이식 복제배아 유래 줄기세포 생산은 실시예 12를 통하여 생산된 배반포기 배아를 활용하는 방법이다. 이는 복제배아유래 줄기세포를 만드는 방법으로 복제배아의 투명대를 제거하는 단계, 면역절제술을 통하여 영양배엽세포층을 제거하는 단계, 내부세포괴만을 회수하여 지지세포위에 배양하는단계, 유사 배아줄기세포덩어리를 증식시키는 단계의 과정이 포함된다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.
Claims (21)
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- 매머드 사체의 조직을 세척 및 소독하는 단계;
상기 조직을 37℃에서 2시간 동안 0.1w/v % 농도의 콜로게나제 타입 I 용액으로 효소 처리하는 단계;
상기 효소 처리된 조직 및 세포층을 크기별로 분리하는 단계;
상기 분리된 조직 및 세포층을 각각 초대세포 배양용 배양액 20 v/v % FBS, 1 v/v % NEAA, 0.1 v/v % 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1 v/v % 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 들어있는 DMEM으로 희석하여 플레이트 상에 접종하는 단계;
상기 플레이트에 10ng/ml의 bFGF를 첨가하여 상기 조직 및 세포층으로부터 초대세포를 배양하는 단계;
상기 배양된 세포를 10% FBS, 1% NEAA, 0.1% 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 들어있는 DMEM으로 배양액을 변경하여 1:3 내지 1:10으로 계대 배양하는 단계;
미국 국립생물정보연구센터(NCBI)에 등록된 매머드 DNA 염기서열 중 Cox 1 (cytochrome c oxidase subunit 1)을 매머드 판별 유전자로 선정하는 단계; 및
상기 배양된 세포로부터 상기 매머드 판별 유전자 Cox 1 (cytochrome c oxidase subunit 1)의 발현여부를 확인하는 단계; 를 포함하고,
상기 계대 배양하는 단계 이후에,
상기 계대 배양된 세포를 10% DMSO 동해제 및 70% 혈청이 포함된 동결액으로 동결 보존하는 단계를 더 포함하는 것인,
매머드 사체의 조직으로부터 세포를 배양하는 방법.
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- 제17항의 방법으로 세포를 배양하는 단계;
상기 배양된 세포를 이용하여 체세포 핵이식을 하는 단계; 및
상기 체세포로부터 매머드 복제배아를 생산하는 단계;를 포함하는,
매머드 복제배아 생산방법.
- 제17항의 방법으로 세포를 배양하는 단계; 및
상기 배양된 세포를 이용하여 매머드 줄기세포를 생산하는 단계;를 포함하는,
매머드 줄기세포 생산방법.
- 제17항의 방법으로 세포를 배양하는 단계; 및
상기 배양된 세포를 이용하여 매머드 복제동물을 생산하는 단계;를 포함하는,
매머드 복제동물 생산방법.
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