KR101523141B1

KR101523141B1 - 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101523141B1
Application number: KR1020130134602A
Authority: KR
Inventors: 이병천; 오현주; 김민정; 김건아; 조영광; 강성근; 고명순; 이항영
Original assignee: 주식회사 케이스템셀
Priority date: 2013-11-07
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2015-05-26
Also published as: KR20150052990A

Abstract

본 발명은 핵 이식 기술에 따른 개과 동물(Canidae)의 복제에 있어서의 효율적인 체외(in vitro) 배양체계에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 개과 동물의 체세포 또는 줄기세포 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 최적의 효과를 나타내는 배지 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 개복제에 필요한 증식능, 줄기세포성(전능성), 리프로그래밍능 및 텔로머라아제 활성이 우수한, 양적 및 질적 모두 향상된 핵 공여 세포를 제공함으로써, 개과 동물의 복제에 있어서의 성공적인 핵이식 효율을 현저히 향상시킨다.

Description

개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지 및 이의 이용{A Medium for Culturing Donor Cells on Preparation of Cloned Canidae Using Somatic Cell Nuclear Transfer and The Use thereof}

본 발명은 핵 이식 기술에 따른 개과 동물(Canidae)의 복제에 있어서의 효율적인 체외(in vitro) 배양체계에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 개과 동물의 체세포 또는 줄기세포 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 최적의 효과를 나타내는 배지 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.

생명공학 또는 유전자 조작기술의 발달에 따라 원하는 형질들로 조합한 다양한 재조합 생명체들의 여러가지 생산 성공사례가 발표되어 왔고, 최근에는 예컨대 양 등과 같은 복제 동물들의 생산에 성공한 사례들이 속속 보고되었다.

체세포 핵 이식을 통한 포유동물 복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577).

복제 동물을 생산하는 기술은 상업적 유용성뿐 아니라, 생체의학과 생물학 연구에 있어서도 그 중요성은 압도적이다. 복제 동물 생산기술의 산업적 적용분야는 고품질의 축산식품 생산, 고부가가치의 약리활성물질 생산, 각종 병원균에 대한 생체저항력 향상동물 생산, 질환 모델 동물의 생산 및 유전자치료 분야에 이르기까지 매우 광범위하다.

복제 동물의 다양한 용도 중에서도, 소, 돼지와 같은 산업동물의 복제와 더불어, 요즘 같은 산업화 및 정보화 시대를 거쳐오면서 개, 고양이 등의 애완 동물 및 반려 동물의 복제는 많은 사람들의 관심의 대상이 되고 있다.

이 중 특히 반려견에에 대한 심리적 의존도가 급격히 증가하고 있고, 개과 동물의 우수한 능력을 이용하는 검역견이나 마약탐지견과 같은 특수목적견의 필요성도 증가하고 있다. 또한, 인간의 난치질환 연구모델분야에서는 여러 한계가 있는 설치류를 대신하여 개과 동물이 선호되고 있는 추세이다. 개는 인간과 생리학적 특성이 비슷하고 사람과 동물의 유사한 질병 발생 패턴을 을 가지고 있어 병리학적, 생리학적으로도 유사하며, 실제로 인간 질병연구에 응용할 수 있는 유전 질병의 수가 65개의 돼지나 136개의 고양이와 비교해 개는 224개로 월등히 많아 (http://omia.angis.org.au/) 이러한 유전 형질을 이용하여 인간의 질병모델 복제개를 만들면 인간 질병연구에 큰 도움이 되는 중요한 의미가 있다.

그렇기 때문에 오랜 기간 개복제에 대한 시도가 이루어져왔으나, 현재까지 개 복제는 여전히 성공률이 극히 낮고, 성공하기 어려운 복제로 여겨지고 있으므로, 개과 동물의 복제 효율을 향상시키기 위한 다양한 방법이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 체세포 핵이식 방법에 의한 복제개의 향상된 생산방법을 연구하던 중, 핵 공여 세포 제조에 있어서, 특정 물질을 함유하는 특정 배지에 핵 공여 세포를 배양시킴으로써, 개복제에 필요한 증식능, 줄기세포성(전능성), 리프로그래밍능 및 텔로머라아제 활성이 현저히 우수한, 양적 및 질적 모두 향상된 핵 공여 세포를 수득할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 주요 목적은 개과 동물의 세포 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 특이적으로 적합한 배지를 제공하고자 하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 배지를 이용하여 개과 동물의 핵 이식란 생산 및 복제 산자 생산의 효율을 높이는 방법을 제공하고자 하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은

기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium), 성장 인자, 항산화제 및 10~20% FBS(fetal bovine serum) 및 비필수 아미노산을 함유하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지를 제공한다.

이 때, 상기 성장 인자는 섬유아세포 증식인자(FGF)이고, 상기 항산화제는 아스코르브산 또는 비타민 C인 것이 바람직하며, 특히 아스코르브산인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 비필수 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글리신, 프롤린 및 세린을 함유하는 MEM 비필수 아미노산이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 가장 바람직한 구체예로서는, 기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium)(high-glucose), 섬유아세포 증식인자(FGF), 아스코르브산, 비필수 아미노산 및 10~20% FBS를 함유하는,개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지를 들 수 있고, 더욱 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 0.2 mM 아스크로브산, 10ng/mL의 섬유아세포 증식인자, 10% FBS, 및 1% MEM 비필수 아미노산을 함유하는 DMEM(dulbecco modified eagle medium)(high-glucose) 기반 배지를 사용하였다.

한편, 상기 핵 공여 세포는 개과 동물 체세포 또는 줄기세포 유래인 것을 사용할 수 있는데, 이 때, 상기 체세포는 유사분열 G2/M단계의 것이 바람직하다.

체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 성체 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 섬유아세포 또는 난구세포를, 가장 바람직하게는 섬유아세포를 사용한다.

상기 줄기세포는 배아 또는 성체 유래인 것을 사용할 수 있으나, 윤리적인 문제 등을 고려하여 성체 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다.

이러한 성체 유래 줄기세포는 골수, 제대혈, 혈액, 지방, 피부, 위장관, 태반 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택된 조직으로부터 분리할 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에서는 개의 지방으로부터 분리하여 사용하였다.

본 발명은 또한, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지의 이용을 제공한다.

일 구체예로써, 개과 동물의 복제를 위하여, 상기 설명한 배지를 이용하는 것을 특징으로 하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법을 제공한다.

이 때, 핵 공여세포의 배양은 5계대까지, 바람직하게는 3계대 또는 4계대까지 이루어지는 것이 바람직하고, 각 계대에서의 배양은 90 %컨플루언스 이상의 값에 도달할 때까지 수행되는 것이 바람직하다. 특히, 핵 공여세포의 1차 배양은 7 내지 10일 동안 이루어질 수 있고, 총 배양 기간은 약 14~17일 정도가 소요될 수 있다.

다른 구체예로써, 본 발명은 상기 방법으로 배양한 핵 공여 세포를 분리하여 탈핵된 난모 세포에 이식 한 다음 이를 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 핵 이식란을 즉시 대리모에게 이식시켜 발생시키는 단계를 포함하는, 복제된 개과 동물의 생산방법을 제공한다.

이처럼, 본 발명은 개과 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시키기 위한 핵 공여 세포 배양에 대하여 유난히 효과가 우수한 배지 조성물 및 이의 모든 용도를 포함한다.

본 발명은 개복제에 필요한 증식능, 줄기세포성(전능성), 리프로그래밍능 및 텔로머라아제 활성이 우수한, 양적 및 질적 모두 향상된 핵 공여 세포를 제공함으로써, 개과 동물의 복제에 있어서의 성공적인 핵이식 효율을 현저히 향상시킨다. 이를 통해 개과 동물을 고효율로 복제할 수 있게 함으로써 개과동물 우량 품종의 번식, 보존, 이종이식, 질환 모델동물 생산 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있을 것이다.

도 1은 개 체세포(섬유아세포) 유래 핵 공여 세포를 DMEM 및 RCME-P 배지에서 배양하여 단일층을 형성하는데 소요되는 시간을 나타낸 그래프이다.
도 2는 DMEM배지에서의 일차 배양(A) 및 RCME-P배지에서의 일차 배양(B)시 핵 공여 체세포의 형태학적 특성 비교 및 세포 크기 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 DMEM 및 RCME-P 각각의 배지를 사용한 경우에 핵 공여 체세포에서의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프로,(A) 1차 배양기간, (B) 전능성과 관련된 유전자(SOX2, NANOG, DPPA2,Rex1) 발현, (C) 리프로그래밍과 관련된 유전자(HDAC, DNMT1, DNMT3a, DMNT3b, and MeCp2) 발현, (D) 세포사와 연관된 유전자(Bax, and Bcl2) 발현의 수준을 비교한 결과이다.
도 4는 개 지방 줄기세포 유래 핵 공여 세포를 DMEM 및 RCME-P 배지에서 배양한 경우의 여러가지 유전자 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 DMEM 및 RCME-P에서 배양된 핵 공여 체세포에서의 텔로머라아제 활성을 비교한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"배양"은 생물체나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일로써, 이 경우 외적 조건으로 온도 ·습도 ·빛 ·기체상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 직접적인 영향을 주는 것은 배지(배양기)로, 그 생물체의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소의 공급장이다.

"체외배양"이란 세포 등이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것으로, 본 발명의 배지 조성물은 핵 공여 세포의 체외배양에 최적화된 배지 조성물이다.

'배지' 또는 '배지 조성물'은 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 개과 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시키 위한 핵 공여 세포에 사용되는 배지이다.

'핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.'핵 이식란'은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.

'복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 개과 동물의 체세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다. 본 발명은 핵 이식 기술을 이용하여 개과 동물을 복제하는 기술에 관한 것이다. 특히, 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.

'핵 공여 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다. 본 발명에서 상기 핵 공여 세포로는 개과 동물의 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있다.

'체세포(somatic cell)'란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포이며, 어떤 목적으로 특화하여 그 이외의 세포는 되지 않는 분화된 세포와, 몇종류인가의 다른 기능을 갖는 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포를 포함한다.

'줄기세포(stem cell)'란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능성 줄기세포(totipotent stem cell), 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 소스에 따라 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포로 분류할 수도 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 개과 동물의 성체 줄기세포를 사용할 수 있다.

'계대 배양(Subcultury)' 은 세포는 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양 접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양 접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시키는데 이때 세포를 동물에서 떼어내어 일차, 이차, 삼차 등등 계속하여 배양하는 방법 즉, 주기적으로 새로운 배지를 교환함으로써 세포주를 보존하는 방법을 말한다. 각 단계를 '계대(passage)'라고 일컫는다.

'융합'은 핵 공여 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여 세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.

'핵 재프로그래밍(nuclear reprogramming)'는 핵 이식 과정 중 수핵 난자와 공여 세포를 융합한 후 공여 세포주의 핵이 재구성 되어 핵 이식란(복제 수정란)의 정상적인 발생을 유도하는 과정을 말하는 것으로, 일정 시간을 항온 배양하는 것으로 달성할 수 있다.

'활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다.

'산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.

'개과 동물(canidae)'은 크게 개족(Tribe Canini)과 여우족(Tribe Vulpini)으로 나눌 수 있고, 개, 늑대, 재칼, 여우, 승냥이, 너구리, 코요테 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다. 상기 개는 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있으며 이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다(Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21:1057-1066). 본 발명에 있어서 상기 '개과 동물'이라는 용어에 대하여, '개'로 단순히 줄여서 혼용하여 쓰기도 한다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "함유하다" 및 "포함하다"란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일반적으로 복제된 개과 동물의 생산방법은 예를 들어,

(a) 개의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 단계;

(b) 개의 조직으로부터 분리한 체세포들에 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 것을 포함하는 핵 공여 세포 제조단계;

(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 핵 공여 세포를 미세주입하고 융합시키는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계;및

(e) 상기 활성화된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 것으로 알려져 있고, 각 단계에 관한 통상적 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래의 체세포 핵이식 기술을 이용한 복제 동물의 제조방법 등을 참조하여 이해할 수 있다.

특히, 본 발명은 상기 방법의 수행 중 이용되는, 개과 동물의 체세포 핵 이식에 따른 복제개 생산에 효율적인 체외 배양체계에 관한 것으로서, 그 중에서도 개과 동물의 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 최적의 효과를 나타내는 배지 조성물(배양액) 및 이의 이용을 제공함을써 개과 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시킨다.

대상 세포

즉, 본 발명은 체세포 핵이식 기술을 이용한 복제개의 생산에 사용되는 "핵 공여 세포"의 배양에 특이적인 것이다.

상기 핵 공여 세포의 일 구체예로서 개과 동물의 체세포를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 개의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.

핵 공여 세포로서 제공되는 상기 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 바람직하게는 유사분열 G2/M단계의 체세포를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 핵 공여 세포로는 체세포 이외에도 개의 배아 유래 또는 성체 유래의 줄기세포를 사용할 수 있다.

성체 유래 줄기세포의 예를 들면, 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 유래된 조직으로부터 분리, 사용할 수 있다. 성체 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 원하는 방향으로 분화되지 않은 세포가 암을 유발할 가능성이 매우 희박하여 임상적으로 매우 중요한 장점을 갖고 있다. 개로부터 배아 줄기세포를 수득하거나 개의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용할 수 있다.

줄기세포를 사용할 경우, 줄기세포의 특성상 일반적으로 초기 배아 발달에 필수적이라 여겨지고 있는, 미분화 유전자들이 발현되고 있다는 점이 그 장점으로 부각될 수 있다.

이처럼, 본 발명에서의 핵 공여 세포로는 개로부터 유래된 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 체세포인 섬유아세포를 사용하였다.

배지 조성물

본 발명은 일 관점에서, 상기 개과 동물의 복제에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 특히 효과적인 배지 조성물에 관한 것으로 하기와 같은 구성을 포함한다.

기본배지

본 발명에서 사용될 수 있는 기본 배지는, 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포를 인 비트로에서 배양하기 위한 배지로서, 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분만을 포함하는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)일 수 있다. 즉, 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함된 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 기본 배지이다.

에너지 공급원으로서 다당류(polysaccharides), 단당류(monosaccharides), 유기산(organic acid), 아미노산(amino acid), 알콜(alcohol), 다환식 함유물(polycyclic compounds), 세루로오스(cellurose), 헤미셀루로오스(hemicellurose), 리그닌(lignin) 등의 여러가지 탄소원을 이용할 수 있다. 상기 다당류로는 덱스트린, 스타치 등을, 이당류로는 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 만니톨 등을, 단당류로는 글루코스, 만노스, 프록토오스, 갈락토오스 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), K-SFM (Keratinocyte-SFM;Keratinocyte serum free medium) 등이 있는데, 가장 바람직하게는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지를 사용한다.

배지의 필수 성분

본 발명의 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포 배양용 배지는 상기 설명한 기본 배지에, 필수 성분으로서 이하와 같은 구성성분을 포함하는 것을 특징으로 한다. 각 배지 구성 성분의 함유량은 당업자들이 적절히 조절할 수 있음은 자명할 것이다.

본 발명의 배지는 성장 인자를 더 함유한다.

이러한 성장 인자를 함유함으로써 핵 공여 세포의 증식이 한층 더 촉진된다.

성장 인자의 바람직한 예로서는 상피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 증식인자(FGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 트랜스포밍 성장 인자(TGF), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 에리스로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 간세포 증식 인자(HGF) 등을 들 수 있고, 본 발명에서 가장 바람직하게는 섬유아세포 증식인자(fibroblast growth factor, FGF)를 사용한다. FGF는 in vivo 상태에서 다양한 형태의 세포증식을 야기할 수 있다.

섬유아세포 증식인자(FGF)의 바람직한 함량은 10∼ 50 ng/mL이며, 이의 함량이 10 ng/mL 미만이면 특별한 효과가 없으며, 50ng/mL을 초과하면 세포에 독성을 가진다.

또한, 본 발명의 배지는 단백질 영양분을 더 함유한다.

예를 들면, FBS(fetal bovine serum), 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민 등을 함유할 수 있다. 가장 바람직하게는 FBS(fetal bovine serum)을 사용하며 바람직한 함량은 10~20% 이다.

또한, 본 발명의 배지는 항산화제를 더 함유한다.

항산화제는 비제한적으로, 천연 항산화제인 토코페놀(Tocopherol), 쎄사몰(Sesamol), 진저론(Gingeron), 캡사이신(Capsaicin), 퀘르세틴(Quercetin), 갈릭산(Garlic acid); 합성항산제인 BHA, BHT, TBHQ; 효과상승제인 구연산, 아스코르브산; 항산화성 생체 기능 분자인 수용성 항산화제 비타민 C, 지용성 항산화제 비타민 E, 유비퀴논 (CoQ), 카로테노이드 등을 선택하여 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 아스코르브산 또는 비타민 C를 사용한다.

본 발명의 일 실시예에서는 아스코르브산을 사용하였는데, 특히, 아스코르브산은 콜라겐 생합성에 중요한 역할을 담당하는 바, 예를 들어, 섬유아세포 배양에서의 아스코르브산 일차 배양에서의 세포 증식을 촉진시키고(Shima and others 2011), 체외에서 산화 스트레스로부터 세포가 안정 상태를 유지할 수 있도록 하기 때문에 세포 생존능도 향상시킬 수 있다. 아스코르브산의 바람직한 함량은 0.1~1mM 이다.

또한, 본 발명의 배지는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 비필수 아미노산을 포함하며, 바람직하게는 하기와 같은 구성성분을 함유하는 MEM 비필수 아미노산(Non-Essential Amino Acids, NEAA)(100X) 용액을 사용한다. 바람직한 함량은 약 0.5~3%, 더욱 바람직하게는 약 1%이다.

그러므로, 본 발명인 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포 배양용 배지 조성물은, 가장 바람직한 구체예로써, 기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium )(high glucose)를 사용하며, 아스코르브산, 섬유아세포증식인자(FGF), MEM 비필수 아미노산(MEM Non-Essential Amino Acids) 및 FBS(Fetal bovine serum)를 함유한다. 본 발명의 실시예에서는 이러한 본 발명의 배지를 "RCME-P"로 명명하여 사용한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에서는, 0.2 mM 아스크로브산, 10ng/mL의 섬유아세포증식인자, 10% FBS, 및 1% NEAA를 함유하는 DMEM(high glucose,Invitrogen) 기반 배지를 RCME-P로 사용하였다.

배지의 임의 성분

이 외에도, 본 발명의 배지는 필요에 따라 하기 임의 성분들을 포함할 수 있다.

예를 들어, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 체세포의 증식 또는 유지를 위한 배양에 사용할 수 있는 것 외에 배양하는 세포가 줄기세포인 경우에는 줄기세포의 분화 유도를 위해서 사용할 수도 있다. 줄기세포의 분화 유도에 사용하는 경우에는 분화 유도제가 더 첨가된다. 분화 유도제로서는 사이토카인(각종 인터류킨, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴 등), 콜로니 자극 인자(예를 들면, G-CSF 등), 스테로이드 호르몬(덱사메타손 등), 인돌(인도메타신 등), 티아졸리딘 유도체(로시글리타존 등) 등을 예시할 수 있다. 이들 중 1개 또는 복수종을 사용할 수 있다.

또한, 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 일반적인 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수도 있다.

또한, 배지는 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent)를 포함할 수 있다.

이러한 임의 성분의 첨가는 당업계의 통상의 지식을 가진 자가 공지 기술 및 실험 설계의 내용에 따라 적절히 수행할 수 있을 것이다.

배양 방법

한편, 본 발명은 다른 관점에서 상기 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포 배양용 배지를 이용하는 방법에 관한 것으로, 예를 들어, 핵 공여 세포 배양용 배지를 이용하여 개과 동물의 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양 및 생산방법에 관한 것이다.

일 구체예를 간단히 설명한다.

개과 동물로부터 조직의 일부를 무균적으로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세절하여 트립신으로 처리한 다음 상기 설명한 핵 공여 세포 배양용 배지에서 배양한다. 예를 들어, 개의 피부 조직을 분리하여 일반적인 일차 배양방법과 동일하게 1mm*1mm의 크기로 자른 조직을 본 발명의 RCME-P 배지에서 배양하기 시작하여 90 %의 컨플루언스 상태에 도달할 때까지 배양액을 3-4일에 1회씩 추가해주는 방법으로 하여 컨플루언스 상태에 도달할 때까지의 배양한다. 1차 배양에는 평균 약 7일이 소요된다.

상기 배지에서 3-4일 배양 후에 배양 접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 핵 이식에 이용하기 위하여 계대 배양을 실시한다. 각각 목적하는 %컨플루언스에 도달함에 따라 새로운 배지로 옮겨 배양하고, 이렇게 계대 배양된 세포에 대해 트립신 처리하여 단일세포로 제조하여 핵이식을 위한 최종 핵 공여 세포로 사용한다. 즉, RCME-P배양액을 이용하여 계대 배양 및 동결하고 90% 컨플루언스 상태에 도달할 때 세포를 분리하여 최종 핵 공여세포로 사용한다.

‘~% 컨플루언스’는 세포 배양에 있어서 단위 면적당 세포수(세포농도)를 상대적으로 나타내는, 당업자들이 실험에 있어서 자주 사용하는 단위이다.

본 발명의 방법에 있어서, 평균적 계대수는 1~5계대이며, 가장 바람직하게는 3~4계대로 사용한다. 또한, 세포를 조직에서 분리하여 계대하기 위해서는 일차 배양시 90%이상의 컨플루언스일 때 사용하는 것이 바람직하다. 또한 각 계대에서 배양시 요구되는 컨플루언스 값은 모두 90% 이상이다. 최종 공여 세포 수득시 요구되는 컨플루언스값 또한 90% 이상에 해당된다.

본 발명에서 최종 핵 공여 세포를 수득하기 위한 배양의 총 기간은 약 14~17일, 바람직하게는 약 15일 정도일 수 있고, 특히, 1차 배양에 걸리는 시간은 약 7~10일이다.

상기 배양은 통상의 체외 배양용 용기, 예를 들어, CO₂ 인큐베이터, 디쉬, 바이오리액터 등을 이용하여 당업자가 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식에 의해 적절히 온도, 습도 등의 조건을 맞추어 수행할 수 있다.

이와 같은 본 발명에 따른 배지 및 이의 이용 방법은, 생물반응장치 시스템(bioreactor systems) 등을 이용한 체외 배양을 통해 복제개 생산을 위한 핵 공여 세포의 효과적인 생산에 적용시킬 수 있을 것이다.

특히, 지금까지 일반적으로 사용해왔던 DMEM 배지에 비해, 본 발명의 RCME-P의 배지를 사용하여 배양하는 경우, 핵 공여 세포의 증식 효율이 현저히 우수하다.

본 발명의 일 실시예에서 DMEM 1차 배양 배지는 단일층이 되기까지 15일 이상이 걸린 반면, RCME-P 1차 배양 배지는 단지 9일만이 소요되었는 바, 이러한 효과를 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 RCME-P의 배지를 이용하여 배양한 핵 공여 세포는 줄기세포성(전능성) 및 리프로그래밍 능력; 그리고 텔로머라아제 활성도 매우 우수한 특성을 보유한다.

본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, DMEM 배양된 핵 공여 세포(체세포 및 줄기세포 모두)에서는 줄기세포성 관련 유전자인 Sox2, Nanog, Oct4, Stella, Rex1의 발현 수준이 현저히 낮게 나타났고, 리프로그래밍과 관련된 유전자 HDAC1, DNMT1, MeCP2의 발현 및 텔로머라아제 활성 역시 RCME-P의 배지의 경우보다 낮게 나타났다.

즉, RCME-P 배지 및 이의 이용을 포함하는 본 발명은 배양된 핵 공여 세포는 개복제에 필요한 증식능, 줄기세포성(전능성), 리프로그래밍능 및 텔로머라아제 활성이 현저히 우수한, 양적 및 질적 모두 향상된 핵 공여 세포를 제공한다.

그리고, 이러한 본 발명의 우수한 공여 세포는 분리하여 탈핵 난자에 이식되어 개과 동물의 핵 이식란을 형성한 후, 궁극적으로 대리모에 이식되어 산자를 출생시킴으로써 높은 효율로 복제개를 생산하는데 사용된다.

이 때, 수행되는 핵 공여 세포의 미세주입 및 융합에 의한 핵 이식란의 제조방법, 융합된 핵 이식란의 활성화 방법, 대리모 난관에로의 이식방법 등의 관련 기술은 당업계에 공지된 방법을 참조로 할 수 있다.

그러므로, 본 발명은 또 다른 관점에서 RCME-P 배지를 이용하여 개과 동물의 핵 이식란 생산 및 복제 산자 생산의 효율을 높이는 방법에 관한 것이다.

이처럼, 본 발명은 핵 공여 세포를 양적으로 및 질적으로 향상시킴으로써, 복제개의 생산에 있어서 종래 극히 낮았던 임신 성공률을 높이는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 방법은 복제 효율이 너무 낮아 실용화가 어려웠던 문제점을 개선하여 실질적으로 복제 개를 생산의 효율을 높이는데 적용될 수 있을 것이다.

[ 실시예 ]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료 및 방법

1. 개 체세포 배양 및 준비

우선, SCNT(체세포 핵이식, somatic cell nuclear transfer)을 위한 섬유아세포의 1차 배양을 하고자 하였다.

7년생 수컷 비글로부터 전신마취 하에서 복부의 전층 피부(abdominal full thickness skin)를 잘라내었다. 수집하자마자, 상기 피부 조각을 얼음 위에서 PBS(phosphate buffered saline)(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 두고 실험실로 옮겼다. 각 피부 조직들을 1 cm×0.5 cm 조각들로 손질하여 자르고, 작은 조각들(1mm×1mm)로 미세하게 저며서 조직 배양 디쉬 상에 균등하게 분포하도록 하고, 각 배양 배지:

- 10% FBS (Invitrogen), 페니실린-스트렙토마이신(P/S; Invitrogen)로 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, high glucose; Invitrogen) 및

- RCME-P (개 MSC 배양을 위한 K-Stemcell 배지; K-Stemcell Ltd, Seoul, Korea)

에서 배양시켰다.

이 때, 상기 RCME-P 배지는 0.2 mM 아스크로브산, 10ng/mL의 섬유아세포증식인자, 10% FBS, 및 1% NEAA를 함유하는 DMEM(high glucose,Invitrogen) 기반 배지이다.

모든 샘플들을, 60 mm² 조직 배양 디쉬에서 37℃ 하 5% CO₂ 를 함유하는 대기에서 배양하였다. 목적하는 컨플루언스에 이를때까지 상기 배지를 2~3일마다 교환하였다. 1차 배양시 90% 이상의 컨플루언스에 도달하기까지 요구된 일수를 각 샘플마다 기록하였다.

각 1차 배양 배지로부터 세포를 수득한 후, 수득한 세포를, 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신로 보충된 RCME-P로 5계대까지 배양하였다.

0계대(passage 0)에서, 샘플들의 형태를 평가하였다(Leica 도립 현미경을 이용하는 광학 현미경, 100X 배율). 0.01% EDTA(ethylenediamine-tetraacetic acid)에서 0.25% 트립신으로 37℃ 하 2.5분 동안 반응시킨 후 세포들을 수득하고, 원심분리에 의해 수집한 후, 0계대에서 냉동보존 하였다. SCNT전에, 2~5계대에서의 세포들을 트립신-EDTA 처리로 분해하고(disaggregated), 공여 세포의 크기 측정을 위해 자동화된 세포 계수기(Countess, Invitrogen)를 사용하였다.

2. 개과 난모 세포( Canine oocyte ) 수집, 체세포 핵 이식 및 배아 이식

in vivo 성숙된 난모세포의 회복을 위해, 난모세포 공여 개의 혈장 황체호르몬(plasma progesterone) 농도를 Immulite 1000 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Flanders, NJ)를 이용하여 모니터링하였다.

난모세포 공여 개의 혈장 황체호르몬 농도가 4ng/ml 또는 그 이상으로 상승하면 배란일로 판단하였다. 배란일로부터 3일 후, 10% (v/v) BSA(bovine serum albumin; Invitrogen) 및 2mM NaHCO₃로 보충된 Hepes-완충된 조직 배양 배지(TCM)-199 에서 in vivo 성숙된 난모세포들을 난관 밖으로 쏟아내어 수집하였다. 그리고 핵 이식을 수행하였다(Kim and others 2013).

수집 후, 0.1% (v/v) 히알루로니다아제로 보충된 TCM-199에서 in vivo 성숙된 난모세포들을 적운 모양의 세포들로부터 벗겨내었다. 그리고, 밀려나간 극체와 함께 난모세포들을 선별하여 사이토칼라신 (cytochalasin) B (5μg/ml) 및 Hoechst (5μg/ml)에 노출시켰다.

UV광 하에 미세한 니들 피펫으로 흡입법에 의해 중기 염색체를 제거하였다. 각 배지에서 1차 배양된 단일 공여 세포들을 난황 주위 공간(perivitelline space) 내로 옮겼다

0.1mM MgSO₄, 0.5mM Hepes, 및 0,05% (w/v) BSA를 함유하는 0.26M 만니톨 용액에서, 전기-세포 융합 기구(Electro-Cell Fusion apparatus) (NEPA GENE Co.)로 복류의 직류 전기 4.0 kV/cm를 15 μs 동안 이용하여 공여 세포-세포질체 복합체(a couplet of donor cell-cytoplast complexes)를 융합하도록 유도시켰다

10μM 칼슘 이노포어(Sigma-Aldrich Corp.)를 함유하는 mSOF (modified synthetic oviductal fluid)에서 재프로그래밍(reconsulted) 배아를 4분동안 배양함으로써 화학적 활성화를 수행하였다.

39℃, 5% CO₂, 5% O₂ 및 90% N₂의 대기에서, 클론화된(복제된) 배아들을 1.9Mm 6-DMAP(dimethylaminopurine) 함유된 40μl mSOF 내로 4시간 동안 트랜스퍼하였다. 재구축된 클론화된 배아들을 동기화된 수령체(synchronized recipients)의 난관 내에 트랜스퍼하였다. 전신 마취 하에, 재구축된 배아들을 3.5 Fr Tom-cat catheter (Sherwood, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 난관의 팽대 부분(ampullary portion)에 삽입하였다 .

3. 정량적 PCR 에 의한 공여 세포에서 유전자의 상대적 빈도( relative abundance)의 측정

트립신-EDTA 처리에 의해, 공여 세포들을 수집하고 멸균된 PBS에서 세척하였다. 각 배양 배지에서 1차 배양된 공여 세포로부터 easy-spinTM (DNA-free) Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Inc., Kyunggi, Korea)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다.

각 샘플의 cDNA를 합성하기 위해, 20μl 반응물에서 임의의 헥사머 및 superscript TM III 역전사효소 (Invitrogen)를 이용하여 50℃에서 50분 동안 역전사를 수행하였다.

Takara Bio Inc. 가이드라인에 따라 Real time RT-PCR (RT-qPCR)을 행하였다. 2μl cDNA, 1μl 정방향 프라이머, 1μl 역방향 프라이머, 8μlSYBR Premix Ex Taq, 0.4μl ROX Reference (Takara Bio Inc. Shiga, Japan) 및 7.6 μl Nuclease-free water (Ambion Inc., Austin, TX)를 첨가함으로써 전체 20μl PCR 반응물을 제조하였다. 7300 Real Time PCR Cycler System (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 상기 반응을 수행하였다.

RT-qPCR에 대한 열적 프로파일을 10분동안 95°C에서, 이어서 95°C에서 10초 동안 40 사이클, 60°C에서 20초 동안, 그리고 72°C에서 40초 동안 행하였다.

정방향 및 역방향 프라이머들을 Primer Express 2.0 software program (Applied Biosystems)을 이용하여 고안하고, 프라이머 서열들 및 증폭된 프래그먼트의 대략적 사이즈들을 표 1에 기재하였다. 실험한 모든 유전적 전사 수준은 β-actin 발현 수준으로 정상화하였다.

4. 텔로머라아제 활성 분석

텔로머라아제 PCR ELISA 키트 (Roche Molecular Biochemicals, Manheim, Germany) 를이용하여 각 배지에서 배양된 공여 세포의 텔로머라아제 활성을 측정하였다.

2백만개의 세포를 4°C에서 10분 150 ×g 로 원심분리하여 페렛화를 한다. lysis buffer (PRO-PREP protein extraction solution; iNtRON Biotechnology, Inc.)를 추가하고 30분간 배양한다. 150 ×g, 10분간 재원심분리하여, 상층액을 수집하고 단백질 농도를 Bradford assay (Nanodrop2000; Thermo fischer scientific)를 이용해 측정한다. 텔로머라아제 활성 분석은 TRAP assay 를 기본으로하여 실시하였고, 2가지 배양액으로부터 회수된 세포의 단백질 농도는 동일 농도로 희석하여 본 실험을 진행하였다.

5. 통계학적 분석

통계학적 분석은 GraphPad Prism 4.02 (Graphpad Software Inc, San Diego, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 데이터들은 2원 분산분석(two-way ANOVA) 및 이어서 Barfornis post test에 의해 분석하였다. P value가 0.05 이하일 때 유의미한 것으로 간주하였다.

실시예 1 : 개과 세포 배양에서 1차 컨플루언스 및 형태에 도달하기까지 걸리는 시간의 측정

1-1 증식 효율

분리된 세포들이 컨플루언트된 단일층이 되기 위해 필요한 날짜 수를 각 세포 배양 배지에 대해 나타내었다(DMEM 및 RCME-P).

그 결과, 도 1에 도시한 바와 같이, 1차 컨플루언스에 이르기까지의 시간이 배양 배지에 따라 현저하게 상이하였다. DMEM 1차 배양 배지는 15일 이상이 걸린 반면, RCME-P 1차 배양 배지는 단지 9일이 걸렸다.

즉, 본 발명의 RCME-P의 배지를 사용하는 경우, 핵 공여 세포의 증식 효율이현저히 우수함을 알 수 있었다.

1-2 표현형적 특성

또한, 1차 배양 동안 표현형 형태를 조사하기 위해, 배양 형태를 평가하였다.

그 결과, 도 2에 도시한 바와 같이, 모든 세포들이 초기 배양에서 전형적인 방추형 세포형을 나타내었고, 세포 크기에서도, 2개의 배양된 배지로부터의 공여 세포들 사이에 차이는 그다지 없었다. 즉, 배지의 종류는 배양된 세포의 형태와 크기에는 큰 영향을 미치지 않았다.

실시예 2 : 두 배양 배지에서 배양된 공여 세포에서 재프로그래밍, 줄기세포성( stemness ) 관련 유전자의 발현 변화

2종류의 각 배지에서 배양된 공여 세포에서 다양한 유전자 전사의 상대적 빈도를 도 3에 도시하였다.

RCME-P와 비교하여, DMEM 배양된 세포에서는 줄기세포성 관련 유전자인 Sox2, Nanog, Oct4, Stella, Rex1 (P<0.05)의 발현 수준이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다.

또한, DMEM 배양 세포들은 또한 RCME-P 유래 세포보다 리프로그래밍과 관련된 유전자 HDAC1, DNMT1, MeCP2의 발현이 현저히 감소된 것으로 나타났지만, DNMT3a, DNMT3b는 그러하지 않았다.

그리고, 세포사멸 관련 유전자들인 bax 및 bcl2의 비율에서는 두 배지에서 큰 차이는 보이지 않았다.

이러한 결과를 통해, 본 발명의 RCME-P의 배지를 사용하여 배양된 핵 공여 세포의 경우가 개 복제에 필요한 줄기세포성 및 리프로그래밍능이 현저히 우수함을 알 수 있었다.

추가예 : 개 지방줄기세포를 핵 공여 세포로 사용한 경우

공지의 방법을 참조하여, 개의 지방 조직으로부터 줄기세포를 분리하여 핵 공여 세포로 사용하여 유전자의 발현 수준을 살펴보았다.

그 결과, 도 4에 도시한 바와 같이, 전능성과 관련된 유전자는 DPPA2 유전자를 제외하고 모두 발현 정도에 차이가 있었으며, 특히, 리프로그래밍과 관련된 유전자 중 DNMT1 또한 RCME-P 배지에서 배양된 세포에서 발현 정도가 높았다. 이는 체세포를 공여 세포로 사용한 경우와 유사한 결과였다.

실시예 3 : DMEM 및 RCME -P에서 1차 배양된 개과 동물 섬유아세포에서의 텔로머라아제 활성

연속적(계대적) 배양 동안 1차 배양 배지로부터 텔로머라아제 활성의 변화를 알아보기 위하여, RTA(relative telomerase activities)을 평가하였다.

그 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, DMEM 및 RCME-P에서 배양된 공여 세포에서 RTA에서의 감소가 눈에 띄었다. 1차 배양 배지에 따른 확실한 차이 또한 분명하게 관찰되었다.

이러한 결과는, 텔로머레이즈 활성이 전능성과 비례하는 바, 이전 실시예에서의 전능성 관련 유전자 발현의 결과와 일치하는 것으로, DMEM 배지보다 RCME-P의 배양액에서 텔로머레아제 활성이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

실시예 4 : 상이한 배지에서 배양된 공여 세포 유래 배아의 in vivo 발달 비교

하기 표 2에 나타나 있는 바와 같이, DMEM 유래 세포들을 공여 세포로 사용한 경우에는, 전체 163개의 클론화된(복제) 배아들을 11마리의 수령체 내로 이식하였다.

RCME-P 유래 세포들의 경우에는, 181개의 형성된 배아들을 11마리의 수령체 내로 이식하였다. 각 그룹에서, 두 수령체(DMEM 유래 세포 18.18%, RCME-P 유래 세포 36.36% : 전체 수령체들에 대한 임신)가 이식된 복제 배아들로 임신이 되었으며, 대리모의 임신율은 유의하게 RCME-P 그룹이 더 높았다 (P<0.05).

DMEM 배양 세포로부터 유래된 복제 배아로 임신한 수령체는 2마리의 복제 강아지를 출산하였다(1.2%, 이식받은 배아에 대한 출산, 표 2). 이러한 출산율은 RCME-P 유래세포와 비교하여 현저하게 낮은 경우에 해당한다(4.41%, P<0.05).

즉, 본 발명의 RCME-P의 배지를 사용하여 배양된 핵 공여 세포로 체세포 핵이식을 수행하는 경우에 복제개 생산율을 높일 수 있음을 확인하였다.

Claims

기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium), 섬유아세포 증식인자(FGF), 항산화제 및 10~20% FBS(fetal bovine serum) 및 비필수 아미노산을 함유하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제1항에 있어서, 상기 항산화제는 아스코르브산 또는 비타민 C인 것을 특징으로 하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제2항에 있어서, 상기 항산화제는 아스코르브산인 것을 특징으로 하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제1항에 있어서, 상기 비필수 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글리신, 프롤린 및 세린을 함유하는 MEM 비필수 아미노산인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제1항에 있어서, 기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium)(high-glucose), 섬유아세포 증식인자(FGF), 아스코르브산, 비필수 아미노산 및 10~20% FBS를 함유하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제5항에 있어서, 상기 배지는 0.2 mM 아스크로브산, 10ng/mL의 섬유아세포 증식인자, 10% FBS, 및 1% MEM 비필수 아미노산을 함유하는 DMEM(dulbecco modified eagle medium)(high-glucose) 기반 배지인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지
제1항에 있어서, 상기 핵 공여 세포는 개과 동물 체세포 또는 줄기세포 유래인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제7항에 있어서, 상기 체세포는 유사분열 G2/M단계의 체세포인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제7항에 있어서, 상기 체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 성체 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제9항에 있어서, 상기 체세포는 개과 동물의 섬유아세포 또는 난구세포인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제7항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 또는 성체 유래인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제10항에 있어서, 상기 성체 유래 줄기세포는 골수, 제대혈, 혈액, 지방, 피부, 위장관, 태반 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택된 조직 유래인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
개과 동물의 복제를 위하여, 제1항 또는 제5항의 배지를 이용하는 것을 특징으로 하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법.
제13항에 있어서, 핵 공여세포의 배양은 3계대 또는 4계대까지 이루어지는 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법.
제13항에 있어서, 핵 공여세포의 각 계대에서의 배양은 90 %컨플루언스 이상의 값에 도달할 때까지 이루어지는 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법.
제13항에 있어서, 핵 공여세포의 1차 배양은 7 내지 10일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법.
제14항에 있어서, 핵 공여세포의 배양은 총 14~17일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법.
제13항의 방법으로 배양한 핵 공여 세포를 분리하여 탈핵된 난모 세포에 이식 한 다음 이를 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 핵 이식란을 즉시 대리모에게 이식시켜 발생시키는 단계를 포함하는, 복제된 개과 동물의 생산방법.