KR20050050075A - 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생존 가능한사람의 간세포를 획득하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간장 전부 또는 그 절제물로부터 간 세포 및 간 줄기/프로제니터 세포가 강화된 생존 가능하고 기능적인 세포를 포함하는 세포 집단을 획득하는 방법, 그 조성물 및 용도에 관한 것이다. 조성물은 간세포 및 간의 줄기/프로제니터 세포가 강화된 간장 세포의 조성물 및 그의 의약 조성물을 포함한다. 용도는 간장 질환의 치료, 간장의 재생, 독성 테스트 및 간장 보조 장치를 포함한다.

Description

간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생존 가능한 사람의 간세포를 획득하는 방법{METHOD OF OBTAINING VIABLE HUMAN LIVER CELLS, INCLUDING HEPATIC STEM/PROGENITOR CELLS}
본 발명은 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생존 가능한 사람의 간세포를 획득하는 방법에 관한 것이다.
정상 간은 손상 조직의 치유나 복원에 의해 스스로 재생시키는 능력을 가진다. 이러한 방어에도 불구하고, 일단 간세포의 임계량이 질환이나 손상으로 사멸하면 간은 약해져 질병 및 사망에 이른다. 간장 부전은 심각한 건강 문제이다. 매년, 미국에서는 만성 간 질환으로 약 300,000명이 입원하고, 30,000명이 사망하고 있다. 현재, 이들 간 질환의 대부분의 유일한 치료는 간장 이식법이다. 그러나, 미국에서 매년 겨우 약 5,000명의 공여자의 간장만이 입수 가능할 뿐이다. 2002년 5월 현재, 약 18,000명의 환자가 간 이식 대기 명단에 올라 있고, 10년 전 1,700명에서 지난 4년 동안 100% 이상 증가하고 있다. 게다가 현재 미국의 중증 간경변 및 만성 간부전의 다른 형태를 앓고 있는 약 100,000명의 성인이 이식의 후보로 되어 있다.
이식용 공여자의 기관의 부족으로 인하여, 잠재적인 간이식 환자들은 이식용으로 제공되는 간을 이용할 수 있게 되기까지 대개 수년간 기다려야만 한다. 현재, 전체 기관 간 이식 처치에는 뇌사 상태이나 심장 박동은 계속되는 공여자가 요구된다. 이는 병원 사망자 총수의 약 1∼2퍼센트에 해당하여 공여자 풀(donor pool)이 극도로 제한된다. 명백한 것은 대다수의 간 질환 환자는 그의 해결책으로 장기 이식에 의존할 수가 없는 것이다. 손상된 간을 가진 환자를 지원하는 신기술에 대한 요구가 긴박한 실정이다.
간의 재생능은 간세포 이식이 동소성간이식(同所性肝移植)의 가치 있는 대체사항일 수 있음을 제시한다. 간질환 환자에게 주입되는 공여자 간세포는 수취인의 간(및/또는 비장, 그 기관에 주입되는 경우)에 이식되어 기능을 회복할 수 있다. 그러나, 성숙 간세포가 장기간 생존하고, 이식 후, 그의 숫자를 확장시킬 가능성은 불확실하다.
통상의 지혜는 모든 성숙된 성인 간세포(간장세포)가 계속하여 분화하여 손상 후의 기관을 재생시킬 수 있을 것으로 생각한다. 그러나, 간 유래의 실질 세포의 재생 가능성의 범위에 대한 인식이 높아지고 있다. 설치동물 간세포의 연구에 있어서, 중심 부위로부터의 성숙 간세포는 제한된 세포 분열이 일어나며; 가끔 작은 간세포라고 불리는 문맥 주위의 성인의 간세포는 보다 큰 재생능을 가지나, 한정된 수의 세포 분열만을 일으키며; 또한, 가장 큰 재생능은 광범위하게 번식하고 성숙 간세포를 만들어 낼 수 있는 특성과 같은 줄기 또는 프로제니터를 수반하는 2배체 실질 세포의 작은 집단에 존재한다[Kubota H and Reid LM. 2000. 보통 간세포 및 담즙 혈통을 위한 전구물질인 클론원성의 간모세포는 고전적인 주요한 조직 적합 복합체 클래스Ⅰ 항원이 결여되어 있다. Proceedings of the National Academy of sciences(USA) 97：12132-12137.]. 간 줄기/프로제니터 세포는 간 혈통에 보내지나, 대부분 성숙 간세포 기능을 아직 발현하지 않는 미숙 세포의 집단이다. 그러나, 이들은 광범위하게 증식할 수 있으며, 간 기능을 제공하는 완전히 분화된 낭세포를 발생시킬 수 있다. 설치동물 모델의 연구는 적어도 2분화능인, 태아와 성인의 간의 줄기/프로제니터 세포의 존재를 나타냈다. 즉, 그들의 후계자는 2개의 세포 형태, 즉, 간세포 및 담관 세포를 포함한다 [Kubota H and Reid LM. 2000. 보통 간세포 및 담즙 혈통을 위한 전구물질인 클론원성의 간모세포는 고전적인 주요한 조직 적합 복합체 클래스Ⅰ 항원이 결여되어 있다. Proceedings of the National Academy of sciences(USA) 97：12132-12137.]. 성인의 간에서, 줄기/프로제니터 세포는 수취인의 성숙한 간세포가 파괴되고 증식능이 손상된 어떤 종류의 간 손상을 따르는 호스트 간의 재생에 관여하며, 광범위하게 번식시키는 것을 나타내었다.
지난 30년 동안, 과학적인 문헌의 주요한 내용은 주입된 성인의 간으로부터 분리되는 간세포의 호스트 조직에 대해 이식하고, 생존하며, 증식하며, 기능하며, 재생 과정에 참여하는 능력을 설명하는 것이 축적되어 있다. 비장 또는 간에의 간세포의 이식은 다수의 모델에 있어 대사의 유전 결함을 고치고, 호스트 간세포를 잃거나 또는 단축된 수명을 가지는 조건 하에서 호스트 간세포를 완전하게 재생하고(FAH-결핍 마우스 모델에서와 같이), 다양한 공격에 의해 야기된 급성 간 부전 중에 간 기능을 제공하며, 사염화탄소 유발 간 경변 모델에서 간 기능을 향상시켜 생존을 연장시키는 것을 나타내었다.
문헌에서의 사례 연구 및 보고는 다양한 급성 및 만성, 선천성 및 후천성 간 질환을 가진 40명 이상의 환자에의 간세포 투여를 설명한다[Storm SC, Chowdhury JR, and Fox IJ. 1999. 사람의 질환의 치료를 위한 간세포 이식(Review). Seminars in Liver Disease 19:39-48.]. 많은 이러한 보고의 데이터는 세포가 실제로 이식되어 생존하여, 몇 개월 이상 기능함을 제시한다. 하나의 연구에서, 간의 합성능은 알부민 레벨 및 프로트롬빈 시간에 의해 증명된 것처럼 이식 후 4∼6개월의 향상을 나타내었다. 이식 및 이식된 간세포를 설명하는 발행되는 최고의 보고서 중 하나는 황달을 일으키는 빌리루빈을 접합시키는 효소 UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제(glucuronosyltransferase)가 결핍된 유전 질환인 크리글러-나자르 증후군(Crigler-Najjar Syndrome)을 앓고 있는 10세의 여아에 대한 보고이다[Fox et al., IJ., "Crigler-Najjar Syndrome 치료법. 간세포 이식을 수반하는 Type Ⅰ, "New England Journal of Medicine, (1998) 338: 1422-1426.]. 이식 후 18개월 동안 그녀는 담즙에서 접합된 빌리루빈이 상당히 많이 배설하고, 간 검사에서 효소 활성의 증가 및 자외선 광선 요법의 필요성의 감소를 경험하였다. 그러나, 이식된 간세포의 이러한 종래의 실험은 일시적인 이점으로 되었다. 단독으로 성숙 간세포의 증식능이 저하되고, 이는 필연적으로 간세포를 이용한 치료의 효과적 수명을 제한한다.
간 질환을 치료하려는 종래의 시도의 전술한 문제점은 본 발명의 생존 가능하고 기능적인 간세포가 강화된 세포 집단을 이용함으로써 해결될 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 세포의 광범위한 증식능은 최대의 조직 재생을 유지하고, 성공적인 이식을 위한 세포의 투여량을 낮춘다. 줄기/프로제니터 세포의 존재는 생존하고 증식하며, 기능하고, 재생에 참여하는 성숙한 간세포와 관하여 그의 향상된 능력으로 인하여 효과적으로 향상된 수명 연장된 간세포 치료를 제공한다.
간세포 치료가 상당한 수의 환자를 위하여 상업적인 현실성과 생존 가능한 치료 옵션이 되어야 한다면, 간 조직의 적절한 공급이 확립되어야 한다. 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 세포가 전체 기관 이식에 적합지 않거나 또는 시간 또는 운송상의 제한 때문에 적시의 방법으로 이용될 수 없는 특정의 장기 공여자의 간에서 유래할 수가 있음이 밝혀졌다. 생존 가능하며 기능적인 간세포는 종래의 가이드라인에 의해서는 동소성 이식에 적합지 않거나 또는 세포 이식을 위한 대량의 성숙한 간세포의 준비에는 적합지 않은 간으로부터 본 발명의 방법에 의하여 분리될 수 있다. 가장 중요하게는, 본 발명의 방법에 의하여 줄기/프로제니터 세포를 포함한 사람 간세포 집단의 정제는 간세포 치료를 위한 공여자 풀(donor pool)을 극적으로 확장시킬 것이 기대된다. 게다가 분명하게 허혈성 손상에 대한 줄기/프로제니터 세포의 상대적인 내성 때문에, 이러한 세포가 본 방법에 의하여 많은 심장 비수축인(즉, 비박동심장) 공여자로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 분리 방법은 이식용 제공 간으로부터 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 기능적인 간세포가 냉동 보존된 세포 혼합물에 포함되는 것을 확실하게 한다. 이 과정은 기증된 사람의 간의 전부 또는 그의 절제물(천연 간 제제와 비교해)로부터 생존 가능한 간세포 현탁액을 보다 많이 분리하며, 작은 간의 줄기/프로제니터 세포 집단의 과도한 결핍 없이 죽은 세포 및 조직 파편을 제거한다. 얻어지는 세포 집단은 냉동 보존 전 생존 가능한 세포의 80% 이상, 해동 후 세포의 70% 이상 그리고 세포의 75% 이상인 간세포를 포함할 수가 있다.
대조적으로, 퍼콜(Percoll)을 포함하는 배지를 통한 많은 사례에 있어서, 주지의 분리방법은 저속 원심분리를 이용하여 생 간세포(펠렛 포스트 원심분리에서 발견되는)를 강화시킨다. 이 방법이 큰 생존 가능한 간세포, 특히 보다 큰 간세포를 분리하는데에는 매우 효율적이지만, 그것은 간의 줄기/프로제니터 세포의 상당한 결핍 및 보다 작은 성인의 간세포의 상당한 상실에 이른다.
본 발명은 약학적으로 양질인 간세포 이식 또는 세포 치료용 제품 및 종래 방법에 의하여 얻어질 수 없는 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생존 가능성이 높으며 기능적인 간세포 집단을 획득하는 방법을 제공함으로써, 전술한 요구에 대처하여 간세포 이식 또는 세포 치료의 수준을 향상시킨다. 본 발명의 간세포 이식 또는 세포 치료 제품은 간에서 발견되는 다른 세포 형태 뿐 아니라 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하고 있는 간세포의 특징적인 혼합물로 구성된다.
도 1은 상대적으로 작은 피크(일반적으로 9∼13uM으로부터 변동함)와 상대적으로 큰 피크(일반적으로 18∼22uM으로부터 변동함)로 명시한 세포의 2개의 피크를 나타내는 신규 OptiPrepTM 분획 방법을 위한 Coulter Counter sizing profile이다.
도 2는 큰 세포(18∼22uM)의 상대적인 다량이 상응하는 상등액 (300 x g) 보다 퍼콜 펠렛(100 x g)에 더 많음을 나타내는 표준(종래) 퍼콜 방법을 위한 Coulter Counter sizing profile이다.
도 3은 퍼콜 펠렛(100 x g)이 출발물질(우측 판넬, EP-CAM에 대하여 0.76%의 집단이 (+)) 보다 6배 적은 EP-CAM 양성염색 세포(좌측 판넬, EP-CAM에 대하여 0.12%의 집단이 (+))를 포함하고 있음을 나타내는 사람의 EP-CAM에 고유한 항체를 가지는 면역 염색에 따른 FACS 분석의 결과를 나타낸다.
도 4는 OptiPrepTM 분획이 EP-CAM 양성염색 집단의 총량(분획된 샘플 및 미분획된 샘플에서 EP-CAM 에 대하여 양성 염색 집단이 각각 3.07%, 3.06%)에는 영향을 미치지 않음을 나타내는 사람의 EP-CAM에 고유한 항체를 가지는 면역 염색에 따른 FACS 분석의 결과를 나타낸다
도 5는 표준 방법(중심 프레임)의 상등액와 표준의 방법(오른쪽 프레임)의 펠렛과 비교하여 본 발명(왼쪽 프레임)의 세포 분리에서 발견되는 EP-CAM 양성 세포의 상대적인 집단을 나타내는 그래프이다.
도 6은 표준의 방법(중심 프레임)의 상등액와 표준의 방법(오른쪽 프레임)의 펠렛과 비교하여 본 발명(왼쪽 프레임)의 세포 분리에서 발견되는 EP-CAM 양성 세포의 상대적인 집단을 나타내는 그래프이다.
도 7은 면역선택 후 EP-CAM 양성 세포를 위한 강화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 면역선택 후 EP-CAM햇빛 세포를 위한 강화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 방법에 의하여 분리되는 세포가 간의 줄기/프로제니터 세포인 것을 증명하는, 다양한 염색 조건 하에서 단세포로부터 발달하는 콜로니의 현미경 사진을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 방법에 의하여 분리되는 세포가 간의 줄기/프로제니터 세포인 것을 증명하는, 다양한 염색 조건 하에서 단세포로부터 발달하는 콜로니의 현미경 사진을 나타낸다.
도 11은 NOD-SCID 마우스의 마이크로 캐리어(microcarrier) 비즈 상에 본 발명에 의해 얻어진 사람의 간세포의 현미경 사진을 나타낸다.
도 12는 적혈구에 의해 증명된 것처럼, 호스트(host)에 의해 혈관을 지나가게 되는 간세포의 넓은 섬을 시각화하기 위한, 도 11의 현미경 사진보다 낮은 전력에서 찍히는 현미경 사진을 나타낸다.
도.13은 세포질에서 글리코겐에 대한 양성염색을 설명하는, 본 발명의 간의 줄기/프로제니터 세포가 간세포로 발달할 수 있으며, 성숙한 표현형을 발현할 수 있다는 증거를 나타낸다. 세포의 식별할 수 있는 기관은 코드로 강조한다.
도 14는 호스트에게 주입되는 마이크로 캐리어에 부착되는 본 발명에 의해 얻어지는 3개의 간세포를 나타낸다. 까만 박스는 2개의 인접한 세포간의 인터페이스 주변에 도시된다. 그 영역의 파열은 구조, 미세융모, 모세담관의 표시, 다른 성숙한 간세포 표지를 나타낸다.
도 15는 본 발명에 의한 냉동 보존된 사람의 간세포의 NOD-SCID 마우스의 간으로의 이식을 설명하는 현미경 사진을 나타낸다. 이식 후 2시간, 사람의 세포는 문맥 및 간 지누소이드에서 인 시츄 하이브리디제이션(in situ hybridization)에 의하여 분명하게 보인다. 세포는 아직 맥관 스페이스로부터 간 실질에 통과하지 않았다.
도 16은 본 발명에 의한 냉동 보존된 사람의 간세포의 NOD-SCID 마우스의 간으로의 이식을 설명하는 현미경 사진을 나타낸다. 이식 후 40일, 사람의 세포는 간에 남아 있을 뿐 아니라 간 실질로 완전하게 통합되는 간의 세포판에 이식되었다.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
본 발명은 생존 가능하며 기능적인 간세포 및 간 줄기/프로제니터 세포가 강화된 세포 집단을 획득하기 위한 방법을 목적으로 한다. 본 발명의 다른 목적은 간 줄기/프로제니터 세포의 식별이다. 후술하는 본 발명의 실시예는 성인 사람의 간으로부터 간의 줄기/프로제니터 세포의 식별과 분리에 중요한 진보를 가져올 것이다.
몇몇의 세포 표면 단백질은 사람 태아의 간으로부터 분리되는 간의 줄기/프로제니터 세포에 의해 발현되는 것으로 알려진다. 같은 표면 항원이 신생아, 소아, 성인 사람의 간에서 작은 퍼센티지의 세포에 의하여 발현되는 것이 알려졌다. 자기 세포 분류 기술(Magnetic cell sorting technology)은 표면 항원 중 하나를 발현하는 세포를 크게 강화하기 위하여 이용된다. 이 방법에 따라 분리되는 세포는 간 예비 세포(미국특허 제5,559,022호)와 같이 크고(성숙한 실질 세포보다 큰) 호산성(acidophilic)인 클래스를 식별하는 종래의 설치류의 간 줄기/프로제니터 세포에 대한 연구와는 대조적으로 성숙한 간세포보다 평균적으로 매우 작다. 게다가 대다수의 세포도, 태아의 간 줄기/프로제니터 세포의 제2 항원 특성을 발현한다. 설치류의 간의 줄기/프로제니터의 성장을 위해 엄격히 선택되며 보다 성숙한 간세포의 성장을 제한하는 조건 하에서 배양될 때 분류된 성인 사람의 세포는 강화된 성장 잠재력을 나타낸다. 가장 인상적으로, 분류된 집단의 단세포로부터 발달하는 콜로니 분석은 간의 줄기/프로제니터 세포의 이중 잠재력에서 예기 되듯이, 간세포 및 담관 혈통의 단백질 특성 발현을 나타낸다.
본 발명에 있어서는, 특성 표면 항원을 발현하는 세포가 채취 전에 수시간 심각한 산소 박탈로 고통받은 간(비고동-심장 제공자로부터)에 존재하는 그대로인 것이 현저하다. 실제, 간의 줄기/프로제니터 세포는 성숙한 간세포보다 허혈에 상당히 내성을 가지는 것으로 보인다. 게다가 심장 비수축인 제공자로부터의 전체 간세포 제제가 일반적으로 조직 손상 및 염증 반응과 관련되는 세포를 매우 많이 포함하지만, 본 발명의 방법에 의하여 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생존 가능하고 기능적인 간세포를 높은 정도로 강화하는 것은 여전히 실행 가능하다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 면역 선택 및 자기 분류 기술이 간으로부터 얻어지는 선택된 세포 형태를 분리하거나 또는 제거하기 위해서 이용된다.
생존 가능하며 기능적인 사람의 간세포를 강화하는데 이용되는 본 발명에 의한 방법은 전체 간세포 제제 또는 간의 절제물로부터의 제제에 직접적으로 적용될 수 있다. 방법은 신속하며, 세포 산출율 및 생존력에 있어서 유리하고, 몇 백억 개의 세포를 처리하기 위해서 확대·축소될 수가 있다. 분리된 세포는 용이하게 냉동 보존되고 해동될 때 생존력을 유지한다.
본 발명은 생존 가능한 간세포가 간이 전체 장기 이식을 위해서 사용될 수 없는 비 막동 심장 공여자 간을 포함하는 다양한 간 공급원으로부터 사후에 분리될 수 있음을 나타낸다. 본 발명의 간세포 집단은 심장 비수축인 공여자로부터 얻어질 수 있기 때문에, 본 발명은 간세포 이식 또는 세포 치료에의 사용에 적합한 이식용 제공 장기의 풀을 상당히 확장한다. 표 1은 심장 박동 및 심장 비수축인 제공자로부터의 산출율을 요약한다.
표 1.
4.1.본 발명에 의한 분리 방법 및 표준(종래) 방법과의 비교
조직을 콜라게나제의 정제된 형태인 LiberaseTM 으로 관류시키고, 얻어진 세포 현탁액을 수집함으로써 세포는 전체 이식용 제공 간 또는 그의 절제물로부터 분리된다. 사멸 세포로부터 생세포를 분리하기 위하여 두 가지 방법이 검토될 수 있다. 본 발명에 의한 신규 방법에 있어서, 하기와 같이 간세포 현탁액의 일정량이 동량의 이오디사놀 수용액(iodixanol; OptiPrepTM, 물에 60%의 이오디사놀, Axis-Shield, Noway) 혼합되고, 실온에서 15분간 Cobe2991TM 세포 워셔(cell washer) (Blood Component Tec1mology, Lakewood, CO로부터 입수 가능)에서 2000 rpm(약 500 x g)으로 원심분리된다.
멸균된 500㎖의 병에 208.5㎖의 OptiPrepTM과 페놀 레드가 결여된 RPMI-1640 291.5m를 가한다. 이는 1.12의 밀도를 가지는 25%의 이오디사놀 용액이 된다. 중량에 근거해 세포의 양을 산출한 후, 페놀 레드가 결여된 RPMI-1640을 충분히 가하여, 총 세포수 10×109(40×106개 세포/㎖)를 가지며 최종 부피가 250㎖ 이상 되도록 한다. 25%의 이오디사놀 용액 250㎖를 가하고, 잘 혼합되도록 천천히 젓는다. 생성 이오디사놀 세포 용액을 중력에 의해 COBE 2991TM 세포 워셔-프로세싱 백에 채운다. 백이 회전하는 동안에 연동 펌프를 사용하여 20㎖/min의 속도로 이오디사놀 세포 용액 상층부에 페놀 레드가 결여된 RPMI-1640 100 ㎖의 층을 이루게 한다. 총 15분간 2000rpm(약 500 x g)으로 원심분리한다. 이오디사놀 세포 용액과 페놀 레드가 결여된 RPMI-1640 사이의 인터페이스에 결과적으로 생기는 간세포 밴드는 펠렛으로 되어진 물질과 별도로 회수된다.
상기한 조건에 이르는 개별적인 실험에서, 출발물질의 밀도 및 "Umix"밴드, 구배량 밴드 및 펠렛으로 표시되는 것을 포함하는 선택된 원심분리 밴드가 결정된다. 대상이 되는 밴드인 "Umix"밴드가 1.0607의 밀도를 가진다. 이 밀도치는 출발물질(1.0792), 구배량 밴드(1.0792) 및 펠렛(1.1061)의 값보다 작다. 그리고, 11.59% 이오디사놀의 용액이 대상이 되는 세포가 원심분리 후에 가라앉도록 구배를 제공하는데 필요하다고 결정된다.
간세포 제제를 위한 표준 방법 중 하나에 있어서, 일정양의 간세포 현탁액은 아이소토닉(isotonic) 퍼콜(Sigma, MO)과 혼합되어 최종 농도 22.5%의 퍼콜이 된다. Sorvall RC3B 원심분리기로 4℃에서 5분동안 100 x g로 행한 원심분리에 따라 펠렛이 회수된다. 종래의 방법의 교시에서 상청이 저생존력을 지닌 세포를 포함하며, 일반적으로 보다 많은 세포 파편을 포함한다고 하는 종래의 신념 때문에 상청이 버려지는 점에 유의할 필요가 있다. 대조 목적으로, 상청이 회수되고 5배 희석되며 4℃에서 5분 동안 300 x g로 원심분리되며 결과적인 펠렛이 회수된다. 간세포 제제를 위한 다른 주요한 표준 방법은 간의 효소의 분해에 의한 간세포 현탁액을 분리하고, 일반적으로 약 50 g로 저속 원심분리에 의해 세포를 회전시킨다. 펠렛으로 된 세포는 유지되며, 상청의 세포는 버려진다.
트립판 블루 배제는 100 x g의 퍼콜 펠렛이 퍼콜 상등액(40∼60% 범위)과 비교하여 생존 가능한 세포(70∼90% 범위)가 강화됨을 나타낸다. 대조적으로, 본 발명에 의한 OptiPrepTM 구배를 위하여 세포의 최상단 밴드는 펠렛으로 된 물질 (일반적으로 20% 미만)과 비교하여 생존 가능한 세포(80∼90%)가 강화된다. Coulter Counter를 이용한 사이즈 분석은 펠렛보다 9∼13uM의 직경 범위인 보다 큰 세포 집단을 포함하는 퍼콜 상등액과 비교하여 퍼콜 펠렛에 보다 큰 세포(직경 18∼22uM)의 강화를 나타낸다. OptiPrepTM 구배에서 최상 밴드는 직경 18∼22uM의 세포와 직경 9∼13uM의 세포를 모두 포함한다. OptiPrepTM 펠렛에 대한 사이즈 분포 판정은 많은 양의 파편에 의한 문제를 가진다. 이러한 세포의 EP-CAM 면역 염색에 따른 형광 표지 세포 분리(FACS) 분석은 퍼콜을 통한 침전이 퍼콜 상등액에서 뒤에 남아있는 양성 세포인 EP-CAM 양성 염색 세포의 결여로 되는 것을 나타낸다. OptiPrepTM 구배의 최상 밴드는 퍼콜의 상등액과 유사하게 EP-CAM 양성 세포 집단을 가진다. 퍼콜 상등액은 OptiPrepTM 구배의 최상 밴드와 동등한 수준의 콜로니 형성 능력을 가지는 반면, 콜로니 형성 분석은 퍼콜 펠렛에서 발견되는 세포에 대하여 실질적으로 콜로니를 형성하지 않음을 나타낸다. EP-CAM 양성 세포의 강화가 또한 세포 제제의 콜로니 형성 능력을 강화하기 때문에, 이 콜로니 형성 능력은 EP-CAM 양성 염색과 관련한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 신규 OptiPrepTM 분획 방법을 위한 Coulter Counter sizing profile은 상대적으로 작은 피크(일반적으로 직경 9∼13uM의 범위)와 상대적으로 큰 피크(일반적으로 직경 18∼22uM의 범위)로 명시한 세포의 2개의 피크를 나타낸다. 작은 세포 집단은 크기가 약 10uM이기 때문에 줄기/프로제니터 세포를 포함한다. 이러한 두 세포 집단의 상대적인 양은 피크 집단의 미크론의 평균 크기가 그러하듯이 기증용 제공 간장에 의존하여 변화한다.
도 2는 표준(종래) 퍼콜 방법에 따른 큰 세포(18∼22 uM)의 상대적인 다량이 상응하는 상등액(300 x g)보다 퍼콜 펠렛(100 x g)에 더 많음을 나타낸다.
도 3은 퍼콜 펠렛(100 x g)이 출발물질(우측 판넬, EP-CAM에 대하여 0.76%의 집단이 (+)) 보다 6배 적은 EP-CAM 양성염색 세포(좌측 판넬, EP-CAM에 대하여 0.12%의 집단이 (+))를 포함하고 있음을 나타내는 사람의 EP-CAM에 고유한 항체를 가지는 면역 염색에 따른 FACS 분석의 결과를 나타낸다.
대조적으로, 도 4에 나타난 바와 같이, 그림 4에 나타낸 바와 같이, OptiPrepTM 분획이 EP-CAM 양성염색 집단의 총량(분획된 샘플 및 미분획된 샘플에서 EP-CAM 에 대하여 양성 염색 집단이 각각 3.07%, 3.06%)에는 영향을 미치지 않는다.
2개의 다른 기증용 제공 간장을 이용하는 실험에서, 출발물질로서 OptiPrepTM 분획된 세포를 이용하여, EP-CAM 양성 세포가 표준 퍼콜 방법에 따른 상등액 에 잔류하는 것이 나타난다. 도 5 및 도 6에 예시된 바와 같이, 이러한 양성 세포에 퍼콜 펠렛이 2∼5배 결핍된 반면에, EP-CAM 양성 세포 집단은 OptiPrepTM 분획된 세포 출발물질과 퍼콜 상등액과 유사하다.
OptiPrepTM 분획 및 퍼콜 밀도 구배 원심분리에 따른 세포 제제에 존재하는 줄기/프로제니터 세포에 대한 생물적 테스트로서, 20,000개의 생세포/웰이 STO　영양세포층에 평판 배양되고, 호르몬 한정 배지에서 유지되며, 2주 배양 후 콜로니 형성이 측정된다. EP-CAM 면역 반응성이 줄기/프로제니터 세포 존재에 상응한다는 주장을 지지하기 위하여 EP-CAM 세포 집단을 증가시키면 그 집단에서 콜로니 형성기의 수도 증가시켜야 한다는 것을 설명한다. 이 목적을 위하여, 우리는 이러한 세포들을 면역선택에 의하여 강화시키고 그것을 분석에 포함시킨다. 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, EP-CAM 양성 세포는 40배 강화된다.(시작 집단의 0.59%가 EP-CAM 양성이지만 면역 선택 후에는 집단의 24.7%가 이 표지에 대하여 양성이다)
표 2는 EP-CAM 양성 세포를 강화시킬 때, 콜로니 형성이 강화되는 것을 나타낸다. 더욱이, 퍼콜 펠렛에는 콜로니 형성 세포가 결여되어 있는 반면, OptiPrepTM 분획된 세포 및 퍼콜 상등액은 콜로니 형성 세포를 포함한다.
표 2.
이러한 콜로니가 단세포로부터 발생하도록 하기 위하여 EP-CAM 양성 강화 세포에 제한희석이 수행되고 평균 하나의 세포를 포함하고 있는 웰이 실질 세포의 표지인 사람의 알부민 및 담즙 세포와 반응하는 CK19에 대한 항체로 면역 염색된다. 도 9 및 도 10에 도시한 바와 같이, 단일 콜로니에 이러한 형태의 세포의 존재는 그러한 콜로니를 발생하는 세포의 바이포텐셜리티(bipotentiality)에 대한 증거를 지지하고 있다. 이러한 바이포텐셜리티는 줄기/프로제니터 세포의 사용중인 정의이다.
이러한 데이터는 본 발명에 의한 신규 OptiPrepTM 분획 방법이 살아 있는 분획에서 생존 가능한 간 줄기/프로제니터 세포를 보유하면서 죽은 세포로부터 살아 있는 세포를 분리하는 것을 명백하게 나타낸다. 대조적으로, 이 기술 분야의 퍼콜 밀도 분배를 통한 원심분리의 표준 방법은 펠렛으로부터 이러한 세포를 배제한다. 파설오토크렉션 밀도 구배가 움직이는 상황의 변경 모양이 있는 한편, 이러한 변형은 모두 짧은 원심분리 시간(분) 및 낮은 g-force (50, 70, 88 x g)을 포함한다.
종래 방법의 목적은 보다 큰 사이즈의 성숙한 생존 가능한 간세포의 강화인 것처럼 보인다. 퍼콜 펠렛이 모든 다음의 실험(상등액은 버린다)에 사용되기 때문에, 기술 분야는 일관하여 이런 종류의 증식성의 줄기/프로제니터 세포가 결핍된 세포 제제를 사용하고 있었다. 우리의 신규 방법은 실행되는 실험, 발생되는 데이터의 형태를 가장 확실히 변화시켜 기술 분야를 향상시킨다. 이는 간 기능 재구성의 가장 큰 확률을 가지기 위해서, 최고 증식 용량을 가지는 이식된 세포를 가지는 것이 결정적이라고 간주되는 세포 이식 분야에서 특히 정확하다.
면역 강화(면역 선택)는 본 발명의 간 줄기/프로제니터 세포의 집단을 강화하는 단지 하나의 수단이다. 단일 클론 항체는 특히 특정 세포 계층 및/또는 분화 단계와 관련된 표지(표층막단백질, 예를 들면 수용기)를 식별하는데 유용하다. 대상 줄기/프로제니터 세포의 분리 방법은 마그네틱 비즈로 코팅된 항체, 친화 크로마토그래피, 고형질, 예를 들면, 플레이트에 수반되는 항체에 의한 패닝 또는 다른 편리한 기술을 사용하는 자기 분리를 포함하여도 좋다. 정확한 분리를 제공하는 기술은 형광 활성화 세포 분류를 포함하는데 이는 복수의 칼라 채널, 저각도 및 둔한 광산란 검출 채널, 임피던스 채널 등의 정도를 변화시키는 것을 가질 수가 있다)
본 발명의 생존 가능한 사람 간장 세포로부터 원하지 않는 세포 집단을 제거하는 것도 가능하다. 간세포 및 그의 즉시 프로제니터에 더하여, 간장은 담관 세포, 내피세포, 조직 대식세포(쿠퍼 세포), 성장 세포 및 임파구를 포함하는 많은 부가적인 세포 형태를 포함한다. 관류된 관으로부터 준비되는 세포 현탁액은 순환으로부터 약간의 잔류 혈구를 포함할 수 있다. 본 발명의 생존 가능한 사람 간장 세포 제제중에서 다수의 세포는 세포내 알부민을 발현하여 간세포이거나 또는 간세포를 발생시킬 수 있는 줄기/프로제니터 세포이다. 제제중에 세포내 알부민을 발현하지 않는 잔류하는 세포 중에서 대다수는 세포막 표지 CD45, 류코사이트 공통 항원(Leukocyte Common Antigen), 임파구, 단구/대식세포, 과립백혈구 계통의 대부분 또는 전체 세포와 적혈구 계통에 존재하는 것으로 알려진 항원으로 염색된다. CD45를 발현하는 것으로 생각되는 성인의 간에 있는 중요한 세포 집합은 T임파구, 쿠퍼 세포(신체 조직 대식세포의 약 80%를 구성한다) 및 약간의 과립백혈구를 포함한다.
본 발명의 생존 가능한 사람의 간장 세포로부터의 CD45 양성 세포의 결핍은 [ 주지의 면역 결핍 방법에 의하여 달성될 수가 있었다. CD45에 고유한 단일 클론 항체는 자기 미세구(microsphere)에 연결될 수 있다. 미세구는 생존 가능한 사람의 간장 세포에 접촉한다. CD45 양성 세포는 미세구에 연결되고, 자기장 인가에 의하여 제거될 수 있다. CD45 양성 세포의 결핍에 적절한 하나의 시스템은 Miltenyi Biotec(Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich-Ebert-Straβe 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Germany)으로부터 상업적으로 입수 가능하다. Miltenyi 시스템에서 CD45 MicroBeads는 CD45 양성 세포 연결하거나 제거하기 위하여 자기 컬럼(AutoMACS 또는 CliniMACS 등의 장치에서)와 함께 이용된다. 이 시스템 또는 동등 시스템을 이용하여 적어도 CD45 양성 세포의 약 90∼95%는 결핍의 1라운드에서 제거될 수가 있다. CD-45 결핍 세포 집단은 간세포를 포함한 상피 세포를 지지하는 조건 하에서 배양될 때 부착할 수 있고 성장할 수 있는 간장 제제로부터 모든 세포를 본질적으로 보유한다. 이러한 세포의 다수는 무혈청 배지에서 콜라겐 코팅된 접시에 부착할 수 있고, 약간의 세포는 긴세포의 형태를 표시한다. 대조적으로 면역 결핍을 이용한 본 발명의 생존 가능한 간장 세포 제제로부터 제거된 자기적으로 분류된 CD45 집단은 부착하고 간장 실질 세포의 형태를 표시하는 세포를 거의 가지지 않는다.
다른 단일 클론 항체는 특히 특정의 불필요한 세포 집단을 결핍시키기 위하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 세포 세포막 표지 CD3에 대한 항체는 T-임파구를 제거하는데 이용된다. 유사하게, 세포 세포막 표지 CD14에 대한 항체는 쿠퍼 세포와 같은 대식세포/단구 계층의 세포를 제거하는데 이용될 수 있다.
항체는 세포 분리를 용이하도록 접합형태로 제공되어도 좋다. 접합을 위한 재료는 직접 분리를 고려하는 마그네틱 비드, 서포트에 부착된 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 결합함으로써 간접 분리를 고려하는 비오틴, 형광 표지 세포 분리기와 함께 사용될 수 있는 형광 색소를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 세포의 생존력에 과도하게 유해하지 않은 어떠한 기술도 사용될 수 있다.
본 발명의 세포는 몇몇 냉동 보존 방법 중의 어떠한 방법에 의해서 냉동 보존될 수 있다. 일반적으로 분리된 세포는(전술한 바와 같이) HypothermosolTM(Biolife Solutions, NY)의 물의 혼합물 중에서 소정 농도로 희석되고, 소정 저장 온도로 제어 냉동된다. 본 발명의 냉동 세포는 액체 질소에서 저장되어도 좋다.
4.2. 본 발명의 세포의 기능성
본 발명의 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함한 간장 세포 집단이 분리되고 냉동 보존되면, 세포 특이 단일 클론 또는 폴리 클론을 이용하는 흐름 세포 측정 및 존재하는 세포 형태의 양을 정하는 형광 색소 접합 2차 항체에 의해 특징 지워진다. 또한, 냉동 보존된 세포의 기능성은 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 종말점의 배터리를 교차하여 평가된다.
예를 들면, 본 발명의 간의 줄기/프로제니터 세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) (Serotec Inc, UK)에 접합된 사람 EP-CAM 항원에 대한 100uL의 마우스 단일 클론 IgG 다형 항체와 얼음 위에서 반응된다. 제어 세포는 마우스 IgG-FITC만으로 처리된다. 샘플은 제어 세포의 98%를 제외하도록 조정되는 형광 게인을 가지며 488nm 파장으로 되는 EPICS C 흐름 세포측정기(Coulter Electronics, Hialeah, Fla)를 이용하여 분석된다. 윈도우는 전방 빛 산란(FLS) 대 측면 산란(SS) 2개의 파라미터 히스토그램을 사용하여 다양한 세포 집단 주위에서 성립되고, 양성인 형광 결과의 퍼센티지가 결정된다.
시험관 내에서 종말점은 결합된 PhaseⅡ접합 반응 뿐 아니라 마이크로소말 사이토크롬 P-450 의존성 PhaseⅠ산화를 측정하는 7-에톡시쿠마린 대사, 암모니아를 요소로 변환하는 세포의 능력(간부전인 경우에는 잃게 되는 중요한 기능)을 평가하는 요소 발생(ureagenesis), 증식 잠재력을 포함한다.
생체 내에서, over time 생존할 수 있고, 성숙한 간세포 표현형을 결정하고 유지할 수 있고, 간 실질에 이식될 수 있는 세포의 능력이 평가된다.
이하의 연구는 동물이 이식된 사람의 세포를 거부하는 것을 방지한 중증 복합형 면역 부전증을 가지는 NOD-SCID 마우스를 이용한다. 한 연구에서는, 세포가 부착되는 마이크로 캐리어를 수반하는 시험관 내에서(in vitro) 세포는 해동되고 배양되었다. 마이크로캐리어는 뒤이어 마우스의 복강에 주입된다. 1주 후, 마이크로캐리어 세포 응괴는 복강으로부터 채취되고, 현미경검사를 위하여 절단되고 염색된다. 전자현미경 검사법도 실행된다.
도 11의 NOD-SCID 마우스의 마이크로캐리어 비즈상의 사람의 간세포의 현미경 사진에서 마이크로 캐리어에 부착된 간세포를 볼 수 있다. 둥근 핵 및 뚜렷한 세포질의 많은 양을 강조한다. 우측의 화살표는 이핵 세포를 나타낸다. 우측 끝부분의 세포는 받는 마우스의 복막 내층으로부터의 섬유모세포(fibroblast)일 수 있는 호스트 버팀질 세포(host stromal cell)이다.
도 12는 적혈구에 의해 증명된 것처럼, 호스트(host)에 의해 혈관을 지나가게 되는 간세포의 넓은 섬을 시각화하기 위한, 도 11의 현미경 사진보다 낮은 전력에서 찍히는 현미경 사진을 나타낸다. 간세포의 코드 또는 열의 현저한 세포 조직 및 간 조직에 횡단면에서 용이하게 관찰되는 구조적 조직은 특히 주목할 만한다.
본 발명의 간의 줄기/프로제니터 세포가 실제로 간세포로 성숙할 수 있고 성숙한 표현형을 발현하고 있는 증거가 그 세포질에서 글리코겐에 대한 양성 염색을 설명하는 도 13에서 제공된다. 다시 코드의 세포의 현저한 조직을 언급한다.
도 14에서, 마이크로캐리어에 부착된 3개의 간세포가 전자현미경 수준에서 확인될 수 있다. 두 개의 인접한 세포간의 인터페이스 주위에 까만 박스(box)가 그려진다. 그 영역의 파열은 구조, 미세융모, 모세담관의 표시, 다른 성숙한 간세포 표지를 나타낸다.
도 15 및 도 16에 도시된 2개의 현미경 사진은 본 발명의 냉동 보존된 사람의 간장 세포의 NOD-SCID 마우스로의 이식을 나타낸다. 이 연구에서, 백만개의 해동된 세포는 마우스의 비장에 주사된다. 이식 후 다양한 타임 포인트에서, 동물이 안락사 당하고, PCR 분석 뿐 아니라 사람의 동원체에 대한 DNA 프로브를 사용하는 인 시츄 부합법(in situ hybridization)에 의하여 사람세포의 존재가 결정된다. 이식 후 2시간 (도 15), 사람세포는 문맥 및 간 지누소이드에서 인 시츄 하이브리다이제이션에 의하여 명확하게 보인다. 그러나, 그들은 혈관 스페이스로부터 간 실질로 통과하지 않았다.
이식 후 40일(도 16), 사람세포는 간에만 잔류하는 것이 아니라 간 실질로 완전하게 통합되는 간세포판에 이식되었다.
4.3 간장 세포 이식.
본 발명의 방법의 및 방법에 의한 세포를 수반하는 치료를 위한 목표 집단 여러 가지 요인에 의해 생기는 간경변 및 말기 간 질환(ESLD)의 외래 환자이다. 환자들은 간 이식 없이는 6개월에서 2년 미만의 수명이 예상된다. 따라서 대부분의 이러한 환자는 같은 자리 간 이식(즉 완전한 이식용 제공 장기의 이식)을 위한 대기 명단에 오르는 것이 고려되었다. 이러한 환자는 복부 유체(복수), 출혈, 착란(간성 뇌병증), 전염 및 다른 장애와 같은 하나 이상의 합병증을 경험했다. 목표 환자가 완전한 간의 이식을 위한 케이스에서처럼, 이식된 간세포에 대한 거부를 방지하는 면역 억제 치료를 받을 것이 예기된다. 치료의 목적은 전체의 간 이식에 대한 필요를 늦추거나 또는 제거하여 간 질환의 합병증으로 인한 병원 입원을 감소시켜 환자의 생활의 질을 향상시키는 것이다.
기초 평가 및 후속 평가는 손상된 간이 독소를 제거하고, 약을 대사하고, 단백질을 합성할 수 있는 능력에 대한 특정 정량 생화학적 평가 뿐 아니라 일상 실험 및 임상 간 기능 평가를 포함한다. 이식된 간세포가 간 및 비장에 사는 것으로 예측되기 때문에, 비장의 간세포 특이 스캔이 주기적으로 실행되어 이식된 간세포의 융합 및 증식을 모니터한다. 이식된 세포는 이식용 제공 세포에 특이한 수용성 항원을 방출한다. 이러한 혈액에서 측정될 수 있는 수용성 항원은 이식된 세포의 생존력 및 기능에 대한 증거로서 모니터된다.
세포 이식을 위한 병원에의 입원 2주전에, 조사자는 클리닉에서 환자를 관찰한다. 조사자는 동의를 얻어 ABO 혈액형을 포함한 기초 평가를 개시한다. 환자의 혈액형은 고형 간장 또는 간장 세포 이식에 있어서 이식용 제공 혈구와 호환성을 가져야 한다. 병원 입원 2일전에 면역 억제 요법은 개시된다. 냉동 보전된 세포가 정확히 이식 전까지 냉동된 채로 병원에 운송된다.
세포 이식 전 저녁에, 환자는 병원에 입원한다. 다음날 아침, 환자는 얕은 진정을 받는 침습 방사선 스위트로 이동된다. 카테터는 환자의 대퇴 동맥(샅고랑부위, groin에서)에 위치되고, 비동맥으로 나아간다. 이식용 제공 간장 세포는 해동되고, 희석되어 바람직하게는 주사기를 통하여 비동맥 카테터로 전달된다. 투여 시간은 투여량에 따라 5분에서 약 30분까지 변화한다. 카테터는 제거되고, 환자는 후속 처치를 위하여 그/그녀의 방으로 이동되어 진다. 환자는 처치 후 8시간 지나면 병원에서 나오게 된다.
본 발명의 간세포 및 간의 줄기/프로제니터 세포 이식은 간세포 및/또는 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함한 생존 가능하고, 기능적인 간장 세포(이는 식염수와 같은 이식 배지 내에 포함된다.)를 간세포 및/또는 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함한 간장 세포가 예를 들면, 간 실질 및/또는 비장과 같은 목적 위치 내에 이식되도록 하는 적합한 해부학적 위치에 주사하고, 간세포 기능을 포함한 분화된 간장 간장 기능을 발현하는데 사용되어도 좋다. 간세포 및/또는 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함한 간세포의 양에 의해 그만큼 이식되어 보다 생의 기능 결핍증이 다른 정도는 세포 이식을 가지는 간 기능의 치환에 의해 수정될 수가 있다. 간세포 및/또는 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함한 이식된 간장 세포의 양에 의존하여 간장 기능 결핍의 상이한 정도는 세포 이식에 의하여 간장 기능을 대체함으로써 수정되어도 좋다. 간세포 및/또는 간의 줄기/프로제니터 세포의 세포 이식은 단일 효소 또는 다른 단백질 제제의 결여되거나 감퇴된 기능을 가져오는 유전적 결함에 의해 야기되는 간장 질환의 치료에 있어서 가장 유리하다. 그러한 질환은 예를 들면, 고지혈증 및 알파-안티트립신 결핍증을 포함한다. 본 발명에 의해 치료할 수 있는 간의 다른 질환은 간염, 간경변, 선천적 대사 이상, 급성 간부전, 급성 간 전염병, 급성 화학 독성, 만성 간부전, 콜란지오시티스(cholangiocitis), 담즙 간경변, 알라지르(Alagille) 증후군, 알파-l-안티트립신 결핍, 자기면역 간염, 담즙 폐쇄증, 간암, 간의 낭포성의 병, 지방간, 갈락토T세미아, 담석, 길버트 증후군, 혈색소 침착증, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 그리고, 다른 간염 바이러스 감염, 포리피리아(poryphyria), 원자력 발전성 경화성 담관염, 레이 증후군, 종류 육종증, 티로신혈증, 1형 당원병, 또는 윌슨병을 포함한다.
이식 절차를 수행하기 위하여, 주사 위치는 간장 세포를 간 실질에 이식하도록 선택된다. 이를 달성하는 하나의 기술에 있어서, 주사 위치는 환자의 비장이다. 비장의 위치 좌표의 계산 후, 간세포 및/또는 간 줄기/프로제니터 세포를 포함한 간장 세포를 포함하는 이식 배지를 비장에 주사되도록 주사기가 위치되어진다. 전달된 세포는 비정맥을 거쳐 간 실질로 이동한다[Gufta et al., Seminars in liver disease 12, 321(1992) 참조]. 다른 기술에 있어서는, 문맥의 가지는 예를 들면, 방사선비투과성 조영제의 주입 후, 복부의 CAT 스캐닝에 의하여 촬상된다. 간의 분리엽을 공급하는 문맥 가지의 위치 좌표는 이식 배지를 문맥 가지에 주사하고, 특정 간장 엽을 간장 세포에 주입하는데 이용되어도 좋다. 이러한 선택적인 주입은 연속하는 문맥 혈류가 다른 간을 통하도록 한다.
선택적으로, 본 발명의 간세포, 담즙 세포, 및/또는 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함한 간장 세포는 비정맥 또는 문맥을 통하여 직접 간 펄프에, 또는 간 피막 아래에 주사 또는 주입된다.
본 발명의 세포를 대상물, 특히 사람인 대상물에 투여하는 적합한 방법이 상세하게 설명된다. 세포를 대상물의 목적 위치에 주사하거나 또는 심어 넣고, 또는 본 발명에 의한 세포가 세포를 대상물에 주사 또는 심어 넣음에 의한 도입을 용이하게 하는 전달 장치에 삽입될 수 있다. 이러한 전달 장치는 세포와 유체를 대상 수용체에 주사하기 위한 튜브, 예를 들면, 카테터를 포함한다. 바람직한 실시예에서는, 튜브는 부가적으로 본 발명의 세포가 소정 위치에 도입되도록 통과하는 바늘, 예를 들면 주사기를 포함한다. 본 발명의 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함한 간장 세포는 이러한 주사기와 같은 전달 장치에 다른 형태로 삽입될 수 있다. 예를 들면, 세포는 이러한 전달 장치에 포함될때 용액에서 현탁되거나 지지 기질에 묻힐 수 있다. 여기에서 사용하는 바와 같이, "용액"은 본 발명의 세포가 생존 가능한 상태로 있는 약학적으로 수용 가능한 캐리어나 또는 희석제를 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 식염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산매를 포함한다. 이런 종류의 담체 및 희석액의 사용은 공지 기술이다. 용액은 바람직하게는 무균이고, 용이하게 주사할 수 있는 정도까지는 유동적이다. 바람직하게는, 용액은 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이고, 빅테리아나 균류 등의 미생물 오염 활동에 대하여 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르빈산, 티메로살(thimerosal) 등을 사용하여 보존된다. 본 발명에 의한 용액은 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제, 그리고 필요하다면, 여과 멸균이 수반되는 상기 열거된 다른 첨가물에 생존 가능하며 기능적인 간장 세포를 혼합함으로써 조제될 수 있다.
생존 가능하고 기능적인 세포가 통합되거나 끼워 넣어지는 지지 기질(support matrix)은 수취인 호환성이고, 수취인에게 유해하지 않은 생성물로 분해되는 기질을 포함한다. 자연적인 및/또는 합성 생물 분해성 기질은 이러한 기질의 예이다. 예를 들면, 자연적인 생물 분해성 기질은 예를 들면, 포유류로부터 기인하는 플라즈마 응혈 및 콜라겐 기질을 포함한다. 합성 생물 분해성 기질은 무수물 중합체, 폴리오르소에스테르, 폴리락틱산 등의 합성 중합체를 포함한다. 합성 중합체의 다른 예 및 이러한 기질에 통합되거나 끼워 넣어지는 방법은 공지 기술이다. 예를 들면 미국 특허 4,298,002호 및 미국 특허 5,308,701호를 참조한다. 이러한 기질은 생체 내에서 간장 세포를 지지하고 보호하여, 간장 세포가 수령 대상으로 도입되는 바람직한 형태이다.
4.4. 본 발명의 유전자 요법
유전자 요법 임상시험 결과는 대개 목적 유전자의 지속적인 유전자 발현을 획득할 수 없기 때문에, 일반적으로 의사와 환자 모두에게 실망스러웠다. 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 본 발명의 세포 집단과 같은 간장 세포 집단은 그들의 광범위한 확장 잠재력 때문에, 유효한 유전자 발현을 획득하고 유지하는 장래성 있는 세포 집단을 나타낸다. 한 실시예에서 본 발명의 유전자 요법은 외인 유전자를 세포에 삽입하고 이러한 세포를 환자에게 이식함으로써 달성된다. 논리적 목표 장해는 고콜레스테롤혈증에서 LDL 수용기의 탈락 및 혈우병에서 응혈 인자의 탈락과 같은 중요한 단백질은 적절하게 만들지 못하는 환자의 간장 세포의 불능으로부터 기인한 질환이다.
다른 기관의 진핵생물 호스트 세포에 외래 유전자가 안정하게 통합될 수 있도록 하려는 현재의 시도에서 주요한 장애는 이러한 세포의 대부분이 생체내에서 증식할 수 없다는 것이다. 이것은 특히 외인 유전자를 간장 세포에 삽입하려는 시도에 있어서 문제가 되는데, 이는 성숙한 간세포가 생체 내에서는 완전한 세포 분열을 하지 않거나 또는 단지 1-2분열만을 하기 때문이다. 최근, 유전자 전달 연구는 사람의 가족성 고콜레스테롤혈증에 대한 동물 모델로서 넓게 사용되고 있는 와타나베 유전성 고지방혈증인 토끼로부터 분리되는 간세포를 사용하여 실행되었다. 대응하는 사람의 세포와 같이, 와타나베 토끼 세포는 저농도 지방단백(LDL) 수용체에, 순환 중에 높은 수준의 콜레스테롤과 미숙 심장 동맥 질환의 증가하는 발생 수에 이르는 유전적인 결함을 가지고 있다(Wilson et al., 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87:8437). 토끼의 간세포는 기능 LDL 수용체 유전자를 담지하고 있는 재조합 바이러스에 감염되어, 이식에 수반하여 유전적 결함이 있는 토끼의 고지혈증의 일시적인 개선됨이 나타내어진다. 목적 유전자가 수령인 세포 집단에 보다 안정한 통합을 이루어 지속적인 세포 분열을 할 수 있다면 이러한 형태의 요법의 성공률은 더욱 증가될 수 있다고 생각되어진다. 본 발명의 간 줄기/프로제니터 세포가 시험관 내에서 특히 실질 세포가 배아 버팀질 세포와 공배양되는 전술한 시스템에서 오랜 기간동안 증식하기 때문에, 이러한 세포는 배양에 있어서 외인 유전자의 도입을 위한 수령인으로서 이상적인 후보일 수 있다.
다양한 대사의 선천적인 과실은 간장 세포에서의 유전적 결핍에 의하여 야기된다. 이러한 질환은 올바른 유전자의 기능 복사를 담지하고 있는 본 발명의 간장 세포의 이식에 의해 치료될 수가 있다. 간략하게 말하면, 이 방법은 특정 결핍증으로 고통받는 환자로부터 본 발명의 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 간장 세포의 분리, 종래의 유전자 전달 기술에 의해 유전자의 결함을 수정하는 이러한 세포로의 기능 유전자의 전달, 소망하는 유전자 산물의 안정한 통합 및 발현의 확립, 제구성을 위한 동일한 또는 상이한 환자 자신의 간으로의 세포의 이식을 포함한다. 이러한 방법은 특히 단일의 유전자 결함이 질환의 원인이 되고, 결함 유전자가 식별되어 분자적으로 클론화되는 상황에서 적용할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 자가 조절에서 유전자 요법에 더하여, 기능 유전자를 담지하는 본 발명에 의한 간 줄기/프로제니터 세포는 동종이형 HLA-적합 개체에 이식되어도 좋다. 목적 유전자의 예와 이러한 형태의 요법을 받을 수 있는 이에 관련된 간장 질환은 가족성 고콜레스테롤혈증의 LDL 수용체 유전자, 혈우병의 인자 VIII 및 IX를 위한 응혈 인자 유전자, 폐기종의 알파 1-안티트립신 유전자, 페닐케톤뇨증의 페닐알라닌 하이드록시라제 유전자, 고암모니아혈증의 오르니틴 트랜스카바밀라제 유전자 및 다양한 형태의 보체 결핍증의 보체 단백질 유전자를 포함하는데 이에 한정되는 것은 아니다.
간은 많은 분비 단백질의 생산 중심이다. 그것은 다양한 단백질의 혈류로의 유효한 방출을 하게 하는 방식으로 순환계와 해부학적으로 연결되어 있다. 따라서 전신 효과를 가지는 유전자 인코딩 단백질은 특히, 유전자를 이러한 세포에 통합시키는 것이 어려운 경우, 정상적으로 이를 생산하는 특정 세포 형태와는 대조적으로 본 발명의 간장 세포에 삽입된다. 예를 들면, 다양한 호르몬 유전자 또는 특정의 항체 유전자는 순환에 그들의 유전자 산물의 분비를 위해 본 발명의 간세포에 삽입될 수 있다.
본 발명의 실행을 위하여, 전술한 방법에 의하여 분리된 본 발명의 간장 세포는 유전자 전달 실험에 수령인으로서 사용되어진다. 세포는 외인 유전자의 도입 이전, 도입중, 또는 도입 후의 배양에서 성장될 수 있다. 이러한 세포의 시험관내의 분화는 조혈 줄기 세포 배양에서의 백혈병 억제 인자의 사용과 같은 방식으로 사이토카인을 첨가함으로써 최소화될 수 있다.
본 발명의 배양된 세포에 외래 유전자를 도입하기 위하여, 클론화된 유전자가 종래 기술을 이용하여 전달될 수 있는데, 종래 기술은 미세 주사법(microinjection), 트랜스팩션, 형질 도입 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 나아가, 간장 세포가 아시알로글리코프로테인(asialoglycoprotein)에 대한 수용체를 발현하는 경우, 목적 유전자를 포함하는 플라스미드는 아시알로글리코프로테인에 접합될 수 있고, 세포에 부가되어 섭취와 발현을 유도할 수 있다(Wu et al., 1991, Journal of Biological Chemistry 266:14338). 이러한 방법은 수령인 세포에서 좀더 적당하다.
유전자 전달의 바람직한 방법은 레트로바이러스 및 아데노바이러스와 같은 재조합 바이러스를 이용하는 것이다. 예를 들면, 아데노바이러스 발현 벡터를 사용할 경우에 코딩 순서는 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체에 결합될 수 있다. 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비본질적 영역(예를 들면 영역 E1 또는 E3)에의 삽입은 감염된 간 예비 세포에서 생존 가능하고 유전자 산물을 발현할 수 있는 재조합 바이러스로 될 것이다(예를 들면, Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659 참조). 선택적으로 종두 바이러스 7.2K 프로모터가 이용될 수 있다(예를 들면, Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931 참조). 특히 중요한 것은 염색체외 요소로서 복제할 수 있는 능력을 가진 반복하는 능력을 가지는 소의 유두종 바이러스에 근거하는 벡터이다(Sarver, et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1:486). 이 DNA를 세포로 도입 직후에 플라스미드는 세포당 약 100∼200회까지 복제한다. 삽입된 cDNA의 전사는 플라스미드의 호스트 염색체로의 통합을 필요로 하지 않으며, 이에 의하여 높은 수준의 발현을 산출한다. 이러한 벡터는 플라스미드에 선택 가능한 표지를 포함시킴으로써 안정한 발현에 이용될 수 있다. 혹은 레트로바이러스 게놈이 본 발명의 간의 줄기/프로제니터 세포의 어떠한 목적 유전자의 발현을 도입하고 이끌 수 있는 벡처로서 이용되도록 변조될 수 있다(Cone & Mulligan, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349-6353). 높은 레벨 발현은 메탈로티오닌 ILA 프로모터 및 열 쇼크 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 유도성 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 장기간, 고수율인 재조합 단백질 생산을 위하여, 안정한 발현이 바람직하다. 복제의 바이러스 기원을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는 오히려, 본 발명의 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생존 가능하고 기능적인 간세포가 적절한 발현 제어 요소(예를 들면, 프로모터, 증강인자, 순서, 전사 종결제, 폴리아데닐레이션 위치 등) 및 선택적인 표지에 의하여 제어되는 cDNA와 함께 변형될 수 있다. 재조합 플라스미드에서의 선택적인 표지는 선택에 저항을 부여하고, 세포가 안정하게 그의 염색체에 통합되고 교대로 클론화될 수 있고 세포주로 확장될 수 있는 포시(foci)를 형성하도록 한다. 예를 들면, 외래 DNA의 도입 후, 설계된 간장 세포는 강화 배지에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 되어지며, 그리고나서 선택 배지에 옮겨진다. 많은 선택 시스템이 사용될 수 있는데 이는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), 등, 1977, Cell 11：223), hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) 및 아데닌 포스포리복실트랜스퍼라제(Lowy, et al., 1980, Cell 22：817) 유전자를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또, 대사 길항 물질 저항이 저항을 메토트랙세이트(methotrexate)에 부여하는 dhfr 유전자(Wigler, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527), 저항을 미코페놀산(mycophenolic acid)에 부여하는 gbt 유전자(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072), 저항을 아미노글리코시드 G-148에 부여하는 neo b전자(Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1), 저항을 하이그로마이신(hygromycin)에 부여하는 hygro 유전자(Santerre, et al., 1984, Gene 30:147)에 대한 선택 근거로 이용될 수 있다. 최근, 추가적인 선택 가능 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하도록 하는 trpB, 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용하도록 하는 hisD(Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047) 및 저항을 오르니틴 디카르복시라제 저해제, 2-디플로로메텔-DL-오르니틴, DFMO에 부여하는 ODC, 오르니틴 디카르복시라제(McConlogue L., 1987, In:Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.)이 설명되어진다.
노던 블롯(Northern blot) 및 ELISA 등의 기술에 의한 그 유전자 산물의 발현에 의하여 측정되는 특정 유전자를 통합한 본 발명의 간장 세포는 전술한 바와 같이 원래 세포가 얻어진 환자 또는 HLA-적합 개체에 이식되어질 수 있다. HLA-적합 동종 이형 이식을 위하여, 간장 예비 세포는 이식에 앞서 유전자 전달을 필수적으로 요구하지 않아도 좋다. 예를 들어, 기능 유전자 인코딩 응혈 인자 Ⅷ은 HLA-적합 혈우병의 환자에게 이식함으로써 직접적으로 이용될 수 있다. 이식된 세포는 증식하여, 응혈 인자 Ⅷ의 생산을 포함하는 정상적인 간 기능을 수행하는 성숙한 PC를 발생시킨다.
간 유전자 결함을 수정하는 본 발명에 의한 간장 세포 이용에 부가하여, 이러한 세포는 간경변의 경우 간 실질을 보충하는데 사용되어져도 좋고, 또는 간 특이 감염 질환에 대하여 설계되어도 좋다. 예를 들면, 비감염성 간 줄기/프로제니터 세포는 초기 간염 환자로부터 얻어져도 좋고, 간염 바이러스의 임계 복사 관련 유전 인자와 상보적인 안티센스 RNA를 인코딩하는 유전자에 대한 수령인으로서 이용되어도 좋다. 세포는 바이러스의 확산을 제어하고 정상적인 간 기능을 회복하기 위하여 환자에게 이식되어져도 좋다.
4.5. 지노믹스 및 연구 응용
본 발명의 간장 세포 기술은 신약을 식별하기 위한 도구로써, 의약 개발 및 시험 방법에 응용될 수 있다. 간 줄기/프로제니터 세포는 성장하여 성숙한 간장 세포로 분화하도록 될 수 있다. 간 혈통의 다양한 단계에서 유전자 발현 패턴을 결정하는 것은 의약 발견을 위한 게놈의 정보를 제공한다. 예를 들면, 이 정보는 의약 발견을 위한 새로운 목표를 식별하거나 치료 요법에 응용될 수 있는 생물학적 기능을 수행하는 단백질을 식별하는데 이용될 수 있다.
의약 시험 및 개발 방법을 위한 도구로서 간장 세포 및 그의 자손은 개발을 위해 고려되고 있는 의약에 의해 발생하는 유전자 발현 패턴의 변화를 평가하는데 사용될 수 있다. 잠재적인 의약으로부터의 유전자 발현 패턴의 변화는 간에 영향을 미치는 것으로 알려진 의약에 의하여 발생하는 변화와 비교될 수 있다. 이는 제약회사로 하여금 개발 과정 초기에 시간과 돈을 절약하면서 간에 대한 효과를 위하여 합성물을 스크린하도록 하였다. 프로제니터에서 성숙한 세포까지의 간장 세포의 총 혈통은 의약의 간에 대한 독성 시험 및 의약의 대사 방법 연구에 이용될 수 있다. 현재, 제약회사는 독성 테스트를 위한 간세포를 지속적으로 공급하는데 어려움을 겪고 있다. 본 발명에 의한 방법이 이러한 요구에 대한 해답이다.
4.6. 간 보조 장치
본 발명에 의한 간 줄기/프로제니터 세포 기술은 간 보조 장치("LAD")의 개발에도 응용된다. 이러한 간 보조 장치는 환자 자신의 간이 회복되는데 충분한 시간을 주도록 또는 이식을 위한 브리지를 제공하도록 단시간 동안(7일에서 30일) 간 기능을 제공함으로써 급성 간부전 환자를 치료하도록 설계되어진다.
다른 것에 의한 임상적으로 유용한 LAD의 시도는 돼지의 간 세포 또는 다양한 생물 반응기 형태의 사람의 종양으로부터 기인하는 불완전 분화된 간장 세포를 이용한다. 이러한 장치는 상당히 전망있는 것으로 보이지만 모두 세포가 극복해야만 하는 한계를 가진 세포를 이용한다. 돼지의 간 세포는 용이하게 얻어지는 반면, 예를 들면, 분비된 돼지 단백질에 대한 면역 반응, 제한된 수명 및 사람 이외의 바이러스 등과 같은 심각한 제한을 가진다. 간 종양 세포는 용이하게 성장하지만, 정상 간장 세포 기능의 부분 집합만을 보유하고 안전 상의 염려도 포함하고 있다. 공여 기관으로부터 사람 간장 세포를 기능시키는 것은 공여 간장의 결핍 때문에 선택 사항이 아니었다. 본 발명에 의한 사람 간 프로제니터 세포를 이용하는 LAD는 현재 겪고 있는 많은 문제들을 극복할 것이다. 이러한 세포에 의해 분비되는 단백질은 사람에 기원하여 면역 반응이 최소화된다. 프로제니터 세포는 배양 시에 광범위하게 분리될 수 있어서 하나의 공여 간으로부터의 세포가 많은 LAD를 공급할 수 있다. 가장 중요하게, 이러한 세포는 임상적 유용성을 위하여 필요한 광범위한 간 기능을 나타내어야 한다.
본 발명의 세포에 적절한 LAD의 예는 International Patent Publication Serial Number PCT US00/15524에 설명되어 있다.
4.7. 본 발명에 의한 백신의 제조
본 발명에 의한 간장 세포는 백신 제조에 이용될 수 있다. 예를 들면, 복제 결핍 바이러스(예를 들어, 렌티 바이러스, Naldini et al. Science 272:263-267, 1996 참조)는 하나 이상의 특정의 단백질 항원을 인코딩하는 유전자를 가지도록 수정되는 사람의 간장 세포를 감염시키는데 이용된다. 특정 단백질 항원은 필요한 면역 응답의 형태에 따라 선택된다. 근본적으로, 본 발명에 있어서 간장 세포는 재조합 바이러스로 감염된다. 감염된 세포는 면역 응답이 갖춰지는 것에 대한 단백질 항원을 발현한다. 면역 응답(항체 또는 세포 기반의) C형 간염 등과 같은 감염원에 대항하도록 예상되어진다. 감염된 세포에 노출된 대상 물질은 감염원에 대항하여 보호되어진다. Brister et al.(J. Gen. Virol. 83(Pt.2):369-381, 2002)를 참조하면 세포 면역 응답을 도출하기 위하여 C형 간염 비구조적 단백질을 코딩하는 재조합 Semliki Forest 바이러스를 사용하는 것이 설명된다.
5. 실시예
5.1. 방법 개요
간의 모든 처리는 무균 기술과 우수한 제조 방법에 따라 클래스 10,000의 방에 위치한 클래스 100의 후드에서 실행된다. 간에 접촉하는 모든 성분은 무균으로서 구입되거나 또는 집합되어 가스 멸균 또는 가압증기멸균이 가해진다.
5.2. 최초의 처리
간은 VIASPANTM( 참조)에 잠겨서 채취된다. 생물학적 안전 캐비넷(BSC)에서, 간은 무게 달아지고 그의 총체적 외형이 문서화된다. VIASPANTM의 샘플이 무균 시험에 이용된다.(VIASPANTM 은 분출 및 기관의 저장을 위한 hypothermic 용액으로서 유용하다.) 간은 무균의 저장소에 옮겨져서 5분간 항생 세정액(0.1mg/mL의 겐타마이신 및 5mg/mL의 세파졸린)에 담가진다. 간은 이 과정 동안 확실하게 양면이 담가지도록 위에서 아래까지 돌려진다.
간은 저장소 위로 올려져서 두 번 총량 2L의 무균의 통상 식염수로 헹궈진다. 그리고 간은 다른 무균의 저장소로 옮겨진다. 대정맥은 2개의 무균의 일회용의 플라스틱제의 끈클램프를 사용해 고정되고, 문맥 및/또는 간동맥은 다양한 사이즈의 플라스틱 환원제/커넥터로 되어 있는 미리 살균된 캐뉼러에 의해 캐뉼레이트된다. 작은 생검(엽의 리딩 에지로부터)은 조직학적 관찰에 이용되어진다. 간은 관류탱크에 옮겨져, 간이 최대로 부풀려지도록 하는 속도로(일반적으로 120-240mL/min) 15분 동안 따뜻한(37℃이하) 킬레이션 완충액으로 관류된다. 관류 단계의 마지막에 완충액은 관류 탱크의 하부에 위치한 드레인 포트를 통하여 버려지도록 배수된다.
5.3 관류 및 소화
간은 28℃∼ 37℃ 의 온도에서 30분 동안 LIBERASETMCI(콜라게나제 및 엘라스타제를 포함하고 있는 효소제제)를 포함하는 관류액에 의해 소화된다. 소화 종료 후, LIBERASETM 함유 완충액은 버려지고, 간은 차가운 혈청 함유 수집 완충액으로 관류되어 효소에 의해 소화가 멈추어진다. 최종 관류 후, 완충액은 폐기물 컨테이너로 배수되고, 탱크에는 신규 혈청 함유 수집 완충액이 보충된다. 간 캡슐은 무균 스테인레스 스틸의 외과용 메스를 사용해 톱니 모양이고, 조직은 세포 해리를 용이하게 하기 위해서 20분 이하의 시간 동안 마사지된다. 소화된 조직으로부터의 모든 세포가 완충액에 해리 된 것처럼 보일 때 결과적인 세포 현탁액은 전치여과기 및 일련의 1000, 500, 250, 150㎛인 전치 멸균되는 스테인레스 스틸 체들을 통과하여 얼음 위에서 냉장된 4L 혈액 백에 수집된다. 생 세포 현탁액은 생존 가능성, 농도, 총 세포량, 그램 조직당 수율 및 서스펜션이 생존 능력, 집중, 총 세포 카운트, 그램 조직에 대해 산출 및 무균성 테스트에 위하여 샘플이 만들어진다.
5.4 하류 과정
생 세포 현탁액은 무균적으로 적당한 수의 600mL 혈액 백에 옮겨지고, 800xg 원심분리에 의하여 원심분리된다. 농축된 세포 현탁액은 동량의 세포 농축물 및 OPTIPREPTM 용액(25%의 이오디사놀)을 혼합하고, COBE 2991 세포 세척기를 사용함으로써 생 세포가 강화된다. 200rpm의 속도로 15분 동안 원심분리한 후, 필요한 세포 집단이 상부로 이동하여 밴드를 형성할 것이다. 밴드는 무균적으로 수집되고, 적절한 수의 600mL의 혈액 백으로 바람직하게는 백당 200mL를 넘지 않는 부피로 분배된다. 백에 들어 있는 부피는 RPMI1640으로 500mL까지 희석된다. 백은 800xg로 10분 동안 원심분리되고, 상청을 제거한 후 얻어진 펠렛을 칭량하고, 최종 500mL가 되도록 충분한 RPMI1640이 가해지고, 800xg로 10분 동안 원심분리된다. 상청이 제거된 후, 포스트-워시 팰렛을 칭량하고, 세포 카운트 및 생존 가능성을 위하여 샘플을 제작하고, 농도가 6ㅧ107세포/mL 되도록 HTS에 재현탁된다. 다수의 세포에 의하여 복합적인 COBE 흐름이 관여하면, 각 흐름에서 수집되는 밴드는 고이게 된다.
5.5. 채워짐과 저장
세포는 수동으로 표지한 33mL의 플로로플라스틱 냉동백(fluoroplastic cryobags)에 채워지고,(1.5mL의 fill-volume으로) 동량의 냉동 완충액(HTS:DMOS:사람의 혈청 60:20:20)과 혼합되어 최종 농도가 3ㅧ107세포/mL, 10% DMSO, 10% 사람 혈청으로 되도록 한다. 백은 Cryomed programmable 냉동기를 사용하여 냉동되고, 냉동된 세포는 증기 질소 냉동기에 저장된다. 냉동 후 적어도 24시간, 냉동기에서 샘플이 나오고 테스트 설비로 운반된다.
5.6. 프로세스 흐름도
수행되는 제조 프로세스를 설명하는 흐름도가 아래에 제공된다.
5.7 임상적인 위치에의 투여
임상적인 공급물이 온도를 -120℃ 이하로 유지하는 증기상 액체 질소 운반고로 임상적인 위치로 운반된다. 세포 현탁액을 포함하는 냉동 백은 환자가 준비될 때까지 운잔고에 남겨진다. 사용 전에, 산물이 운반고로부터 제거되고 37℃에서 급속 해동되고 얼음 위에 놓여진다. 오버랩은 제거되고, 표준 무균 병원 절차를 이용하여 세포 현탁액은 환자에게 투여되기 전에 냉동 백에서 찬 Plasma-Lyte??A로 10배 희석된다. 이 과정은 주입 전에 세포를 세척할 필요를 배제하고 의심되는 불모의 리스크를 최소화한다. 환자에게 주어지는 본 발명의 실시예는 3×106 세포/mL을 포함하고, DMSO(1%), 사람 혈청 AB(1%), HypoThermosol??(4%-8%) 및 Plasma-Lyte?玲? 페놀레드가 결여된 RPMI(0%-4%)를 더욱 포함한다.
5.8. 돼지 간 세포의 분리
전술한 바와 같이 세포 현탁액을 여과하고 수집하는 과정이 돼지 간의 샘플에 계속되어진다.
샘플은 생존 능력, 밀도 및 수율이 테스트된다. 산출이 이루어진 후, 100억 개의 세포는 제거된다. 밀도가 2,500만 세포/mL보다 낮은 경우, 세포는 Sorval RC3B 원심분리기, Sorval centritech 또는 COBE 2991 세포 프로세서를 이용하여 농축된다.
펠렛은 페놀 레드가 없는 250 mL의 RPMI 1640 배지에서 재현탁한다. 세포 현탁액은 600 mL의 혈액 백으로 옮기고 RPMI 1640 w/o 페놀 레드로 희석된 동량(250 mL)의 25% 이오디사놀(Opti-prepTM, http://www.nycomed-diagnostics.com/gradmed/optiprep/potil. html 참조)을 첨가한다. 두 용액을 함께 혼합하여 저온으로 보관한다.
단일 프로세싱 세트를 이용하는 COBE 2991 세포 프로세서를 작동한다. 세트의 적색선을 이용한 그래버티 페드(garvity fed)이다. 도넛(doughnut)이 채워지면, 2000 rpm에서 15분간 원심분리한다. 원심분리를 시작함에 따라 100 mL의 RPMI 1640 배지(혼합 밴드를 위한 완충액으로 작용하는)가 20 mL/분의 연동 펌프를 이용한 구배의 상부에 층을 이룬다. 15분 후 상층 완충액은 100 mL/분의 속도로 폐기물 백으로 옮겨지고, 상층 세포 밴드는 회수용 백에 회수된다. 펠렛은 또한 필요에 따라 추가 분석을 위해 회수된다. 상층 세포 밴드는 얼음 위에 두고 생존율 및 수율을 측정한다. 상기 과정은 모든 미분획 돼지 헤파토사이트가 처리될 때까지 반복된다. 모든 밴드가 회수되고 함께 풀(pool)을 만든 후 합쳐진 회수 세포 밴드를 회수용 완충액에 희석하여 세정하고 Sorval RC3B를 이용하여 3000rpm에서 10분간 원심분리한다. 얻어진 펠렛은 300만/mL의 밀도로 저온 보존 완충액으로 재현탁한다. 필요에 따라, 앨리쿼트는 백 및/또는 바이얼에 담겨진다. 최종 돼지 세포 조제는 액체 질소상에서 조절된 비율 프리저에 저장한다.
본 발명은 상기 실시예에 제한되는 것은 아니며, 상술한 것 외의 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 해당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구 범위의 범위 내에 포함되어야 한다.
약제품 제조 흐름도
약제품 제조 흐름도(연속성의)
본 발명은 다음 단계, 즉 사람 간장의 전부 또는 그의 절제물을 단백질 분해 효소제제로 소화시켜 소화된 사람 간장 전부 또는 그 절제물을 제공하는 단계; 소화된 사람장의 간장 전부 또는 그 절제물을 해리하여 세포의 현탁액을 제공하는 단계; 세포가 현탁된 배지의 밀도를 조정하여 밀도 베리어에 의해 분리된 적어도 2종이상의 밴드를 갖는 세포를 원심분리하여 얻고, 이들 적어도 2종 밴드의 어느 1종 밴드가 다른 1종 밴드보다 저밀도를 갖도록 하는 단계; 및 저밀도를 가지는 적어도 1종 밴드를 수집하여 간 줄기/프로제니터 세포를 포함한 생존 가능한 사람의 간장 세포가 강화된 세포의 집단을 얻는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 생존 가능한 사람의 간장 세포가 강화된 세포의 집단의 획득 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 다음 단계, 즉 사람 간장의 전부 또는 그의 절제물을 단백질 분해 효소제제로 소화시켜 소화된 사람 간장 전부 또는 그 절제물을 제공하는 단계; 소화된 사람장의 간장 전부 또는 그 절제물을 해리하여 세포의 현탁액을 제공하는 단계; 세포가 현탁된 배지의 밀도를 조정하여 밀도 베리어에 의해 분리된 적어도 2종이상의 밴드를 갖는 세포를 원심분리하여 얻고, 이들 적어도 2종 밴드의 어느 1종 밴드가 다른 1종 밴드보다 저밀도를 갖도록 하는 단계; 및 저밀도를 가지는 적어도 1종 밴드를 수집하여 간 줄기/프로제니터 세포를 포함한 생존 가능한 사람의 간장 세포가 강화된 세포의 집단을 얻는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 간 줄기/프로제니터 세포를 포함한 생존 가능한 사람의 간장 세포가 강화된 세포의 집단의 획득 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 실시예는 기능 간세포, 기능 담즙 세포, 기능 조혈 세포 또는 그 조합을 포함하는 세포 집단을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예는 간 또는 그의 절재물이 심장 박동인 또는 비수축 심장인 신생아, 소아, 청소년 또는 성인 공여자로부터 획득되어도 좋다. 특히, 세포는 본 발명의 방법에 의하여, 따뜻한 허혈 기간을 유지하도록 하거나 심장 비수축인 공여자로부터 획득되는 공여된 간장으로부터 얻어진다.
본 발명은 생육 가능하며 기능적인 담즙 세포 및 간 줄기/프로제니터 세포가 강화된 간장 세포 집단을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 특정 실시예에 있어서는, 강화된 세포 집단은 약 9∼13μm의 직경을 가지며, EP-CAM(또한 GA733-2, C017-1A, EGP40, KS1-4, KSA), CD133 또는 양자의 발현에 대하여 양성인 간 줄기/프로제니터 세포가 강화된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 간으로부터 획득되는 생세포 현탁액과 관련하여 생육 가능하며, 기능적인 간세포 및 간 줄기/프로제니터 세포에 농축되는 간세포 집단을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또 다른 실시예는 담즙 세포를 포함한다. 본 발명의 간세포의 집단의 담즙 세포는 사이토케라틴 19(CK19)의 발현에 양성이고, 알부민 발현에 대하여 음성임이 알려졌다.
본 발명은 또한 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하고, 기능적인 간세포가 강화된 세포 집단의 유효량을 투여함을 특징으로 하는 간장 질환의 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 비장 동맥 또는 문맥 정맥을 통하여, 간장 펄프에 직접, 간장 캡슐 아래로, 직접 비장에 도입하는 것을 포함하는 본 방법에 의하여 다양한 투여 모드가 고찰되어진다.
다른 실시예에 있어서, 본 발명은 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하며, 기능적인 간세포가 강화된 간세포 집단 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어진 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 실시예에 따라서는 약학적으로 허용되는 담체가 HYPOTHERMOSOLTM 등의 냉동 보존제를 포함하여도 좋다.
실시예에 따라서는 본 발명은 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하며, 기능적인 간세포가 강화된 간세포 집단을 테스트 약제에 노출시키는 단계; 및 간세포 집단에 가해지는 테스트 약제의 적어도 하나의 효과(예를 들면, 세포 생존 가능성, 세포 기능 또는 양자)를 관찰하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 시험관내(in vitro) 독성 테스트를 수행하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 또한 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하며, 기능적인 간세포가 강화된 간세포 집단을 테스트 약제에 노출시키는 단계; 및 소정 시험 기간 이후에 시험 약품을 포함하는 적어도 하나의 변화를 관찰하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 시험관내(in vitro) 약제 대사 연구를 수행하는 방법을 의도한다. 적어도 하나의 변화는 구조의 변화, 농도의 변화, 또는 시험 약품의 양자의 변화를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 다른 실시예는 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하며 기능적인 간장 세포가 강화된 세포 집단을 가지고 있는 하우징을 포함하는 간장 보조 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다. 간장 세포는 사람의 간장 세포 또는 돼지의 간장 세포를 포함하여도 좋다.
본 발명은 또한 생존 가능하며, 기능적인 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 사람의 간장 세포 집단에 유전자의 기능적인 복사를 도입하여 변형된 집단을 제공하는 단계; 및 유전자의 기능적인 복사를 필요로 하는 환자의 간에 변형된 집단의 적어도 일부분을 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 유전자 발현의 이상 유무를 처리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 전술한 방법에 유용한 본 발명의 조성물은 본 발명의 또 다른 실시예이다.
본 발명에 의해 제공되는 다른 방법은 손상 또는 질환 간장의 재생을 상승시키는 방법, 간장의 감염을 치료하기 위한 유효한 시약을 시험하기 위한 방법, 목적 단백질의 생산방법 및 목적 백신의 생산방법을 포함한다.
간장의 감염을 치료하기 위한 유효한 시약을 시험하기 위한 방법에서, 사람의 간장 세포 집단은 목적 감염성 제제로 감염된다. 이후, 감염된 집단을 소정 양의 시험 약품에 노출되고 감염된 집단에 대하여 노출의 효과가 관찰된다. 목적 단백질 생산방법에 있어서, 간의 프로제니터/줄기 세포를 포함하는 간세포 집단에 목적 단백질을 코드화하는 기능 유전자가 도입된다. 결과적인 세포 집단은 복사, 번역, 및 임의의 번역 후 변형이 발생하는데 효과적인 조건 하에서 배양되고, 이후 목적 단백질이 채취된다. 백신 생산은 간세포 집단의 적어도 일부 기관을 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스 또는 비리온(virion) 입자를 도입하여 항원을 발현시킴으로써 면역 반응이 집단의 감염된 기관을 도입할 때 항원과 관련한 감염성 제제에의 장래의 노출에 대하여 면역되려고 하는 대상으로부터 도출된다.
본 발명의 실행은 공지 기술인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자 재조합 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들면, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989); DNA Cloning, Volumes ⅠandⅡ(D. N. Glover ed.,1985); Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait ed.,1984); Mullis et al. U.S.Pat No:4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press., Inc.,N.Y.): Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Sprong Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols.154 and 155(Wu et al. eds), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Pres, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes Ⅰ-Ⅳ(D. M. Weir and C. C. Black웰, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Applications and Products 2001:Density Gradient Media(Axis-Shiel PoC AS, Oslo, Norway, 2001)
본 발명의 다른 특징 및 효과는 본 발명을 예시하여 설명하는 첨부의 도면을 참조하여 이하의 발명의 상세한 설명으로부터 명백하게 된다.
본 발명은 간 질환을 치료하려는 종래의 시도의 문제점을 해결하기 위하여 간 줄기/프로제니터 세포의 존재는 생존하고, 증식하며, 기능하고, 재생에 참여하는 성숙한 간세포와 관하여 그의 향상된 능력으로 인하여 효과적으로 향상된 수명 연장된 간세포 치료할 수 있다.
생존 가능하며 기능적인 간세포는 종래의 가이드라인에 의해서는 동소성 이식에 적합지 않거나 또는 세포 이식을 위한 대량의 성숙한 간세포의 준비에는 적합지 않은 간으로부터 본 발명의 방법에 의하여 분리될 수 있으며, 본 발명의 방법에 의하여 줄기/프로제니터 세포를 포함한 사람 간세포 집단의 정제는 간세포 치료를 위한 공여자 풀(donor pool)을 극적으로 확장시키는 것이 가능하며, 더욱이, 허혈성 손상에 대한 줄기/프로제니터 세포의 상대적인 내성 때문에, 이러한 세포가 본 방법에 의하여 많은 심장 비수축인(즉, 비박동심장) 공여자로부터 얻어질 수 있는 유용한 발명이다.

Claims (86)

  1. 다음 단계, 즉
    (a) 사람 간장의 전부 또는 그의 절제물을 단백질 분해 효소제제로 소화시켜 소화된 사람 간장 전부 또는 그 절제물을 제공하는 단계;
    (b) 소화된 사람장의 간장 전부 또는 그 절제물을 해리하여 세포의 현탁액을 제공하는 단계;
    (c) 세포가 현탁된 배지의 밀도를 조정하여 밀도 베리어에 의해 분리된 적어도 2종이상의 밴드를 갖는 세포를 원심분리하여 얻고, 이들 적어도 2종 밴드의 어느 1종 밴드가 다른 1종 밴드보다 저밀도를 갖도록 하는 단계; 및
    (d) 저밀도를 가지는 적어도 1종 밴드를 수집하여 간 줄기/프로제니터 세포를 포함한 생존 가능한 사람의 간장 세포가 강화된 세포의 집단을 얻는 단계;
    로 이루어진 것을 특징으로 하는 간 줄기/프로제니터 세포를 포함한 생존 가능한 사람의 간장 세포가 강화된 세포의 집단의 획득 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 생존 가능한 사람의 간장 세포중 강화된 전술한 세포의 집단이 기능 간세포를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 생존 가능한 사람의 간장 세포중 강화된 전술한 세포의 집단은 기능 담즙 세포를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 생존 가능한 사람의 간장 세포중 강화된 전술한 세포의 집단은 기능 조혈 세포를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 단계 (a)가 다음 단계, 즉,
    (e) 사람의 간장 전부 또는 그의 절제물을 약 37℃에서 약 15분간 킬레이션 완충액으로 관류시키는 단계;
    (f) 사람의 간장 전부 또는 그의 절제물을 콜라게나제 및 적어도 1종의 다른 단백질 분해 효소로 이루어진 효소제제로 약 37℃에서 30분 이하 소화시켜 소화된 간장을 제공하는 단계; 및
    (g) 소화된 간장을 4∼15℃의 수집 완충액으로 관류시키는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 전술한 효소제제가 적어도 1종의 중성 단백분해효소를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 전술한 효소제제가 엘라스타아제를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 전술한 효소제제가 LIBERASETM를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 전술한 해리가 기계적 해리를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 전술한 해리는 간장을 절단, 긁기, 결합 또는 갊으로서 기계적으로 해리함을 특징으로 하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 단계 (c)는 다음 단계, 즉,
    (h) 세포 현탁액을 여과하여 세포 파편 및 세포 응집물를 제거하는 단계;
    (i) 얻어진 여과된 세포 현탁액을 제 1 백에 수집하는 단계;
    (j) 여과된 세포 현탁액의 세포 농도를 결정하는 임의 단계;
    (k) 필요에 따라, 세포의 농도를 조정하여 개시 세포 현탁액을 제공하는 단계;
    (l) 개시 세포 현탁액의 일정 양을 액체 매체 중의 25%의 아이디사놀(이오디사놀) 용액의 동량과 혼합하여 혼합물을 제공하는 단계; 및
    (m) 혼합물의 적어도 일부분을 원심분리하는 소정량양의 액체 배지에 오버레이하여 생존 가능한 사람의 간장 세포가 강화된 적어도 1종의 밴드를 획득하는 단계;
    로 이루어진 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 단계 (d)는 다음 단계, 즉,
    (n) 얼음 위의 용기에 적어도 1종의 밴드를 수집하는 단계;
    (o) 세포의 생존율 및 농도를 결정하는 임의 단계;
    (p) 냉동 보존 완충액으로 원심분리 및 재현탁함으로서 세포를 세척하여 최종 세포 현탁액을 획득하는 단계;
    (q) 최종 세포 현탁액을 제어 동결시켜 동결 세포 현탁액을 제공하는 단계; 및
    (r) 동결 세포 현탁액을 액체 질소 냉동기에 저장하는 단계;
    로 이루어진 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 5항에 있어서, 전술한 수집 완충액이 10%의 사람 또는 소혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지를 함유함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 전술한 여과 단계는 필터 카트리지를 통해 전술한 세포 현탁액을 통과시킴을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11항에 있어서, 전술한 액체 배지는 페놀레드가 결여된 RPMI 1640 배지로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11항에 있어서, 전술한 원심분리를 약 500xg에서 약 15분간 수행함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 12항에 있어서, 전술한 용기는 수집 백을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 12항에 있어서, 전술한 냉동 보존 완충액이 Na+, K+, Ca2+, Mg2+ , Cl-, H2P04 -, HC03 -, HEPES, 락토비오네이트(lactobionate), 슈크로오스, 만니톨, 글루코오스, 덱스트란-40, 아데노신, 글루타치온, 또는 이들의 조합을 포함하는 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 전술한 냉동 보존 완충액은 혈청 및 디메틸설폭사이드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 전술한 혼합물, 전술한 혈청 및 전술한 디메틸설폭사이드가 약 80：10：10 v/v/v의 비로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 전술한 혈청은 사람 혈청, 소 혈청, 또는 이들의 조합을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 전술한 배지의 밀도가 이오디사놀 또는 이오헥솔 수용액으로 조정함을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 전술한 이오디사놀 또는 이오헥솔의 수용액은 물에 무균의 60%(w/v)의 이오디사놀 및 동등 밀도의 수중 이오헥솔 또는 그의 조합을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 전술한 배지의 밀도는 슈크로오스의 친수성 중합체의 수용액을 사용하여 조정함을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 전술한 슈크로오스의 친수성 중합체의 수용액은 피콜, 칼슘 EDTA와 결합된 디아트리조에이트를 가한 피콜, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 전술한 강화된 세포 집단은 9∼13㎛의 직경을 가지며, EP-CAM, CD-133, 또는 양자의 발현에 양성인 간 프로제니터/줄기 세포를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  27. 기능 간세포 및 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생존 가능한 사람의 간세포가 강화된 세포 집단을 획득하는 방법에 있어서,
    (a) 사람의 간장 전부 또는 그의 절제물을 신생아, 소아, 청소년, 성인, 또는 시신 기증자로부터 제공받는 단계;
    (b) 사람의 간장 전부 또는 그의 절제물을 약 37℃에서 약 15분간 킬레이션 완충액으로 관류시키는 단계;
    (c) 사람의 간장 전부 또는 그의 절제물을 콜라게나제 및 적어도 1종의 다른 단백질 분해 효소를 포함하는 효소제제로 약 37℃에서 약 15분간 소화시켜 소화된 간을 제공하는 단계;
    (d) 소화된 간을 냉장한 수집 완충액으로 관류시키는 단계;
    (e) 소화된 간을 기계적으로 해리하여 세포 현탁액을 제공하는 단계;
    (f) 세포 현탁액을 필터 카트리지에 통과시켜서 조직 파편 및 세포 응집물을 제거하는 단계;
    (g) 여과된 세포 현탁액을 제 1백에 수집하는 단계;
    (h) 여과된 세포 현탁액의 세포의 생육 가능성 및 농도를 결정하는 임의 단계;
    (i) 농도를 약 ㎖당 세포 25,000,000개 정도로 조정하여 개시 세포 현탁액을 제공하는 단계;
    (j) 개시 세포 현탁액의 일정량(250㎖)을 페놀레드가 결여된 RPMI 1640 배지의 25% 이오디사놀(OptiPrepTM) 수용액 동량과 제 2백에서 혼합하는 단계;
    (k) 얻어진 혼합물(500㎖)을 페놀레드가 결여된 RPMI 1640 배지의 소정량(60 ㎖)을 COBETM 2991 세포 프로세서(2000rpm에서 15분, 500xg)의 원심분리에 오버레이시켜 생존 가능한 세포가 강화된 적어도 1종의 밴드를 얻는 단계;
    (1) 적어도 1종의 밴드를 얼음 위의 제 3백에 수집하는 단계;
    (m) 제 3백의 세포의 생육 가능성 및 농도를 결정하는 임의 단계;
    (n) 제 3백의 세포를 냉동 보존 완충액으로 원심분리 및 재현탁시킴으로써 세척하여 최종 세포 현탁액을 획득하는 단계;
    (o) 최종적인 세포 현탁액을 제어 동결하여 동결 세포 현탁액을 획득하는 단계; 및
    (p) 냉동된 세포 현탁액을 액체 질소 냉동고에 저장하는 단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 기능 간세포 및 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생존 가능한 사람의 간세포가 강화된 세포 집단을 획득하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 전술한 강화된 세포 집단이 약 9∼13㎛의 직경을 가지며, EP-CAM, CD-133 또는 양자의 발현에 양성인 간 프로제니터/줄기 세포가 강화되는 방법.
  29. 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하고, 기능적인 간세포가 강화된 세포 집단을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 29항에 있어서, 전술한 간세포는 사람의 간세포 또는 포유류의 간세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 30항에 있어서, 담즙 세포, 조혈 세포 또는 그 혼합을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 29항에 있어서, 전술한 간세포는 EP-CAM, CD-133 또는 양자의 발현에 양성인 세포를 포함하는 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 29항에 있어서, 전술한 간세포는 직경 약 9∼13㎛의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 간으로부터 획득되는 생세포 현탁액과 관련하여 생육 가능하며, 기능적인 간세포 및 간 줄기/프로제니터 세포에 농축되는 간세포 집단을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 34항에 있어서, 전술한 간세포는 사람의 간세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제 35항에 있어서, 전술한 간세포의 집단은 사이토케라틴 19(CK19)의 발현에 양성이고, 알부민 발현에 대하여 음성인 담즙 세포를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제 34항에 있어서, 전술한 줄기/프로제니터 세포는 EP-CAM, CD133, 또는 양자의 발현에 양성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제 36항에 있어서, 전술한 세포 집단은 단구/대식세포 혈통 세포(예를 들면 쿠퍼 세포), 임파구(예를 들면, T임파구), 내피세포, 또는 그의 조합을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제 34항에 있어서, 면역 시스템의 세포에서 전술한 간세포 집단이 결핍된 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제 39항에 있어서, 네가티브 면역 선택을 이용하여 면역 시스템의 세포에서 전술한 간세포 집단이 결핍된 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제 40항에 있어서, 네가티브 면역 선택은 CD45, CD3, CD11b, 또는 CD14 결핍 또는 그의 조합을 이용하여 조혈 세포를 제거함을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제 39항에 있어서, 제거되는 면역 시스템의 세포는 단구/대식세포 혈통 세포(예를 들면, 쿠퍼 세포), 임파구(예를 들면, T임파구), 또는 양자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제 34항에 있어서, 공여된 간장이 따뜻한 허혈의 기간을 유지하도록 함을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제 34항에 있어서, 전술한 간장 세포가 심장 비수축인 기증자로부터 얻어지는 조성물.
  45. 제 34항에 있어서, 전술한 간장 세포 집단의 적어도 75%는 간세포 및 간 프로제니터/줄기 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 생육 가능하며 기능적인 담즙 세포 및 간 줄기/프로제니터 세포가 강화된 간장 세포 집단을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제 46에 있어서, 전술한 간장세포는 사람 간장 세포, 돼지 간장세포, 또는 그의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  48. 제 46항에 있어서, 전술한 간장 세포는 심장 비수축인 제공자로부터 얻어지거나 또는 따뜻한 허혈의 기간을 유지하도록 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 제 46항에 있어서, 전술한 담즙 세포는 CK19의 발현이 양성이며, 알부민의 발현이 음성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하고, 기능적인 간세포가 강화된 세포 집단의 유효량을 투여함을 특징으로 하는 간장 질환의 치료방법.
  51. 제 50항에 있어서, 투여가 비장 동맥 또는 문맥 정맥을 통하여 도입함으로서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 50항에 있어서, 전술한 투여는 간장 펄프에 직접 도입함으로써 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 50항에 있어서, 전술한 투여는 간장 캡슐 아래로 도입함으로써 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 50항에 있어서, 전술한 투여는 직접 비장에 도입함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 50항에 있어서, 전술한 도입은 정맥 주입 또는 주사인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 50항에 있어서, 간장 질환이 간염, 간경변, 선천적 대사 이상, 급성 간부전, 급성 간 전염병, 급성 화학 독성, 만성 간부전, 콜란지오시티스(cholangiocitis), 담즙 간경변, 알라지르(Alagille) 증후군, 알파-l-안티트립신 결핍, 자기면역 간염, 담즙 폐쇄증, 간암, 간의 낭포성의 병, 지방간, 갈락토T세미아, 담석, 길버트 증후군, 혈색소 침착증, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 그리고, 다른 간염 바이러스 감염, 포리피리아(poryphyria), 원자력 발전성 경화성 담관염, 레이 증후군, 종류 육종증, 티로신혈증, 1형 당원병, 또는 윌슨병을 포함하는 방법.
  57. 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하며, 기능적인 간세포가 강화된 간세포 집단 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어진 의약 조성물.
  58. 제 57항에 있어서, 전술한 간세포는 사람 간세포, 돼지 간세포, 또는 그의 혼합물인 조성물.
  59. 제 57항에 있어서, 전술한 간세포는 심장 비수축인 공여자로부터 얻어지거나, 또는 따뜻한 허혈의 기간을 유지되도록 한 조성물.
  60. 제 57항에 있어서, 전술한 줄기/프로제니터 세포는 EP-CAM, CD133, 또는 양자의 발현이 양성인 조성물.
  61. 제 57항에 있어서, 줄기/프로제니터 세포는 직경이 약 9∼13㎛인 조성물.
  62. 제 57항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체가 HYPOTHERMOSOLTM를 포함하는 조성물.
  63. 제 57항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체가 사람 혈청 및 디메틸설폭사이드를 더욱 포함하는 조성물.
  64. 시험관내(in vitro) 독성 테스트를 수행하는 방법에 있어서,
    (i) 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하며, 기능적인 간세포가 강화된 간세포 집단을 테스트 약제에 노출시키는 단계; 및
    (ii) 간세포 집단에 가해지는 테스트 약제의 적어도 하나의 효과를 관찰하는 단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 전술한 적어도 하나의 효과는 세포의 생육 가능성, 세포 기능, 또는 양자를 포함하는 방법.
  66. 시험관내(in vitro) 약제 대사 연구를 수행하는 방법에 있어서,
    (i) 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하며, 기능적인 간세포가 강화된 간세포 집단을 테스트 약제에 노출시키는 단계; 및
    (ii) 소정 시험 기간 이후에 시험 약품을 포함하는 적어도 하나의 변화를 관찰하는 단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 전술한 적어도 하나의 변화는 구조의 변화, 농도의 변화, 또는 시험 약품의 양자의 변화를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  68. 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생육 가능하며 기능적인 간장 세포가 강화된 세포 집단을 가지고 있는 하우징을 포함하는 간장 보조 장치.
  69. 제 68항에 있어서, 전술한 간장 세포는 면역 시스템 세포가 결핍된 장치.
  70. 유전자 발현의 이상을 처리하는 방법에 있어서,
    (i) 생존 가능하며, 기능적인 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 사람의 간장 세포 집단에 유전자의 기능적인 복사를 도입하여 변형된 집단을 제공하는 단계; 및
    (ii) 유전자의 기능적인 복사를 필요로 하는 환자의 간에 변형된 집단의 적어도 일부분을 도입하는 단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 유전자 발현의 이상 유무를 처리하는 방법.
  71. 유전자의 기능 복사가 도입되는, 생존 가능하며, 기능적인 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 사람 간장 세포의 변형된 집단을 포함하는 유전자 발현을 처리하기 위한 조성물.
  72. 유전자의 기능 복사가 도입되는, 생존 가능하며, 기능적인 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 사람 간세포의 변형된 집단 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 유전자 발현의 이상을 처리하기 위한 의약 조성물.
  73. 제 72항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체가 Na+, K+, Ca2+, Mg2+ , Cl-, H2P04 -, HC03 -, HEPES, 락토비오네이트, 슈크로오스, 만니톨, 글루코스, 덱스트란-40, 아데노신, 글루타치온, 또는 이들의 조합을 함유하는 혼합물을 포함하는 조성물.
  74. 간 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생존 가능하며, 기능적인 간세포가 강화된 사람의 간장 세포 집단의 유효량을 간장에 투여하는 것을 특징으로 하는 손상 또는 질환 간장의 재생을 상승시키는 방법.
  75. 제 74항에 있어서, 전술한 투여는 비장 동맥 또는 문맥을 통하여, 직접 간장 펄프에, 간 캡슐 아래에, 또는 그의 조합에 의해 도입됨을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 74항에 있어서, 전술한 투여는 직접 비장에 도입하여 수행함을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 74항에 있어서, 전술한 도입이 정맥 주입 또는 주사에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 간장의 감염을 치료하기 위한 유효한 시약을 시험하기 위한 방법에 있어서,
    (i) 간의 줄기/프로제니터 세포를 포함하는 생존 가능하며, 기능적인 간세포가 강화된 사람의 간세포의 집단을 중요한 감염성 제제로 감염시켜 감염된 집단을 제공하는 단계; 및
    (ii) 감염된 집단을 소정량의 시험 시약에 노출시키는 단계; 및
    (iii) 감염된 집단에 대하여 노출의 효과를 관찰하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  79. 제 78항에 있어서, 전술한 감염성 제제가 미생물을 포함하는 방법.
  80. 제 78항에 있어서, 감염성 제제는 1종 이상의 바이러스, 박테리아, 균류 또는 그의 조합을 포함하는 방법.
  81. 제 80항에 있어서, 전술한 관찰된 효과는 바이러스 감염성 제제의 바이러스 복제에 대한 효과를 포함하는 방법.
  82. 제 81항에 있어서, 바이러스 감염성 제제가 간염 바이러스를 포함하는 방법.
  83. 간 프로제니터/줄기 세포를 포함하는 간세포 집단에 목적 단백질을 코드화하는 기능 유전자를 도입하고,
    전사, 번역에 유효한 조건하에서 간세포 집단을 배양한 후,
    필요에 따라, 포스트 번역하여 변이를 일으키고,
    목적 단백질을 채취함을
    특징으로 하는 목적 단백질의 생산방법.
  84. 제 83항에 있어서, 전술한 간장 세포가 사람의 간장 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 83항에 있어서, 목적 단백질이 백신 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  86. 간 프로제니터/줄기 세포를 포함하는 간세포 집단을, 간장 세포의 적어도 어떤 부분을 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스 또는 비리온 입자를 도입하여 항원을 발현시킴으로써 면역 반응이 항원이 결합된 감염성 제제를 집단의 감염 부재를 개체에 도입함으로서 항원에 결합된 감염 시약에 장래의 노출에 대하여 면역되는 것이 구해지는 개체로부터 도출되는 것을 특징으로 하는 백신의 생산방법.
    제 86항에 있어서, 세포 기준 면역 반응이 도출되는 것을 특징으로 하는 방법.
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