RU2624139C2 - Способы и препараты для трансфекции клеток - Google Patents
Способы и препараты для трансфекции клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2624139C2 RU2624139C2 RU2014127505A RU2014127505A RU2624139C2 RU 2624139 C2 RU2624139 C2 RU 2624139C2 RU 2014127505 A RU2014127505 A RU 2014127505A RU 2014127505 A RU2014127505 A RU 2014127505A RU 2624139 C2 RU2624139 C2 RU 2624139C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- cells
- protein
- medium
- albumin
- Prior art date
Links
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title claims abstract description 152
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 137
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 41
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 510
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 167
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims abstract description 102
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 68
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 47
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 34
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims abstract description 19
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 14
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 12
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims abstract description 12
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract 8
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 38
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 31
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims description 30
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 claims description 23
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 claims description 21
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 19
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 19
- 108010087705 Proto-Oncogene Proteins c-myc Proteins 0.000 claims description 18
- 102000009092 Proto-Oncogene Proteins c-myc Human genes 0.000 claims description 18
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical group O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 claims description 17
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 claims description 17
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims description 15
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 15
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 claims description 11
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 claims description 11
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 8
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 claims description 8
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 8
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 8
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 8
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 claims description 8
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 7
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 5
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 4
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 4
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 claims description 4
- ACFGRWJEQJVZTM-LEJBHHMKSA-L Magnesium L-ascorbic acid-2-phosphate Chemical compound [Mg+2].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP([O-])([O-])=O)=C1O ACFGRWJEQJVZTM-LEJBHHMKSA-L 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 147
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 133
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 124
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 121
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 103
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 103
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 103
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 76
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 73
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 49
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 49
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 45
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 42
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 32
- 125000002680 canonical nucleotide group Chemical group 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 28
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 26
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 25
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 23
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 21
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 21
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- -1 for example Proteins 0.000 description 20
- 229940096913 pseudoisocytidine Drugs 0.000 description 20
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 20
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 20
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 18
- JRYMOPZHXMVHTA-DAGMQNCNSA-N 2-amino-7-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-one Chemical compound C1=CC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O JRYMOPZHXMVHTA-DAGMQNCNSA-N 0.000 description 17
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 17
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 17
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 17
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 17
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 17
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 16
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 16
- MPDKOGQMQLSNOF-GBNDHIKLSA-N 2-amino-5-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrimidin-6-one Chemical compound O=C1NC(N)=NC=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 MPDKOGQMQLSNOF-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- QXDXBKZJFLRLCM-UAKXSSHOSA-N 5-hydroxyuridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(O)=C1 QXDXBKZJFLRLCM-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 14
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 13
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 13
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 13
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 12
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 12
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 12
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 12
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 12
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 12
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 11
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 11
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 10
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 10
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C=C1 GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 0.000 description 9
- ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 4-Thiouridine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 9
- LZCNWAXLJWBRJE-ZOQUXTDFSA-N N4-Methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(NC)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LZCNWAXLJWBRJE-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 9
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 9
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 9
- YBTWWWIJBCCYNR-UAKXSSHOSA-N 5-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YBTWWWIJBCCYNR-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 8
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 8
- RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 2-thiocytidine Chemical compound S=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 0.000 description 7
- LZWSGWMPCIAGIJ-UAKXSSHOSA-N 4,5-diamino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C(N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LZWSGWMPCIAGIJ-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 7
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 7
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 7
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 7
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 7
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 7
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 7
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 7
- RHFUOMFWUGWKKO-UHFFFAOYSA-N s2C Natural products S=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KYEKLQMDNZPEFU-KVTDHHQDSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1,3,5-triazine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)N=C1 KYEKLQMDNZPEFU-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 6
- OTDJAMXESTUWLO-UUOKFMHZSA-N 2-amino-9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-oxolanyl]-3H-purine-6-thione Chemical compound C12=NC(N)=NC(S)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OTDJAMXESTUWLO-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 6
- MPPUDRFYDKDPBN-UAKXSSHOSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-hydroxypyrimidin-2-one Chemical compound C1=C(O)C(N)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 MPPUDRFYDKDPBN-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 6
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 6
- HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 9beta-Ribofuranosyl-7-deazaadenin Natural products C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 6
- 101150023320 B16R gene Proteins 0.000 description 6
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 6
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 6
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 6
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 6
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 6
- 101001009007 Homo sapiens Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 6
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 6
- VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N N(6)-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 6
- VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N NSC 29409 Natural products C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 101100316831 Vaccinia virus (strain Copenhagen) B18R gene Proteins 0.000 description 6
- 101100004099 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR200 gene Proteins 0.000 description 6
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 6
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 6
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 6
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 6
- HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N tubercidin Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- DDHOXEOVAJVODV-GBNDHIKLSA-N 5-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=S)NC1=O DDHOXEOVAJVODV-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 5
- CBNRZZNSRJQZNT-IOSLPCCCSA-O 6-thio-7-deaza-guanosine Chemical compound CC1=C[NH+]([C@@H]([C@@H]2O)O[C@H](CO)[C@H]2O)C(NC(N)=N2)=C1C2=S CBNRZZNSRJQZNT-IOSLPCCCSA-O 0.000 description 5
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 description 5
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 201000004939 Fanconi anemia Diseases 0.000 description 5
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 5
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 5
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 5
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 5
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 5
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 5
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 5
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 5
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 5
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 5
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YWWVWXASSLXJHU-AATRIKPKSA-N (9E)-tetradecenoic acid Chemical compound CCCC\C=C\CCCCCCCC(O)=O YWWVWXASSLXJHU-AATRIKPKSA-N 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BNAWMJKJLNJZFU-GBNDHIKLSA-N 5-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=S BNAWMJKJLNJZFU-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 4
- QOVIBFFZCVPCEI-UMMCILCDSA-N 5-amino-3-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6H-triazolo[4,5-d]pyrimidin-7-one Chemical compound N1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O QOVIBFFZCVPCEI-UMMCILCDSA-N 0.000 description 4
- 102000052609 BRCA2 Human genes 0.000 description 4
- 108700020462 BRCA2 Proteins 0.000 description 4
- 101150008921 Brca2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150017501 CCR5 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 4
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 4
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 4
- 102100035902 Glutamate decarboxylase 1 Human genes 0.000 description 4
- 102100035857 Glutamate decarboxylase 2 Human genes 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 4
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 4
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 4
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 4
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 4
- 206010048858 Ischaemic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 4
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 4
- 102220595793 Myc proto-oncogene protein_T58A_mutation Human genes 0.000 description 4
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 4
- 108010021188 Superoxide Dismutase-1 Proteins 0.000 description 4
- 102100038836 Superoxide dismutase [Cu-Zn] Human genes 0.000 description 4
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 4
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 4
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 4
- 206010048218 Xeroderma Diseases 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 4
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 4
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 4
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 4
- XMHIUKTWLZUKEX-UHFFFAOYSA-N hexacosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O XMHIUKTWLZUKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010021198 ichthyosis Diseases 0.000 description 4
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 4
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 4
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 4
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 4
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 4
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 4
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 4
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 3
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 3
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 3
- 101000636222 Cyprinus carpio Transcriptional regulator Myc-2 Proteins 0.000 description 3
- 102100022474 DNA repair protein complementing XP-A cells Human genes 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000009095 Fanconi Anemia Complementation Group A protein Human genes 0.000 description 3
- 108010087740 Fanconi Anemia Complementation Group A protein Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100020997 Fractalkine Human genes 0.000 description 3
- 102100035184 General transcription and DNA repair factor IIH helicase subunit XPD Human genes 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 3
- 102100039894 Hemoglobin subunit delta Human genes 0.000 description 3
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 3
- 101000873546 Homo sapiens Glutamate decarboxylase 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000873786 Homo sapiens Glutamate decarboxylase 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 101001035503 Homo sapiens Hemoglobin subunit delta Proteins 0.000 description 3
- 101000941879 Homo sapiens Leucine-rich repeat serine/threonine-protein kinase 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000803709 Homo sapiens Vitronectin Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 102100032693 Leucine-rich repeat serine/threonine-protein kinase 2 Human genes 0.000 description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 3
- DZTHIGRZJZPRDV-GFCCVEGCSA-N N-acetyl-D-tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](NC(=O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 DZTHIGRZJZPRDV-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 3
- DZTHIGRZJZPRDV-UHFFFAOYSA-N Nalpha-Acetyltryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 DZTHIGRZJZPRDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 3
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150019524 WNT2 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 3
- 102000052547 Wnt-1 Human genes 0.000 description 3
- 108700020987 Wnt-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000052556 Wnt-2 Human genes 0.000 description 3
- 108700020986 Wnt-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000052549 Wnt-3 Human genes 0.000 description 3
- 108700020985 Wnt-3 Proteins 0.000 description 3
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-MDZDMXLPSA-N elaidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-MDZDMXLPSA-N 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 3
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940116191 n-acetyltryptophan Drugs 0.000 description 3
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 3
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 3
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 3
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 3
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 3
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- DUYSYHSSBDVJSM-KRWOKUGFSA-N sphingosine 1-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O DUYSYHSSBDVJSM-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- KZVPFSJPLBOVLO-UHFFFAOYSA-N trimethyl(2-methylprop-1-enoxy)silane Chemical compound CC(C)=CO[Si](C)(C)C KZVPFSJPLBOVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- YZOUYRAONFXZSI-SBHWVFSVSA-N (1S,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13R,15R,16R,18R,20R,21R,23R,25R,26R,28R,30R,31S,33R,35R,36R,37S,38R,39S,40R,41S,42R,43S,44R,45S,46R,47S,48R,49S)-5,10,15,20,25,30,35-heptakis(hydroxymethyl)-37,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49-dodecamethoxy-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34-tetradecaoxaoctacyclo[31.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26.228,31]nonatetracontane-36,38-diol Chemical compound O([C@@H]([C@H]([C@@H]1OC)OC)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H]([C@@H](O[C@@H]3[C@@H](CO)O[C@@H]([C@H]([C@@H]3O)OC)O[C@@H]3[C@@H](CO)O[C@@H]([C@H]([C@@H]3OC)OC)O[C@@H]3[C@@H](CO)O[C@@H]([C@H]([C@@H]3OC)OC)O[C@@H]3[C@@H](CO)O[C@@H]([C@H]([C@@H]3OC)OC)O3)O[C@@H]2CO)OC)[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@H]3[C@@H](CO)O1 YZOUYRAONFXZSI-SBHWVFSVSA-N 0.000 description 2
- QROZCFCNYCVEDO-KQYNXXCUSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-[6-(hydroxyamino)purin-9-yl]-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NO)=C2N=C1 QROZCFCNYCVEDO-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 0.000 description 2
- OKTWQKXBJUBAKS-WQADZSDSSA-N 2-[[(e,2r,3s)-2-amino-3-hydroxyoctadec-4-enoxy]-hydroxyphosphoryl]oxyethyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@H](O)[C@H](N)COP(O)(=O)OCC[N+](C)(C)C OKTWQKXBJUBAKS-WQADZSDSSA-N 0.000 description 2
- RGNOTKMIMZMNRX-XVFCMESISA-N 2-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-4-one Chemical compound NC1=NC(=O)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RGNOTKMIMZMNRX-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- YWWVWXASSLXJHU-UHFFFAOYSA-N 9E-tetradecenoic acid Natural products CCCCC=CCCCCCCCC(O)=O YWWVWXASSLXJHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 2
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 2
- 101100210322 Arabidopsis thaliana WIP2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 2
- 235000021357 Behenic acid Nutrition 0.000 description 2
- DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N Brassidinsaeure Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 108091008927 CC chemokine receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005674 CCR Receptors Human genes 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005632 Capric acid (CAS 334-48-5) Substances 0.000 description 2
- 206010048610 Cardiotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N DAPT Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC(C)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 102100022477 DNA repair protein complementing XP-C cells Human genes 0.000 description 2
- 101100226017 Dictyostelium discoideum repD gene Proteins 0.000 description 2
- 102100024108 Dystrophin Human genes 0.000 description 2
- 101150105460 ERCC2 gene Proteins 0.000 description 2
- URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N Erucic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 2
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 2
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 2
- 229940125373 Gamma-Secretase Inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102100031885 General transcription and DNA repair factor IIH helicase subunit XPB Human genes 0.000 description 2
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000924727 Homo sapiens Alternative prion protein Proteins 0.000 description 2
- 101100373200 Homo sapiens CX3CL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000618531 Homo sapiens DNA repair protein complementing XP-A cells Proteins 0.000 description 2
- 101000618535 Homo sapiens DNA repair protein complementing XP-C cells Proteins 0.000 description 2
- 101001053946 Homo sapiens Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- 101000917237 Homo sapiens Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 2
- 101000920748 Homo sapiens General transcription and DNA repair factor IIH helicase subunit XPB Proteins 0.000 description 2
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 description 2
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 2
- 235000021353 Lignoceric acid Nutrition 0.000 description 2
- CQXMAMUUWHYSIY-UHFFFAOYSA-N Lignoceric acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCC1=CC=C(O)C=C1 CQXMAMUUWHYSIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930184725 Lipoxin Natural products 0.000 description 2
- 102100025818 Major prion protein Human genes 0.000 description 2
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108700026371 Nanog Homeobox Proteins 0.000 description 2
- 102000055601 Nanog Homeobox Human genes 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001053942 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Diphosphomevalonate decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-M Vaccenic acid Natural products CCCCCC\C=C/CCCCCCCCCC([O-])=O UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-M 0.000 description 2
- 235000021322 Vaccenic acid Nutrition 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700031763 Xeroderma Pigmentosum Group D Proteins 0.000 description 2
- ZUZUHROPOMGOKE-ZOQUXTDFSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-3,4-dihydroxy-5-[4-(methylamino)-2-oxopyrimidin-1-yl]oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(NC)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 ZUZUHROPOMGOKE-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229940116226 behenic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002537 betamethasone Drugs 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N betamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 231100000259 cardiotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002242 deionisation method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 description 2
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 2
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 2
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 2
- DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N erucic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- FARYTWBWLZAXNK-WAYWQWQTSA-N ethyl (z)-3-(methylamino)but-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C(\C)NC FARYTWBWLZAXNK-WAYWQWQTSA-N 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000003540 gamma secretase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 108040006858 interleukin-6 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008371 intracellularly ATP-gated chloride channel activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-AVQMFFATSA-N linoelaidic acid Chemical compound CCCCC\C=C\C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-AVQMFFATSA-N 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 150000002639 lipoxins Chemical class 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WDHRPWOAMDJICD-FOAQWNCLSA-N n-[2-[(3'r,3'as,6's,6as,6bs,7'ar,9r,11as,11br)-3',6',10,11b-tetramethyl-3-oxospiro[1,2,4,6,6a,6b,7,8,11,11a-decahydrobenzo[a]fluorene-9,2'-3,3a,5,6,7,7a-hexahydrofuro[3,2-b]pyridine]-4'-yl]ethyl]-6-(3-phenylpropanoylamino)hexanamide Chemical compound C([C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@H]([C@]3(C(=C4C[C@@H]5[C@@]6(C)CCC(=O)CC6=CC[C@H]5[C@@H]4CC3)C)O1)C)N2CCNC(=O)CCCCCNC(=O)CCC1=CC=CC=C1 WDHRPWOAMDJICD-FOAQWNCLSA-N 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 2
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L paraquat dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UWHZIFQPPBDJPM-BQYQJAHWSA-N trans-vaccenic acid Chemical compound CCCCCC\C=C\CCCCCCCCCC(O)=O UWHZIFQPPBDJPM-BQYQJAHWSA-N 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- QDLHCMPXEPAAMD-QAIWCSMKSA-N wortmannin Chemical compound C1([C@]2(C)C3=C(C4=O)OC=C3C(=O)O[C@@H]2COC)=C4[C@@H]2CCC(=O)[C@@]2(C)C[C@H]1OC(C)=O QDLHCMPXEPAAMD-QAIWCSMKSA-N 0.000 description 2
- QDLHCMPXEPAAMD-UHFFFAOYSA-N wortmannin Natural products COCC1OC(=O)C2=COC(C3=O)=C2C1(C)C1=C3C2CCC(=O)C2(C)CC1OC(C)=O QDLHCMPXEPAAMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- IMEBVVPYOVUBKA-UUOKFMHZSA-N (2R,3R,4S,5R)-2-[7-(hydroxyamino)triazolo[4,5-d]pyrimidin-3-yl]-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1O)n1nnc2c(NO)ncnc12 IMEBVVPYOVUBKA-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- DGKZTAGCCXJUAT-KQYNXXCUSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(6-hydrazinylpurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC=2C(NN)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O DGKZTAGCCXJUAT-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- KLNYEFMNJOUCTO-UUOKFMHZSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(7-hydrazinyltriazolo[4,5-d]pyrimidin-3-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound N1=NC=2C(NN)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O KLNYEFMNJOUCTO-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- CCEITODEOHVTFL-DBRKOABJSA-N (4Z)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-hydrazinylidene-5-methyl-1,3,5-triazinan-2-one Chemical compound CN1CN([C@@H]2O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]2O)C(=O)N=C1NN CCEITODEOHVTFL-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- HLHYXXBCQOUTGK-FHCQLJOMSA-N (7R,14S)-dihydroxy-(4Z,8E,10E,12Z,16Z,19Z)-docosahexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C[C@H](O)\C=C/C=C/C=C/[C@H](O)C\C=C/CCC(O)=O HLHYXXBCQOUTGK-FHCQLJOMSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- ABGLXZLYLBSFDZ-KVTDHHQDSA-N 1,6-diamino-3-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2h-1,3,5-triazin-4-one Chemical compound O=C1N=C(N)N(N)CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ABGLXZLYLBSFDZ-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- ARYVNLRUDOYCGR-KVTDHHQDSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-(hydroxyamino)-1,3,5-triazin-2-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(NO)N=C1 ARYVNLRUDOYCGR-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FIAQJMSWEWAREU-JXOAFFINSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-(hydroxyamino)-5-methylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(NO)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 FIAQJMSWEWAREU-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- WVMPZTYBROSQRJ-DBRKOABJSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-(methylamino)-1,3,5-triazin-2-one Chemical compound O=C1N=C(NC)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WVMPZTYBROSQRJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- MHOFECSHUOJTRF-UAKXSSHOSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-hydrazinyl-5-hydroxypyrimidin-2-one Chemical compound C1=C(O)C(NN)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 MHOFECSHUOJTRF-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- YUNJBQDCTLSQCZ-JXOAFFINSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-hydrazinyl-5-methylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(NN)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YUNJBQDCTLSQCZ-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- RSSRMDMJEZIUJX-XVFCMESISA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-hydrazinylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(NN)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RSSRMDMJEZIUJX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- RNKDWPJBJIFTKV-KVTDHHQDSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-hydroxy-1,3,5-triazinane-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)N(O)C1 RNKDWPJBJIFTKV-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- UXCALUXXUFSTBY-UAKXSSHOSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-hydroxy-4-(hydroxyamino)pyrimidin-2-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(NO)C(O)=C1 UXCALUXXUFSTBY-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- LKBQDNUCHULBBA-JXOAFFINSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-hydroxy-4-(methylamino)pyrimidin-2-one Chemical compound C1=C(O)C(NC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LKBQDNUCHULBBA-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- FQLVAQCZHLHEIP-DBRKOABJSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methyl-1,3,5-triazinane-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 FQLVAQCZHLHEIP-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- WOWKPCXEBJGZMT-KVTDHHQDSA-N 1-amino-3-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-(hydroxyamino)-2h-1,3,5-triazin-4-one Chemical compound O=C1N=C(NO)N(N)CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WOWKPCXEBJGZMT-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- KKNOZXSBLXTZCI-DBRKOABJSA-N 1-amino-3-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-(methylamino)-2h-1,3,5-triazin-4-one Chemical compound C1N(N)C(NC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 KKNOZXSBLXTZCI-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- CNDJSOTUEUHZDN-KVTDHHQDSA-N 1-amino-3-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-hydrazinyl-2h-1,3,5-triazin-4-one Chemical compound C1N(N)C(NN)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CNDJSOTUEUHZDN-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- YIBJSENXVGMWRM-KVTDHHQDSA-N 1-amino-5-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1,3,5-triazinane-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)N(N)CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YIBJSENXVGMWRM-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- MMKZAICYSVWBPW-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-(difluoromethoxy)phenyl]methylamino]-1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]ethanol Chemical compound C=1C=CC(C(F)(F)F)=CC=1C(O)CNCC1=CC=CC=C1OC(F)F MMKZAICYSVWBPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150098072 20 gene Proteins 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHAAQEZYQXNVDN-DBRKOABJSA-N 3-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1-hydroxy-6-(methylamino)-2h-1,3,5-triazin-4-one Chemical compound C1N(O)C(NC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HHAAQEZYQXNVDN-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- FFJZTSHFIURSSU-DBRKOABJSA-N 3-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-(hydroxyamino)-1-methyl-2h-1,3,5-triazin-4-one Chemical compound O=C1N=C(NO)N(C)CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 FFJZTSHFIURSSU-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- AVRXOMHHZIEGHW-KVTDHHQDSA-N 3-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-hydrazinyl-1-hydroxy-2h-1,3,5-triazin-4-one Chemical compound C1N(O)C(NN)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 AVRXOMHHZIEGHW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- VOEJKTLBNFDGGT-JXOAFFINSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-(methylamino)pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C(NC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 VOEJKTLBNFDGGT-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- UEHXEKJKNOHULW-FDDDBJFASA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-ethylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C(CC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UEHXEKJKNOHULW-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- NGCMLYZVLNLYTA-UAKXSSHOSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-nitropyrimidin-2-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(N)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NGCMLYZVLNLYTA-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- NFEXJLMYXXIWPI-JXOAFFINSA-N 5-Hydroxymethylcytidine Chemical compound C1=C(CO)C(N)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NFEXJLMYXXIWPI-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- YDGHCPCSMRXRSN-UAKXSSHOSA-N 5-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-(hydroxyamino)pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(NO)C(N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YDGHCPCSMRXRSN-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- PRZPQRIVPUNQTO-JXOAFFINSA-N 5-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-(methylamino)pyrimidin-2-one Chemical compound C1=C(N)C(NC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PRZPQRIVPUNQTO-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- PXAVPJLBJSKTBJ-UAKXSSHOSA-N 5-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-hydrazinylpyrimidin-2-one Chemical compound C1=C(N)C(NN)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PXAVPJLBJSKTBJ-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- OZTOEARQSSIFOG-MWKIOEHESA-N 6-Thio-7-deaza-8-azaguanosine Chemical compound Nc1nc(=S)c2cnn([C@@H]3O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]3O)c2[nH]1 OZTOEARQSSIFOG-MWKIOEHESA-N 0.000 description 1
- OHMBAVJOBLEQPZ-DBRKOABJSA-N 6-amino-3-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1-methyl-2h-1,3,5-triazin-4-one Chemical compound O=C1N=C(N)N(C)CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 OHMBAVJOBLEQPZ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MJJUWOIBPREHRU-MWKIOEHESA-N 7-Deaza-8-azaguanosine Chemical compound NC=1NC(C2=C(N=1)N(N=C2)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)=O MJJUWOIBPREHRU-MWKIOEHESA-N 0.000 description 1
- OAUKGFJQZRGECT-UUOKFMHZSA-N 8-Azaadenosine Chemical compound N1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OAUKGFJQZRGECT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029988 AICDA (activation-induced cytidine deaminase) Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010055167 CD59 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- BZKFMUIJRXWWQK-UHFFFAOYSA-N Cyclopentenone Chemical compound O=C1CCC=C1 BZKFMUIJRXWWQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-UHFFFAOYSA-N Cytidine 5'-triphosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102100031867 DNA excision repair protein ERCC-6 Human genes 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100034552 Fanconi anemia group M protein Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 1
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000851684 Homo sapiens Chimeric ERCC6-PGBD3 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000920783 Homo sapiens DNA excision repair protein ERCC-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000848187 Homo sapiens Fanconi anemia group M protein Proteins 0.000 description 1
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 description 1
- 101100510266 Homo sapiens KLF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 description 1
- 101150070299 KLF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101150039798 MYC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091027977 Mir-200 Proteins 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000650589 Mus musculus Roundabout homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- FABQUVYDAXWUQP-UHFFFAOYSA-N N4-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound COC1=CC=CC(C=2N=C(N)N=C(NCC=3C=C4OCOC4=CC=3)C=2)=C1 FABQUVYDAXWUQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044547 Nodal Human genes 0.000 description 1
- 108700024442 Nodal Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100035593 POU domain, class 2, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710084414 POU domain, class 2, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150082761 POU5F1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021319 Palmitoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000002490 Rad51 Recombinase Human genes 0.000 description 1
- 108010068097 Rad51 Recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 1
- DLVAMZWIILNQTD-IEKAXWOWSA-H [O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.[O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.[O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.O.O.[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2] Chemical compound [O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.[O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.[O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.O.O.[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2] DLVAMZWIILNQTD-IEKAXWOWSA-H 0.000 description 1
- KHYOUGAATNYCAZ-XVFCMESISA-N [[(2r,3s,4r,5r)-3,4-dihydroxy-5-(4-oxo-2-sulfanylidenepyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1N1C(=S)NC(=O)C=C1 KHYOUGAATNYCAZ-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 1
- 125000000440 benzylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008668 cellular reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N cis-palmitoleic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-ZAKLUEHWSA-N cytidine-5'-triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000007947 dispensing tablet Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 150000002066 eicosanoids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000012953 feeding on blood of other organism Effects 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 210000001368 germline stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010024847 glutamate decarboxylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010024780 glutamate decarboxylase 2 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037584 hereditary sensory and autonomic neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 102000053563 human MYC Human genes 0.000 description 1
- 102000052983 human POU5F1 Human genes 0.000 description 1
- 102000047444 human SOX2 Human genes 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 229920001684 low density polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 108091062637 miR-367 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091057188 miR-369 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 150000003815 prostacyclins Chemical class 0.000 description 1
- 229940076372 protein antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 231100000916 relative toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000009781 safety test method Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- QYHFIVBSNOWOCQ-UHFFFAOYSA-N selenic acid Chemical compound O[Se](O)(=O)=O QYHFIVBSNOWOCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000010648 susceptibility to HIV infection Diseases 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 1
- RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N thromboxane Chemical compound CCCCCCCC[C@H]1OCCC[C@@H]1CCCCCCC RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 150000003595 thromboxanes Chemical class 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
- C08K5/00—Use of organic ingredients
- C08K5/49—Phosphorus-containing compounds
- C08K5/5399—Phosphorus bound to nitrogen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01L—SEMICONDUCTOR DEVICES NOT COVERED BY CLASS H10
- H01L31/00—Semiconductor devices sensitive to infrared radiation, light, electromagnetic radiation of shorter wavelength or corpuscular radiation and specially adapted either for the conversion of the energy of such radiation into electrical energy or for the control of electrical energy by such radiation; Processes or apparatus specially adapted for the manufacture or treatment thereof or of parts thereof; Details thereof
- H01L31/04—Semiconductor devices sensitive to infrared radiation, light, electromagnetic radiation of shorter wavelength or corpuscular radiation and specially adapted either for the conversion of the energy of such radiation into electrical energy or for the control of electrical energy by such radiation; Processes or apparatus specially adapted for the manufacture or treatment thereof or of parts thereof; Details thereof adapted as photovoltaic [PV] conversion devices
- H01L31/042—PV modules or arrays of single PV cells
- H01L31/048—Encapsulation of modules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G77/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing silicon with or without sulfur, nitrogen, oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule
- C08G77/04—Polysiloxanes
- C08G77/06—Preparatory processes
- C08G77/08—Preparatory processes characterised by the catalysts used
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
- C12N2501/91—Heparin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/09—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from epidermal cells, from skin cells, from oral mucosa cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E10/00—Energy generation through renewable energy sources
- Y02E10/50—Photovoltaic [PV] energy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E10/00—Energy generation through renewable energy sources
- Y02E10/50—Photovoltaic [PV] energy
- Y02E10/52—PV systems with concentrators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии. Описан способ перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, включающий культивирование дифференцированной клетки в среде для перепрограммирования, содержащей альбумин, где альбумин обработан ионообменной смолой или древесным углем, трансфицирование клетки одной или более синтетических молекул РНК, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую один или более факторов перепрограммирования, и где указанное трансфицирование приводит к получению клетки, экспрессирующей один или более факторов перепрограммирования; и повторение стадии (b) по меньшей мере дважды в течение 5 последовательных дней с получением клетки, перепрограммированной в менее дифференцированное состояние. Описана среда для культивирования клеток для перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, содержащая: среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко: питательную среду F-12 (DMEM/F12), 10 мкг/мЛ инсулина, 5,5 мкг/мЛ трансферрина, 6,7 нг/мЛ селенита натрия, 20 нг/мЛ основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 5 мг/мЛ альбумина, где альбумин обработан ионообменной смолой и/или древесным углем. Также представлена среда для культивирования клеток для перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, содержащая среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко: питательную среду F-12 (DMEM/F12), 10 мкг/мЛ инсулина, 5,5 мкг/мЛ трансферрина, 6,7 нг/мЛ селенита натрия, 20 нг/мЛ основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 5 мг/мЛ альбумина, где менее чем 0,65% сухого веса альбумина включает липиды и/или менее чем 0,35% сухого веса альбумина включает свободные жирные кислоты. Изобретение расширяет арсенал способов перевода клетки в менее дифференцированное состояние. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 29 пр.
Description
ПРИОРИТЕТ
Настоящая заявка испрашивает приоритет относительно предварительной заявки на патент США №61/566,948, поданной 5 декабря 2011 г., предварительной заявки на патент США №61/569,595, поданной 12 декабря 2011 г., предварительной заявки на патент США №61/637,570, поданной 24 апреля 2012 г., заявки на патент США №13/465,490, поданной 7 мая 2012 г., и предварительной заявки на патент США №61/664,494, поданной 26 июня 2012 г., которые в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение частично относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим белки, нуклеиновым кислотам, содержащим неканонические нуклеотиды, терапевтическим препаратам, содержащим нуклеиновые кислоты, способам, наборам инструментов и устройствам для индукции экспрессии белков клетками, способам, наборам инструментов и устройствам для трансфекции, редактирования генов и перепрограммирования клеток, и клеткам, организмам и терапевтическим препаратам, полученным при помощи этих способов, наборов инструментов и устройств.
ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
Содержание текстового файла, поданного в электронном виде вместе с заявкой, в полном объеме включено в данный текст посредством ссылки: копия перечня последовательностей в читаемом компьютером формате (название файла: FABI_001_01WO_SeqList_ST25.txt; дата записи: 4 декабря 2012 г.; размер файла: 18 КБ).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Трансфекция нуклеиновыми кислотами
Нуклеиновые кислоты можно in vitro и in vivo доставлять в клетки путем предварительного комплексирования нуклеиновых кислот с заряженными липидами, липидоидами, протеинами, полимерами или их смесями. Подобные трансфекционные реагенты являются коммерчески доступными и широко применяются для доставки нуклеиновых кислот в клетки при культивировании. Клетки, обрабатываемые комплексами из трансфекционного реагента и нуклеиновой кислоты, могут поглощать эти комплексы путем эндоцитоза либо другими способами. Оказавшись внутри клетки, нуклеиновая кислота может осуществлять предназначенную ей биологическую функцию. В случае кодирующей белок РНК, к примеру, РНК может быть транслирована в белок рибосомами клетки.
Бессывороточная клеточная культура
Животные сыворотки, такие как фетальная бычья сыворотка (ФБС), обычно используют в качестве добавок в клеточных культуральных средах для стимуляции роста многих типов клеток. При этом неопределенная природа сыворотки делает клетки, контактирующие с этим компонентом, непригодными как для исследований, так и для терапевтических применений. Как следствие, были разработаны бессывороточные клеточные культуральные среды для того, чтобы исключить постоянную изменчивость и риск загрязнения токсичными и/или патогенными веществами, которые присущи сыворотке.
Наиболее распространенным белком в сыворотке является сывороточный альбумин. Сывороточный альбумин связывается с большим количеством молекул как in vitro, так и in vivo, включая гормоны, жирные кислоты, ионы кальция и металлов, а также низкомолекулярные лекарственные препараты, и может транспортировать эти молекулы в клетки как in vitro, так и in vivo. Сывороточный альбумин (наиболее часто это бычий сывороточный альбумин (БСА) или человеческий сывороточный альбумин (ЧСА)) является обычным ингредиентом в бессывороточной клеточной культуральной среде, в которой его обычно используют в концентрации 1-10 г/Л. Как правило, сывороточный альбумин готовят из плазмы крови путем фракционирования этанолом (по методу Кона). Фракцию, содержащую сывороточный альбумин (ʺфракция Кона Vʺ или просто "фракция Vʺ), выделяют и обычно используют без дальнейшей обработки. Таким образом, стандартное приготовление сывороточного альбумина включает белковую часть (полипептид сывороточного альбумина) и часть с участием ассоциированных молекул (включая соли, жирные кислоты и т.д., которые связаны с полипептидом сывороточного альбумина). Состав компонента сывороточного альбумина, содержащего ассоциированные молекулы, в общем случае является сложным и неизвестным.
Сывороточный альбумин можно обрабатывать для использования в определенных специализированных применениях (см. Barker A method for the deionization of bovine serum albumin. Tissue Culture Association. 1975; Droge et al. Biochem Pharmacol. 1982; 31:3775-9; Ng et al. Nat Protoc. 2008; 3:768-76; Публикация заявки на патент США №2010/0168000, содержание которых включено в данный текст посредством ссылки). Обычно процессы обработки применяются для удаления из растворов сывороточного альбумина глобулинов и контаминантных вирусов и они часто включают стабилизацию полипептида сывороточного альбумина путем добавления короткоцепочечной жирной кислоты, октановой кислоты с последующей термоинактивацией/преципитацией загрязняющих веществ. Для высокоспециализированных применений в культивировании стволовых клеток было показано, что использование ионообменной смолы для удаления излишка соли из растворов БСА повышает жизнеспособность клеток (см. Ng et al. Nat Protoc. 2008; 3:768-76; Публикация заявки на патент США №2010/0168000, содержание которых включено в данный текст посредством ссылки). При этом такая обработка не приносит пользы в случае рекомбинантного сывороточного альбумина даже при аналогичных чувствительных способах применения в культивировании стволовых клеток (см. Ng et al. Nat Protoc. 2008; 3:768-76; Публикация заявки на патент США №2010/0168000, содержание которых включено в данный текст посредством ссылки), демонстрируя, что эффект деионизации в этих применениях направлен на удаления излишка соли в растворе альбумина, но не на изменение компонента альбумина, содержащего ассоциированные молекулы. Вдобавок, до настоящего времени не исследовали воздействие такой обработки на другие типы клеток, такие как человеческие фибробласты, а также воздействие такой обработки на эффективность трансфекции и на связанную с трансфекцией токсичность. Более того, было показано, что связанные с альбумином липиды являются критическими для культуры человеческих полипотентных стволовых клеток, а удаление таких клеток из альбумина приводит к спонтанной дифференциации человеческих полипотентных стволовых клеток даже в том случае, когда липиды отдельно добавляют в клеточную культуральную среду (см. Garcia-Gonzalo et al. PLoS One. 2008; 3:e1384, содержание которой включено в данный текст посредством ссылки). Таким образом, считается, что клеточная культуральная среда, содержащая альбумин с немодифицированным компонентом, содержащим ассоциированные молекулы, является критической для культуры человеческих полипотентных стволовых клеток. Важным является и то, что взаимосвязь между содержащим ассоциированные молекулы компонентом липидного носителя, такого как альбумин, и эффективностью трансфекции и связанной с трансфекцией токсичности, до настоящего времени не была исследована.
Перепрограммирование клеток
Клетки можно перепрограммировать путем воздействия на них специфических внеклеточных сигналов и/или путем эктопической экспрессии специфических белков, микроРНК и т.д. Хотя ранее было описано несколько способов перепрограммирования, большинство способов, основанных на эктопической экспрессии, требует внесения экзогенной ДНК, что может привести к риску появления мутаций. Сообщалось о способах перепрограммирования без участия ДНК, основанных на прямой доставке перепрограммирующих белков, но при этом данные способы являются слишком неэффективными и ненадежными для коммерческого использования. Вдобавок были описаны основанные на РНК способы перепрограммирования, но при этом существующие основанные на РНК способы перепрограммирования являются медленными, ненадежными и неэффективными при применении их к зрелым клеткам, требуют большого количества трансфекций (что приводит к высокой стоимости и возможности ошибки), могут перепрограммировать лишь ограниченное количество типов клеток, могут перепрограммировать клетки лишь в ограниченное количество типов клеток, требуют использования иммунодепрессантов, а также требуют использования большого количества компонентов человеческого происхождения, включая полученный из крови ЧСА и человеческие фибробластные фидеры. Большое количество недостатков описанных ранее способов перепрограммирования клеток делают их непригодными как для применения в исследованиях, так и для терапевтического применения.
Генное редактирование
Некоторые белки природного происхождения содержат ДНК-связывающие домены, которые могут распознавать специфические последовательности ДНК, например, цинковые пальцы (ЦП) и транскрипционные эффекторы активаторного типа (TALEs - от англ. ʺtranscription activator-like effectorsʺ). Белки слияния, содержащие один или более ДНК-связывающих доменов и каталитический домен нуклеазы, можно использовать для создания двухцепочечного разрыва в нужном участке ДНК в клетке. При соединении с ДНК-матрицей, содержащей один или более участков, гомологичных к ДНК клетки, генно-редактирующие белки можно использовать для вставки последовательности ДНК или изменения последовательности ДНК клетки другим контролируемым способом. При этом большинство существующих на данный момент способов генного редактирования в клетках используют векторы на основе ДНК для экспрессии генно-редактирующих белков. Как следствие, эти способы генного редактирования являются неэффективными и несут риск возникновения неконтролируемого мутагенеза, что делает их непригодными как для применения в исследованиях, так и для терапевтического применения. Способы генного редактирования соматических клеток без участия ДНК ранее не исследовали, как и способы одновременного или последовательного генного редактирования и перепрограммирования соматических клеток. И наконец, применение генного редактирования в антибактериальном, противовирусном или противораковом лечении ранее не исследовали.
Модельные организмы
Крыс с выключенными генами получали путем эмбриональной микроинъекции нуклеиновых кислот, кодирующих цинк-пальцевые нуклеазы и TALE-нуклеазы (TALENs). Также сообщалось о генном редактировании с целью внесения специфичных к последовательности мутаций (также называемых ʺвыключениямиʺ), проводимом на мышах и крысах путем инъекции нуклеиновых кислот, кодирующих цинк-пальцевые нуклеазы, в эмбрионы. Генетически модифицированных крыс получали, используя эмбриональные стволовые клетки, а компетентные крысиные полипотентные стволовые клетки зародышевой линии получали при помощи перепрограммирования соматических клеток. При этом ранее не исследовали использование клеток, прошедших перепрограммирование и генное редактирование, для получения генетически модифицированных организмов.
В данной области техники существует потребность в усовершенствованных способах и препаратах для трансфекции клеток.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соответственно, в настоящем изобретении предложены реагенты, протоколы, наборы инструментов и устройства для индукции экспрессии белков клетками и для трансфекции, перепрограммирования и генного редактирования клеток. В отличие от способов, о которых сообщалось ранее, отдельные варианты реализации настоящего изобретения не включают обработку клеток экзогенной ДНК или аллогенными материалами либо материалами животного происхождения.
В одном аспекте данного изобретения предложена синтетическая молекула РНК, содержащая три или более неканонических нуклеотидов, каждый их которых содержит одну или более из следующих замен: пиримидина в позиции 2С, пиримидина в позиции 4С, пиримидина в позиции 5С, пурина в позиции 6С, пурина в позиции 7N и пурина в позиции 8С. В некоторых вариантах реализации изобретения синтетическую молекулу РНК получают путем in vitro транскрипции. В других вариантах реализации изобретения синтетическая молекула РНК дополнительно содержит по меньшей мере один следующий элемент: 5ʹ-кэп, 5ʹ-кэп 1 структуру и 3ʹ-поли(А) хвост. В других вариантах реализации изобретения по меньшей мере два неканонических нуклеотида являются пиримидинами. В других вариантах реализации изобретения неканонические нуклеотиды содержат по меньшей мере одно из следующих соединений: псевдоуридин, 2-тиоуридин, 4-тиоуридин, 5-азауридин, 5-гидроксиуридин, 5-аминоуридин, 5-метилуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-гидроксипсевдоуридин, 5-метилпсевдоуридин, 5-аминопсевдоуридин, псевдоизоцитидин, 5-метилцитидин, N4-метилцитидин, 2-тиоцитидин, 5-азацитидин, 5-гидроксицитидин, 5-аминоцитидин, N4-метилпсевдоизоцитидин, 2-тиопсевдоизоцитидин, 5-гидроксипсевдоизоцитидин, 5-аминопсевдоизоцитидин, 5-метилпсевдоизоцитидин, N6-метиладенозин, 7-деазааденозин, 6-тиогуанозин, 7-деазагуанозин, 8-азагуанозин, 6-тио-7-деазагуанозин, 6-тио-8-азагуанозин, 7-деаза-8-азагуанозин и 6-тио-7-деаза-8-азагуанозин. В других вариантах реализации изобретения по меньшей мере два неканонических нуклеотида содержат менее чем 20% молекулы синтетической РНК каждый. В других вариантах реализации изобретения неканонические нуклеотиды содержат по меньшей мере одно из следующих соединений: псевдоуридин, 2-тиоуридин, 4-тиоуридин, 5-азауридин, 5-гидроксиуридин, 5-аминоуридин, 5-метилуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-гидроксипсевдоуридин, 5-метилпсевдоуридин и 5-аминопсевдоуридин, и по меньшей мере из следующих соединений: псевдоизоцитидин, 5-метилцитидин, N4-метилцитидин, 2-тиоцитидин, 5-азацитидин, 5-гидроксицитидин, 5-аминоцитидин, N4-метилпсевдоизоцитидин, 2-тиопсевдоизоцитидин, 5-гидроксипсевдоизоцитидин, 5-аминопсевдоизоцитидин и 5-метилпсевдоизоцитидин. В дополнительном варианте реализации изобретения неканонические нуклеотиды дополнительно содержат по меньшей мере одно из следующих соединений: N6-метиладенозин, 7-деазааденозин, 6-тиогуанозин, 7-деазагуанозин, 8-азагуанозин, 6-тио-7-деазагуанозин, 6-тио-8-азагуанозин, 7-деаза-8-азагуанозин и 6-тио-7-деаза-8-азагуанозин.
В другом аспекте данного изобретения предложена синтетическая молекула РНК, которая содержит неканонический нуклеотид и кодирует генно-редактирующий белок.
В другом варианте реализации изобретения предложен терапевтический состав, содержащий описанную в данном тексте синтетическую молекулу РНК.
В другом аспекте данного изобретения предложен терапевтический состав, содержащий синтетическую молекулу РНК, которая кодирует генно-редактирующий белок, и трансфекционный реагент.
В другом варианте реализации изобретения предложен способ трансфекции клетки нуклеиновой кислотой, включающий приведение клетки в контакт с описанной в данном тексте синтетической молекулой РНК.
В другом варианте реализации изобретения предложен способ индукции экспрессии клеткой млекопитающего представляющего интерес белка, включающий приведение клетки в контакт с описанными в данном тексте синтетическими молекулами РНК. В другом варианте реализации изобретения предложен способ перепрограммирования клетки, включающий приведение клетки в контакт с описанными в данном тексте синтетическими молекулами РНК. В другом варианте реализации изобретения предложен способ генного редактирования клетки, включающий приведение клетки в контакт с описанными в данном тексте синтетическими молекулами РНК.
В другом аспекте данного изобретения предложен способ трансфекции клетки нуклеиновой кислотой, включающий: приведение клетки в контакт со средой, содержащей гидрокортизон и/или альбумин, причем альбумин обработан ионообменной смолой или древесным углем, и приведение клетки в контакт с нуклеиновой кислотой. В одном варианте реализации изобретения альбумин обработан короткоцепочечной жирной кислотой и/или нагрет до температуры, составляющей по меньшей мере 40°С. В других вариантах реализации изобретения данный способ дополнительно включает приведение клетки в контакт с трансфекционным реагентом. В других вариантах реализации изобретения клетка является клеткой млекопитающего, а в клетке млекопитающего индуцируют экспрессию представляющего интерес белка. В других вариантах реализации изобретения данный способ дополнительно включает приведение клетки в контакт с нуклеиновой кислотой по меньшей мере дважды в продолжение 5 последовательных дней. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота кодирует перепрограммирующий белок. В других вариантах реализации изобретения клетку перепрограммируют. В другом варианте реализации изобретения клетка является клеткой кожи, а способ дополнительно включает культивирование клетки кожи в условиях, которые способствуют росту по меньшей мере одного из следующих видов клеток: клеток кожи, полипотентных стволовых клеток, глюкозозависимых инсулин-продуцирующих клеток, гемопоэтических клеток, сердечных клеток и ретинальных клеток, при этом клетку кожи перепрограммируют в клетку, выбранную из: клетки кожи, полипотентной стволовой клетки, глюкозозависимой инсулин-продуцирующей клетки, гемопоэтической клетки, сердечной клетки и ретинальной клетки. В другом варианте реализации изобретения нуклеиновая кислота кодирует белок Oct4. В другом варианте реализации изобретения данный способ дополнительно включает приведение клетки в контакт с нуклеиновой кислотой, которая кодирует по меньшей мере один из белков: белок Sox2, белок Klf4 и белок c-Myc. В другом варианте реализации изобретения данный способ дополнительно включает приведение клетки в контакт с одной или более нуклеиновыми кислотами, которые кодируют белок Sox2, белок Klf4 и белок c-Myc. В других вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота кодирует генно-редактирующий белок. В других вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота кодирует белок, который действуя отдельно или в комбинации с одной или более другими молекулами, создает одноцепочечный или двухцепочечный разрыв в молекуле ДНК. В разных вариантах реализации изобретения клетка является генетически отредактированной. В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный или двухцепочечный разрыв составляет около 5,000,000 оснований сайта инициации транскрипции гена, выбранного из: CCR5, CXCR4, GAD1, GAD2, CFTR, НВА1, НВА2, НВВ, HBD, FANCA, ХРА, ХРВ, ХРС, ERCC2, POLH, НТТ, DMD, SOD1, АРОЕ, АРР, LRRK2, PRNP, BRCA1 и BRCA2, или его аналога, варианта и представителя семейства. В некоторых вариантах реализации изобретения данный способ дополнительно включает приведение клетки в контакт с по меньшей мере одним соединением из: поли-L-лизина, поли-L-орнитина, RGD-пептида, фибронектина, витронектина, коллагена и ламинина, или его биологически активным фрагментом, функциональным вариантом или представителем семейства. В других вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота является синтетической молекулой РНК, которая может содержать по меньшей мере одно соединение из: псевдоуридина, 5-метилпсевдоуридина и 5-метилцитидина. В некоторых вариантах реализации изобретения данный способ предусматривает приведение клетки в контакт с фактором дифференцировки или получение клетки от пациента и/или доставку клетки пациенту.
В другом аспекте данного изобретения предложена среда, содержащая альбумин, причем альбумин является рекомбинантным и обработанным ионообменной смолой или древесным углем. В другом варианте реализации изобретения среда дополнительно содержит буферный солевой раствор и аминокислоты, а также один или более компонентов из инсулина, трансферрина и селена, и/или холестерин, и/или стероид (такой как, например, гидрокортизон), и/или иммунодепрессант (такой как, например, B18R).
В другом аспекте данного изобретения предложен набор инструментов, содержащий гидрокортизон и/или альбумин, причем альбумин обработан ионообменной смолой или древесным углем, и синтетическую молекулу РНК. В одном варианте реализации изобретения синтетическая молекула РНК кодирует по меньшей мере один из белков: белок Oct4, белок Sox2, белок Klf4, белок c-Myc, белок Nanog, белок Lin28 и белок Utfl. В другом варианте реализации изобретения набор инструментов дополнительно содержит трансфекционный реагент и/или описанные в данном тексте синтетические молекулы РНК. В другом варианте реализации изобретения набор инструментов является набором инструментов для перепрограммирования и/или набором инструментов для генного редактирования.
В другом аспекте данного изобретения предложен комплекс из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента, содержащий нуклеиновую кислоту и трансфекционный реагент, при этом комплекс из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента отвержден путем охлаждения. В некоторых вариантах реализации изобретения комплекс из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента отвержден путем приведения в контакт комплекса из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента с жидким азотом в жидком и/или парообразном состоянии.
В другом аспекте данного изобретения предложен способ трансфекции клетки, включающий приведение клетки в контакт с описанным в данном тексте комплексом из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента.
В другом аспекте данного изобретения предложено устройство для трансфекции клеток, содержащее приспособления для приведения клеток в контакт с трансфекционной средой и приспособления для приведения клеток в контакт с комплексами из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента. В некоторых вариантах реализации изобретения атмосфера, окружающая клетки, содержит около 5% углекислого газа и/или около 5% кислорода.
В некоторых вариантах реализации изобретения предложены клетка, и/или организм, и/или терапевтический состав, и/или терапевтический состав, содержащие клетку, полученную при помощи описанных в данном тексте способов.
В некоторых аспектах предложены синтетические молекулы РНК с низкой токсичностью и высокой трансляционной эффективностью. В других аспектах предложены способы, наборы инструментов и устройства для получения и доставки синтетических молекул РНК в клетки. В других аспектах предложена клеточная культуральная среда для высокоэффективной трансфекции, перепрограммирования и генного редактирования клеток. Другие аспекты относятся к содержащим синтетические молекулы РНК терапевтическим препаратам для лечения заболеваний, включая диабет 1 типа, сердечную недостаточность, включая ишемическую и дилатационную кардиомиопатию, макулярную дегенерацию, болезнь Паркинсона, кистозный фиброз, серповидноклеточную анемию, талассемию, анемию Фанкони, тяжёлый комбинированный иммунодефицит, радикулярную сенсорную наследственную невропатию, пигментную ксеродерму, болезнь Хантингтона, мышечную дистрофию, амиотрофический боковой склероз, болезнь Альцгеймера, рак и инфекционные заболевания, включая гепатиты и ВИЧ/СПИД. Дополнительные аспекты относятся к содержащим клетки терапевтическим препаратам для лечения заболеваний, включая диабет 1 типа, сердечную недостаточность, включая ишемическую и дилатационную кардиомиопатию, макулярную дегенерацию, болезнь Паркинсона, кистозный фиброз, серповидноклеточную анемию, талассемию, анемию Фанкони, тяжёлый комбинированный иммунодефицит, радикулярную сенсорную наследственную невропатию, пигментную ксеродерму, болезнь Хантингтона, мышечную дистрофию, амиотрофический боковой склероз, болезнь Альцгеймера, рак и инфекционные заболевания, включая гепатиты и ВИЧ/СПИД.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Данное изобретение в качестве примера, но не в качестве ограничения, проиллюстрировано фигурами из прилагаемых чертежей.
На ФИГ. 1 показана РНК, кодирующая указанные белки, разделенные в денатурирующем формальдегидном арагозном геле.
На ФИГ. 2А показаны первичные человеческие фибробласты, трансфицированные синтетической РНК, кодирующей Oct4 и содержащей указанные нуклеотиды. ʺАʺ обозначает аденозин, ʺГʺ обозначает гуанозин, ʺУʺ обозначает уридин, ʺЦʺ обозначает цитидин, ʺпсУʺ обозначает псевдоуридин, ʺ5мЦʺ обозначает 5 метилцитидин, ʺN4мЦʺ обозначает N4-метилцитидин, ʺ7дГʺ обозначает 7-деазагуанозин и ʺпсизоЦʺ обозначает псевдоизоцитидин. Числа перед нуклеотидами указывают на долю соответствующего нуклеотид-5ʹ-трифосфата в реакции in vitro транскрипции. Например, 0,5 N4мЦ обозначает РНК, синтезированную при помощи реакции in vitro транскрипции с участием равных количеств N4-метилцитидин-5ʹ-трифосфата и цитидин-5ʹ-трифосфата. Через 20 ч после трансфекции клетки фиксировали и окрашивали на наличие белка Oct4.
На ФИГ. 2Б показана экспрессия Oct4 и клеточная плотность культур первичных человеческих фибробластов, трансфицированных синтетической РНК, кодирующей Oct4 и содержащей указанные нуклеотиды. Нуклеотиды обозначаются так же, как и на ФИГ. 2А, за исключением того, что ʺ7дАʺ обозначает 7-деазааденозин и ʺпиЦʺ обозначает псевдоизоцитидин. Приведенная клеточная плотность нормирована относительно нетрансфицированных клеток. Приведенная экспрессия Oct4 нормирована относительно синтетической РНК, содержащей только канонические нуклеотиды. Планки погрешностей показывают среднеквадратическую погрешность (n=3).
На ФИГ. 3А показана перепрограммированная клеточная линия, полученная путем трансфекции первичных человеческих фибробластов РНК, кодирующей белки Oct4, Sox2, Klf4, с-Мус-2 (Т58А) и Lin28, через день после того, как колонии были собраны и высеяны на покрытый экстрагированной базальной мембраной планшет.
На ФИГ. 3Б показана перепрограммированная клеточная линия, полученная таким же способом, как и на ФИГ. 3А, окрашенная на наличие полипотентных маркеров стволовых клеток Oct4 и SSEA4. На сегменте, обозначенном как ʺХехстʺ, показаны ядра, а на сегменте, обозначенном как ʺСовмещениеʺ показаны совмещенные сигналы от трех каналов.
На ФИГ. 3В показаны первичные человеческие фибробласты, трансфицированные и культивированные как на ФИГ. 3А. Всего было проведено 5 трансфекций. Снимки делали на 7 день. Видно несколько колоний клеток с перепрограммированной морфологией.
На ФИГ. 4А показан образец ткани диаметром 1,5 мм, полученный путем проведения биопсии при помощи дерматома.
На ФИГ. 4Б показан образец ткани, полученный как на ФИГ. 4А и находящийся во взвешенном состоянии на границе раздела воздух-жидкость раствора, содержащего фермент.
На ФИГ. 4В показаны первичные человеческие фибробласты, полученные как на ФИГ. 4А, диссоциированные как на ФИГ. 4Б и высеянные в лунки 96-луночного планшета.
На ФИГ. 5А показаны первичные человеческие фибробласты, перепрограммированные в инсулин-продуцирующие клетки. Клетки фиксировали и окрашивали на наличие инсулина.
На ФИГ. 5Б показаны первичные человеческие фибробласты, перепрограммированные в гемопоэтические клетки. Клетки фиксировали и окрашивали на наличие CD34.
На ФИГ. 5В показаны первичные человеческие фибробласты, перепрограммированные в сократительные сердечные клетки.
На ФИГ. 6А показана передняя цепь матрицы для in vitro транскрипции для получения остова РНК TALEN™.
На ФИГ. 6Б показана матрица с ФИГ. 6А после проведения реакции клонирования Золотые ворота для включения серии повторяющихся мономеров, образующих полную матрицу РНК TALEN™.
На ФИГ. 6В показана 5ʹ-кэпированная, 3ʹ-поли(А)-хвостовая РНК TALEN™, полученная с матрицы с ФИГ. 6Б.
На ФИГ. 7 показана последовательность матрицы с ФИГ. 6Б, где РНК TALEN™ предназначена для связывания с участком ДНК в 20 п.о. и где участки, обозначенные как ʺХ(02)Хʺ, ʺХ(03)Хʺ и так далее, представляют собой повторяющиеся вариабельные домены (ПВД), которые можно выбрать таким образом, чтобы они были нацелены на специфическую последовательность ДНК. Данная матрица кодирует РНК TALEN™, причем первый остаток, который связывает РНК TALEN™, является остатком тимидина независимым от ПВД, и, таким образом, первый ПВД обозначен как ʺХ(02)Хʺ вместо ʺХ(01)Хʺ.
На ФИГ. 8 показаны первичные человеческие фибробласты, генетически отредактированные и перепрограммированные. Стрелки указывают на колонии клеток с перепрограммированной морфологией.
На ФИГ. 9А показан вид спереди на устройство, которое может трансфицировать и/или перепрограммировать клетки в автоматическом или полуавтоматическом режиме.
На ФИГ. 9Б показана задняя панель устройства с ФИГ. 9А.
На ФИГ. 9В показаны основные компоненты устройства с ФИГ. 9А.
На ФИГ. 10А показано комплексирование РНК и трансфекционного реагента в комплексообразующей среде.
На ФИГ. 10Б показаны два способа распределения пре-комплексационных таблеток, содержащих нуклеиновые кислоты.
На ФИГ. 10В показан способ снятия крышки с луночного планшета путем присасывания.
На ФИГ. 10Г показан способ снятия крышки с луночного планшета при помощи зажима.
На ФИГ. 11 показано устройство, которое может трансфицировать и/или перепрограммировать клетки в автоматическом или полуавтоматическом режиме в функциональной комбинации с оборудованием для визуализации, инкубации и других манипуляций с клетками.
Определения
Под ʺмолекулойʺ подразумевается молекулярная частица (молекула, ион, комплекс и т.д.).
Под ʺбелкомʺ подразумевается полипептид.
Под ʺмолекулой РНКʺ подразумевается молекула, которая содержит РНК.
Под ʺсинтетической молекулой РНКʺ подразумевается молекула РНК, которая синтезирована вне клетки или которая синтезирована в клетке при помощи биоинженерии, например, синтезированная путем реакции in vitro транскрипции молекула РНК, синтезированная путем прямого химического синтеза молекула РНК или синтезированная в созданной методами генетической инженерии клетке E. coli молекула РНК.
Под ʺнуклеотидомʺ подразумевается нуклеотид либо его фрагмент или производное, например, нуклеиновое основание, нуклеозид, нуклеотид-трифосфат и т.д.
Под ʺнуклеозидомʺ подразумевается нуклеотид.
Под ʺтрансфекциейʺ подразумевается приведение клетки в контакт с молекулой, при котором молекула поглощается клеткой.
Выражение ʺпри трансфекцииʺ подразумевает во время или после трансфекции.
Под ʺтрансфекционный реагентомʺ подразумевается вещество или смесь веществ, которое связывается с молекулой и способствует доставке молекулы в клетку и/или поглощению молекулы клеткой, например, катионный липид, заряженный полимер или проникающий в клетку пептид.
Под ʺтрансфекцией на основе реагентаʺ подразумевается трансфекция, осуществленная при помощи трансфекционного реагента.
Под ʺклеточной культуральной средойʺ подразумевается среда, которая может быть использована для культивирования клеток, например, среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (DMEM - от англ. ʺDulbeccoʹs Modified Eagleʹs Mediumʺ) или DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС).
Под ʺсредой для комплексированияʺ подразумевается среда, в которую добавляют трансфекционный реагент и трансфектируемую молекулу, и в которой трансфекционный реагент связывается с трансфектируемой молекулой.
Под ʺтрансфекционной средойʺ подразумевается среда, которую можно использовать для трансфекции, например, среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (DMEM) или DMEM/F12.
Под ʺрекомбинантным белкомʺ подразумевается белок или пептид который не синтезируется в организме животных или людей. Неограничивающие примеры включают человеческий трансферрин, который синтезируется в бактериях, человеческий фибронектин, который синтезируется в in vitro культуре мышиных клеток, и человеческий сывороточный альбумин, который синтезируется в рисовой культуре.
Под ʺлипидным носителемʺ подразумевается вещество, которое может повысить растворимость липида или липидорастворимой молекулы в водном растворе, например, человеческий сывороточный альбумин или метил-бета-циклодекстрин.
Под ʺбелком Oct4ʺ подразумевается белок, который кодируется геном POU5F1, либо его природный или полученный методами генетической инженерии вариант, представитель семейства, ортолог, фрагмент или конструкция слияния, например, человеческий белок Oct4 (SEQ ID NO: 1), мышиный белок Oct4, белок Oct1, белок, кодируемый псевдогеном 2 POU5F1, ДНК-связывающий домен белка Oct4 или белок слияния Oct4-ЗФБ. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Oct4 содержит аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 70% идентичности с SEQ ID NO: 1, или, в других вариантах реализации изобретения - по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности с SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Oct4 содержит аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 20 аминокислотных инсерций, делеций или замен (в совокупности) по отношению к SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения белок Oct4 содержит аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 15 или от 1 до 10 аминокислотных инсерций, делеций или замен (в совокупности) по отношению к SEQ ID NO: 1.
Под ʺбелком Sox2ʺ подразумевается белок, который кодируется геном SoX2, либо его природный или полученный методами генетической инженерии вариант, представитель семейства, ортолог, фрагмент или конструкция слияния, например, человеческий белок Sox2 (SEQ ID NO: 2), мышиный белок Sox2, ДНК-связывающий домен белка Sox2 или белок слияния Sox2-ЗФБ. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Sox2 содержит аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 70% идентичности с SEQ ID NO: 2, или, в других вариантах реализации изобретения - по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности с SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Sox2 содержит аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 20 аминокислотных инсерций, делеций или замен (в совокупности) по отношению к SEQ ID NO: 2. В других вариантах реализации изобретения белок Sox2 содержит аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 15 или от 1 до 10 аминокислотных инсерций, делеций или замен (в совокупности) по отношению к SEQ ID NO: 2.
Под ʺбелком Klf4ʺ подразумевается белок, который кодируется геном KLF4, либо его природный или полученный методами генетической инженерии вариант, представитель семейства, ортолог, фрагмент или конструкция слияния, например, человеческий белок Klf4 (SEQ ID NO: 3), мышиный белок Klf4, ДНК-связывающий домен белка Klf4 или белок слияния Klf4-ЗФБ. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Klf4 содержит аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 70% идентичности с SEQ ID NO: 3, или, в других вариантах реализации изобретения - по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности с SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Klf4 содержит аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 20 аминокислотных инсерций, делеций или замен (в совокупности) по отношению к SEQ ID NO: 3. В других вариантах реализации изобретения белок Klf4 содержит аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 15 или от 1 до 10 аминокислотных инсерций, делеций или замен (в совокупности) по отношению к SEQ ID NO: 3.
Под ʺбелком с-Мусʺ подразумевается белок, который кодируется геном MYC, либо его природный или полученный методами генетической инженерии вариант, представитель семейства, ортолог, фрагмент или конструкция слияния, например, человеческий белок с-Мус (SEQ ID NO: 4), мышиный белок с-Мус, белок 1-Мус, белок с-Мус (Т58А), ДНК-связывающий домен белка с-Мус или белок слияния с-Мус-ЗФБ. В некоторых вариантах реализации изобретения белок с-Мус содержит аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 70% идентичности с SEQ ID NO: 4, или, в других вариантах реализации изобретения - по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности с SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения белок с-Мус содержит аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 20 аминокислотных инсерций, делеций или замен (в совокупности) по отношению к SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации изобретения белок с-Мус содержит аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 15 или от 1 до 10 аминокислотных инсерций, делеций или замен (в совокупности) по отношению к SEQ ID NO: 4.
Под ʺперепрограммированиемʺ подразумевается инициация изменения в фенотипе клетки, например, инициация дифференцирования β-клетки-предшественницы в зрелую β-клетку, инициация дедифференцирования фибробласта в полипотентную стволовую клетку, инициация трансдифференцирования кератиноцита в сердечную стволовую клетку или инициация роста аксона нейрона.
Под ʺфактором перепрограммированияʺ подразумевается молекула, которая в случае контакта клетки с этой молекулой и/или экспрессии этой молекулы клеткой, может как отдельно, так и в комбинации с другими молекулами, инициировать перепрограммирование, например, это белок Oct4.
Под ʺфидеромʺ подразумевается клетка, которую можно использовать для улучшения среды или другого способа стимуляции роста других клеток в культуре.
Под ʺкондиционированиемʺ подразумевается приведение одного или более фидеров в контакт со средой.
Под ʺжирной кислотойʺ подразумевается молекула, которая содержит алифатическую цепь, содержащую по меньшей мере два атома углерода, например, линолевая кислота, α-линолевая кислота, октановая кислота, лейкотриен, простагландин, холестерин, глюкокортикоид, резолвин, протектин, тромбоксан, липоксин, марезин, сфинголипид, триптофан, N-ацетил триптофан или их соли, метиловые эфиры или производные.
Под ʺкороткоцепочечной жирной кислотойʺ подразумевается жирная кислота, которая содержит алифатическую цепь, содержащую от двух до 30 атомов углерода.
Под ʺальбуминомʺ подразумевается белок, который является хорошо растворимым в воде, например, человеческий сывороточный альбумин.
Под ʺассоциированной молекулойʺ подразумевается молекула, которая нековалентно связана с другой молекулой.
Под ʺкомпонентом альбумина, содержащим ассоциированные молекулыʺ подразумеваются одна или более молекул, которые связаны с полипептидом альбумина, например, это липиды, гормоны, холестерин, ионы кальция и т.д., которые связаны с полипептидом альбумина.
Под ʺобработанным альбуминомʺ подразумевается альбумин, который обработан для того, чтобы уменьшить, удалить, заменить или каким-либо другим способом инактивировать компонент альбумина, содержащий ассоциированные молекулы, например, это человеческий сывороточный альбумин, который инкубирован при повышенной температуре, человеческий сывороточный альбумин, который приведен в контакт с октаноатом натрия, или человеческий сывороточный альбумин, который приведен в контакт с пористым материалом.
Под ʺионообменной смолойʺ подразумевается вещество, которое при контакте с содержащим ионы раствором может заменить один или более ионов одним или более отличными ионами, например, вещество, которое может заменить один или более ионов кальция одним или более ионами натрия.
Под ʺзародышевой клеткойʺ подразумевается сперматозоид или яйцеклетка.
Под ʺполипотентной стволовой клеткойʺ подразумевается клетка, которая может дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых слоев (эндодерма, мезодерма и эктодерма) in vivo.
Под ʺсоматической клеткойʺ подразумевается клетка, которая не является полипотентной стволовой клеткой или зародышевой клеткой, например, клетка кожи.
Под ʺглюкозозависимой инсулин-продуцирующей клеткойʺ подразумевается клетка, которая при воздействии определенной концентрации глюкозы может синтезировать и/или секретировать такое количество инсулина, которое отличается (как в меньшую, так и в большую сторону) от количества инсулина, которое клетка синтезирует и/или секретирует при воздействии другой концентрации глюкозы, например, это β-клетка.
Под ʺгемопоэтической клеткойʺ подразумевается клетка крови или клетка, которая может дифференцироваться в клетку крови, например, гемопоэтическая стволовая клетка или белые кровяные тельца.
Под ʺсердечной клеткойʺ подразумевается клетка сердца или клетка, которая может дифференцироваться в клетку сердца, например, сердечная стволовая клетка или кардиомиоцит.
Под ʺретинальной клеткойʺ подразумевается клетка сетчатки или клетка, которая может дифференцироваться в клетку сетчатки, например, ретинальная пигментная эпителиальная клетка.
Под ʺклеткой кожиʺ подразумевается клетка, которую обычно можно обнаружить в коже, например, фибробласт, кератиноцит, меланоцит, адипоцит, мезенхимная стволовая клетка, жировая стволовая клетка или клетка крови.
Под ʺагонистом Wnt-сигнального путиʺ подразумевается молекула, которая может выполнять одну или более биологических функций одного или более представителей семейства белков Wnt, например, Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a или 2-амино-4-[3,4-(метилендиокси)бензиламино]-6-(3-метоксифенил)пиримидин.
Под ʺагонистом IL-6-сигнального путиʺ подразумевается молекула, которая может выполнять одну или более биологических функций белка IL-6, например, белок IL-6 или рецептор IL-6 (также известный как растворимый рецептор IL-6, IL-6R, IL-6R альфа и т.д.).
Под ʺагонистом TGF-β-сигнального путиʺ подразумевается молекула, которая может выполнять одну или более биологических функций одного или более представителей надсемейства белков TGF-β, например, TGF-β1, TGF-β3, активин А, КМБ-4 или Nodal.
Под ʺиммунодепрессантомʺ подразумевается вещество, которое может подавлять один или более аспектов иммунной системы и которое обычно не присутствует в организме млекопитающего, например, B18R или дексаметазон.
Под ʺгенным редактированиемʺ подразумевается изменение последовательности ДНК клетки.
Под ʺгенно-редактирующим белкомʺ подразумевается белок, который может как отдельно, так и в комбинации с другой молекулой, изменять последовательность ДНК клетки, например, это нуклеаза, транскрипционная активаторо-подобная эффекторная нуклеаза (TALEN - от англ. ʺtranscription activator-like effector nucleaseʺ), цинк-пальцевая нуклеаза, мегануклеаза, никаза, либо его природный или полученный методами генетической инженерии вариант, представитель семейства, ортолог, фрагмент или конструкция слияния.
Под ʺодноцепочечным разрывомʺ подразумевается участок одноцепочечной или двухцепочечной ДНК, на котором в одной из одной или двух цепей были разорваны одна или более ковалентных связей между нуклеотидами.
Под ʺдвухцепочечным разрывомʺ подразумевается участок двухцепочечной ДНК, на котором в каждой из двух цепей были разорваны одна или более ковалентных связей между нуклеотидами.
Сывороточный альбумин является обычным компонентом в бессывороточной клеточной культуральной среде. Недавно было обнаружено, что сывороточный альбумин может подавлять трансфекцию и что добавление необработанного сывороточного альбумина в трансфекционную среду в концентрации, которая обычно используется в бессывороточной клеточной культуральной среде, может привести к низкой эффективности трансфекции и/или низкой жизнеспособности клеток после трансфекции. Полипептид сывороточного альбумина может связываться с большим количеством молекул, включая липиды, ионы, холестерин и т.д., как in vitro, так и in vivo, и в результате как выделенный из крови сывороточный альбумин, так и рекомбинантный сывороточный альбумин содержат полипептидный компонент и компонент, содержащий ассоциированные молекулы. Недавно было обнаружено, что низкая эффективность трансфекции и низкая жизнеспособность клеток после трансфекции, причиной которых является сывороточный альбумин, могут быть частично вызваны компонентом сывороточного альбумина, содержащим ассоциированные молекулы. Также было обнаружено, что эффективность трансфекции можно повысить, а связанную с трансфекцией токсичность снизить путем частичного или полного уменьшения, удаления, замены или инактивации каким-либо другим способом компонента сывороточного альбумина, содержащего ассоциированные молекулы. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к белку, который обработан таким образом, чтобы уменьшить, удалить, заменить или инактивировать каким-либо другим способом компонент белка, содержащий ассоциированные молекулы.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к способу обработки белка путем приведения белка в контакт с одной или более молекулами, которые уменьшают низкую эффективность трансфекции и/или низкую жизнеспособность клеток после трансфекции, причиной которых является белок. Было обнаружено, что приведение сывороточного альбумина в контакт с короткоцепочечной жирной кислотой, октаноатом натрия (также известным как ʺоктановая кислотаʺ, ʺоктаноатʺ, ʺкаприлатʺ или ʺкаприловая кислотаʺ) в некоторых ситуациях уменьшает низкую эффективность трансфекции и низкую жизнеспособность клеток после трансфекции, причиной которых является сывороточный альбумин. Другие вещества, которые можно применять для обработки белка, включают: каприновую кислоту, лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, арахидиновую кислоту, бегеновую кислоту, лигноцериновую кислоту, церотиновую кислоту, миристолеиновую кислоту, пальмитолеиновую кислоту, сапиеновую кислоту, олеиновую кислоту, элаидиновую кислоту, вакценовую кислоту, линолевую кислоту, линоэлаидиновую кислоту, альфа-линолевую кислоту, арахидоновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту, эруковую кислоту, докозагексаеновую кислоту, триптофан, N-ацетил триптофан, холестерин, другие жирные кислоты и их соли, смеси, фрагменты и производные. Вещества для обработки белка могут являться чистыми веществами, смесями с точно определенными компонентами либо комплексными смесями или смесями с неопределенными компонентами, такими как масла животного или растительного происхождения, например, рыбий жир. В определенных вариантах реализации изобретения белок обрабатывают после того, как белок очищают. В других вариантах реализации изобретения белок обрабатывают перед тем, как белок очищают. В других вариантах реализации изобретения белок обрабатывают и очищают одновременно. В других вариантах реализации изобретения белок обрабатывают, но не очищают.
Инкубация белка при повышенной температуре может привести к частичной или полной денатурации полипептидного компонента белка, что может уменьшить количество или ликвидировать связывающие участки, которые могут являться критическими для поддержания компонента белка, содержащего ассоциированные молекулы. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу обработки белка путем инкубации белка при повышенной температуре. В одном варианте реализации изобретения белок инкубируют при температуре, составляющей по меньшей мере 40°С, на протяжении по меньшей мере около 10 мин. В другом варианте реализации изобретения белок инкубируют при температуре, составляющей по меньшей мере 50°С, на протяжении по меньшей мере около 10 минут. В другом варианте реализации изобретения белок инкубируют при температуре, составляющей по меньшей мере 55°С, на протяжении по меньшей мере около 30 мин. В одном варианте реализации изобретения белок приводят в контакт с октаноатом натрия, а потом инкубируют при около 60°С на протяжении нескольких часов, например между около 1 ч и около 24 ч, или между около 2 ч и около 6 ч. В другом варианте реализации изобретения концентрация октаноата натрия составляет между около 5 мМ и около 50 мМ, или между около 10 мМ и около 40 мМ. В определенных вариантах реализации изобретения октаноат натрия заменяют или применяют в комбинации с по меньшей мере одним элементом из каприновой кислоты, лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, бегеновой кислоты, лигноцериновой кислоты, церотиновой кислоты, миристолеиновой кислоты, пальмитолеиновой кислоты, сапиеновой кислоты, олеиновой кислоты, элаидиновой кислоты, вакценовой кислоты, линолевой кислоты, линоэлаидиновой кислоты, альфа-линолевой кислоты, арахидоновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, эруковой кислоты, докозагексаеновой кислоты, триптофана, N-ацетил триптофана и холестерина или их солей, смесей, фрагментов и производных.
Гликирование и гликозилирование являются процессами, при помощи которых одна или более молекул Сахаров связываются с белком. Гликирование и гликозилирование могут влиять на связывающие свойства белка, а сывороточный альбумин содержит несколько потенциальных участков гликирования. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу обработки белка путем гликирования или гликозилирования белка.
Ионообменные смолы, включая анионообменные, катионообменные и смешанные смолы, обычно применяют для деионизации растворов. Содержащий ассоциированные молекулы компонент белков, таких как сывороточный альбумин, может содержать ионы. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу обработки белка путем приведения белка в контакт с одной или более ионообменными смолами. В одном варианте реализации изобретения одна или более из ионообменных смол содержит смешанную смолу, содержащую функциональные группы с протонными (Н+) и гидроксильными (ОН-) формами. В другом варианте реализации изобретения одна или более из ионообменных смол содержит индикатор, который изменяет цвет, когда смола насыщается ионами. Дополнительно к приведению в контакт с одной или более ионообменными смолами можно использовать другие способы для того, чтобы уменьшить, удалить, заменить или инактивировать каким-либо другим способом компонент белка, содержащий ассоциированные молекулы, включая приведение белка в контакт с древесным углем, который может быть активирован и/или обработан химическим веществом, таким как сульфат декстрана, диализ (включая разбавление, приводящее к деассоциации компонента белка, содержащего ассоциированные молекулы, с или без последующего удаления деассоциированных молекул из раствора), кристаллизацию, хроматографию, электрофорез, тепловую обработку, низкотемпературную обработку, обработку растворами с высоким уровнем pH, обработку растворами с низким уровнем pH, преципитацию органическими растворителями и афинную очистку.
Определенные способы обработки белка могут предпочтительно уменьшить, удалить, заменить или инактивировать каким-либо другим способом специфические типы молекул. Следовательно, в определенных ситуациях может быть выгодным комбинировать два или более способов обработки белка для того, чтобы уменьшить низкую эффективность трансфекции и/или низкую жизнеспособность клеток после трансфекции, причиной которых является белок. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу обработки белка, в котором применяются два или более способов для того, чтобы уменьшить, удалить, заменить или инактивировать каким-либо другим способом компонент белка, содержащий ассоциированные молекулы. В одном варианте реализации изобретения белок приводят в контакт с одной или более ионообменными смолами и активированным древесным углем. В другом варианте реализации изобретения белок приводят в контакт с октаноатом натрия, инкубируют при повышенной температуре, приводят в контакт с одной или более ионообменными смолами и приводят в контакт с активированным древесным углем. В другом варианте реализации изобретения белок является сывороточным альбумином, а повышенная температура составляет по меньшей мере около 50°С.
Определенные элементы компонента белка, содержащего ассоциированные молекулы, могут оказаться полезными для клеток в культуре и/или для трансфекции, например, это некоторые резолвины, протектины, липоксины, марезины, эйкозаноиды, простациклины, тромбоксаны, лейкотриены, циклопентенон простагландины и глюкокортикоиды. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу обработки белка для того, чтобы уменьшить, удалить, заменить или инактивировать каким-либо другим способом компонент белка, содержащий ассоциированные молекулы, без уменьшения, удаления, замены или инактивации каким-либо другим способом одного или более из полезных элементов компонента белка, содержащего ассоциированные молекулы. Другие варианты реализации изобретения относятся к способу обработки белка для того, чтобы уменьшить, удалить, заменить или инактивировать каким-либо другим способом компонент белка, содержащий ассоциированные молекулы, и дополнительного приведения белка в контакт с одной или более молекулами, содержащими один или более полезных элементов компонента белка, содержащего ассоциированные молекулы.
Другие варианты реализации изобретения относятся к способу обработки белка для того, чтобы уменьшить низкую эффективность трансфекции и/или низкую жизнеспособность клеток после трансфекции, причиной которых является белок, путем приведения белка в контакт с одной или более молекулами, содержащими один или более полезных элементов компонента белка, содержащего ассоциированные молекулы. Другие варианты реализации изобретения относятся к способу повышения эффективности трансфекции и/или повышения жизнеспособности клеток после трансфекции путем приведения клетки в контакт с одной или более молекулами, содержащими один или более полезных элементов компонента белка, содержащего ассоциированные молекулы. В одном варианте реализации изобретения белок приводят в контакт с одной или более ионообменными смолами или древесным углем и дополнительно приводят в контакт с глюкокортикоидом, таким как гидрокортизон, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон или бетаметазон. В другом варианте реализации изобретения клетку приводят в контакт с глюкокортикоидом, таким как гидрокортизон, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон или бетаметазон. Дополнительно было обнаружено, что в определенных ситуациях добавление в трансфекционную среду одного или более стероидов и/или одного или более антиоксидантов может повысить эффективность трансфекции, эффективность перепрограммирования и эффективность генного редактирования. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу индукции экспрессии клеткой представляющего интерес белка путем культивирования клетки в среде, содержащей стероид и приведения клетки в контакт с одной или более синтетическими молекулами РНК. В одном варианте реализации изобретения стероид является гидрокортизоном. В другом варианте реализации изобретения гидрокортизон присутствует в среде в концентрации между около 0,1 мкМ и около 10 мкМ или около 1 мкМ. Другие варианты реализации изобретения относятся к способу индукции экспрессии клеткой представляющего интерес белка путем культивирования клетки в среде, содержащей антиоксидант и приведения клетки в контакт с одной или более синтетическими молекулами РНК. В одном варианте реализации изобретения антиоксидант является аскорбиновой кислотой или аскорбиновой кислотой-2-фосфатом. В другом варианте реализации изобретения аскорбиновая кислота или аскорбиновая кислота-2-фосфат присутствует в среде в концентрации между около 0,5 мг/Л и около 500 мг/Л, включая около 50 мг/Л. Другие варианты реализации изобретения относятся к способу перепрограммирования и/или генного редактирования клетки путем культивирования клетки в среде, содержащей стероид и/или антиоксидант и приведения клетки в контакт с одной или более синтетическими молекулами РНК, при этом одна или более из синтетических молекул РНК кодирует один или более перепрограммирующих и/или генно-редактирующих белков. В определенных вариантах реализации изобретения клетка изначально присутствует в организме, а стероид и/или антиоксидант доставляют в организм.
Сообщалось, что добавление в среду для комплексирования трансферрина в определенных ситуациях повышает эффективность плазмидной трансфекции. Недавно было обнаружено, что добавление трансферрина в среду для комплексирования также может повысить эффективность трансфекции синтетическими молекулами РНК. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу индукции экспрессии клеткой представляющего интерес белка путем добавления одной или более синтетических молекул РНК и трансфекционного реагента в раствор, содержащий трансферрин. В одном варианте реализации изобретения трансферрин присутствует в растворе в концентрации между около 1 мг/Л и около 100 мг/Л, например, около 5 мг/Л. В другом варианте реализации изобретения трансферрин является рекомбинантным.
Другие варианты реализации изобретения относятся к среде, содержащей белок, который обработан согласно одному или более способам настоящего изобретения. В определенных вариантах реализации изобретения белок обрабатывают до того, как его смешивают с одним или более другими ингредиентами среды. В одном варианте реализации изобретения среда является трансфекционной средой. В другом варианте реализации изобретения данная среда также способствует эффективной трансфекции и высокой жизнеспособности клеток. В определенных вариантах реализации изобретения белок и одну или более молекул, которые уменьшают низкую эффективность трансфекции и/или низкую жизнеспособность клеток после трансфекции, причиной которых является белок, добавляют в среду независимо друг от друга. В одном варианте реализации изобретения белок обрабатывают до того, как его смешивают с одним или более других ингредиентов среды. В другом варианте реализации изобретения среду готовят, обрабатывая сначала концентрированный раствор сывороточного альбумина путем приведения концентрированного раствора сывороточного альбумина в контакт с одной или более ионообменными смолами, затем удаляя одну или более ионообменных смол из концентрированного раствора сывороточного альбумина, и затем добавляя обработанный концентрированный раствор сывороточного альбумина к другим компонентам среды. В другом варианте реализации изобретения концентрированный раствор сывороточного альбумина дополнительно приводят в контакт с древесным углем перед тем, как добавить обработанный концентрированный раствор сывороточного альбумина к другим компонентам среды. В другом варианте реализации изобретения концентрированный раствор сывороточного альбумина сначала приводят в контакт с октаноатом натрия, затем нагревают до температуры по меньшей мере около 50°С на протяжении по меньшей мере 10 минут, затем приводят в контакт с одной или более ионообменными смолами, затем приводят в контакт с активированным древесным углем, а затем добавляют к другим компонентам среды.
Недавно было обнаружено, что трансфекция клеток с применением среды, содержащей буферный солевой раствор, аминокислоты, холестерин, гидрокортизон и сывороточный альбумин, может привести к эффективной трансфекции, и что трансфекция клеток с применением среды, в значительной степени, состоящей из буферного солевого раствора, аминокислот, инсулина, трансферрина, холестерина, гидрокортизона, сывороточного альбумина и фактора роста фибробластов, может привести к эффективной трансфекции и эффективному перепрограммированию. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к трансфекционной среде, содержащей: буферный солевой раствор, аминокислоты, холестерин, гидрокортизон и сывороточный альбумин. Другие варианты реализации изобретения относятся к трансфекционной среде, в значительной степени состоящей из и/или содержащей: буферный солевой раствор, аминокислоты, инсулин, трансферрин, холестерин, гидрокортизон, сывороточный альбумин и фактор роста фибробластов. Другие варианты реализации изобретения относятся к перепрограммирующей среде, в значительной степени состоящей из и/или содержащей: буферный солевой раствор, аминокислоты, инсулин, трансферрин, холестерин, гидрокортизон, сывороточный альбумин и фактор роста фибробластов. В одном варианте реализации изобретения среда также содержит полиоксиэтиленсорбитан моноолеат и/или D-альфа-токоферола ацетат. В другом варианте реализации изобретения среда также содержит аскорбиновую кислоту или аскорбиновую кислоту-2-фосфат, например, в концентрации между около 1 мг/Л и около 100 мг/Л. В одном варианте реализации изобретения гидрокортизон присутствует в концентрации около 1 мкМ. В другом варианте реализации изобретения фактор роста фибробластов является основным фактором роста фибробластов, и основной фактор роста фибробластов присутствует в концентрации между около 1 нг/мЛ и около 200 нг/мЛ, например, между около 4 нг/мЛ и около 100 нг/мЛ, или между около 10 нг/мЛ и около 50 нг/мЛ, или около 20 нг/мЛ. В одном варианте реализации изобретения сывороточный альбумин является человеческим сывороточным альбумином, и человеческий сывороточный альбумин присутствует в концентрации между около 0,05% и около 2%, включая между около 0,1% и около 1%, например, около 0,5%. В другом варианте реализации изобретения человеческий сывороточный альбумин является рекомбинантным. В другом варианте реализации изобретения холестерин присутствует в концентрации около 4,5 мг/Л. В одном варианте реализации изобретения среда не содержит компонентов животного происхождения. В другом варианте реализации изобретения среда не содержит компонентов с неопределенным составом, например, жирных кислот рыбьего жира или сыворотки. В одном варианте реализации изобретения среда содержит ингибитор TGF-β, например, А83-01 или SB431542. В одном варианте реализации изобретения ингибитор TGF-β присутствует в концентрации между около 0,1 мкМ и около 10 мкМ. В одном варианте реализации изобретения среда содержит агонист Wnt-сигнального пути, такой как Wnt3a. В другом варианте реализации изобретения агонист Wnt-сигнального пути присутствует в концентрации между около 10 нг/мЛ и около 500 нг/мЛ, включая между около 50 нг/мЛ и около 200 нг/мЛ. В одном варианте реализации изобретения среда содержит источник селена, такой как селенит натрия.
В определенных ситуациях может возникать необходимость замены компонентов животного происхождения на компоненты неживотного происхождения и/или рекомбинантные компоненты, частично по причине того, что компоненты неживотного происхождения и/или рекомбинантные компоненты можно получать с более высокой степенью выдержанности, чем компоненты животного происхождения, и частично по причине того, что риск загрязнения компонентов неживотного происхождения и/или рекомбинантных компонентов токсичными и/или патогенными веществами меньше, чем для компонентов животного происхождения. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к белку, который имеет неживотное происхождение и/или является рекомбинантным. Другие варианты реализации изобретения относятся к среде, отличающейся тем, что некоторые или все компоненты данной среды имеют неживотное происхождение и/или являются рекомбинантными. В одном варианте реализации изобретения белок является рекомбинантным сывороточным альбумином. В другом варианте реализации изобретения белок является рекомбинантным человеческим сывороточным альбумином. В другом варианте реализации изобретения белок является рекомбинантным сывороточным альбумином, а все компоненты среды имеют неживотное происхождение и/или являются рекомбинантными.
N-конец сывороточного альбумина может содержать никель- и медь-связывающий домен, который может являться важной антигенной детерминантой. Удаление остатка аспарагиновой кислоты с N-конца сывороточного альбумина может исключить никель- и медь-связывающую активность сывороточного альбумина и привести к образованию гипоаллергенного варианта белка. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к белку с модифицированными связывающими характеристиками и/или другими необходимыми характеристиками, таким как гипоаллергенность. В одном варианте реализации изобретения белок является сывороточным альбумином, а в сывороточном альбумине отсутствует N-концевая аспарагиновая кислота.
Другие варианты реализации изобретения относятся к способу трансфекции клетки. В одном варианте реализации изобретения клетку трансфицируют одной или более нуклеиновыми кислотами, а трансфекцию проводят при помощи трансфекционного реагента, такого как трансфекционный реагент на липидной основе. В одном варианте реализации изобретения одна или более нуклеиновых кислот включает по меньшей мере одну молекулу РНК. В другом варианте реализации изобретения клетку трансфицируют одной или более нуклеиновыми кислотами, а одна или более нуклеиновых кислот кодирует по меньшей мере один элемент из: р53, TERT, цитокина, секретируемого белка, мембраносвязанного белка, фермента, генно-редактирующего белка, хроматин-модифицирующего белка, ДНК-связывающего белка, транскрипционного фактора, гистондеацетилазы, патоген-ассоциированного молекулярного паттерна и опухолеассоциированного антигена, либо его биологически активный фрагмент, аналог, вариант или представителя семейства. В другом варианте реализации изобретения клетку трансфицируют многократно, например, по меньшей мере 2 раза на протяжении около 10 последовательных дней, или по меньшей мере 3 раза на протяжении около 7 последовательных дней, или по меньшей мере 4 раза на протяжении около 6 последовательных дней.
Перепрограммирование можно проводить при помощи трансфекции клеток одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более перепрограммирующих факторов, и культивирования клеток в среде, которая поддерживает жизнедеятельность перепрограммированных клеток. Примеры перепрограммирующих факторов включают, но не ограничиваются этим: белок Oct4, белок Sox2, белок Klf4, белок с-Мус, белок 1-Мус, белок TERT, белок Nanog, белок Lin28, белок Utf1, белок Aicda, микро-РНК miR200, микро-РНК miR302, микро-РНК miR367, микро-РНК miR369 и их биологически активные фрагменты, аналоги, варианты или представителей семейств. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу перепрограммирования клетки. В одном варианте реализации изобретения клетку перепрограммируют путем трансфекции клетки одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более перепрограммирующих факторов. В одном варианте реализации изобретения одна или более нуклеиновых кислот включает молекулу РНК, которая кодирует белок Oct4. В другом варианте реализации изобретения одна или более нуклеиновых кислот также включает одну или более молекул РНК, которая кодирует белок Sox2, белок Klf4 и белок с-Мус. В другом варианте реализации изобретения одна или более нуклеиновых кислот также включает молекулу РНК, которая кодирует белок Lin28. В одном варианте реализации изобретения клетка является человеческой клеткой кожи, а человеческую клетку кожи перепрограммируют в полипотентную стволовую клетку. В другом варианте реализации изобретения клетка является человеческой клеткой кожи, а человеческую клетку кожи перепрограммируют в глюкозозависимую инсулин-продуцирующую клетку. Примеры других клеток, которые можно перепрограммировать, и других клеток, в которые клетку можно перепрограммировать, включают, но не ограничиваются этим: клетки кожи, полипотентные стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки, β-клетки, ретинальные пигментные эпителиальные клетки, гемопоэтические клетки, сердечные клетки, эпителиальные клетки верхних дыхательных путей, нейральные стволовые клетки, нейроны, глиальные клетки, костные клетки, клетки крови и стволовые клетки зубной пульпы. В других вариантах реализации изобретения клетку культивируют в среде, которая поддерживает жизнедеятельность перепрограммированной клетки. В одном варианте реализации изобретения среда также поддерживает жизнедеятельность клетки.
Сообщалось о важном факте, который состоит в том, что инфицирование клеток вирусами, кодирующими Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус в комбинации с культивированием клеток в среде, которая способствует росту кардиомиоцитов, приводит к перепрограммированию клеток кожи в кардиомиоциты без предварительного перепрограммирования клеток кожи в полипотентные стволовые клетки (Смотрите Efs et al Nat Cell Biol. 2011; 13:215-22, содержание которой включено в данный текст посредством ссылки). В определенных ситуациях, например, при разработке индивидуального терапевтического препарата, может быть необходимым прямое перепрограммирование (перепрограммирование одной соматической клетки в другую соматическую клетку без предварительного перепрограммирования соматической клетки в полипотентную стволовую клетку, также известное как ʺтрансдифференцировкаʺ), частично из-за того, что культивирование полипотентных стволовых клеток может требовать продолжительного времени и высоких затрат, дополнительная обработка, требуемая для создания и оценки стабильной линии полипотентных стволовых клеток, может нести повышенный риск загрязнения, а дополнительное время в процессе культивирования, связанное с изначальным получением полипотентных стволовых клеток, может нести повышенный риск геномной нестабильности и появления мутаций, включая точечные мутации, вариации числа копий и кариотипические нарушения. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу перепрограммирования соматической клетки, в котором клетку перепрограммируют в соматическую клетку, и в котором не формируется характерная линия полипотентных стволовых клеток.
Известные ранее способы перепрограммирования клеток путем их трансфекции РНК, кодирующей перепрограммирующие факторы, требуют применения фидеров. Во многих ситуациях применение фидеров может быть нежелательным, частично потому, что фидеры могут быть получены из животных иди алогенных ресурсов и, таким образом, могут нести риск иммуногенности и загрязнения патогенами. Недавно было обнаружено, что с помощью среды, являющейся объектом настоящего изобретения, можно осуществить перепрограммирование РНК в отсутствие фидеров. Дополнительно было обнаружено, что перепрограммирование клеток согласно способам настоящего изобретения, в котором клетки не приводят в контакт с фидерами, может быть быстрым, эффективным и надежным. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу перепрограммирования клетки, в котором клетку не приводят в контакт с фидерами.
Недавно было обнаружено, что эффективность перепрограммирования может коррелировать с начальной плотностью клеток, в случае, когда клетки перепрограммируют согласно способам настоящего изобретения. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу перепрограммирования клеток, в котором клетки высевают с плотностью между около 100 клеток/см2 и около 100,000 клеток/см2. В одном варианте реализации изобретения клетки высевают с плотностью между около 100 клеток/см2 и около 10,000 клеток/см2, или между около 2000 клеток/см2 и около 20,000 клеток/см2, или между около 1000 клеток/см2 и около 2000 клеток/см2.
Дополнительно было обнаружено, что в некоторых ситуациях для перепрограммирования клетки согласно способам настоящего изобретения может требоваться меньшее общее количество трансфекций, чем при других способах. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу перепрограммирования клетки, в котором на протяжении около 20 последовательных дней проводят от около 2 до около 12 трансфекций, или на протяжении около 15 последовательных дней проводят от около 4 до около 10 трансфекций, или на протяжении около 10 последовательных дней проводят от около 4 до около 8 трансфекций. Известно, что когда в среду, в которой культивируют клетку, добавляют нуклеиновые кислоты, с большей вероятностью может произойти контакт и/или поглощение клеткой более чем одной молекулы нуклеиновой кислоты как одновременно, так и в разное время. Соответственно, клетка может контактировать с нуклеиновой кислотой более одного раза, т.е., неоднократно, даже в случае, когда нуклеиновые кислоты только один раз добавляют в среду, в которой культивируют клетку.
Фидеры могут способствовать адгезии клеток к поверхности, секретируя молекулы, такие как коллаген, которые связываются с поверхностью (ʺмолекулы клеточной адгезииʺ). Белки, включая интегрины, находясь на поверхности клеток, могут связываться с этими молекулами клеточной адгезии, что может привести к прикреплению клеток к поверхности. Недавно было обнаружено, что клетки можно перепрограммировать, в том числе в отсутствие фидеров, при помощи покрытия поверхности одной или более молекулами клеточной адгезии. Дополнительно было обнаружено, что такие молекулы клеточной адгезии как фибронектин и витронектин особенно хорошо подходят для этой цели. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу трансфекции, перепрограммирования и/или генного редактирования клетки, в котором клетку приводят в контакт с поверхностью, которую приводят в контакт с одной или более молекулами клеточной адгезии. В одном варианте реализации изобретения одна или более из молекул клеточной адгезии включает по меньшей мере одно соединение из: поли-L-лизина, поли-L-орнитина, RGD-пептида, фибронектина, витронектина, коллагена и ламинина, либо его биологически активный фрагмент, аналог, вариант или представителя семейства. В другом варианте реализации изобретения одна или более из молекул клеточной адгезии является фибронектином или его биологически активным фрагментом. В другом варианте реализации изобретения фибронектин является рекомбинантным. В другом варианте реализации изобретения одна или более из молекул клеточной адгезии представляют собой смесь фибронектина и витронектина или их биологически активных фрагментов. В другом варианте реализации изобретения фибронектин и витронектин каждый присутствуют на поверхности в концентрации около 100 нг/см2 или в растворе, который применяют для покрытия поверхности, в концентрации около 1 мкг/мЛ. В другом варианте реализации изобретения фибронектин и витронектин являются рекомбинантными. Приведение поверхности в контакт с одной или более молекулами клеточной адгезии можно проводить как независимый этап и/или путем добавления одной или более молекул клеточной адгезии в среду.
Следует отметить, что нуклеиновые кислоты могут содержать один или более неканонических или ʺмодифицированныхʺ остатков (например, остатков, которые не являются аденином, гуанином, тимином, урацилом и цитозином или их стандартными нуклеозидными, нуклеотидными, дезоксинуклеозидными или дезоксинуклеотидными производными). В особенности следует отметить, что уридин-5ʹ-трифосфат можно заменить на псевдоуридин-5ʹ-трифосфат в реакции in vitro транскрипции, чтобы получить синтетическую РНК, отличающуюся тем, что до 100% остатков уридина синтетической РНК можно заменить остатками псевдоуридина. При помощи in vitro транскрипции можно получить РНК с иммуногенностью остатков, даже когда уридин и цитидин полностью заменены псевдоуридином и 5-метилцитидином соответственно (Смотрите Angel Reprogramming Human Somatic Cells to Pluripotency Using RNA [Doctoral Thesis]. Cambridge, MA: MIT; 2011, содержание которой включено в данный текст посредством ссылки). По этой причине при трансфекции клеток РНК обычно применяют добавление в трансфекционную среду иммунодепрессанта. В некоторых ситуациях добавление в трансфекционную среду иммунодепрессанта может быть нежелательным, частично из-за того, что наиболее часто применяемый для этой цели рекомбинантный иммунодепрессант B18R может быть дорогостоящим и труднопроизводимым. Недавно было обнаружено, что клетки можно трансфицировать и/или перепрограммировать согласно способам настоящего изобретения без применения B18R или любого другого иммунодепрессанта. Дополнительно было обнаружено, что перепрограммирование клеток согласно способам настоящего изобретения без применения иммунодепрессантов может быть быстрым, эффективным и надежным. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу трансфекции клетки, в котором трансфекционная среда не содержит иммунодепрессант. Другие варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу перепрограммирования клетки, в котором трансфекционная среда не содержит иммунодепрессант. В определенных ситуациях, например, при применении высокой клеточной плотности, добавление иммунодепрессанта в трансфекционную среду может быть полезным. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу трансфекции клетки, в котором трансфекционная среда содержит иммунодепрессант. Другие варианты реализации изобретения относятся к способу перепрограммирования клетки, в котором трансфекционная среда содержит иммунодепрессант. В одном варианте реализации изобретения иммунодепрессант является B18R либо его биологически активным фрагментом, аналогом, вариантом или представителем семейства или дексаметазоном либо его производным. В одном варианте реализации изобретения клетки высевают с плотностью, составляющей менее чем около 20,000 клеток/см2, а трансфекционная среда не содержит иммунодепрессант. В другом варианте реализации изобретения трансфекционная среда не содержит иммунодепрессант, а дозировку нуклеиновой кислоты подбирают так, чтобы избежать излишней токсичности. В другом варианте реализации изобретения дозировка нуклеиновой кислоты составляет менее чем 2 мкг/лунку 6-луночного планшета, например, около 0,25 мкг/лунку 6-луночного планшета или около 1 мкг/лунку 6-луночного планшета.
Перепрограммированные клетки, полученные согласно определенным способам настоящего изобретения, подходят для терапевтических применений, включая трансплантацию пациентам, так как они не содержат экзогенных последовательностей ДНК и не подвержены действию продуктов животного или человеческого происхождения, состав которых может быть неопределенным, и которые могут содержать токсичные и/или патогенные примеси. Более того, высокая скорость, эффективность и надежность определенных способов настоящего изобретения может снизить риск появления и накопления мутаций и других хромосомных аномалий. Определенные варианты реализации настоящего изобретения можно, таким образом, применять для получения клеток с приемлемым профилем безопасности для применения в терапевтических целях. Например, путем перепрограммирования клеток при помощи РНК и среды согласно настоящему изобретению, отличающейся тем, что среда не содержит компонентов животного или человеческого происхождения, можно получить клетки, которые не подвергались действию аллогенных веществ. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к перепрограммированным клеткам, которые имеют необходимый профиль безопасности. В одном варианте реализации изобретения перепрограммированная клетка обладает нормальным кариотипом. В другом варианте реализации изобретения перепрограммированная клетка содержит менее чем около 5 вариаций числа копий (ВЧК) по сравнению с геномом пациента, например, менее чем около 3 вариаций числа копий по сравнению с геномом пациента, или не содержит вариаций числа копий по сравнению с геномом пациента. В другом варианте реализации изобретения перепрограммированная клетка обладает нормальным кариотипом и содержит менее чем около 100 одиночных нуклеотидных вариантов на кодирующих участках по сравнению с геномом пациента, или менее чем около 50 одиночных нуклеотидных вариантов на кодирующих участках по сравнению с геномом пациента, или менее чем около 10 одиночных нуклеотидных вариантов на кодирующих участках по сравнению с геномом пациента.
Эндотоксины и нуклеазы могут проходить совместную очистку и/или связываться с другими белками, такими как сывороточный альбумин. В частности, рекомбинантные белки могут содержать высокие уровни ассоциированных эндотоксинов и нуклеаз, частично из-за лизиса клеток, который может происходить во время их получения. Эндотоксины и нуклеазы можно уменьшить в количестве, удалить, заменить или каким-либо другим способом инактивировать при помощи многих способов настоящего изобретения, включая, например, ацетилирование, добавление стабилизатора, такого как октаноат натрия с последующей тепловой обработкой, добавление ингибиторов нуклеазы в раствор альбумина и/или среду, кристаллизацию, приведение в контакт с одной или более ионообменными смолами, приведение в контакт с древесным углем, препаративный электрофорез или аффинную хроматографию. Недавно было обнаружено, что частичное или полное уменьшение количества, удаление, замена или инактивация каким-либо другим способом эндотоксинов и/или нуклеаз в среде и/или в одном или более компонентах среды может повысить эффективность, с которой клетки могут быть трансфицированы и перепрограммированы. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу трансфекции клетки одной или более нуклеиновыми кислотами, в котором трансфекционную среду обрабатывают для того, чтобы частично либо полностью уменьшить в количестве, удалить, заменить или каким-либо другим способом инактивировать один или более эндотоксинов и/или нуклеаз. Другие варианты реализации изобретения относятся к среде, в которой происходит минимальная деградация нуклеиновых кислот. В одном варианте реализации изобретения данная среда содержит менее чем около 1 единицы эндотоксина на мЛ, или менее чем около 0,1 единицы эндотоксина на мЛ, или менее чем около 0,01 единицы эндотоксина на мЛ.
В определенных ситуациях липидные носители на белковой основе, такие как сывороточный альбумин, можно заменить липидными носителями на небелковой основе, такими как метил-бета-циклодекстрин. Среду, являющуюся объектом настоящего изобретения, также можно применять без липидного носителя, например, когда трансфекцию проводят способом, который может не требовать или для которого может не быть выгодным присутствие липидного носителя, например, при использовании одного или более трансфекционных реагентов на полимерной основе или трансфекционных реагентов на белковой основе.
Многие ассоциированные с белком молекулы, такие как металлы, могут быть высокотоксичными для клеток. Эта токсичность может являться причиной сниженной жизнеспособности в культуре, а также появления мутаций. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, имеют дополнительное преимущество, состоящее в получении клеток, в которых отсутствуют токсичные молекулы.
Компонент белка, содержащий ассоциированные молекулы можно оценить путем растворения белка в растворе и измерения проводимости раствора. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к среде, содержащей белок, в которой приблизительно 10% раствор белка в воде имеет проводимость менее чем около 500 мкСм/см. В одном варианте реализации изобретения раствор имеет проводимость менее чем около 50 мкСм/см.
Окружающая среда с низким содержанием кислорода может быть благоприятной для культивирования многих типов клеток. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу культивирования, трансфекции, перепрограммирования и/или генного редактирования клеток, в котором клетки культивируют, трансфицируют, перепрограммируют и/или генетически редактируют в среде с низким содержанием кислорода. В одном варианте реализации изобретения среда с низким содержанием кислорода содержит между около 2% и около 10% кислорода или между около 4% и около 6% кислорода.
Количество доставленной в клетки нуклеиновой кислоты можно увеличить для того, чтобы увеличить необходимый эффект от нуклеиновой кислоты. При этом увеличение количества доставленной в клетки нуклеиновой кислоты выше определенной величины может привести к снижению жизнеспособности клеток, частично по причине токсичности трансфекционного реагента. Недавно было обнаружено, что когда нуклеиновую кислоту доставляют в клеточную популяцию в фиксированном объеме (например, клетки на участке ткани или клетки, выращенные в емкости для культивирования клеток), количество доставляемой в каждую клетку нуклеиновой кислоты может зависеть от общего количества нуклеиновой кислоты, доставляемой в клеточную популяцию, и от плотности клеток, когда более высокая плотность клеток приводит к меньшему количеству доставляемой в каждую клетку нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах реализации изобретения клетку трансфицируют одной или более нуклеиновыми кислотами более одного раза. В определенных условиях, например, в случае пролиферации клеток, плотность клеток может изменяться от одной трансфекции к следующей. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу трансфекции клетки нуклеиновой кислотой, в котором клетку трансфицируют более одного раза и в котором количество доставляемой в клетку нуклеиновой кислоты отличается для двух трансфекций. В одном варианте реализации изобретения клетка пролиферирует между двумя трансфекциями, а количество доставляемой в клетку нуклеиновой кислоты является большим для второй из двух трансфекций, чем для первой из двух трансфекций. В другом варианте реализации изобретения клетку трансфицируют более двух раз, а количество доставляемой в клетку нуклеиновой кислоты является большим для второй из трех трансфекций, чем для первой из тех же трех трансфекций, и количество доставляемой в клетку нуклеиновой кислоты является большим для третьей из тех же трех трансфекций, чем для второй из тех же трех трансфекций. В другом варианте реализации изобретения клетку трансфицируют более одного раза, а максимальное количество доставляемой в клетку во время каждой трансфекции нуклеиновой кислоты является в достаточной мере низким для того, чтобы достичь приблизительно 80% жизнеспособности для по меньшей мере двух последовательных трансфекций.
Недавно было обнаружено, что изменение количества нуклеиновой кислоты, доставляемой в популяцию пролиферирующих клеток на протяжении ряда трансфекций, может привести как к повышенной эффективности нуклеиновой кислоты, так и повышенной жизнеспособности клеток. Дополнительно было обнаружено, что в некоторых ситуациях, когда клетки приводят в контакт с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более перепрограммирующих факторов на протяжении ряда трансфекций, эффективность перепрограммирования можно повысить, если количество нуклеиновой кислоты, доставляемой во время более поздних трансфекций, является большим, чем количество нуклеиновой кислоты, доставляемой во время более ранних трансфекций, по меньшей мере для части трансфекций. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу перепрограммирования клеток, в котором одну или более нуклеиновых кислот неоднократно доставляют в клетку на протяжении ряда трансфекций, а количество доставляемой в клетку нуклеиновой кислоты является большим для по меньшей мере одной из более поздних трансфекций, чем для по меньшей мере одной из более ранних трансфекций. В одном варианте реализации изобретения клетку трансфицируют от около 2 до около 10 раз, или от около 3 до около 8 раз, или от около 4 до около 6 раз. В другом варианте реализации изобретения одна или более нуклеиновых кислот включают по меньшей мере одну молекулу РНК, клетку трансфицируют от около 2 до около 10 раз, а количество нуклеиновой кислоты, доставляемой в клетку во время каждой трансфекции, является одинаковым или большим, чем количество нуклеиновой кислоты, доставляемой в клетку во время наиболее поздней из предыдущих трансфекций. В другом варианте реализации изобретения количество нуклеиновой кислоты, доставляемой в клетку во время первой трансфекции, составляет между около 20 нг/см2 и около 250 нг/см2 или между около 100 нг/см2 и около 600 нг/см2. В другом варианте реализации изобретения клетку трансфицируют около 5 раз с интервалами, составляющими от около 12 до около 48 ч, а количество нуклеиновой кислоты, доставляемой в клетку, составляет около 25 нг/см2 для первой трансфекции, около 50 нг/см2 для второй трансфекции, около 100 нг/см2 для третьей трансфекции, около 200 нг/см2 для четвертой трансфекции и около 400 нг/см2 для пятой трансфекции. В другом варианте реализации изобретения клетку дополнительно трансфицируют по меньшей мере один раз после пятой трансфекции, а количество нуклеиновой кислоты, доставляемой в клетку, составляет около 400 нг/см2.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к способу трансфекции клетки нуклеиновой кислотой, в котором количество нуклеиновой кислоты определяют, измеряя плотность клеток и выбирая количество нуклеиновой кислоты для трансфекции на основе измеренной плотности клеток. В одном варианте реализации изобретения клетка находится в in vitro культуре, а плотность клеток измеряют оптическими методами. В другом варианте реализации изобретения клетку трансфицируют неоднократно, плотность клеток увеличивается в промежутке между двумя трансфекциями, а количество трансфицируемой нуклеиновой кислоты является большим для второй из двух трансфекций, чем для первой из двух трансфекций.
Недавно было обнаружено, что в некоторых ситуациях эффективность трансфекции и жизнеспособность клеток, культивируемых в среде согласно настоящему изобретению, можно повысить путем кондиционирования среды. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу кондиционирования среды. Другие варианты реализации изобретения относятся к среде, которую кондиционируют. В одном варианте реализации изобретения фидеры являются фибробластами, а среду кондиционируют приблизительно на протяжении 24 ч. Другие варианты реализации изобретения относятся к способу трансфекции клетки, в котором трансфекционную среду кондиционируют. Другие варианты реализации изобретения относятся к способу перепрограммирования и/или генного редактирования клетки, в котором среду кондиционируют. В одном варианте реализации изобретения фидеры являются митотически инактивированными, например, при помощи обработки химическим веществом, таким как митомицин-С, или при помощи радиоактивного облучения. В определенных вариантах реализации изобретения может быть более выгодным использование только аутологических материалов, частично для того, как можно привести в качестве примера, и не ограничивая себя теорией, чтобы избежать риска передачи заболевания от фидеров к клетке. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу трансфекции клетки, в котором трансфекционную среду кондиционируют, и в котором фидеры получены из того же организма, что и трансфицируемая клетка. Другие варианты реализации изобретения относятся к способу перепрограммирования и/или генного редактирования клетки, в котором среду кондиционируют, и в котором фидеры получены из того же организма, что и перепрограммируемая и/или генетически редактируемая клетка.
Путем кондиционирования в среду можно добавить несколько молекул. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к среде, в которую добавлены одна или более молекул, которые присутствуют в кондиционированной среде. В одном варианте реализации изобретения в среду добавляют Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a либо их биологически активный фрагмент, аналог, вариант, агонист или представителя семейства. В другом варианте реализации изобретения в среду добавляют TGF-β либо его биологически активный фрагмент, аналог, вариант, агонист или представителя семейства. В другом варианте реализации изобретения клетку перепрограммируют согласно способу настоящего изобретения, при этом в среду не добавляют TGF-β на протяжении от около 1 и до около 5 дней, а затем добавляют TGF-β на протяжении по меньшей мере около 2 дней. В другом варианте реализации изобретения в среду добавляют IL-6, IL-6R либо их биологически активный фрагмент, аналог, вариант, агонист или представителя семейства. В другом варианте реализации изобретения в среду добавляют сфинголипид или жирную кислоту. В другом варианте реализации изобретения сфинголипид является лизофосфатидной кислотой, лизосфингомиелином, сфингозин-1-фосфатом либо их биологически активным аналогом, вариантом или производным.
Дополнительно к митотической инактивации клеток в определенных условиях генную экспрессию клеток может изменить облучение, приводя к тому, что клетки вырабатывают меньшее количество определенных белков и большее количество других определенных белков, чем необлученные клетки, например, представителей семейства белков Wnt. Вдобавок, определенные представители семейства белков Wnt могут стимулировать рост и трансформацию клеток. Недавно было обнаружено, что в некоторых ситуациях эффективность перепрограммирования РНК можно значительно повысить путем приведения клетки в контакт со средой, которая является кондиционированной при помощи облученных фидеров вместо фидеров, обработанных митомицином-с. Дополнительно было обнаружено, что повышение эффективности перепрограммирования, наблюдаемой при применении облученных фидеров, происходит частично по причине секретируемых фидерами белков Wnt. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу перепрограммирования клетки, в котором клетку приводят в контакт с Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a либо их биологически активным фрагментом, аналогом, вариантом, представителем семейства или агонистом, включая агонистов низлежащих мишеней белков Wnt, и/или веществами, которые имитируют один или более биологических эффектов белков Wnt, например, 2-амино-4-[3,4-(метилэтилендиокси)бензиламино]-6-(3-метоксифенил)пиримидином.
Недавно было обнаружено, что среду, являющуюся объектом настоящего изобретения, можно использовать для поддержания жизнедеятельности клеток, включая фибробласты и человеческие полипотентные стволовые клетки, в культуре (т.е., в качестве ʺподдерживающей средыʺ). Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к среде, которую используют качестве поддерживающей среды. В одном варианте реализации изобретения данная среда не содержит каких-либо компонентов человеческого происхождения. В другом варианте реализации изобретения состав среды химически определен.
Из-за низкой эффективности многих способов перепрограммирования на основе ДНК эти способы может быть трудно или невозможно применять к клеткам, полученным из образцов пациентов, в которых может содержаться лишь небольшое количество клеток. И наоборот, высокая эффективность определенных вариантов реализации настоящего изобретения может дать возможность надежного перепрограммирования небольшого количества клеток, начиная с одиночных клеток. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, можно применять для того, чтобы перепрограммировать клетки из биопсийного образца, в том числе без предварительного создания большой культуры. Перепрограммирование клеток прямо из биопсийного образца может быть необходимым в определенных ситуациях, например, при разработке индивидуального терапевтического препарата, частично из-за того, что создание большой культуры первичных клеток может требовать продолжительного времени, дополнительная обработка, требуемая для создания большой культуры, может нести повышенный риск загрязнения, а дополнительное время в процессе культивирования может нести повышенный риск геномной нестабильности и появления мутаций, включая точечные мутации, вариации числа копий и кариотипические нарушения. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу перепрограммирования клетки, включающему получение клетки от пациента или из биопсийного образца и последующее перепрограммирование клетки. В одном варианте реализации изобретения клетку перепрограммируют без предварительного создания большой культуры, а первую трансфекцию проводят предпочтительно до того, как культуру перевивают более двух раз. В другом варианте реализации изобретения клетку получают от пациента, а первую трансфекцию проводят не позднее, чем приблизительно через 14 дней после того, как клетка была высеяна в первый раз. В другом варианте реализации изобретения клетку получают из биопсийного образца, а первую трансфекцию проводят не позднее, чем приблизительно через 7 дней после того, как клетка была высеяна в первый раз. В другом варианте реализации изобретения биопсийный образец является полнослойным биопсийным образцом, полученным при помощи дерматома, клетку получают из биопсийного образца путем обработки одним или более ферментами, клетку высеивают на поверхность, которая покрыта одной или более молекулами клеточной адгезии, и/или клетку высеивают в среду, которая содержит молекулу клеточной адгезии, клетку трансфицируют одной или более нуклеиновыми кислотами, содержащими по меньшей мере одну молекулу РНК, а первую трансфекцию проводят не позднее, чем приблизительно через 14 дней после того, как клетка была высеяна в первый раз. В другом варианте реализации изобретения фермент является коллагеназой. В другом варианте реализации изобретения коллагеназа не содержит компонентов животного происхождения. В другом варианте реализации изобретения коллагеназа присутствует в концентрации, составляющей между около 0,1 мг/мЛ и около 10 мг/мЛ или между около 0,5 мг/мЛ и около 5 мг/мЛ. В другом варианте реализации изобретения клетку получают из крови. В другом варианте реализации изобретения клетку высеивают в среду, содержащую один или более белков, которые получены из крови пациента. В другом варианте реализации изобретения клетку высеивают в среду, содержащую DMEM/F12 + 2 мМ L-аланил-L-глутамина + от около 5% до около 25% полученной от пациента сыворотки, или от около 10% до около 20% полученной от пациента сыворотки, или около 20% полученной от пациента сыворотки.
Недавно было обнаружено, что в некоторых ситуациях трансфекция клеток, содержащих смесь РНК, кодирующей Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус, с применением среды, являющейся объектом настоящего изобретения, может привести к возрастанию скорости пролиферации клеток. Когда количество доставляемой в клетки РНК является слишком низким для гарантии того, что все клетки трансфицированы, повышенную скорость пролиферации может демонстрировать только часть клеток. В определенных ситуациях, например, при разработке индивидуального терапевтического препарата, повышение скорости пролиферации клеток может быть желательным, частично потому, что таким образом можно уменьшить время, необходимое для создания терапевтического препарата, и, следовательно, можно уменьшить стоимость терапевтического препарата. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу трансфекции клетки смесью РНК, кодирующей Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус, в котором клетка демонстрирует повышенную скорость пролиферации. В одном варианте реализации изобретения клетки, демонстрирующие повышенную скорость пролиферации, выделяют из культуры. В другом варианте реализации изобретения клетки, демонстрирующие повышенную скорость пролиферации, увеличивают в количестве и культивируют в среде, которая способствует росту одного или более типов клеток, и перепрограммируют в клетку, принадлежащую одному или более типам клеток.
Многие заболевания связаны с наличием одной или более мутаций. Мутации можно исправить путем приведения клетки в контакт с нуклеиновой кислотой, которая кодирует белок, который либо отдельно, либо в комбинации с другими молекулами исправляет мутацию (пример генного редактирования). Примеры таких белков включают: цинк-пальцевые нуклеазы и TALENs. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу трансфекции клетки нуклеиновой кислотой, в котором нуклеиновая кислота кодирует белок, который либо отдельно, либо в комбинации с другими молекулами, создает одноцепочечный или двухцепочечный разрыв в молекуле ДНК. В одном варианте реализации изобретения белок является цинк-пальцевой нуклеазой или TALEN. В другом варианте реализации изобретения нуклеиновая кислота является молекулой РНК. В другом варианте реализации изобретения одноцепочечный или двухцепочечный разрыв составляет около 5,000,000 оснований сайта инициации транскрипции гена, выбранного из группы: CCR5, CXCR4, GAD1, GAD2, CFTR, НВА1, НВА2, НВВ, HBD, FANCA, ХРА, ХРВ, ХРС, ERCC2, POLH, НТТ, DMD, SOD1, АРОЕ, PRNP, BRCA1 и BRCA2, его их аналога, варианта и представителя семейства. В другом варианте реализации изобретения клетку трансфицируют нуклеиновой кислотой, которая действует как репарационная матрица, обеспечивая инсерцию последовательности ДНК на участке одноцепочечного или двухцепочечного разрыва либо обеспечивая какое-либо другое изменение последовательности ДНК на участке одноцепочечного или двухцепочечного разрыва. В другом варианте реализации изобретения проводят перепрограммирование клетки и последовательное генное редактирование. В другом варианте реализации изобретения проводят генное редактирование клетки и последовательное перепрограммирование. В другом варианте реализации изобретения генное редактирование и перепрограммирование проводят с интервалом между ними, составляющим около 7 дней. В другом варианте реализации изобретения генное редактирование и перепрограммирование происходит одновременно или в один день. В другом варианте реализации изобретения клетка является клеткой кожи, клетку кожи генетически редактируют для того, чтобы разрушить ген CCR5, клетку кожи перепрограммируют в гемопоэтическую стволовую клетку, создавая, таким образом, терапевтический препарат против ВИЧ/СПИД, а терапевтический препарат вводят пациенту вместе с ВИЧ/СПИД. В другом варианте реализации изобретения клетка кожи получена от того же пациента, которому вводят терапевтический препарат.
Гены, которые можно редактировать согласно способам настоящего изобретения для того, чтобы создавать терапевтические препараты согласно настоящему изобретению, включают гены, которые можно редактировать так, чтобы сохранить их нормальную функцию, а также гены, которые можно редактировать так, чтобы снизить или элиминировать их функцию. Такие гены включают, но не ограничиваются этим, бета глобин (НВВ), мутации в котором могут привести к серповидноклеточной анемии (СКА) и β-талассемии, ген рака груди 1 с ранним началом (BRCA1) и рака груди 2 с ранним началом (BRCA2), мутации в которых могут усилить подверженность раку груди, С-С хемокиновый рецептор типа 5 (CCR5) и С-Х-С хемокиновый рецептор типа 4 (CXCR4), мутации в которых могут подавлять устойчивость к ВИЧ инфекции, муковисцидозный трансмембранный регулятор (CFTR), мутации в котором могут привести к кистозному фиброзу, дистрофии (DMD), мутации в котором могут привести к мышечной дистрофии, включая мышечную дистрофию Дюшенна и мышечную дистрофию Беккера, глутамат декарбоксилазу 1 и глутамат декарбоксилазу 2 (GAD1, GAD2), мутации в которых могут препятствовать аутоиммунному разрушению β-клеток, гемоглобин альфа 1, гемоглобин альфа 2 и гемоглобин дельта (НВА1, НВА2 и HBD), мутации в которых могут привести к талассемии, Хантингтон (НТТ), мутации в котором могут привести к хорее Хантингтона, супероксиддисмутазу 1 (SOD1), мутации в котором могут привести к амиотрофическому боковому склерозу (ALS), ХРА, ХРВ, ХРС, XPD (ERCC6) и полимеразу (ДНК-направленную), эта (POLH), мутации в котором могут привести к пигментной ксеродерме, богатую лейцином повторную киназу 2 (LRRK2), мутации в котором могут привести к болезни Паркинсона и анемии Фанкони, комплементационные группы А, В, С, D1, D2, Е, F, G, I, J, L, М, N, Р (FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ, FANCL, FANCM, FANCN, FANCP), и гомолог RAD51 С (S. cerevisiae) (RAD51C), мутации в котором могут привести к анемии Фанкони.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к терапевтическому препарату, содержащему нуклеиновую кислоту, которая кодирует один или более редактирующих гены белков. Другие варианты реализации изобретения относятся к терапевтическому препарату, содержащему одну или более клеток, которые являются трансфицированными, перепрограммированными и/или генетически отредактированными согласно способам настоящего изобретения. В одном варианте реализации изобретения клетка является трансфицированной, перепрограммированной и/или генетически отредактированной, и трансфицированную, перепрограммированную и/или генетически отредактированную клетку вводят пациенту. В другом варианте реализации изобретения клетку получают от того же пациента, которому вводят трансфицированную, перепрограммированную и/или генетически отредактированную клетку. Примеры заболеваний, которые можно лечить при помощи терапевтических препаратов, являющихся объектами настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются этим болезнь Альцгеймера, повреждение спинного мозга, амиотрофический боковой склероз, кистозный фиброз, сердечную недостаточность, включая ишемическую и дилатационную кардиомиопатию, макулярную дегенерацию, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, диабет, серповидноклеточную анемию, талассемию, анемию Фанкони, пигментную ксеродерму, мышечную дистрофию, тяжёлый комбинированный иммунодефицит, радикулярную сенсорную наследственную невропатию, рак и ВИЧ/СПИД. В определенных вариантах реализации изобретения клетку получают от пациента, клетку перепрограммируют и смешивают с большим количеством жировых клеток, создавая, таким образом, косметическое средство, а косметическое средство вводят пациенту. В других вариантах реализации изобретения косметическое средство применяют для восстановления ткани.
Хотя приведенные в данном тексте детальные примеры описывают создание специфических типов клеток и создание терапевтических препаратов, содержащих специфические типы клеток, понятно, что способы согласно данному изобретению можно применять для того, чтобы создавать множество других типов клеток и терапевтических препаратов, содержащих одну или более из множества других типов клеток, например, путем перепрограммирования клеток согласно способам настоящего изобретения и культивирования клеток в условиях, которые повторяют один или более из аспектов получения, путем создания условий, которые схожи с условиями клеточной микросреды во время получения.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к библиотеке клеток, содержащей множество типов антигенов лейкоцитов человека (HLA - от англ. ʺhuman leukocyte antigenʺ) (ʺHLA-библиотекиʺ). HLA-библиотека может быть полезной, частично потому, что она может обеспечить быстрое создание и/или распространение терапевтических препаратов без ожидания пациентом создания терапевтического препарата из клетки пациента. Такая библиотека может быть частично полезной в лечении сердечной недостаточности и заболеваний крови и/или иммунной системы, так как возможность немедленного приобретения терапевтического препарата удобна для пациентов.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к клетке, которая используется для моделирования ткани/органа или для моделирования заболевания. В одном варианте реализации изобретения клетку кожи перепрограммируют и смешивают с большим количеством сердечных клеток, а сердечные клетки используют для скрининга биоактивных молекул на предмет кардиотоксичности (пример испытания на безвредность). В другом варианте реализации изобретения клетку кожи от пациента с болезнью Альцгеймера перепрограммируют и смешивают с большим количеством кортикальных нейронов, а кортикальные нейроны используют для скрининга биоактивных молекул на предмет снижения накопления нерастворимых бляшек (пример испытание на эффективность). Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, полезны для испытаний на безвредность и/или испытаний на эффективность.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к способу инкапсуляции клеток и/или высевания клеток на матрицу и к клеткам, которые инкапсулированы и/или высеяны на матрицу. В определенных ситуациях инкапсуляция клеток может быть выгодной, частично потому что инкапсулированные клетки могут оказаться менее иммуногенными, чем неинкапсулированные клетки. В одном варианте реализации изобретения клетку перепрограммируют в глюкозозависимую инсулин-продуцирующую клетку, глюкозозависимую инсулин-продуцирующую клетку инкапсулируют в веществе, таком как альгинат, а инкапсулированную глюкозозависимую инсулин-продуцирующую клетку вводят пациенту с диабетом 1 типа. В другом варианте реализации изобретения введение осуществляется путем внутрибрюшинной инъекции или интрапортальной инъекции. В определенных ситуациях высевание клеток на матрицу может быть выгодным, частично потому что матрица может обеспечить механическую устойчивость. В одном варианте реализации изобретения клетку перепрограммируют и смешивают с большим количеством фибробластов и кератиноцитов, фибробласты и кератиноциты высевают на матрицу, содержащую коллаген, а засеянную матрицу прикладывают к ране, формируя искусственный кожный трансплантат. В другом варианте реализации изобретения клетку перепрограммируют, перепрограммированную клетку смешивают с матрицей в жидкой форме или форме суспензии, смесь вводят пациенту, а плотность матрицы увеличивается во время или после введения.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к способу очищения клеток. Трансфекция, перепрограммирование и генное редактирование часто приводят к созданию клеточных популяций, которые содержат клетки с желательным фенотипом и клетки с одним или более нежелательными фенотипами. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к способу очищения трансфицированных, перепрограммированных и/или генетически отредактированных клеток. В одном варианте реализации изобретения клетки очищают, используя градиент плотности. В другом варианте реализации изобретения клетки очищают путем приведения клеток в контакт с одним или более антителами, которые делают возможным отделение клеток, имеющих один или более из желательных фенотипов, от клеток, имеющих один или более из нежелательных фенотипов. В другом варианте реализации изобретения антитело связано с субстратом, предпочтительно, с магнитным микроносителем. В другом варианте реализации изобретения антитело связано с флуоресцентной молекулой, а разделение проводят при помощи сортировки флуоресцентно-активированных клеток (СФАК) или подобных способов. В другом варианте реализации изобретения предупреждают пролиферацию клеток с нежелательным фенотипом путем приведения клеток в контакт с одной или более молекулами, которые препятствуют делению клеток, предпочтительно, с митомицином-с, 5-аза-деоксицитидином, фторурацилом либо их биологически активным аналогом или производным. Другие варианты реализации изобретения относятся к терапевтическому препарату, содержащему клетки, которые были очищены для того, чтобы увеличить долю клеток, имеющих один или более из желательных фенотипов.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к способу создания животных моделей, включая модели мутаций и заболеваний. В одном варианте реализации изобретения животную клетку кожи генетически редактируют и перепрограммируют в полипотентную стволовую клетку. В другом варианте реализации изобретения около 1-100 перепрограммированных и генетически отредактированных клеток вносят в бластоцисту, а бластоцисту имплантируют в рог матки животного. В одном варианте реализации изобретения животное выбрано из группы, включающей: кота, собаку, мышь, свинью, лошадь, корову, цыпленка, овцу, козу, рыбу, примата и крысу. В другом варианте реализации изобретения животное является крысой.
Определенные неканонические нуклеотиды при инкорпорации в синтетическую молекулу РНК могут снизить токсичность синтетических молекул РНК, частично путем препятствования связыванию белков, которые распознают экзогенные нуклеиновые кислоты, например, протеинкиназ R, Rig-1 и семейства белков олигоаденилат синтетазы. Неканонические нуклеотиды, о которых сообщалось, что они снижают токсичность синтетических молекул РНК при инкорпорации их в молекулы, включают: псевдоуридин, 5-метилуридин, 2-тиоуридин, 5-метилцитидин, N6-метиладенозин и их некоторые комбинации. При этом химические характеристики неканонических нуклеотидов, которые дают им возможность снижения токсичности синтетических молекул РНК, до сих пор остаются неизвестными. Более того, инкорпорация в больших количествах большинства неканонических нуклеотидов, например, 5-метилуридина, 2-тиоуридина, 5-метилцитидина и N6-метиладенозина, может снизить эффективность, с которой молекулы синтетической РНК могут быть транслированы в белок, что ограничивает полезность синтетических молекул РНК, содержащих эти нуклеотиды, в применениях, которые требуют экспрессии белка. Вдобавок, хотя в синтетических молекулах РНК уридин можно полностью заменить псевдоуридином без снижения эффективности, с которой молекулы синтетической РНК могут быть транслированы в белок, в определенных ситуациях, например, при проведении частых неоднократных трансфекций избыточную токсичность могут демонстрировать синтетические молекулы РНК, содержащие только аденозин, гуанозин, цитидин и псевдоуридин.
Недавно было обнаружено, что синтетические молекулы РНК, содержащие один или более неканонических нуклеотидов, которые содержат одну или более замен в 2С, и/или 4С, и/или 5С позициях в случае пиримидина или 6С, и/или 7N, и/или 8С позициях в случае пурина, могут быть менее токсичными, чем синтетические молекулы РНК, содержащие только канонические нуклеотиды, частично благодаря способности замен в этих позициях препятствовать распознаванию синтетических молекул РНК белками, которые распознают экзогенные нуклеиновые кислоты, и, более того, замены в этих позициях могут оказывать минимальное влияние на эффективность, с которой молекулы синтетической РНК могут быть транслированы в белок, частично благодаря небольшому влиянию замен в этих позициях на спаривание оснований и межплоскостное взаимодействие оснований.
Примеры неканонических нуклеотидов, которые содержат одну или более замен в 2С, и/или 4С, и/или 5С позициях в случае пиримидина или 6С, и/или 7N, и/или 8С позициях в случае пурина, включают, но не ограничиваются этим: 2-тиоуридин, 5-азауридин, псевдоуридин, 4-тиоуридин, 5-метилуридин, 5-аминоуридин, 5-гидроксиуридин, 5-метил- 5-азауридин, 5-амино-5-азауридин, 5-гидрокси-5-азауридин, 5-метилпсевдоуридин, 5- аминопсевдоуридин, 5-гидроксипсевдоуридин, 4-тио-5-азауридин, 4-тиопсевдоуридин, 4-тио-5-метилуридин, 4-тио-5-аминоуридин, 4-тио-5-гидроксиуридин, 4-тио-5-метил-5-азауридин, 4-тио-5-амино-5-азауридин, 4-тио-5-гидрокси-5-азауридин, 4-тио-5-метилпсевдоуридин, 4-тио-5-гидроксипсевдоуридин, 2-тиоцитидин, 5-азацитидин, псевдоизоцитидин, N4-метилцитидин, N4-аминоцитидин, N4-гидроксицитидин, 5-метилцитидин, 5-аминоцитидин, 5-гидроксицитидин, 5-метил-5-азацитидин, 5-амино-5-азацитидин, 5-гидрокси-5-азацитидин, 5-метилпсевдоизоцитидин, 5-гидроксипсевдоизоцитидин, N4-метил-5-азацитидин, N4-метилпсевдоизоцитидин, 2-тио-5-азацитидин, 2-тиопсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-метилцитидин, 2-тио-N4-аминоцитидин, 2-тио-N4-гидроксицитидин, 2-тио-5-метилцитидин, 2-тио-5-аминоцитидин, 2-тио-5-гидроксицитидин, 2-тио-5-метил-5-азацитидин, 2-тио-5-амино-5-азацитидин, 2-тио-5-гидрокси-5-азацитидин, 2-тио-5-метилпсевдоизоцитидин, 2-тио-5-аминопсевдоизоцитидин, 2-тио-5-гидроксипсевдоизоцитидин, 2-тио-N-метил-5-азацитидин, 2-тио-N4-метилпсевдоизоцитидин, N4-метил-5-метилцитидин, N4-метил-5-аминоцитидин, N4-метил-5-гидроксицитидин, N4-метил-5-метил-5-азацитидин, N4-метил-5-амино-5-азацитидин, N4-метил-5-гидрокси-5-азацитидин, N4-метил-5-метилпсевдоизоцитидин, N4-метил-5-аминопсевдоизоцитидин, N4-метил-5-гидроксипсевдоизоцитидин, N4-амино-5-азацитидин, N4-аминопсевдоизоцитидин, N4-амино-5-метилцитидин, N4-амино-5-аминоцитидин, N4-амино-5-гидроксицитидин, N4-амино-5-метил-5-азацитидин, N4-амино-5-амино-5-азацитидин, N4-амино-5-гидрокси-5-азацитидин, N4-амино-5-метилпсевдоизоцитидин, N4-амино-5-аминопсевдоизоцитидин, N4-амино-5-гидроксипсевдоизоцитидин, N4-гидрокси-5-азацитидин, N4-гидроксипсевдоизоцитидин, N4-гидрокси-5-метилцитидин, N4-гидрокси-5-аминоцитидин, N4-гидрокси-5-гидроксицитидин, N4-гидрокси-5-метил-5-азацитидин, N4-гидрокси-5-амино-5-азацитидин, N4-гидрокси-5-гидрокси-5-азацитидин, N4-гидрокси-5-метилпсевдоизоцитидин, N4-гидрокси-5-аминопсевдоизоцитидин, N4-гидрокси-5-гидроксипсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-метил-5-метилцитидин, 2-тио-N4-метил-5-аминоцитидин, 2-тио-N4-метил-5-гидроксицитидин, 2-тио-N4-метил-5-метил-5-азацитидин, 2-тио-N4-метил-5-амино-5-азацитидин, 2-тио-N4-метил-5-гидрокси-5-азацитидин, 2-тио-N4-метил-5-метилпсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-метил-5-аминопсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-метил-5-гидроксипсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-амино-5-азацитидин, 2-тио-N4-аминопсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-амино-5-метилцитидин, 2-тио-N4-амино-5-аминоцитидин, 2-тио-N4-амино-5-гидроксицитидин, 2-тио-N4-амино-5-метил-5-азацитидин, 2-тио-N4-амино-5-амино-5-азацитидин, 2-тио-N4-амино-5-гидрокси-5-азацитидин, 2-тио-N4-амино-5-метилпсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-амино-5-аминопсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-амино-5-гидроксипсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-гидрокси-5-азацитидин, 2-тио-N4-гидроксипсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-гидрокси-5-метилцитидин, 2-тио-N4-гидрокси-5-аминоцитидин, 2-тио-N4-гидрокси-5-гидроксицитидин, 2-тио-N4-гидрокси-5-метил-5-азацитидин, 2-тио-N-гидрокси-5-амино-5-азацитидин, 2-тио-N-гидрокси-5-гидрокси-5-азацитидин, 2-тио-N4-гидрокси-5-метилпсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-гидрокси-5-аминопсевдоизоцитидин, 2-тио-N4-гидрокси-5-гидроксипсевдоизоцитидин, N6-метиладенозин, N6-аминоаденозин, N6-гидроксиаденозин, 7-деазааденозин, 8-азааденозин, N6-метил-7-деазааденозин, N6-метил-8-азааденозин, 7-деаза-8-азааденозин, N6-метил-7-деаза-8-азааденозин, N6-амино-7-деазааденозин, N6-амино-8-азааденозин, N6-амино-7-деаза-8-азааденозин, N6-гидроксиаденозин, N6-гидрокси-7-деазааденозин, N6-гидрокси-8-азааденозин, N6-гидрокси-7-деаза-8-азааденозин, 6-тиогуанозин, 7-деазагуанозин, 8-азагуанозин, 6-тио-7-деазагуанозин, 6-тио-8-азагуанозин, 7-деаза-8-азагуанозин и 6-тио-7-деаза-8-азагуанозин. Стоит отметить, что для некоторых неканонических нуклеотидов существуют альтернативные схемы наименований. Например, в некоторых ситуациях 5-метилпсевдоуридин может обозначаться как ʺ3-метилпсевдоуридинʺ или ʺN3-метилпсевдоуридинʺ.
Нуклеотиды, которые содержат приставку ʺаминоʺ могут обозначать любой нуклеотид, который содержит атом азота, связанный с атомом в указанной позиции нуклеотида, например, 5-аминоцитидин может обозначаться как 5-аминоцитидин, 5-метиламиноцитидин и 5-нитроцитидин. Аналогично, нуклеотиды, которые содержат приставку ʺметилʺ могут обозначать любой нуклеотид, который содержит атом углерода, связанный с атомом в указанной позиции нуклеотида, например, 5-метилцитидин может обозначаться как 5-метилцитидин, 5-этилцитидин и 5-гидроксиметилцитидин, нуклеотиды, которые содержат приставку ʺтиоʺ могут обозначать любой нуклеотид, который содержит атом серы, связанный с атомом в данной позиции нуклеотида, а нуклеотиды, которые содержат приставку ʺгидроксиʺ могут обозначать любой нуклеотид, который содержит атом кислорода, связанный с атомом в данной позиции нуклеотида.
Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к молекуле синтетической РНК, содержащей один или более нуклеотидов, которые содержат одну или более замен в 2С, и/или 4С, и/или 5С позициях в случае пиримидина или 6С, и/или 7N, и/или 8С позициях в случае пурина. Другие варианты реализации изобретения относятся к терапевтическому препарату, при этом терапевтический препарат содержит одну или более синтетических молекул РНК, а одна или более из синтетических молекул РНК содержит один или более нуклеотидов, которые содержат одну или более замен в 2С, и/или 4С, и/или 5С позициях в случае пиримидина или 6С, и/или 7N, и/или 8С позициях в случае пурина. В одном варианте реализации изобретения терапевтический препарат содержит трансфекционный реагент. В другом варианте реализации изобретения трансфекционный реагент содержит катионный липид, липосому или мицеллу. В другом варианте реализации изобретения липосома или мицелла содержит фолат, а терапевтический состав обладает противораковой активностью. В другом варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов содержат по меньшей мере одно из следующих соединений: псевдоуридин, 2-тиоуридин, 4-тиоуридин, 5-азауридин, 5-гидроксиуридин, 5-метилуридин, 5-аминоуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-гидроксипсевдоуридин, 5-метилпсевдоуридин, 5-аминопсевдоуридин, псевдоизоцитидин, N4-метилцитидин, 2-тиоцитидин, 5-азацитидин, 5-гидроксицитидин, 5-аминоцитидин, 5-метилцитидин, N4-метилпсевдоизоцитидин, 2-тиопсевдоизоцитидин, 5-гидроксипсевдоизоцитидин, 5-аминопсевдоизоцитидин, 5-метилпсевдоизоцитидин, 7-деазааденозин, 7-деазагуанозин, 6-тиогуанозин и 6-тио-7-деазагуанозин. В другом варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов содержат по меньшей мере одно из следующих соединений: псевдоуридин, 2-тиоуридин, 4-тиоуридин, 5-азауридин, 5-гидроксиуридин, 5-метилуридин, 5-аминоуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-гидроксипсевдоуридин, 5-метилпсевдоуридин и 5-аминопсевдоуридин, и по меньшей мере одно из следующих соединений: псевдоизоцитидин, N4-метилцитидин, 2-тиоцитидин, 5-азацитидин, 5-гидроксицитидин, 5-аминоцитидин, 5-метилцитидин, N4-метилпсевдоизоцитидин, 2-тиопсевдоизоцитидин, 5-гйдроксипсевдоизоцитидин, 5-аминопсевдоизоцитидин и 5-метилпсевдоизоцитидин. В другом варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов содержат по меньшей мере одно из следующих соединений: псевдоуридин, 2-тиоуридин, 4-тиоуридин, 5-азауридин, 5-гидроксиуридин, 5-метилуридин, 5-аминоуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-гидроксипеевдоуридин и 5-метилпсевдоуридин, 5-аминопсевдоуридин, и по меньшей мере одно из следующих соединений: псевдоизоцитидин, N4-метилцитидин, 2-тиоцитидин, 5-азацитидин, 5-гидроксицитидин, 5-аминоцитидин, 5-метилцитидин, N4-метилпсевдоизоцитидин, 2-тиопсевдоизоцитидин, 5-гидроксипсевдоизоцитидин, 5-аминопсевдоизоцитидин и 5-метилпсевдоизоцитидин, и по меньшей мере одно из следующих соединений: 7-деазагуанозин, 6-тиогуанозин и 6-тио-7-деазагуанозин. В другом варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов включают: 5-метилцитидин и 7-деазагуанозин. В другом варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов также содержат псевдоуридин или 4-тиоуридин, или 5-метилуридин, или 5-аминоуридин, или 4-тиопсевдоуридин, или 5-метилпсевдоуридин, или 5-аминопсевдоуридин. В другом варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов также содержит 7-деазагуанозин. В другом варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов содержат: псевдоизоцитидин и 7-деазагуанозин, и 4-тиоуридин. В другом варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов содержат: псевдоизоцитидин или 7-деазагуанозин и псевдоуридин. В другом варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов содержат: 5-метилуридин и 5-метилцитидин, и 7-деазагуанозин. В дополнительном варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов содержат: псевдоуридин или 5-метилпсевдоуридин и 5-метилцитидин, и 7-деазагуанозин. В другом варианте реализации изобретения один или более нуклеотидов содержат: псевдоизоцитидин и 7-деазагуанозин, и псевдоуридин.
Определенные неканонические нуклеотиды могут быть включены в состав синтетических молекул РНК более эффективно, чем другие неканонические нуклеотиды, при помощи РНК полимераз, которые обычно применяют для in vitro транскрипции, частично благодаря свойству этих определенных неканонических нуклеотидов принимать участие в стандартных взаимодействиях спаривания оснований и межплоскостных взаимодействиях оснований, и взаимодействовать с РНК полимеразой способом, аналогичным тому, которым соответствующие канонические нуклеотиды взаимодействуют с РНК полимеразой. Следовательно, определенные смеси нуклеотидов, содержащие один или более неканонических нуклеотидов, могут являться целесообразными, частично потому, что при помощи реакций in vitro транскрипции с участием данных смесей нуклеотидов можно получить большое количество синтетической РНК. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к смеси нуклеотидов, содержащей один или более нуклеотидов, которые содержат одну или более замен в 2С, и/или 4С, и/или 5 С позициях в случае пиримидина или 6С, и/или 7N, и/или 8С позициях в случае пурина. Смеси нуклеотидов включают, но не ограничиваются этим (цифры перед каждым нуклеотидом указывают на приведенную в качестве примера долю трифосфата неканонического нуклеотида в реакции in vitro транскрипции, например, 0,2 псевдоизоцитидина относится к реакции с участием аденозин-5ʹ-трифосфата, гуанозин-5ʹ-трифосфата, уридин-5ʹ-трифосфата, цитидин-5ʹ-трифосфата и псевдоизоцитидин-5ʹ-трифосфата, в которой псевдоизоцитидин-5ʹ-трифосфат присутствует в реакции в количестве, приблизительно равном 0,2 части от общего количества, в котором в реакции присутствуют псевдоизоцитидин-5ʹ-трифосфат + цитидин-5ʹ-трифосфат, при этом количества рассчитаны на основе молярной массы или массы, а наличие более чем одной цифры перед нуклеозидом указывает на диапазон приведенных в качестве примера долей): 1,0 псевдоуридина, 0,1-0,8 2-тиоуридина, 0,1 0,8 5-метилуридина, 0,2-1,0 5-гидроксиуридина, 0,1-1,0 5-аминоуридина, 0,1-1,0 4-тиоуридина, 0,1-1,0 2-тиопсевдоуридина, 0,1-1,0 4-тиопсевдоуридИна, 0,1-1,0 5-гидроксипсевдоуридина, 0,2-1,5-метилпсевдоуридина, 0,1-1,0 5-аминопсевдоуридина, 0,2-1,0 2-тиоцитидина, 0,1-0,8 псевдоизоцитидина, 0,2-1,0 5-метилцитидина, 0,2-1,0 5-гидроксицитидина, 0,1-1,0 5-аминоцитидина, 0,2-1,0 N4-метилцитидина, 0,2-1,0 5-метилпсевдоизоцитидина, 0,2-1,0 5-гидроксипсевдоизоцитидина, 0,2-1,0 5-аминопсевдоизоцитидина, 0,2-1,0 N4-метилпсевдоизоцитидина, 0,2-1,0 2-тиопсевдоизоцитидина, 0,2-1,0 7-деазагуанозина, 0,2-1,0 6-тиогуанозина, 0,2-1,0 6-тио-7-деазагуанозина, 0,2-1,0 8-азагуанозина, 0,2-1,0 7-деаза-8-азагуанозина, 0,2-1,0 6-тио-8-азагуанозина, 0,1-0,5 7-деазааденозина и 0,1-0,5 N6-метиладенозина.
Недавно было обнаружено, что комбинирование определенных неканонических нуклеотидов может являться целесообразным, частично потому, что вклад неканонических нуклеотидов в снижение токсичности синтетических молекул РНК может быть кумулятивным. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к нуклеотидной смеси, при этом нуклеотидная смесь содержит более одного неканонического нуклеотида из вышеперечисленных, например, нуклеотидная смесь содержит как псевдоизоцитидин, так и 7-деазагуанозин, или нуклеотидная смесь содержит как N4- метилцитидин, так и 7-деазагуанозин, и т.д. В одном варианте реализации изобретения нуклеотидная смесь содержит более одного неканонического нуклеотида из вышеперечисленных, а доля каждого из неканонических нуклеотидов, присутствующих в смеси, составляет одно из вышеперечисленных значений, например, нуклеотидная смесь содержит 0,1-0,8 псевдоизоцитидина и 0,2-1,0 7-деазагуанозина или нуклеотидная смесь содержит 0,2-1,0 N4-метилпсевдоизоцитидина и 0,2-1,0 7-деазагуанозина и т.д.
В определенных ситуациях, например, когда может быть необязательным или нежелательным максимизировать выход реакции in vitro транскрипции, можно использовать доли нуклеотидов, отличные от вышеперечисленных. Приведенные в качестве примеров вышеперечисленные доли и диапазоны долей относятся к растворам нуклеотид-трифосфатов стандартной степени чистоты (более чем 90% чистоты). Большие доли этих и других нуклеотидов можно применять путем применения растворов нуклеотид-трифосфатов большей степени чистоты, например, более чем около 95% чистоты, или более чем около 98% чистоты, или более чем около 99% чистоты, более чем около 99,5% чистоты, которой можно достичь, например, путем очищения раствора нуклеотид-трифосфатов при помощи существующих методов химической очистки, таких как жидкостная хроматография при высоких давлениях (ЖХВД) или других способов. В одном варианте реализации изобретения нуклеотиды с множественными изомерами очищают для того, чтобы увеличить долю необходимого изомера.
Другие варианты реализации изобретения относятся к способу индукции экспрессии клеткой представляющего интерес белка путем приведения клетки в контакт с синтетической молекулой РНК, которая содержит один или более неканонических нуклеотидов, которые содержат одну или более замен в 2С, и/или 4С, и/или 5С позициях в случае пиримидина или 6С, и/или 7N, и/или 8С позициях в случае пурина. Другие варианты реализации изобретения относятся к способу трансфекции, перепрограммирования и генного редактирования клетки путем приведения клетки в контакт с синтетической молекулой РНК, которая содержит один или более неканонических нуклеотидов, которые содержат одну или более замен в 2С, и/или 4С, и/или 5С позициях в случае пиримидина или 6С, и/или 7N, и/или 8С позициях в случае пурина. В одном варианте реализации изобретения синтетическую молекулу РНК получают путем in vitro транскрипции. В другом варианте реализации изобретения один или более из перепрограммирующих факторов содержит белок Oct4. В другом варианте реализации изобретения клетку также приводят в контакт с синтетической молекулой РНК, которая кодирует белок Sox2. В другом варианте реализации изобретения клетку также приводят в контакт с синтетической молекулой РНК, которая кодирует белок Klf4. В другом варианте реализации изобретения клетку также приводят в контакт с синтетической молекулой РНК, которая кодирует белок с-Мус. В другом варианте реализации изобретения клетку также приводят в контакт с синтетической молекулой РНК, которая кодирует белок Lin28.
Ферменты, такие как Т7 РНК полимераза могут преимущественно инкорпорировать канонические нуклеотиды в реакции in vitro транскрипции с участием как канонических, так и неканонических нуклеотидов. Следовательно, реакция in vitro транскрипции с участием определенной доли неканонического нуклеотида может давать на выходе РНК, содержащую отличную, часто более низкую, долю неканонического нуклеотида, чем та доля, в которой неканонический нуклеотид присутствовал в реакции. В определенных вариантах реализации изобретения ссылки на доли инкорпорации нуклеотида (например, ʺсинтетическая молекула РНК, содержащая 50% псевдоизицитидинаʺ или ʺ0,1-0,8 псевдоизоцитидинаʺ), таким образом, могут относится как к молекулам РНК, содержащим указанную долю нуклеотида, и к молекулам РНК, синтезированным в реакции, содержащей указанную долю нуклеотида (или производного нуклеотида, например, нуклеотид-трифосфата), не смотря даже на то, что такая реакция может дать на выходе РНК, содержащую долю нуклеотида, отличную от доли, в которой неканонический нуклеотид присутствовал в реакции.
Разные нуклеотидные последовательности могут кодировать один и тот же белок, путем использования альтернативных кодонов. В определенных вариантах реализации изобретения ссылки на доли инкорпорации нуклеотида, таким образом, могут относится как к молекулам РНК, содержащим указанную долю нуклеотида, и к молекулам РНК, кодирующим тот же самый белок в качестве отличной молекулы РНК, при этом отличная молекула РНК содержит указанную долю нуклеотида.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к набору инструментов, содержащему один или более материалов, необходимых для осуществления настоящего изобретения на практике. В одном варианте реализации изобретения набор инструментов содержит синтетические молекулы РНК. В одном варианте реализации изобретения набор инструментов содержит синтетические молекулы РНК, которые кодируют один или более перепрограммирующих факторов и/или редактирующих гены белков. В другом варианте реализации изобретения синтетические молекулы РНК содержат один или более неканонических нуклеотидов, которые содержат одну или более замен в 2С, и/или 4С, и/или 5С позициях в случае пиримидина или 6С, и/или 7N, и/или 8С позициях в случае пурина. В другом варианте реализации изобретения набор инструментов содержит один или более следующих элементов: трансфекционную среду, трансфекционный реагент, среду для комплексирования и раствор для покрытия. В одном варианте реализации изобретения раствор для покрытия содержит фибронектин и/или витронектин, предпочтительно, рекомбинантный фибронектин и/или рекомбинантный витронектин. В одном варианте реализации изобретения один или более из компонентов набора инструментов присутствуют в виде множества аликвот. В одном варианте реализации изобретения набор инструментов содержит аликвоты комплексов трансфекционного реагента и нуклеиновой кислоты. В другом варианте реализации изобретения набор инструментов содержит аликвоты комплексов трансфекционного реагента и нуклеиновой кислоты, которые находятся в твердой форме, например, в виде замороженных или высушенных заморозкой таблеток. В другом варианте реализации изобретения набор инструментов содержит аликвоты среды, при этом каждая аликвота содержит комплексы трансфекционного реагента и нуклеиновой кислоты, которые стабилизированы либо путем химической обработки, либо путем заморозки.
Трансфекция в общем случае и перепрограммирование в частности могут представлять собой трудоемкие и требующие больших затрат времени методы, которые могут быть повторяемыми и предрасположенными к ошибке. При этом эти методы часто осуществляются вручную из-за недостатка автоматического оборудования для трансфекции. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к устройству, которое может трансфицировать, перепрограммировать и/или генетически редактировать клетки в автоматическом или полуавтоматическом режиме.
С учетом фигур от ФИГ. 9А до ФИГ. 11, определенные варианты реализации изобретения относятся к устройству (1), при помощи которого можно проводить трансфекцию клеток в многолуночных планшетах (2). В одном варианте реализации изобретения планшет помещают в лоток (3), который выдвигается из устройства. В другом варианте реализации изобретения в устройстве рассчитано на размещение нескольких планшетов (12). В другом варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления (4) для хранения среды при определенной температуре, предпочтительно, между 2°С и 6°С. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления (5) для хранения жидкости, отходов и/или клеток, удаленных их лунок. В другом варианте реализации изобретения устройство содержит соединение для подачи питания (6). В другом варианте реализации изобретения устройство содержит порт (33) для подключения к компьютеру (34). В одном варианте реализации изобретения порт является USB портом. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит вентилятор (7). В другом варианте реализации изобретения устройство содержит соединение для создания вакуума (8).
На жизнеспособность клеток может благоприятно влиять регулирование окружающих условий, в которых находятся клетки. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к устройству, содержащему приспособления для инкубации клеток при установленной или необходимой температуре. В одном варианте реализации изобретения клетки инкубируют при одной или более температурах, составляющих между 35С и 39С. В одном варианте реализации изобретения клетки инкубируют при температуре, составляющей около 37С. Другие варианты реализации изобретения относятся к устройству, содержащему приспособления для регулирования атмосферы, в которой инкубируют клетки. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для регулирования концентрации углекислого газа в атмосфере. В одном варианте реализации изобретения концентрация углекислого газа составляет между 3% и 7%, предпочтительно, около 5%. В другом варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для регулирования концентрации кислорода в атмосфере. В одном варианте реализации изобретения устройство регулирует концентрацию кислорода при помощи подачи азота. В другом варианте реализации изобретения концентрация кислорода составляет от около 3% до около 7%, например, около 5%. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для регулирования концентраций как кислорода, так и углекислого газа в атмосфере, в которой инкубируют клетки. В другом варианте реализации изобретения устройство содержит соединение для подачи углекислого газа (9). В другом варианте реализации изобретения устройство содержит соединение для подачи азота (10). В другом варианте реализации изобретения устройство содержит соединение для подачи кислорода (11).
Определенные варианты реализации изобретения относятся к устройству, содержащему приспособления для подачи комплексов из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента и/или среды (24). В одном варианте реализации изобретения устройство содержит одну или более пипеток с фронтальной загрузкой, которые могут подавать комплексы и/или среду. Примеры других приспособлений для подачи комплексов включают, но не ограничиваются этим: пипетку с задней загрузкой, перистальтический насос, микроструйное устройство, электрораспылительную форсунку, пьезоэлектрический эжектор и акустический капельный эжектор. Определенные варианты реализации изобретения относятся к устройству, содержащему приспособления для создания комплексов из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента (13). В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для комбинирования одного или более трансфекционных реагентов (14) и одной или более нуклеиновых кислот (15). В одном варианте реализации изобретения приспособления для комбинирования содержит одну или более пипеток с фронтальной загрузкой. Примеры других приспособлений, которые можно использовать для комбинирования включают, но не ограничиваются этим: пипетку с задней загрузкой, перистальтический насос, микроструйное устройство, электрораспылительную форсунку, пьезоэлектрический эжектор и акустический капельный эжектор. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит один или более съемных наконечников. В другом варианте реализации изобретения один или более съемных наконечников можно стерилизовать. В другом варианте реализации изобретения один или более съемных наконечников являются одноразовыми. В другом варианте реализации изобретения один или более съемных наконечников выполнены из пластика или стекла. В другом варианте реализации изобретения пластик является полипропиленом. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для инкубации одной или более нуклеиновых кислот с одним или более трансфекционными реагентами в одной или более средах для комплексирования (16). В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для хранения одной или более нуклеиновых кислот, одного или более трансфекционных реагентов и одной или более сред для комплексирования. В одном варианте реализации изобретения комплексирование происходит при комнатной температуре. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для нагревания среды перед приведением клетки в контакт со средой, например, до между около 20°С и около 39°С или до между около 30°С и около 39°С. В одном варианте реализации изобретения среду нагревают при помощи нагревательного элемента (25). В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для хранения и/или подачи нескольких культуральных сред.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к способу хранения комплексов из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента. В одном варианте реализации изобретения одну или более нуклеиновых кислот и один или более трансфекционных реагентов соединяют с одной или более средами для комплексирования и охлаждают для получения таблетки из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента. В одном варианте реализации изобретения охлаждение проводят путем приведения в контакт с жидким азотом. Другие способы охлаждения включают, но не ограничиваются этим, приведение в контакт с: охлаждающим элементом Пельтье, охлажденным жидким пропаном, охлажденным жидким этаном и охлажденной полированной металлической поверхностью. В одном варианте реализации изобретения данный способ является в значительной степени свободным от РНКазы. Определенные варианты реализации изобретения относятся к способу трансфицирования клеток с применением таблетки из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента. В одном варианте реализации изобретения таблетку нагревают перед тем, как добавить в трансфекционную среду. В одном варианте реализации изобретения таблетку нагревают путем помещения таблетки в небольшой объем теплой трансфекционной среды, которую затем приводят в контакт с клетками, предназначенными для трансфекции. В другом варианте реализации изобретения таблетку добавляют прямо в трансфекционную среду. Определенные варианты реализации изобретения относятся к устройству, при помощи которого можно осуществить трансфекцию с применением таблеток из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для хранения таблеток (17) в определенном диапазоне температур. В одном варианте реализации изобретения диапазон температур составляет между около -90°С и около 0°С, предпочтительно, между около -30°С и около -4°С. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для распределения таблеток. В одном варианте реализации изобретения таблетки распределяют при помощи плунжера (19). В другом варианте реализации изобретения таблетки распределяют при помощи вращающегося диска (20), в котором находится отверстие (21), через которое подаются таблетки. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для разогревания таблетки перед добавлением таблетки в трансфекционную среду. В одном варианте реализации изобретения таблетку разогревают, помещая таблетку в небольшой контейнер (22), содержащий теплую трансфекционную среду, которую затем приводят в контакт с трансфицируемыми клетками. В другом варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для подачи таблеток прямо в трансфекционную среду. В другом варианте реализации изобретения таблетки хранят в картридже (16). В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для смены картриджей (36).
Во время культивирования клеток может быль целесообразной замена, либо полная либо частичная, культуральной среды или дополнение культуральной среды добавочным количеством среды или другой добавки с целью добавить питательные вещества и/или уменьшить, удалить или инактивировать другим способом клеточные отходы или другие нежелательные компоненты, которые могут присутствовать в среде, включая остаточные комплексы. Определенные варианты реализации изобретения, следовательно, относятся к устройству, содержащему приспособления (23) для удаления, полного либо частичного, культуральной среды от клеток. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит аспиратор.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к устройству, содержащему приспособления для удаления крышки с луночного планшета. В одном варианте реализации изобретения устройство содержит приспособления для удаления крышки с луночного планшета (26) путем присасывания (27). Другие приспособления для удаления крышки с луночного планшета включают, но не ограничиваются этим: клейкий материал, шарнирный элемент (28), зажим, магнит и электромагнит. В определенных вариантах реализации изобретения устройство содержит приспособления для визуализации клеток (29). В одном варианте реализации изобретения плотность клеток определяют путем измерения оптической плотности емкости, в которой содержатся клетки. В другом варианте реализации изобретения плотность клеток определяют при помощи визуализации клеток.
Определенные варианты реализации изобретения относятся к устройству, которое применяют в рабочей комбинации с другим оборудованием, например, оборудованием для культивирования, визуализации или каких-либо других манипуляций с клетками. В одном варианте реализации изобретения устройство (1) загружают при помощи роботизированной руки (30). В другом варианте реализации изобретения роботизированную руку используют для помещения планшетов в и/или извлечения планшетов из инкубатора (31). В другом варианте реализации изобретения для визуализации клеток используют плоское устройство для визуализации (32). В другом варианте реализации изобретения устройством управляют через компьютер (34). В одном варианте реализации изобретения устройство используют для трансфекции, перепрограммирования и/или генного редактирования клеток.
Цель настоящего изобретения, следовательно, состоит в обеспечении продуктов для применения как в исследованиях, так и для терапевтического применения.
Детали данного изобретения изложены в прилагающемся ниже описании. Хотя способы и материалы, схожие либо одинаковые с теми, которые описаны в данном тексте, можно применять при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, ниже будут описаны иллюстративные способы и материалы. Другие отличительные признаки, объекты и преимущества данного изобретения станут понятны из описания и формулы изобретения. В описании изобретения и прилагающейся формуле изобретения формы единственного числа часто включают в себя множественное число, если другое четко не предусмотрено контекстом. Если не указано иное, все употребляемые в данном тексте технические и научные термины имеют те же значения, которые обычно подразумеваются специалистами в данной области техники, которым принадлежит данное изобретение.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 Синтез РНК
РНК, кодирующие человеческие белки Oct4, Sox2, Klf4, с-Мус-2 (Т58А) и Lin28 и содержащие различные комбинации канонических и неканонических нуклеотидов, синтезировали с ДНК матриц (Таблица 1). Образцы РНК анализировали при помощи электрофореза в арагозном геле для того, чтобы оценить качество РНК (ФИГ. 1). Затем РНК разводили до концентрации между 100 нг/мкЛ и 500 нг/мкЛ. Для определенных экспериментов добавляли ингибитор РНКазы (Superase-In™, Life Technologies Corporation) в концентрации 1 мкЛ/100 мкг РНК. Растворы РНК хранили при 4С. Для определенных экспериментов со смесями РНК, РНК, кодирующие Oct4, Sox2, Klf4, с-Мус-2 (Т58А) и Lin28 смешивали в мольном отношении 3:1:1:1:1.
ʺАʺ обозначает аденозин-5ʹ-трифосфат, ʺГʺ обозначает гуанозин-5ʹ-трифосфат, ʺУʺ обозначает уридин-5ʹ-трифосфат, ʺЦʺ обозначает цитидин-5'-трифосфат, ʺпсУʺ обозначает псевдоуридин-5ʹ-трифосфат, ʺ5мЦʺ обозначает 5-метилцитидин-5ʹ-трифосфат, ʺ2сУʺ обозначает 2-тиоуридин-5ʹ-трифосфат, ʺпсизоЦʺ обозначает псевдоизоцитидин-5ʹ-трифосфат, ʺ5мУʺ обозначает 5-метилуридин-5ʹ-трифосфат, ʺ7дАʺ обозначает 7-деазааденозин-5ʹ-трифосфат, ʺ7дГʺ обозначает 7-деазагуанозин-5ʹ-трифосфат и ʺN4mЦʺ обозначает N4-метилцитидин-5ʹ-трифосфат.
Пример 2 Приготовление трансфекционной среды
Состав среды разрабатывали таким образом, чтобы она способствовала эффективной трансфекции, перепрограммированию и генному редактированию клеток: DMEM/F12 + 10 мкг/мЛ инсулина + 5,5 мкг/мЛ трансферрина + 6,7 нг/мЛ селенита натрия + 20 нг/мЛ bFGF + 5 мг/мЛ обработанного человеческого сывороточного альбумина.
Также были разработаны варианты этой среды для того, чтобы обеспечить улучшенные показатели при применении определенных трансфекционных реагентов, определенных нуклеиновых кислот и определенных типов клеток: DMEM/F12 + 10 мкг/мЛ инсулина + 5,5 мкг/мЛ трансферрина + 6,7 нг/мЛ селенита натрия + 4,5 мкг/мЛ холестерина + 20 нг/мЛ bFGF + 5 мг/мЛ обработанного человеческого сывороточного альбумина, DMEM/F12 + 10 мкг/мЛ инсулина + 5,5 мкг/мЛ трансферрина + 6,7 нг/мЛ селенита натрия + 1 мкМ гидрокортизона + 20 нг/мЛ bFGF + 5 мг/мЛ обработанного человеческого сывороточного альбумина и DMEM/F12 + 10 мкг/мЛ инсулина + 5,5 мкг/мЛ трансферрина + 6,7 нг/мЛ селенита натрия + 4,5 мкг/мЛ холестерина +1 мкМ гидрокортизона + 20 нг/мЛ bFGF + 5 мг/мЛ обработанного человеческого сывороточного альбумина.
Примеры дополнительных компонентов, которые добавляли в клеточную культуральную среду в определенных экспериментах (перечисленные с приведенными в качеств примера концентрациями), включают: 15 мМ ГЭПЭС, 2 мМ L-аланил-L-глутамина, 2 мкг/мЛ этаноламина, 10 мкг/мЛ жирных кислот, 10 мкг/мЛ жирных кислот из рыбьего жира (метил эфиров), 25 мкг/мЛ полиоксиэтиленсорбитан моноолеата, 2 мкг/мЛ D-альфа-токоферол ацетата, 1-50 мкг/мЛ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат сесквимагний соль гидрата, 200 нг/мЛ B18R и 0,1% плюроника F-68.
Для определенных экспериментов, в которых среду кондиционировали, применяли следующий вариант:
DMEM/F12 + 15 мМ ГЭПЭС + 2 мМ L-аланил-L-глутамина + 10 мкг/мЛ инсулина + 5,5 мкг/мЛ трансферрина + 6,7 нг/мЛ селенита натрия + 2 мкг/мЛ этаноламина + 4,5 мкг/мЛ холестерина + 10 мкг/мЛ жирных кислот из рыбьего жира (метил эфиров) + 25 мкг/мЛ полиоксиэтиленсорбитан моноолеата + 2 мкг/мЛ D-альфа-токоферол ацетата + 1 мкг/мЛ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат сесквимагний соль гидрата + 0,1% плюроника F-68 + 20 нг/мЛ bFGF + 5 мг/мЛ обработанного человеческого сывороточного альбумина.
Для определенных экспериментов, в которых среду не кондиционировали, применяли следующий вариант:
DMEM/F12 + 15 мМ ГЭПЭС + 2 мМ L-аланил-L-глутамина + 10 мкг/мЛ инсулина + 5,5 мкг/мЛ трансферрина + 6,7 нг/мЛ селенита натрия + 2 мкг/мЛ этаноламина + 4,5 мкг/мЛ холестерина + 1 мкМ гидрокортизона + 0-25 мкг/мЛ полиоксиэтиленсорбитан моноолеата + 2 мкг/мЛ D-альфа-токоферол ацетата + 50 мкг/мЛ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат сесквимагний соль гидрата + 20 нг/мЛ bFGF + 5 мг/мЛ обработанного человеческого сывороточного альбумина.
Для приготовления этих вариантов обработанный человеческий сывороточный альбумин обрабатывали путем добавления 32 мМ октаноата натрия с последующим нагреванием при 60С на протяжении 4 ч, с последующей обработкой ионообменной смолой (AG501-X8(D)) на протяжении 6 ч при комнатной температуре, с последующей обработкой покрытым декстраном активированным древесным углем (С6241, Sigma-Aldrich Co. LLC.) на протяжении ночи при комнатной температуре, с последующими центрифугированием, фильтрацией, доведением до 10% раствора не содержащей нуклеазы водой, с последующим добавлением к другим компонентам среды. Для определенных экспериментов, в которых среду кондиционировали, среду кондиционировали на протяжении 24 ч на облученных фидерах их человеческих неонатальных фибробластов. Клетки высевали на покрытые фибронектином планшеты или покрытые фибронектином и витронектином планшеты, если не указано иное.
Состав среды может быть адаптирован к требованиям определенных типов культивируемых клеток. Более того, в определенных ситуациях, обработанный человеческий сывороточный альбумин можно заменить другим обработанным альбумином, например, обработанным бычьим сывороточным альбумином, вместо или дополнительно к L-аланил-L-глутамину можно использовать другие источники глутамина, например, L-глутамин, вместо или дополнительно к ГЭПЕС можно использовать другие буферные системы, например, фосфатные, бикарбонатные и т.д., вместо или дополнительно к селениту натрия селен может присутствовать в других формах, например, селенистой кислоты, вместо или дополнительно к L-аскорбиновой кислоте 2-фосфат сесквимагний соль гидрату и/или D-альфа-токоферол ацетату можно использовать другие антиоксиданты, например L-аскорбиновую кислоту, вместо или дополнительно к полиоксиэтиленсорбитан моноолеату и/или плюронику F-68 можно использовать другие поверхностно активные вещества, например, плюроник F-127, вместо или дополнительно к DMEM/F12 можно использовать другие базальные среды, например, MEM, DMEM и т.д., а компоненты культуральной среды можно менять со временем, например, путем применения среды TGF-β, начиная с 0-го дня до 5-го дня, затем применяя среду, содержащую 2 нг/мЛ TGF-β после 5-го дня. В некоторых ситуациях можно добавлять другие ингредиенты, например, жирные кислоты, лизофосфатидную кислоту, лизосфингомиелин, сфингозин-1-фосфат, другие сфинголипиды, представителей семейства белков TGF-β/NODAL, IL-6, представителей семейства белков Wnt и т.д. в подходящих концентрациях, а ингредиенты, для которых известно, что они стимулируют или подавляют рост определенных типов клеток, и/или агонисты, и/или антагонисты белков либо другие молекулы, для которых известно, что они стимулируют или подавляют рост определенных типов клеток, можно добавлять в среду в подходящих концентрациях при применении с этими типами клеток, например, сфингозин-1-фосфат и полипотентные стволовые клетки. Ингредиенты могут находиться в форме очищенных соединений, частей смесей с точно определенным составом, частей сложных смесей или смесей с неопределенным составом, например, животных и растительных масел, и могут быть добавлены при помощи биологических процессов, например, кондиционирования. Концентрации компонентов могут отличаться от перечисленных значений в границах диапазонов, которые очевидны для специалистов в данной области техники.
Пример 3 Трансфекция клеток синтетической РНК
Для трансфекции в 6-луночных планшетах 2 мкг РНК и 6 мкЛ трансфекционного реагента (Липофектамин™ RNAiMAX, Life Technologies Corporation) разводили сначала раздельно в среде для комплексирования (Опти-МЕМ®, Life Technologies Corporation) до общего объема, составляющего 60 мкЛ для каждого компонента. Затем разведенные РНК и трансфекционный реагент смешивали и инкубировали на протяжении 15 мин при комнатной температуре согласно инструкциям производителя трансфекционного реагента. Затем комплексы добавляли к клеткам в культуре. От 30 мкЛ до 240 мкЛ комплексов добавляли в каждую лунку 6-луночного планшета, в которых уже находилось по 2 мЛ трансфекционной среды. Затем планшеты аккуратно встряхивали для того, чтобы распределить комплексы по объему лунки. Клетки инкубировали вместе с комплексами от 2 ч до ночи перед тем, как сменить среду свежей трансфекционной средой (2 мЛ/лунку). Объемы устанавливали для трансфекции в 24-луночных и 96-луночных планшетах. Клетки фиксировали и окрашивали через 20-24 ч после трансфекции с использованием антитела к Oct4 (ФИГ. 2А). Ядра окрашивали и пересчитывали, чтобы определить относительную токсичность РНК (ФИГ. 2Б).
Пример 4 Анализ способности препаратов необработанного человеческого сывороточного альбумина способствовать трансфекции нуклеиновой кислоты и перепрограммированию РНК
Первичные человеческие неонатальные фибробласты культивировали в среде с или без 5 мг/мЛ ЧСА. Исследовали фракцию Кона V (А6784, Sigma-Aldrich Co. LLC.) и четыре различных препарата рекомбинантного ЧСА (А6608, А7736, А9731 и А9986, все от Sigma-Aldrich Co. LLC). Клетки трансфицировали согласно Примеру 3 РНК, синтезированной согласно Примеру 1. В то время как нетрансфицированные клетки хорошо росли в средах, содержащих любой из препаратов ЧСА, в трансфицированных лунках для каждого из препаратов ЧСА наблюдали существенные различия в морфологии клеток и плотности клеток, и ни один из препаратов не привел к морфологическим изменениям, которые указывали бы на перепрограммирование.
Пример 5 Получение человеческого сывороточного альбумина, обработанного октаноатом
10% раствор ЧСА предварительно инкубировали с 22 мМ хлорида натрия и 16 мМ октаноата натрия (Sigma-Aldrich Co. LLC), а затем инкубировали при 37С на протяжении 3 ч до образования конечной среды.
Пример 6 Обработка человеческого сывороточного альбумина при помощи ионообменной хроматографии
20% раствор рекомбинантного ЧСА, синтезированного в Pichia pastoris (А7736, Sigma-Aldrich Co. LLC), готовили путем растворения 2 г ЧСА в 10 мЛ не содержащей нуклеаз воды и аккуратного перемешивания при комнатной температуре. Затем раствор ЧСА деионизировали, добавляя сначала 1 г смешанной деионизирующей смолы (AG 501-X8(D), Bio-Rad Laboratories, Inc.), и встряхивая на протяжении 1 ч при комнатной температуре. Затем раствор ЧСА переливали в пробирку, содержащую 5 г свежей смолы, и встряхивали на протяжении 4 ч при комнатной температуре. В конце деионизированный раствор ЧСА переливали, доводили не содержащей нуклеаз водой до общего содержания белка в 10%, стерилизовали посредством фильтрации, используя 0,2 мкм мембранный фильтр из полиэфирсульфона, и хранили при 4С.
Пример 7 Анализ эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток, культивированных в среде, содержащей обработанный октаноатом человеческий сывороточный альбумин
Первичные человеческие неонатальные фибробласты культивировали в среде, содержащей рекомбинантный ЧСА, обработанный согласно Примеру 4, или обработанный ЧСА, полученный из крови (Bio-Pure HSA, Biological Industries). Клетки трансфицировали ежедневно согласно Примеру 3 РНК, синтезированной согласно Примеру 1, начиная с 0-го дня. Снимки делали на 3-й день. В лунках, содержащих октаноат, наблюдали несколько небольших участков, на которых клетки претерпевали морфологические изменения, схожие с мезенхимально-эпителиальным переходом, что указывает на повышенную эффективность трансфекции. Для образцов, содержащих обработанный ЧСА, полученный из крови, наблюдали много крупных участков морфологических изменений, схожих с мезенхимально-эпителиальным переходом. В обоих случаях морфологические изменения были характерны для перепрограммирования.
Пример 8 Перепрограммирование человеческих фибробластов с использованием среды, содержащей обработанный октаноатом человеческий сывороточный альбумин
Первичные человеческие неонатальные фибробласты высевали на 6-луночные планшеты при плотности в 5000 клеток/лунку в среду для фибробластов (DMEM + 10% фетальная бычья сыворотка). Через 6 ч среду меняли на трансфекционную среду, содержащую обработанный октаноатом ЧСА. Клетки трансфицировали ежедневно согласно Примеру 3 РНК, синтезированной согласно Примеру 1, начиная с 0-го дня. К 5-му дню лунка содержала несколько участков клеток, демонстрирующих морфологию, которая соответствует перепрограммированию. В этом эксперименте не использовали фидеры или иммунодепрессанты.
Пример 9 Анализ эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток, культивированных в среде, содержащей обработанный ионообменной смолой человеческий сывороточный альбумин
Первичные человеческие неонатальные фибробласты трансфицировали согласно Примеру 3 РНК, синтезированной согласно Примеру 1, начиная с 0-го дня. Снимки делали на 2-й день. Клетки в лунке, содержащей необработанный ЧСА демонстрировали низкую жизнеспособность по сравнению с лункой, содержащей обработанный ЧСА, полученный из крови, или обработанный ионообменной смолой ЧСА.
Пример 10 Перепрограммирование человеческих фибробластов с использованием обработанного ионообменной смолой человеческого сывороточного альбумина
Первичные человеческие неонатальные фибробласты высевали на 6-луночные планшеты при плотности в 10,000 клеток/лунку в среду для фибробластов (DMEM + 10% фетальная бычья сыворотка). Клетки трансфицировали ежедневно согласно Примеру 3 РНК, синтезированной согласно Примеру 1, начиная с 0-го дня. На 4-й день проводили пересев клеток с индексом разведения 1:20. Снимки делали на 10-й день. Лунка содержала много крупных колоний клеток, демонстрирующих морфологию, которая соответствует перепрограммированию. В лунках, в которых находилась клеточная культуральная среда, содержащая необработанный ЧСА, колоний не наблюдали.
Пример 11 Перепрограммирование человеческих фибробластов без использования фидеров или иммунодепрессантов
Первичные человеческие фибробласты высевали на 6-луночные планшеты при плотности в 20,000 клеток/лунку в среду для фибробластов (DMEM + 10% фетальная бычья сыворотка). Через 6 ч среду меняли на трансфекционную среду, содержащую обработанный ЧСА и не содержащую иммунодепрессантов, а клетки трансфицировали ежедневно согласно Примеру 3 РНК, синтезированной согласно Примеру 1, за исключением того, что дозу РНК уменьшили до 1 мкг/лунку, при этом было проведено всего 5 трансфекций. Снимки делали на 7-й день. К 5-му дню можно было видеть небольшие колонии клеток, демонстрирующих морфологию, которая соответствует перепрограммированию. На 7-й день среду меняли на DMEM/F12 + 20% Knockout™ Serum Replacement (Life Technologies Corporation) + 1X заменимых аминокислот + 2 мМ L-глутамина, кондиционировали на облученных мышиных эмбриональных фибробластах на протяжении 24 ч, а затем добавляли 20 нг/мЛ bFGF и 10 мкМ Y-27632. К 8-му дню можно было видеть крупные колонии с перепрограммированной морфологией. Колонии собирали на 10-й день и высевали в лунки, покрытые экстрактом базальной мембраны (Cultrex® Human ВМЕ Pathclear®, Trevigen Inc.) (ФИГ. 3А). Клетки быстро росли, их пересевали для того, чтобы получить стабильные линии. Стабильные линии демонстрировали положительное окрашивание в отношении маркеров полипотентных стволовых клеток Oct4 и SSEA4 (ФИГ. 3Б). После повторного проведения полного протокола действий наблюдали аналогичные результаты (ФИГ. 3В).
Пример 12 Эффективное быстрое получение и перепрограммирование клеток из биопсийного образца человеческой кожи
Полнослойным биопсийный образец брали при помощи дерматома у здорового 31 -летнего добровольца согласно утвержденному протоколу. Вкратце, участок кожи на левом плече обезболивали при помощи местного применения 2,5% лидокаина. Участок дезинфицировали 70% изопропанолом и проводили взятие полнослойного биопсийного образца кожи при помощи дерматома диаметром 1,5 мм (ФИГ. 4А). Ткань промывали в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСР) и помещали в 1,5 мЛ пробирку, содержащую 250 мкЛ TrypLE™ Select CTS™ (Life Technologies Corporation), и инкубировали при 37C на протяжении 30 мин. Затем ткань перемещали в 1,5 мЛ пробирку, содержащую 250 мкЛ DMEM/F12-CTS™ (Life Technologies Corporation) + 5 мг/мЛ коллагеназы, и инкубировали при 37С на протяжении 2 ч (ФИГ. 4Б). Эпидермис удаляли при помощи щипцов, а ткань механически разделяли. Клетки дважды промывали в DMEM/F12-CTS™ и высевали в покрытые фибронектином лунки 24-луночных и 96-луночных планшетов. Тому же добровольцу проводили флеботомию и собирали венозную кровь в пробирки Vacutainer® SST™ (Becton, Dickinson and Company). Сыворотку выделяли согласно протоколу производителя. Изогенную среду для высевания готовили путем смешивания DMEM/F12-CTS™ + 2 мМ L-аланил-L-глутамина (Sigma-Aldrich Co. LLC.) + 20% человеческой сыворотки. Клетки из образца кожной ткани высевали как в трансфекционную среду, так и в изогенную среду для высевания. Через 2 дня лунки промывали, а среду меняли на трансфекционную среду. Много клеток с морфологией фибробластов прикрепились и начали делиться на 2-й день (ФИГ. 4В). Клетки трансфицировали согласно Примеру 3 РНК, синтезированной согласно Примеру 1, начиная со 2-го дня, при этом все объемы были установлены так, чтобы соответствовать более маленьким лункам. К 5-му дню наблюдали участки клеток с морфологией, которая соответствует перепрограммированию.
Пример 13 Перепрограммирование человеческих фибробластов с использованием синтетической РНК, содержащей неканонические нуклеотиды
Первичные человеческие фибробласты высевали на 6-луночные планшеты, покрытые рекомбинантным человеческим фибронектином и рекомбинантным человеческим витронектином (каждый разводили в DMEM/F12 до концентрации 1 мкг/мЛ, 1 мЛ/лунку, и инкубировали при комнатной температуре на протяжении 1 ч) при плотности в 20,000 клеток/лунку в трансфекционную среду. На следующий день клетки трансфицировали как в Примере 3 РНК, синтезированной согласно Примеру 1, за исключением того, что доза РНК составляла 0,5 мкг/лунку в 1-й день, 0,5 мкг/лунку во 2-й день и 2 мкг/лунку на 3-й день. Снимки делали на 4-й день. На 4-й день можно было видеть небольшие колонии клеток, демонстрирующих морфологию, которая соответствует перепрограммированию.
Пример 14 Перепрограммирование человеческих фибробластов при помощи некондиционированной трансфекционной среды
Первичные человеческие фибробласты высевали на 6-луночные планшеты, покрытые рекомбинантным человеческим фибронектином и рекомбинантным человеческим витронектином (каждый разводили в DMEM/F12 до концентрации 1 мкг/мЛ, 1 мЛ/лунку, и инкубировали при комнатной температуре на протяжении 1 ч) при плотности в 20,000 клеток/лунку в трансфекционную среду. На следующий день клетки трансфицировали как в Примере 3 РНК, синтезированной согласно Примеру 1, за исключением того, что доза РНК составляла 0,5 мкг/лунку в 1-й день, 0,5 мкг/лунку во 2-й день и 2 мкг/лунку на 3-й день, 2 мкг/лунку на 4-й день и 4 мкг/лунку на 5-й день. К 5-му дню можно было видеть небольшие колонии клеток, демонстрирующих морфологию, которая соответствует перепрограммированию. На 7-й день среду меняли на DMEM/F12 + 20% Knockout™ Serum Replacement (Life Technologies Corporation) + 1X заменимых аминокислот + 2 мМ L-глутамина, кондиционировали на облученных мышиных эмбриональных фибробластах на протяжении 24 ч, а затем добавляли 20 нг/мЛ bFGF и 10 мкМ Y-27632. К 8-му дню можно было видеть крупные колонии с перепрограммированной морфологией. Колонии собирали на 10-й день и высевали в лунки, покрытые экстрактом базальной мембраны (Cultrex® Human ВМЕ Pathclear®, Trevigen Inc.). Клетки быстро росли, их пересевали для того, чтобы получить стабильные линии.
Пример 15 Получение глюкозозависимых инсулин-продуцирующих клеток
Клетки перепрограммировали согласно Примеру 11 или Примеру 12, а затем культивировали в DMEM/F12 + 0,2% ЧСА + 0,5Х N2 добавки + 0,5Х В27 добавки + 100 нг/мЛ активина А + 1 мкМ вортманнина на протяжении 4 дней, затем в 1:1 F12/IMDM + 0,5% ЧСА + 0,5% ITS добавки + 0,5Х В27 добавки + 2 мкМ ретиноевой кислоты + 20 нг/мЛ FGF7 + 50 нг/мЛ NOGGIN на протяжении 4 дней, затем в DMEM + 0,5% ЧСА + 1% ITS добавки + 1X N2 добавки + 50 нг/мЛ EGF на протяжении 5 дней, затем в DMEM/F12 + 1% ITS добавки + 10 нг/мЛ bFGF + 10 мМ никотинамида + 50 нг/мЛ эксендина-4 + 10 нг/мЛ ВМР4 на протяжении 7-9 дней для того, чтобы получить глюкозозависимые инсулин-продуцирующие клетки. В альтернативном варианте клетки перепрограммировали согласно Примеру 11 или Примеру 12, а затем культивировали в 1:1 F12/IMDM + 0,5% ЧСА + 0,5% ITS добавки + 0,5Х В27 добавки + 2 мкМ ретиноевой кислоты + 20 нг/мЛ FGF7 + 50 нг/мЛ NOGGIN на протяжении 4 дней, затем в DMEM + 0,5% ЧСА + 1% ITS добавки + 1X N2 добавки + 50 нг/мЛ EGF на протяжении 5 дней, затем в DMEM/F12 + 1% ITS добавки + 10 нг/мЛ bFGF + 10 мМ никотинамида + 50 нг/мЛ эксендина-4 + 10 нг/мЛ ВМР4 на протяжении 7-9 дней для того, чтобы получить глюкозозависимые инсулин-продуцирующие клетки без получения зрелых эндодермальных клеток. В альтернативном варианте клетки перепрограммировали согласно Примеру 11 или Примеру 12, а затем культивировали в 1:1 F12/IMDM + 0,5% ЧСА + 0,5% ITS добавки + 0,5Х В27 добавки + 2 мкМ ретиноевой кислоты + 20 нг/мЛ FGF7 + 50 нг/мЛ NOGGIN на протяжении 4 дней, затем в DMEM/F12 + 1% ITS добавки + 10 нг/мЛ bFGF + 10 мМ никотинамида + 50 нг/мЛ эксендина-4 + 10 нг/мЛ ВМР4 на протяжении 7-9 дней для того, чтобы получить глюкозозависимые инсулин-продуцирующие клетки без получения зрелых эндодермальных клеток и без роста клеток-предшественниц. Хотя эндодермальные клетки или инсулин-продуцирующие клетки можно отделить от других присутствующих в культуре клеток, при помощи данного способа получают достаточно высокое процентное содержание глюкозозависимых инсулин-продуцирующих клеток, поэтому в общем случае такое отделение не является необходимым. Полученные клетки затем можно использовать in vitro или in vivo для скрининга биоактивных молекул для исследования диабета или для разработки терапевтических препаратов от диабета.
Пример 16 Получение глюкозозависимых инсулин-продуцирующих клеток с использованием рекомбинантных белков
Клетки перепрограммировали согласно Примеру 11, а затем культивировали в DMEM/F12, 100 нг/мл активина А, 25 нг/мл Wnt3a, 0,01% рекомбинантном ЧСА, 1X ITSE на протяжении 1 дня, затем в DMEM/F12, 100 нг/мл активина А, 0,01% рекомбинантном ЧСА, 1X ITSE на протяжении 2 дней, затем в DMEM/F12, 50 нг/мл FGF10, 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 0,01% рекомбинантном ЧСА, 1X ITSE на протяжении 3 дней, затем в DMEM/F12, 1% В27, 2 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты, 50 нг/мл FGF10, 0,25 мкМ KAAD-циклопамина на протяжении 4 дней, затем в DMEM/F12, 1% В27, 1 мкМ ингибитора γ-секретазы DAPT, 50 нг/мл эксендина-4, 10 нМ бетацеллюлина, 10 мМ никотинамида на протяжении 2 дней, затем в DMEM/F12, 50 мг/Л аскорбиновой кислоты-2-фосфата, 1% В27, 1 мкМ ингибитора γ-секретазы DAPT, 50 нг/мл эксендина-4, 50 нг/мл IGF-1, 50 нг/мл HGF, 10 нМ бетацеллюлина, 10 мМ никотинамида на протяжении 6 дней для того, чтобы получить глюкозозависимые инсулин-продуцирующие клетки (ФИГ. 5А). Полученные клетки затем можно использовать in vitro или in vivo для скрининга биоактивных молекул для исследования диабета или для разработки терапевтических препаратов от диабета.
Пример 17 Индивидуальная заместительная клеточная терапия диабета I типа, включающая применение перепрограммированных клеток
Клетки кожи пациента перепрограммировали в глюкозозависимые инсулин-продуцирующие клетки согласно Примеру 12 и Примеру 14. Затем клетки ферментативным способом извлекали из емкости для культивирования и во внутрибрюшинное пространство или в воротную вену вводили от около 1×106 до около 1×107 клеток. В случае внутрибрюшинной инъекции клетки предварительно смешивали с белками внеклеточного матрикса, чтобы предотвратить избыточную миграцию. Клетки приживались и начинали вырабатывать инсулин. Отслеживали уровни инсулина/С-пептида и в случае необходимости проводили дополнительные инъекции.
Пример 18 Синтез РНК TALEN
РНК, кодирующую совпадающие по 20 п.о. TALEN, синтезировали с ДНК матрицы как в Примере 1 (ФИГ. 6А-В и ФИГ. 7) (Таблица 2). Полученные РНК анализировали при помощи электрофореза в арагозном геле для того, чтобы оценить качество РНК. Затем РНК разводили до 200 нг/мкЛ и добавляли ингибитор РНКазы (Superase-In™, Life Technologies Corporation) в концентрации 1 мкЛ/100 мкг РНК. Растворы РНК хранили при 4С. РНК, кодирующие каждую половину из пары TALEN смешивали в мольном отношении 1:1.
Пример 19 Синтез РНК TALEN, нацеленных на ген CCR5
РНК, кодирующую TALEN L1: TCATTTTCCATACAGTCAGT, L2: TTTTCCATACAGTCAGTATC, R1: TGACTATCTTTAATGTCTGG, и R2: TATCTTTAATGTCTGGAAAT синтезировали согласно Примеру 18. Эти TALEN нацелены на участки в 20 п.о. гена CCR5, находящиеся на смысловой (L1 и L2) или антисмысловой (R1 и R2) цепи. Готовили следующие пары TALEN: L1 и R1, L1 и R2, L2 и R1 и L2 и R2.
Пример 20 Генное редактирование гена CCR5 с использованием РНК TALEN и перепрограммирование человеческих фибробластов без ДНК, фидеров, иммунодепрессантов и кондиционирования
Первичные человеческие фибробласты высевали на 6-луночные планшеты, покрытые рекомбинантным человеческим фибронектином и рекомбинантным человеческим витронектином (каждый разводили в DMEM/F12 до концентрации 1 мкг/мЛ, 1 мЛ/лунку, и инкубировали при комнатной температуре на протяжении 1 ч) при плотности в 10,000 клеток/лунку в трансфекционную среду. На следующий день клетки трансфицировали как в Примере 3 РНК, за исключением того, что доза РНК составляла 0,5 мкг/лунку, а РНК синтезировали согласно Примеру 19. Начиная со следующего дня клетки перепрограммировали согласно Примеру 11. Как и в Примере 11 было видно крупные колонии клеток, демонстрирующих морфологию, которая соответствует перепрограммированию. Снимки делали на 9-й день (ФИГ. 8).
Пример 21 Трансфекция клеток РНК TALEN и матрицей для репарации ДНК
0,5 мкг РНК + 0,5 мкг ДНК, содержащей участок в 1001 п.о., простирающийся от 500 п.о. выше целевого месторасположения двухцепочечного разрыва до 500 п.о. ниже целевого месторасположения двухцепочечного разрыва, и 6 мкЛ трансфекционного реагента (Липофектамин™ 2000, Life Technologies Corporation) сначала разводили отдельно в среде для комплексирования (Опти-МЕМ®) до общего объема, составляющего около 60 мкЛ для каждого компонента. Затем разведенные РНК+ДНК и трансфекционный реагент смешивали и инкубировали на протяжении 15 мин при комнатной температуре согласно инструкциям производителя трансфекционного реагента. Затем комплексы добавляли к клеткам в культуре. От 60 мкЛ до 120 мкЛ комплексов добавляли в каждую лунку 6-луночного планшета, в которых уже находилось по 2 мЛ трансфекционной среды. Затем планшеты аккуратно встряхивали для того, чтобы распределить комплексы по объему лунки. Клетки инкубировали вместе с комплексами от 2 ч до ночи перед тем, как сменить среду свежей трансфекционной средой (2 мЛ/лунку).
Пример 22 Генное редактирование с использованием РНК TALEN и матрицы для репарации ДНК и перепрограммирование человеческих фибробластов без ДНК, фидеров, иммунодепрессантов и кондиционирования
Первичные человеческие фибробласты высевали на 6-луночные планшеты при плотности в 10,000 клеток/лунку в среду для фибробластов (DMEM + 10% фетальная бычья сыворотка). Через 6 ч среду меняли на трансфекционную среду, содержащую обработанный ЧСА и не содержащую иммунодепрессантов, а клетки трансфицировали согласно Примеру 21. Начиная со следующего дня клетки перепрограммировали согласно Примеру 11 или Примеру 12, за исключением того, что этапы первичного высевания и замены среды были опущены.
Пример 23 Получение гемопоэтических клеток
Клетки перепрограммировали согласно Примеру 11, а затем культивировали в IMDM + 0,5% ЧСА + 1x ITS добавки + 450 мкМ монотиоглицерола + 2 мМ L-глутамина + 1X заменимых аминокислот + 50 нг/мЛ ВМР4 + 50 нг/мЛ VEGF + 50 нг/мЛ bFGF на протяжении 6 дней для того, чтобы получить гемопоэтические клетки (ФИГ. 5Б). В альтернативном варианте клетки перепрограммировали согласно Примеру 11, или Примеру 12, или Примеру 20, или Примеру 22, а затем культивировали в IMDM + 0,5% ЧСА + 1x ITS добавки + 450 мкМ монотиоглицерола + 2 мМ L-глутамина + 1X заменимых аминокислот + 50 нг/мЛ ВМР4 + 50 нг/мЛ VEGF + 50 нг/мЛ bFGF на протяжении 6 дней, затем в IMDM + 0,5% ЧСА + 1x ITS добавки + 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола + 5 ед./мЛ гепарина + 10 нг/мЛ ТПО + 25 нг/мЛ ФСК + 25 нг/мЛ FLT3L + 10 нг/мЛ IL-3 + 10 нг/мЛ IL-6 на протяжении 8 дней для того, чтобы получить гемопоэтические клетки. В альтернативном варианте клетки перепрограммировали согласно Примеру 11, или Примеру 12, или Примеру 20, или Примеру 22, а затем повторно высевали в коллаген IV и культивировали в IMDM + 0,5% ЧСА + 1x ITS добавки + 450 мкМ монотиоглицерола + 2 мМ L-глутамина + 1X заменимых аминокислот + 50 нг/мЛ ВМР4 + 50 нг/мЛ VEGF + 50 нг/мЛ bFGF на протяжении 6 дней, затем в IMDM + 0,5% ЧСА + 1x ITS добавки + 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола + 5 ед./мЛ гепарина + 10 нг/мЛ ТПО + 25 нг/мЛ ФСК + 25 нг/мЛ FLT3L + 10 нг/мЛ IL-3 + 10 нг/мЛ IL-6 на протяжении 8 дней для того, чтобы получить гемопоэтические клетки. В альтернативном варианте клетки перепрограммировали согласно Примеру 11, или Примеру 12, или Примеру 20, или Примеру 22, а затем культивировали в 1:1 F12/IMDM + 0,5% ЧСА + 1x ITS добавки + 4,5 мкг/мЛ холестерина + 10 мкг/мЛ жирных кислот из рыбьего жира (метил эфиров) + 25 мкг/мЛ полиоксиэтиленсорбитан моноолеата + 2 мкг/мЛ D-α-токоферол ацетата + 450 мкМ монотиоглицерола + 2 мМ L-глутамина + 25 нг/мЛ ВМР4 + 25 нг/мЛ VEGF + 25 нг/мЛ bFGF + 20 нг/мЛ ФСК на протяжении 10 дней для того, чтобы получить гемопоэтические клетки.
Пример 24 Индивидуальная заместительная клеточная терапия заболевания крови, включающая применение перепрограммированных клеток
Клетки кожи пациента перепрограммировали в гемопоэтические клетки согласно Примеру 23. Затем клетки извлекали из емкости для культивирования, и за период времени, составляющий несколько часов, в главную вену вводили от около 1×106 до около 1×107 клеток/кг массы тела пациента.
Пример 25 Индивидуальная заместительная клеточная терапия ВИЧ/СПИД, включающая применение генетически отредактированных и перепрограммированных клеток
Клетки кожи пациента генетически редактировали и перепрограммировали в гемопоэтические клетки согласно Примеру 23. Затем клетки ферментативным способом извлекали из емкости для культивирования, и за период времени, составляющий несколько часов, в главную вену вводили от около 1×106 до около 1×107 клеток/кг массы тела пациента. Гемопоэтические клетки оседали в костномозговой полости и приживались. В альтернативном варианте клетки кожи пациента генетически редактировали и перепрограммировали в гемопоэтические клетки согласно Примеру 23, затем клетки ферментативным способом извлекали из емкости для культивирования, и выделяли клетки CD34+/CD90+/Lin- или CD34+/CD49f+/Lin-. Пациенту в главную вену вводили от около 1×103 до около 1×105 клеток. Гемопоэтические клетки оседали в костномозговой полости и приживались.
Пример 26 Модели сердечных заболеваний для скрининга биоактивных молекул
Клетки перепрограммировали согласно Примеру 11, а затем культивировали в DMEM/F12 + 0,2% ЧСА + 0,5Х N2 добавки + 0,5Х В27 добавки + 100 нг/мЛ активина А + 1 мкМ вортманнина на протяжении 4 дней, затем в 1:1 F12/IMDM + 0,5% ЧСА + 0,5% ITS добавки + 0,5Х В27 добавки + 2 мкМ ретиноевой кислоты + 20 нг/мЛ FGF7 + 50 нг/мЛ NOGGIN на протяжении 4 дней, затем в DMEM/F12 + 1% ITS добавки + 10 нг/мЛ bFGF + 10 мМ никотинамида + 50 нг/мЛ эксендина-4 + 10 нг/мЛ ВМР4 на протяжении 7-9 дней для того, чтобы получить сердечные клетки (ФИГ. 5В). В альтернативном варианте клетки перепрограммировали согласно Примеру 12. Хотя сердечные клетки можно отделить от других присутствующих в культуре клеток, при помощи данного способа получают достаточно высокое процентное содержание сердечных клеток, поэтому в общем случае такое отделение не является необходимым. Полученные клетки затем можно использовать in vitro или in vivo для скрининга биоактивных молекул для исследования сердечной недостаточности или для разработки терапевтических препаратов от сердечной недостаточности. Полученные клетки также можно использовать для исследования кардиотоксичности.
Пример 27 Индивидуальная заместительная клеточная терапия ишемической кардиомиопатии, включающая применение перепрограммированных клеток
Клетки кожи пациента перепрограммировали в сердечные клетки согласно Примеру 26. Затем клетки ферментативным способом извлекали из емкости для культивирования, и вводили от около 1×103 до около 1×107 клеток в перикард или от около 1×107 до около 1×105 клеток в одну или более коронарных артерий. Клетки приживались, а дополнительные инъекции проводили в случае необходимости.
Пример 28 Модели заболеваний сетчатки для скрининга биоактивных молекул
Клетки перепрограммировали согласно Примеру 11 или Примеру 12, а затем культивировали в DMEM/F12 + 0,2% ЧСА + 0,5Х N2 добавки + 0,5Х В27 добавки на протяжении 7 дней для того, чтобы получить ретинальные клетки. Полученные клетки затем можно использовать in vitro или in vivo для скрининга биоактивных молекул для исследования заболеваний сетчатки или для разработки терапевтических препаратов от заболеваний сетчатки.
Пример 29 Индивидуальная заместительная клеточная терапия макулярной дегенерации, включающая применение перепрограммированных клеток
Клетки кожи пациента перепрограммировали в ретинальные клетки согласно Примеру 28. Затем клетки ферментативным способом извлекали из емкости для культивирования, и вводили от около 1×104 до около 1×105 клеток в сетчатку или чуть ниже. Клетки приживались, а дополнительные инъекции проводили в случае необходимости.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Специалисты в данной области техники признают или смогут установить при помощи стандартных экспериментов существование многочисленных эквивалентных вариантов описанных в данном тексте отдельных вариантов реализации изобретения. Такие эквивалентные варианты включены в объем приведенной ниже формулы изобретения.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛОК
Все патентные заявки и публикации, перечисленные в тексте, в полном объеме включены в данный текст посредством ссылок.
Claims (31)
1. Способ перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, включающий:
(a) культивирование дифференцированной клетки в среде для перепрограммирования, содержащей альбумин, где альбумин обработан ионообменной смолой или древесным углем,
(b) трансфицирование клетки одной или более синтетических молекул РНК, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую один или более факторов перепрограммирования, и где указанное трансфицирование приводит к получению клетки, экспрессирующей один или более факторов перепрограммирования; и
(c) повторение стадии (b) по меньшей мере дважды в течение 5 последовательных дней с получением клетки, перепрограммированной в менее дифференцированное состояние.
2. Способ по п. 1, где альбумин был обработан октаноатом натрия.
3. Способ по п. 2, где альбумин нагрет до температуры, составляющей по меньшей мере 40°C.
4. Способ по п. 1, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую по меньшей мере один член группы: белок Oct4, белок Sox2, белок Klf4 и белок c-Myc.
5. Способ по п. 1, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок Oct4, по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок Sox2, по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок Klf4, и по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок c-Myc.
6. Способ по п. 1, дополнительно включающий приведение указанной клетки в контакт с по меньшей мере с одним членом группы: поли-L-лизин, поли-L-орнитин, RGD-пептид, фибронектин, витронектин, коллаген и ламинин.
7. Способ по п. 1, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере один член группы: остаток псевдоуридина и остаток 5-метилцитидина.
8. Способ по п. 1, где клетка представляет собой клетку кожи.
9. Способ по п. 1, где альбумин дополнительно обрабатывают октаноатом натрия и нагревают до температуры, составляющей по меньшей мере 40°C.
10. Способ по п. 9, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую по меньшей мере один член группы: белок Oct4, белок Sox2, белок Klf4 и белок c-Myc.
11. Способ по п. 9, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок Oct4, по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок Sox2, по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок Klf4, и по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок c-Myc.
12. Способ по п. 9, дополнительно включающий приведение указанной клетки в контакт по меньшей мере с одним членом группы: поли-L-лизин, поли-L-орнитин, RGD-пептид, фибронектин, витронектин, коллаген и ламинин.
13. Способ по п. 9, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере один член группы: остаток псевдоуридина и остаток 5-метилцитидина.
14. Способ по п. 9, где клетка представляет собой клетку кожи.
15. Среда для культивирования клеток для перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, содержащая: среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко: питательную среду F-12 (DMEM/F12), 10 мкг/мЛ инсулина, 5,5 мкг/мЛ трансферрина, 6,7 нг/мЛ селенита натрия, 20 нг/мЛ основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 5 мг/мЛ альбумина, где альбумин обработан ионообменной смолой и/или древесным углем.
16. Среда для культивирования клеток по п. 15, дополнительно включающая по меньшей мере одно из следующих: 15 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (ГЭПЭС), 2 мМ L-аланил-L-глутамин, 2 мкг/мЛ этаноламин, 4,5 мкг/мЛ холестерин, 25 мкг/мЛ полиоксиэтиленсорбитан моноолеат, 2 мкг/мЛ D-альфа-токоферол ацетат и 1 мкг/мЛ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат сесквимагний соль гидрата.
17. Среда для культивирования клеток по п. 15, где альбумин обработан октаноатом натрия.
18. Среда для культивирования клеток по п. 15, где альбумин нагрет до температуры, составляющей по меньшей мере 40°C.
19. Среда для культивирования клеток по п. 15, где альбумин является рекомбинантным.
20. Среда для культивирования клеток для перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, содержащая среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко: питательную среду F-12 (DMEM/F12), 10 мкг/мЛ инсулина, 5,5 мкг/мЛ трансферрина, 6,7 нг/мЛ селенита натрия, 20 нг/мЛ основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 5 мг/мЛ альбумина, где менее чем 0,65% сухого веса альбумина включает липиды и/или менее чем 0,35% сухого веса альбумина включает свободные жирные кислоты.
21. Среда для культивирования клеток по п. 20, дополнительно включающая по меньшей мере одно из следующих: 15 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (ГЭПЭС), 2 мМ L-аланил-L-глутамин, 2 мкг/мЛ этаноламин, 4,5 мкг/мЛ холестерин, 25 мкг/мЛ полиоксиэтиленсорбитан моноолеат, 2 мкг/мЛ D-альфа-токоферол ацетат и 1 мкг/мЛ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат сесквимагний соль гидрата.
22. Среда для культивирования клеток по п. 20, где альбумин является рекомбинантным.
23. Набор, включающий среду для культивирования клеток по п. 15 и одну или более синтетических молекул РНК.
24. Набор по п. 23, где альбумин является рекомбинантным.
25. Набор по п. 23, где указанные одна или более синтетических молекул РНК содержат по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую один или более факторов перепрограммирования.
26. Набор по п. 25, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую по меньшей мере один из: белка Oct4, белка Sox2, белка Klf4 и белка c-Myc.
27. Набор по п. 25, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок Oct4, по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок Sox2, по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок Klf4, и по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую белок c-Myc.
28. Набор по п. 25, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере один из остатка псевдоуридина и остатка 5-метилцитидина.
Applications Claiming Priority (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161566948P | 2011-12-05 | 2011-12-05 | |
US61/566,948 | 2011-12-05 | ||
US201161569595P | 2011-12-12 | 2011-12-12 | |
US61/569,595 | 2011-12-12 | ||
US201261637570P | 2012-04-24 | 2012-04-24 | |
US61/637,570 | 2012-04-24 | ||
US13/465,490 | 2012-05-07 | ||
US13/465,490 US8497124B2 (en) | 2011-12-05 | 2012-05-07 | Methods and products for reprogramming cells to a less differentiated state |
US201261664494P | 2012-06-26 | 2012-06-26 | |
US61/664,494 | 2012-06-26 | ||
PCT/US2012/067966 WO2013086008A1 (en) | 2011-12-05 | 2012-12-05 | Methods and products for transfecting cells |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017118312A Division RU2691027C2 (ru) | 2011-12-05 | 2012-12-05 | Способы и препараты для трансфекции клеток |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014127505A RU2014127505A (ru) | 2016-02-10 |
RU2624139C2 true RU2624139C2 (ru) | 2017-06-30 |
Family
ID=48574831
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014127505A RU2624139C2 (ru) | 2011-12-05 | 2012-12-05 | Способы и препараты для трансфекции клеток |
RU2017118312A RU2691027C2 (ru) | 2011-12-05 | 2012-12-05 | Способы и препараты для трансфекции клеток |
RU2018112719A RU2018112719A (ru) | 2011-12-05 | 2018-04-10 | Способы и препараты для трансфекции клеток |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017118312A RU2691027C2 (ru) | 2011-12-05 | 2012-12-05 | Способы и препараты для трансфекции клеток |
RU2018112719A RU2018112719A (ru) | 2011-12-05 | 2018-04-10 | Способы и препараты для трансфекции клеток |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (17) | US9422577B2 (ru) |
EP (3) | EP3260140B1 (ru) |
JP (2) | JP6073916B2 (ru) |
KR (4) | KR102320571B1 (ru) |
CN (2) | CN111893140A (ru) |
AU (7) | AU2012347919B2 (ru) |
BR (1) | BR112014013664A2 (ru) |
CA (2) | CA2858148C (ru) |
DK (1) | DK3260140T3 (ru) |
HK (4) | HK1202443A1 (ru) |
MX (4) | MX354995B (ru) |
RU (3) | RU2624139C2 (ru) |
WO (1) | WO2013086008A1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2746162C2 (ru) * | 2019-07-30 | 2021-04-08 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ трансфекции и культивирования клеток, синтезирующих рекомбинантный белок глутаматдекарбоксилазу |
RU2795065C1 (ru) * | 2022-07-01 | 2023-04-28 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Состав бессывороточной питательной среды для культивирования мезенхимных стволовых клеток свиньи |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012019168A2 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
CA2821992A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
WO2012122318A2 (en) * | 2011-03-07 | 2012-09-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for transfecting cells with nucleic acids |
DE12722942T1 (de) | 2011-03-31 | 2021-09-30 | Modernatx, Inc. | Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren |
US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
EP3492109B1 (en) | 2011-10-03 | 2020-03-04 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
RU2624139C2 (ru) | 2011-12-05 | 2017-06-30 | Фэктор Байосайенс Инк. | Способы и препараты для трансфекции клеток |
JP2015501844A (ja) | 2011-12-16 | 2015-01-19 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. | 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物 |
EP2833923A4 (en) | 2012-04-02 | 2016-02-24 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS |
US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
US9878056B2 (en) | 2012-04-02 | 2018-01-30 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
CN104718284A (zh) | 2012-05-25 | 2015-06-17 | 塞勒克提斯公司 | 工程化用于免疫疗法的异体和免疫抑制耐受性t细胞的方法 |
WO2014071219A1 (en) * | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Factor Bioscience Inc. | Methods and products for expressing proteins in cells |
LT2922554T (lt) | 2012-11-26 | 2022-06-27 | Modernatx, Inc. | Terminaliai modifikuota rnr |
WO2014130909A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compounds, compositions, methods, and kits relating to telomere extension |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
WO2015048744A2 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
EP3052521A1 (en) | 2013-10-03 | 2016-08-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
JP2017510542A (ja) * | 2014-01-31 | 2017-04-13 | ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド | 核酸生成及び送達のための方法及び製品 |
CA2957532A1 (en) * | 2014-08-07 | 2016-02-11 | Duke University | Compositions and methods for the reprogramming of cells into cardiomyocytes |
EP3219322A4 (en) * | 2014-11-14 | 2018-06-20 | JCR Pharmaceuticals CO., LTD. | Muscular dystrophy therapeutic agent containing pluripotent stem cells derived from dental pulp |
EP4406585A3 (en) * | 2015-02-13 | 2024-10-23 | Factor Bioscience Inc. | Nucleic acid products and methods of administration thereof |
CN107787363B (zh) | 2015-04-24 | 2021-06-25 | 哥本哈根大学 | 真正的胰腺祖细胞的分离 |
WO2017053729A1 (en) | 2015-09-25 | 2017-03-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof |
CA3011692A1 (en) * | 2015-11-23 | 2017-06-01 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods and compositions for reprogramming cells |
CA3033788A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | Factor Bioscience Inc. | Nucleic acid products and methods of administration thereof |
US20190352604A1 (en) * | 2017-02-24 | 2019-11-21 | Koji Tanabe | Nerve cell production method |
CN106967686B (zh) * | 2017-03-31 | 2019-11-08 | 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 | 软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨 |
CN108728903A (zh) * | 2017-04-21 | 2018-11-02 | 深圳市乐土精准医疗科技有限公司 | 基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法 |
DK3645719T3 (da) | 2017-06-30 | 2022-05-16 | Inscripta Inc | Automatiserede cellebehandlingsfremgangsmåder, moduler, instrumenter og systemer |
CN109280701A (zh) * | 2017-07-21 | 2019-01-29 | 深圳华大基因股份有限公司 | 用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及制备方法和应用 |
CN111372650A (zh) * | 2017-09-30 | 2020-07-03 | 因思科瑞普特公司 | 流通式电穿孔仪器 |
CA2983845C (en) | 2017-10-26 | 2024-01-30 | University Of Copenhagen | Generation of glucose-responsive beta cells |
CN108103027B (zh) * | 2018-02-02 | 2021-12-24 | 中国医学科学院血液病医院(血液学研究所) | 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法 |
US20210284958A1 (en) * | 2018-06-15 | 2021-09-16 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Culture medium for assisted reproductive technology |
US10501404B1 (en) | 2019-07-30 | 2019-12-10 | Factor Bioscience Inc. | Cationic lipids and transfection methods |
AU2020329166A1 (en) | 2019-08-09 | 2022-03-03 | Nutcracker Therapeutics, Inc. | Microfluidic apparatus and methods of use thereof |
WO2021231549A2 (en) * | 2020-05-12 | 2021-11-18 | Factor Bioscience Inc. | Engineered gene-editing proteins |
SE544701C2 (en) | 2020-12-17 | 2022-10-18 | Cellink Bioprinting Ab | A biodispensing or bioprinting system comprising an apparatus for handling a sample container having a lid |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA014166B1 (ru) * | 2005-12-13 | 2010-10-29 | Киото Юниверсити | Ядерный фактор перепрограммирования |
US20110143397A1 (en) * | 2005-08-23 | 2011-06-16 | Katalin Kariko | Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells |
RU2009148666A (ru) * | 2007-05-29 | 2011-07-10 | Кристофер Б. РЕЙД (US) | Способы получения и применения мультипотентных клеточных популяций |
Family Cites Families (116)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2705230A (en) * | 1949-09-23 | 1955-03-29 | Allen F Reid | Method of purifying albumin |
US3539465A (en) | 1968-10-08 | 1970-11-10 | Ncr Co | Encapsulation of hydrophilic liquid-in-oil emulsions |
FR2322871A1 (fr) * | 1975-09-08 | 1977-04-01 | New Zealand Inventions Dev | Procede d'isolement d'albumine |
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
AT403989B (de) * | 1996-09-16 | 1998-07-27 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines plasmaprotein-hältigen arzneimittels |
JP2001508302A (ja) | 1997-01-10 | 2001-06-26 | ライフ テクノロジーズ,インコーポレイテッド | 胚性幹細胞血清置換 |
GB9703554D0 (en) | 1997-02-20 | 1997-04-09 | Dow Corning | Polymerisation of cyclosiloxanes |
EP2292771A3 (en) | 1997-09-19 | 2011-07-27 | Life Technologies Corporation | Sense mRNA therapy |
GB9827085D0 (en) | 1998-12-09 | 1999-02-03 | Dow Corning | Polymerisation of siloxanes |
GB9827036D0 (en) | 1998-12-09 | 1999-02-03 | Dow Corning | Polymerisation of siloxanes |
GB9827069D0 (en) | 1998-12-09 | 1999-02-03 | Dow Corning | Polymerisation catalyst |
GB9902000D0 (en) * | 1999-01-30 | 1999-03-17 | Delta Biotechnology Ltd | Process |
US20110171185A1 (en) | 1999-06-30 | 2011-07-14 | Klimanskaya Irina V | Genetically intact induced pluripotent cells or transdifferentiated cells and methods for the production thereof |
AU9475001A (en) | 2000-09-26 | 2002-04-08 | Hybridon Inc | Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes |
WO2003018767A2 (en) | 2001-08-27 | 2003-03-06 | Advanced Cell Technology, Inc. | Trans-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies |
EP1437403A4 (en) | 2001-09-21 | 2004-10-27 | Japan Science & Tech Corp | METHOD FOR PATTERNING REPROGRAMMING FACTOR, METHOD OF PATTERNED REPROGRAMMING FACTOR, METHOD FOR USE OF REPROGRAMMING FACTOR, METHOD FOR DIFFERENTIATING AND SIFE-INGENATING FAN |
US20030138951A1 (en) | 2001-10-18 | 2003-07-24 | Li Yin | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
US7276489B2 (en) | 2002-10-24 | 2007-10-02 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends |
GB0202149D0 (en) | 2002-01-30 | 2002-03-20 | Univ Edinburgh | Pluripotency determining factors and uses thereof |
GB0202633D0 (en) * | 2002-02-05 | 2002-03-20 | Delta Biotechnology Ltd | Stabilization of protein preparations |
BRPI0410886A (pt) | 2003-06-03 | 2006-07-04 | Isis Pharmaceuticals Inc | composto de filamento duplo, composição farmacêutica, sal farmaceuticamente aceitável, métodos de modificação do ácido nucleico que codifica a survivina humana, de inibição da expressão da suvivina em células ou tecidos, e de tratamento de uma condição associada com a expressão ou superexpressão da suvivina, e, oligonucleotìdeo de rnai de filamento único |
US7682828B2 (en) | 2003-11-26 | 2010-03-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods for reprogramming somatic cells |
JP5420837B2 (ja) | 2004-09-08 | 2014-02-19 | ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 胚幹細胞の培地及び培養 |
KR20070058584A (ko) | 2004-09-08 | 2007-06-08 | 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 | 인간 배아 줄기 세포의 배양 |
JP2009502124A (ja) * | 2005-07-15 | 2009-01-29 | プライムジェン バイオテック エルエルシー | 生殖系列幹細胞の療法的再プログラミング |
SG10201508995QA (en) | 2005-07-26 | 2015-11-27 | Sangamo Biosciences Inc | Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences |
US8323666B2 (en) | 2005-08-01 | 2012-12-04 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin compositions |
SI3611266T1 (sl) | 2005-08-23 | 2023-02-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modificirani nukleozidi, ki vsebujejo RNA, in postopki za njihovo uporabo |
EP3354723B1 (en) | 2005-08-29 | 2023-12-13 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Media for culturing stem cells |
EP1762609B1 (en) * | 2005-09-13 | 2012-04-04 | Takara Bio Inc. | Serum-free medium for the production of retroviral vectors |
US8129187B2 (en) | 2005-12-13 | 2012-03-06 | Kyoto University | Somatic cell reprogramming by retroviral vectors encoding Oct3/4. Klf4, c-Myc and Sox2 |
US8278104B2 (en) | 2005-12-13 | 2012-10-02 | Kyoto University | Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2 |
KR20080078010A (ko) * | 2005-12-22 | 2008-08-26 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 옥타노에이트-감소된 사람 알부민 |
EP1987133A2 (en) | 2006-02-24 | 2008-11-05 | Reliance Life Sciences Pvt., Ltd. | Conjunctival tissue system |
US20090014055A1 (en) * | 2006-03-18 | 2009-01-15 | Solyndra, Inc. | Photovoltaic Modules Having a Filling Material |
JP2008077874A (ja) * | 2006-09-19 | 2008-04-03 | Shin Etsu Polymer Co Ltd | 色素増感型太陽電池 |
DE102006051516A1 (de) | 2006-10-31 | 2008-05-08 | Curevac Gmbh | (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins |
GB0623635D0 (en) | 2006-11-27 | 2007-01-03 | Stem Cell Sciences Uk Ltd | Pluripotent cell growth media |
US10829733B2 (en) | 2007-01-04 | 2020-11-10 | Biolamina Ab | Composition and method for enabling proliferation of pluripotent human stem cells |
JP2010515464A (ja) * | 2007-01-11 | 2010-05-13 | イエール・ユニバーシテイ | Hiv細胞表面受容体の標的化不活性化のための組成物および方法 |
US9249423B2 (en) | 2007-02-02 | 2016-02-02 | Yale University | Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA |
US8859229B2 (en) | 2007-02-02 | 2014-10-14 | Yale University | Transient transfection with RNA |
CA2684242C (en) | 2007-03-23 | 2019-11-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Somatic cell reprogramming |
EP2145000A4 (en) | 2007-04-07 | 2010-05-05 | Whitehead Biomedical Inst | REPROGRAMMING SOMATIC CELLS |
JP2008307007A (ja) | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Bayer Schering Pharma Ag | 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞 |
WO2009062157A1 (en) * | 2007-11-09 | 2009-05-14 | Michigan State University | Epigenetic modification of cell phenotype, fate and/or function by rna transfer |
AU2008286249B2 (en) | 2007-12-10 | 2013-10-10 | Kyoto University | Efficient method for nuclear reprogramming |
EP2072618A1 (en) * | 2007-12-14 | 2009-06-24 | Johannes Gutenberg-Universität Mainz | Use of RNA for reprogramming somatic cells |
KR101679082B1 (ko) | 2008-03-17 | 2016-11-23 | 더 스크립스 리서치 인스티튜트 | 유도 만능 줄기 세포 생성을 위한 화학적 및 유전적 조합 접근법 |
EP2265959B1 (en) | 2008-03-27 | 2014-03-05 | President and Fellows of Harvard College | Paper-based cellular arrays |
US20110045001A1 (en) | 2008-03-28 | 2011-02-24 | Biontex Laboratories Gmbh | Transfection results of non-viral gene delivery systems by influencing of the innate immune system |
JP5464443B2 (ja) * | 2008-03-31 | 2014-04-09 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 多能性幹細胞を増殖させる方法 |
CN101550406B (zh) * | 2008-04-03 | 2016-02-10 | 北京大学 | 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途 |
WO2009127230A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Curevac Gmbh | MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION |
JP2011160661A (ja) * | 2008-06-02 | 2011-08-25 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | 血球細胞の初期化法 |
JP2011522540A (ja) | 2008-06-04 | 2011-08-04 | セルラー ダイナミクス インターナショナル, インコーポレイテッド | 非ウイルスアプローチを用いたiPS細胞の産生のための方法 |
WO2009147400A1 (en) | 2008-06-05 | 2009-12-10 | Iti Scotland Limited | Stem cell culture media and methods |
WO2010008486A2 (en) | 2008-06-24 | 2010-01-21 | Parkinsons Institute | Pluripotent cell lines and methods of use thereof |
US20100184033A1 (en) | 2008-07-16 | 2010-07-22 | West Michael D | Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby |
US20110263015A1 (en) | 2008-08-20 | 2011-10-27 | Virxsys Corporation | Compositions and methods for generation of pluripotent stem cells |
US20100076057A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
CN105802917A (zh) | 2008-10-24 | 2016-07-27 | 威斯康星校友研究基金会 | 通过非病毒重编程获得的多潜能干细胞 |
EP2881461A1 (en) | 2008-11-21 | 2015-06-10 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Reprogramming cells toward a pluripotent state |
EP3156494B8 (en) * | 2008-12-04 | 2018-09-19 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Genome editing in rats using zinc-finger nucleases |
EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
WO2010093655A2 (en) | 2009-02-10 | 2010-08-19 | University Of Dayton | Enhanced method for producing stem-like cells from somatic cells |
US10894944B2 (en) * | 2009-04-10 | 2021-01-19 | Monash University | Cell culture media |
EP2421563B1 (en) | 2009-04-22 | 2017-04-12 | Massachusetts Institute of Technology | Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules |
US10837020B2 (en) | 2009-04-22 | 2020-11-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Innate immune suppression enables repeated delivery of long RNA molecules |
DK2421957T3 (da) | 2009-04-22 | 2021-01-25 | Viacyte Inc | Cellesammensætninger afledt af dedifferentierede omprogrammerede celler |
US8496941B2 (en) | 2009-06-03 | 2013-07-30 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Vectors for generating pluripotent stem cells and methods of producing pluripotent stem cells using the same |
JP2013500018A (ja) | 2009-07-24 | 2013-01-07 | シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | ゲノム編集のための方法 |
EP3581197A1 (de) | 2009-07-31 | 2019-12-18 | ethris GmbH | Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression |
JP5898086B2 (ja) | 2009-11-04 | 2016-04-06 | セルラー ダイナミクス インターナショナル, インコーポレイテッド | 化学物質を用いるエピソームリプログラミング |
AU2010319555A1 (en) | 2009-11-11 | 2012-06-14 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Method for generation and regulation of iPS cells and compositions thereof |
ES2779048T3 (es) * | 2009-11-12 | 2020-08-13 | Technion Res & Dev Foundation | Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en un estado indiferenciado |
SI3112467T1 (en) | 2009-12-07 | 2018-06-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells |
US20130189741A1 (en) | 2009-12-07 | 2013-07-25 | Cellscript, Inc. | Compositions and methods for reprogramming mammalian cells |
PL2816112T3 (pl) | 2009-12-10 | 2019-03-29 | Regents Of The University Of Minnesota | Modyfikacja DNA za pośrednictwem efektorów TAL |
US8557972B2 (en) | 2009-12-21 | 2013-10-15 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Compositions and methods for transfection of RNA and controlled stabilization of transfected RNA |
WO2011094738A1 (en) | 2010-02-01 | 2011-08-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enhanced efficiency of induced pluripotent stem cell generation |
WO2011110886A1 (en) | 2010-03-09 | 2011-09-15 | Biolamina Ab | Composition and method for enabling proliferation of pluripotent human stem cells |
WO2011130624A2 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Immune Disease Institute, Inc. | Sustained polypeptide expression from synthetic, modified rnas and uses thereof |
JP5896421B2 (ja) * | 2010-04-22 | 2016-03-30 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞から骨格筋または骨格筋前駆細胞への分化誘導法 |
US8771985B2 (en) * | 2010-04-26 | 2014-07-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing of a Rosa locus using zinc-finger nucleases |
CN102234627B (zh) * | 2010-04-30 | 2015-06-03 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种培养基添加剂及其应用 |
US9725695B2 (en) | 2010-05-05 | 2017-08-08 | The Regents Of The University Of California | Stem cell defined media for xeno-free and feeder free conditions and uses thereof |
US8048675B1 (en) | 2010-05-12 | 2011-11-01 | Ipierian, Inc. | Integration-free human induced pluripotent stem cells from blood |
WO2011141820A1 (en) | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Cellectis | Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from the dystrophin gene and uses thereof |
CA2798988C (en) | 2010-05-17 | 2020-03-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof |
EP2392208B1 (en) | 2010-06-07 | 2016-05-04 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Fusion proteins comprising a DNA-binding domain of a Tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use |
CA2807418C (en) | 2010-08-05 | 2017-04-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Simplified basic media for human pluripotent cell culture |
WO2012019168A2 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
US20140127814A1 (en) * | 2010-08-10 | 2014-05-08 | Srinivasan Chandrasegaran | Generation and use of pluripotent stem cells |
JP5794588B2 (ja) | 2010-09-14 | 2015-10-14 | 国立大学法人京都大学 | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 |
CA2821992A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
EP2625278A1 (en) | 2010-10-08 | 2013-08-14 | Regents of the University of Minnesota | A method to increase gene targeting frequency |
US9637732B2 (en) | 2010-11-04 | 2017-05-02 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
WO2012122318A2 (en) * | 2011-03-07 | 2012-09-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for transfecting cells with nucleic acids |
DE12722942T1 (de) | 2011-03-31 | 2021-09-30 | Modernatx, Inc. | Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren |
US10086043B2 (en) | 2011-04-03 | 2018-10-02 | The General Hospital Corporation | Efficient protein expression in vivo using modified RNA (MOD-RNA) |
WO2013003475A1 (en) | 2011-06-27 | 2013-01-03 | Cellscript, Inc. | Inhibition of innate immune response |
CA2841165A1 (en) * | 2011-07-11 | 2013-01-17 | Cellular Dynamics International, Inc. | Methods for cell reprogramming and genome engineering |
EP3492109B1 (en) | 2011-10-03 | 2020-03-04 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
RU2624139C2 (ru) | 2011-12-05 | 2017-06-30 | Фэктор Байосайенс Инк. | Способы и препараты для трансфекции клеток |
JP2015501844A (ja) | 2011-12-16 | 2015-01-19 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. | 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物 |
AU2012358384A1 (en) | 2011-12-21 | 2014-07-31 | Moderna Therapeutics, Inc. | Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant |
CA2862377A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Cellscript, Llc | Making and using in vitro-synthesized ssrna for introducing into mammalian cells to induce a biological or biochemical effect |
EP2833923A4 (en) | 2012-04-02 | 2016-02-24 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS |
EP2844738A4 (en) | 2012-04-24 | 2015-12-23 | Brigham & Womens Hospital | GENERATION OF NOVO OF PLURIPOTENT CELLS |
US10155929B2 (en) | 2012-05-13 | 2018-12-18 | Allele Biotechnology & Pharmaceuticals, Inc. | Feeder-free derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger RNA |
US10119150B2 (en) | 2012-05-13 | 2018-11-06 | Allele Biotechnology & Pharmaceuticals, Inc. | Feeder-free Derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger RNA |
ES2951822T3 (es) | 2012-05-13 | 2023-10-25 | Allele Biotechnology & Pharmaceuticals Inc | Derivación sin alimentadores de células madre pluripotentes inducidas humanas con ARN mensajero sintético |
WO2014130909A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compounds, compositions, methods, and kits relating to telomere extension |
KR20180031697A (ko) * | 2015-07-27 | 2018-03-28 | 킴벌리-클라크 월드와이드, 인크. | 신속한 항바이러스 효능을 갖는 소독제 조성물 |
-
2012
- 2012-12-05 RU RU2014127505A patent/RU2624139C2/ru active
- 2012-12-05 JP JP2014546024A patent/JP6073916B2/ja active Active
- 2012-12-05 KR KR1020207036814A patent/KR102320571B1/ko active IP Right Grant
- 2012-12-05 EP EP17170810.0A patent/EP3260140B1/en active Active
- 2012-12-05 KR KR1020247009226A patent/KR20240039237A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-12-05 CA CA2858148A patent/CA2858148C/en active Active
- 2012-12-05 EP EP20211670.3A patent/EP3835420A1/en active Pending
- 2012-12-05 AU AU2012347919A patent/AU2012347919B2/en active Active
- 2012-12-05 WO PCT/US2012/067966 patent/WO2013086008A1/en active Application Filing
- 2012-12-05 EP EP12813595.1A patent/EP2788033B1/en active Active
- 2012-12-05 KR KR1020217034975A patent/KR20210134808A/ko active Application Filing
- 2012-12-05 CA CA3188654A patent/CA3188654A1/en active Pending
- 2012-12-05 CN CN202010626574.5A patent/CN111893140A/zh active Pending
- 2012-12-05 MX MX2014006663A patent/MX354995B/es active IP Right Grant
- 2012-12-05 DK DK17170810.0T patent/DK3260140T3/da active
- 2012-12-05 CN CN201280068223.0A patent/CN104080482B/zh active Active
- 2012-12-05 RU RU2017118312A patent/RU2691027C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-12-05 BR BR112014013664-5A patent/BR112014013664A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-12-05 KR KR1020147018569A patent/KR102196339B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-06-04 MX MX2021000211A patent/MX2021000211A/es unknown
- 2014-06-04 MX MX2021000209A patent/MX2021000209A/es unknown
- 2014-06-04 US US14/296,220 patent/US9422577B2/en active Active
- 2014-06-04 MX MX2021000210A patent/MX2021000210A/es unknown
-
2015
- 2015-02-20 US US14/627,666 patent/US20150167019A1/en not_active Abandoned
- 2015-03-27 HK HK15103141.5A patent/HK1202443A1/xx unknown
-
2016
- 2016-07-11 US US15/207,167 patent/US9605277B2/en active Active
- 2016-07-19 HK HK16108558.9A patent/HK1220490A1/zh unknown
- 2016-07-28 US US15/222,453 patent/US9605278B2/en active Active
- 2016-09-02 HK HK16110474.6A patent/HK1222204A1/zh unknown
- 2016-09-02 HK HK16110473.7A patent/HK1222203A1/zh unknown
- 2016-10-31 JP JP2016213019A patent/JP6294944B2/ja active Active
- 2016-12-19 AU AU2016277545A patent/AU2016277545B2/en active Active
-
2017
- 2017-02-10 US US15/429,798 patent/US20170151285A1/en not_active Abandoned
- 2017-02-10 US US15/429,795 patent/US20170152483A1/en not_active Abandoned
- 2017-09-08 AU AU2017225124A patent/AU2017225124B2/en active Active
-
2018
- 2018-04-10 RU RU2018112719A patent/RU2018112719A/ru unknown
-
2019
- 2019-05-02 US US16/402,175 patent/US10472611B2/en active Active
- 2019-05-24 AU AU2019203662A patent/AU2019203662B2/en active Active
- 2019-09-11 US US16/567,059 patent/US11466293B2/en active Active
-
2020
- 2020-01-30 US US16/776,765 patent/US10662410B1/en active Active
- 2020-04-24 US US16/857,894 patent/US10829738B2/en active Active
- 2020-04-27 AU AU2020202780A patent/AU2020202780B2/en active Active
- 2020-05-07 US US16/869,232 patent/US10982229B2/en active Active
- 2020-06-26 US US16/913,315 patent/US11708586B2/en active Active
- 2020-06-26 US US16/913,306 patent/US11692203B2/en active Active
-
2022
- 2022-06-29 AU AU2022204659A patent/AU2022204659B2/en active Active
- 2022-08-05 US US17/817,966 patent/US20230033888A1/en active Pending
- 2022-08-22 US US17/821,298 patent/US20230242943A1/en active Pending
- 2022-08-31 AU AU2022224788A patent/AU2022224788B2/en active Active
-
2023
- 2023-06-09 US US18/332,621 patent/US20230323399A1/en active Pending
- 2023-06-09 US US18/332,620 patent/US20230304044A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110143397A1 (en) * | 2005-08-23 | 2011-06-16 | Katalin Kariko | Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells |
EA014166B1 (ru) * | 2005-12-13 | 2010-10-29 | Киото Юниверсити | Ядерный фактор перепрограммирования |
RU2009148666A (ru) * | 2007-05-29 | 2011-07-10 | Кристофер Б. РЕЙД (US) | Способы получения и применения мультипотентных клеточных популяций |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2746162C2 (ru) * | 2019-07-30 | 2021-04-08 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ трансфекции и культивирования клеток, синтезирующих рекомбинантный белок глутаматдекарбоксилазу |
RU2795065C1 (ru) * | 2022-07-01 | 2023-04-28 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Состав бессывороточной питательной среды для культивирования мезенхимных стволовых клеток свиньи |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2624139C2 (ru) | Способы и препараты для трансфекции клеток | |
BR122023004186B1 (pt) | Meios de cultura celular e kit |