KR20210134808A - 세포를 형질감염시키는 방법들 및 생성물들 - Google Patents

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KR20210134808A
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Abstract

본 발명은 인코딩된 단백질들을 인코딩하는 핵산들, 비-정규 뉴클레오티드들을 함유하는 핵산들, 핵산들을 포함하는 치료제들, 단백질들을 발현시키기 위하여 세포를 유도하는 방법들, 키트들 그리고 장치들, 세포를 형질감염, 유전자 에디팅, 재프로그래밍하기 위한 방법들, 키트들 그리고 장치들, 그리고 이런 방법들, 키트들, 및 장치들을 이용하여 생성된 세포들, 유기체들, 그리고 치료제들에 일부 관련된다. 단백질들을 발현시키기 위하여 세포들을 유도하는 방법들, 그리고 RNA를 이용하여 세포들을 재프로그래밍하고, 유전자-에디팅하는 방법들이 공개된다. 환자 시료로부터 세포를 만드는 방법들, 이들 방법들을 이용하여 생성된 세포들, 그리고 이들 방법을 이용하여 생성된 세포들을 포함하는 치료제들 또한 공개된다.

Description

세포를 형질감염시키는 방법들 및 생성물들{METHODS AND PRODUCTS FOR TRANSFECTING CELLS}
우선권
본 출원은 2011년 12월 5일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/566,948, 2011년 12월 12일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/569,595, 2012년 4월 24일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/637,570, 2012년 5월 7일자로 제출된 미국 출원 번호 13/465,490, 그리고 2012년 6월 26일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/664,494에 대하여 우선권을 주장하며, 이들의 전문은 명세서의 참고자료에 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 단백질들을 인코딩하는 핵산들, 비-정규(non-canonical) 뉴클레오티드들을 포함하는 핵산들, 핵산들을 포함하는 치료제들, 단백질들을 발현시키기 위하여 세포들을 유도하는 방법들, 키트들과 장치들, 형질감염, 세포의 유전자 에디팅(gene editing)과 재프로그래밍하는 방법들, 키트들과 장치들, 그리고 이들 방법들, 키트들과 장치들을 이용하여 만든 세포들, 유기체들, 및 치료제들에 일부 관계한다.
전자적으로 제출된 문서 파일의 설명
전자적으로 제출된 문서 파일은 전문이 참고자료에 편입된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 포펫 복사본 (화일명: FABI_001_01WO_SeqList_ST25.txt; 기록된 날짜: 2012년 12월 4일; 파일 크기: 18 KB).
핵산 형질감염(Nucleic-Acid Transfection)
핵산들은 하전된 지질들, 리피도이드(lipidoids), 펩티드들, 중합체들 또는 이의 혼합물들과 사전-복합됨으로써 생체내 그리고 시험관 모두에서 세포들로 운반될 수 있다. 이러한 형질감염 시약들은 상업적으로 이용가능하며, 그리고 배양물 안 세포들에게 핵산들을 운반하는데 광범위하게 이용된다. 형질감염 시약-핵산 복합물들에 노출된 세포들은 엔도사이토시스(endocytosis) 또는 다른 수단들에 의해 이들 복합물을 내화시킬 수 있다. 일단 세포 안에 들어가면, 이 핵산은 이의 의도된 생물학적 기능을 실행할 수 있다. 예를 들면, 단백질-인코딩된 RNA의 경우, 이 RNA는 세포의 리보좀들에 의해 단백질로 해독될 수 있다.
무혈청 배양
우태 혈청 (FBS)과 같은 동물 혈청은 세포-배양 배지에서 보충물로 흔히 이용되어 많은 유형의 세포들의 성장을 촉진시킨다. 그러나, 혈청의 확인되지 않은 성질로 인하여 이들 성분과 접촉된 세포들은 연구 및 치료 용도로 바람직하지 못하게 된다. 그 결과, 배취간(batch-to-batch) 가변성 및 혈청과 연합된 독성 및/또는 병원성 물질들의 오염 위험을 제거하기 위하여 무혈청 세포-배양 배지가 개발되었다.
혈청 안에서 가장 풍부한 단백질은 혈청 알부민이다. 혈청 알부민은 시험관 및 생체내에서 호르몬들, 지방산들, 칼슘 및 금속 이온들, 그리고 소분자 약물들을 포함한 다양한 분자들에 결합되고, 그리고 시험관 및 생체내 세포들에게 이들 분자를 운반할 수 있다. 혈청 알부민 (가장 흔하게는 소의 혈청 알부민 (BSA) 또는 인간 혈청 알부민 (HSA))은 무혈청 세포-배양 배지의 공통 성분이며, 여기에서 알부민은 1-10g/L의 농도에서 일반적으로 이용된다. 혈청 알부민은 에탄올 분별 ("Cohn" 공정)에 의해 혈장으로부터 통상적으로 준비된다. 혈청 알부민 ("Cohn Fraction V" 또는 간단하게 "Fraction V")을 함유하는 분획(fraction)이 단리되고, 추가 처리없이 일반적으로 이용된다. 따라서, 혈청 알부민의 표준 조제물(preparation)은 단백질 부분(혈청 알부민 폴리펩티드)과 연합된-분자 부분(이 혈청 알부민 폴리펩티드에 결합된 염들, 지방산들, 등등을 포함)을 포함한다. 혈청 알부민에 연합된-분자 성분의 조성은 일반적으로 복합물이며, 알려지지 않았다.
혈청 알부민은 특정 분화된 용도에 사용하기 위하여 처리될 수 있다(Barker A method for the deionization of bovine serum albumin. Tissue Culture Association. 1975; Droge 등 Biochem Pharmacol. 1982;31:3775-9; Ng 등 Nat Protoc. 2008;3:768-76; US 특허 출원 공개 번호 US 2010/0168000 참고, 이의 내용들은 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 이들 처리 공정은 혈청 알부민의 용액으로부터 글로불린 및 오염 바이러스들을 제거하는데 흔히 이용되며, 단-쇄 지방산, 옥탄산의 추가에 이어서 오염물질들의 열에 의한 비활성화/침전에 의해 혈청 알부민 폴리펩티드의 안정화를 대개 포함한다. 고도로 전문화된 줄기-세포-배양 용도의 경우, BSA 용액으로부터 과량의 염을 제거하기 위하여 이온-교환 수지를 사용하면 세포 생존능이 증가되는 것으로 나타났다(Ng 등 Nat Protoc. 2008;3:768-76; US 특허 출원 공개 번호 US 2010/0168000 참고, 이의 내용들은 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 그러나, 재조합 혈청 알부민은 이러한 처리에 의해 이익을 갖지 못하고, 심지어 동일한 민감한 줄기-세포 배양 용도에서도 이익을 갖지 못하여(Ng 등 Nat Protoc. 2008;3:768-76; US 특허 출원 공개 번호 US 2010/0168000 참고, 이의 내용들은 본 명세서의 참고자료에 편입된다), 이들 용도에서 탈이온화 효과는 알부민 용액으로부터 과량의 염을 제거하는 것이지만, 알부민에 연합된-분자 성분을 변경시키지 못한다는 것으로 설명된다. 또한, 인간 섬유아세포들과 같은 다른 세포 유형에서 이러한 처리 효과, 형질감염 효율에서 이러한 처리 효과 그리고 형질감염-연합된 독성은 이전에 조사되지 않았었다. 더욱이, 알부민-연합된 지질들은 인간 다능성(pluripotent) 줄기-세포 배양에 중요한 것으로 나타났고, 알부민으로부터 이 지질들의 제거는 비록 이 지질들이 세포-배양 배지에 별도로 추가되었을 때에도 인간 다능성 줄기 세포들의 자발적 분화를 야기하는 것으로 확인되었다(Garcia-Gonza10 등 P10S One. 2008;3:e1384, 이의 내용들은 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 따라서, 변형안된 연합된-분자 성분을 가진 알부민을 함유하는 세포-배양 배지는 인간 다능성 줄기 세포들의 배양에 중요한 것으로 간주된다. 중요한 것은, 지질 운반체들 이를 테면, 알부민에 연합된-분자 성분과 형질감염 효과 및 형질감염-연합된 독성 간에 상관관계는 이전에 연구되지 않았다.
세포 재프로그래밍(Cell Reprogramming)
세포들은 특정 세포밖 신호들에 노출됨으로써 및/또는 특정 단백질들, microRNAs, 등의 전위(ectopic) 발현에 의해 재프로그래밍화될 수 있다. 몇 가지 재프로그래밍 방법들이 이미 설명되었지만, 전위 발현에 의존하는 대부분은 외인성 DNA의 도입을 필요로 하고, 이는 돌연변이 위험을 가질 수 있다. 재프로그래밍 단백질들의 직접적인 운반에 기반을 둔 DNA-없는 재프로그래밍 방법들이 보고된 바 있지만, 이들 방법들은 상업적으로 사용하기에는 너무 비효율적이고, 신뢰성이 없다. 또한, RNA-기반 재프로그래밍 방법들도 설명되었지만, 기존 RNA-기반 재프로그래밍 방법들은 성인 세포들에서 실행될 때 느리고, 신뢰성이 없으며, 비효율적이며, 많은 형질감염을 요구하며(상당한 비용이 들고, 오류 가능성이 많으며), 오직 제한된 수의 세포 유형만을 재프로그래밍할 수 있고, 오직 제한된 수의 세포 유형만을 재프로그래밍할 수 있고, 면역억제제들의 사용을 요구하고, 그리고 혈액-유도된 HSA와 인간 섬유아세포 영양공급세포(feeders)를 포함하는 다중의 인간으로부터 유도된 성분들의 사용을 요구한다. 기존의 공개된 세포-재프로그래밍 방법들의 많은 단점들로 인하여 연구 및 치료 용도 모두에 이 방법들의 사용은 바람직하지 못하다.
유전자 에디팅(Gene Editing)
몇 가지 자연 발생적 단백질들은 특정 DNA 서열들, 예를 들면, 아연 핑거들 (ZFs) 및 전사 활성화물질-유사 효과물질들 (TALEs)을 포함하는 특정 DNA 서열들을 인지하는 DNA-결합 도메인들을 포함한다. 하나 이상의 DNA-결합 도메인들과 뉴클레아제의 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질들은 세포 안에서 DNA의 원하는 영역내 이중-가닥 브레이크(break)를 만드는데 이용될 수 있다. 세포의 DNA에 상동성인 하나 이상의 영역들을 포함하는 DNA 주형과 복합되었을 때, 유전자-에디팅 단백질들은 DNA 서열을 삽입하는데 이용되거나 또는 조절된 방식으로 세포의 DNA의 서열을 변경시키는데 이용될 수 있다. 그러나, 유전자 에디팅 세포들의 유전자 에디팅을 위한 대부분의 현행 방법들은 유전자-에디팅 단백질들을 발현시키기 위하여 DNA-기반 벡터들을 이용한다. 그 결과, 이들 유전자-에디팅 방법들은 비효과적이며, 제어안된 돌연변이생성의 위험을 안고 있어, 연구 및 치료 용도에 사용하는 것은 바람직하지 못하다. 체세포들의 DNA-없는 유전자 에디팅 방법들은 이전에 연구되지 않았으며, 체세포들의 동시 또는 순차적 유전자 에디팅 및 재프로그래밍을 위한 방법들도 연구되지 않았다. 끝으로, 항균, 항-바이러스, 또는 항-암 치료에서 유전자 에디팅의 사용은 이전에 조사된 적이 없었다
유기체 모델들
녹아웃(knockout) 렛은 아연-핑거 뉴클레아제 및 TALE-뉴클레아제들 (TALENs)를 인코딩하는 핵산들의 배 현미주사에 의해 만들어졌다. 아연-핑거 뉴클레아제들을 인코딩하는 핵산들을 배로 주사함으로써, 서열-특정 돌연변이들 (a.k.a. "knockins")을 도입하기 위한 유전자 에디팅이 마우스 및 렛에서 또한 보고되었다. 배의 줄기 세포들을 이용하여 유전적으로-변형된 렛들이 만들어졌고, 그리고 체세포 재프로그래밍에 의해 생식계통-컴피턴트 렛 다능성 줄기 세포들이 생성되었다. 그러나, 마우스 및 렛들을 포함하는 유전적으로-변형된 유기체들을 만들기 위한 유전자-에디팅된 재프로그래밍된 세포들은 이전에 연구된 적이 없었다.
세포들을 형질감염시키기 위한 개선된 방법들 및 생성물들이 이 분야에서 필요하다.
발명의 요약
따라서, 본 발명은 단백질들을 발현시키기 위하여 세포들을 유도하기 위한 시약들, 프로토콜들, 키트들, 그리고 장치들과 세포들을 형질감염, 재프로그래밍, 그리고 유전자-에디팅하기 위한 시약들, 프로토콜들, 키트들, 그리고 장치들을 제공한다. 기존의 보고된 방법들과는 달리, 본 발명의 특정 구체예들은 외인성 DNA 또는 이질유전적(al10geneic) 또는 동물로부터 유도된 재료들을 이 세포들에게 노출시키는 것이 포함되지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 3개 이상의 비-정규 뉴클레오티드들를 포함하는 합성 RNA 분자를 제공하는데, 이들 각 뉴클레오티드는 다음의 하나 이상의 치환체를 포함한다: 피리미딘 위치 2C, 피리미딘 위치 4C, 피리미딘 위치 5C, 퓨린 위치 6C, 퓨린 위치 7N, 및 퓨린 위치 8C. 일부 구체예들에서, 합성 RNA 분자는 시험관 전사에 의해 만들어진다. 다른 구체예들에서, 합성 RNA 분자는 5'-캡, 5'-캡 1 구조, 및 3'-폴리(A) 꼬리 중 적어도 하나를 더 포함한다. 다른 구체예들에서, 비-정규 뉴클레오티드들 중 적어도 2개는 피리미딘이다. 여전히 다른 구체예들에서, 비-정규 뉴클레오티드들은 슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-아자우리딘, 5-히드록시우리딘, 5-아미노우리딘, 5-메틸우리딘, 2-티오슈도우리딘, 4-티오슈도우리딘, 5-히드록시슈도우리딘, 5-메틸슈도우리딘, 5-아미노슈도우리딘, 슈도이소시티딘, 5-메틸시티딘, N4-메틸시티딘, 2-티오시티딘, 5-아자시티딘, 5 -히드록시 시티딘, 5-아미노시티딘, N4-메틸슈도이소시티딘, 2-티오슈도이소시티딘, 5-히드록시슈도이소시티딘, 5-아미노슈도이소시티딘, 5-메틸슈도이소시티딘, N6-메틸아데노신, 7-데아자아데노신, 6-티오구아노신, 7-데아자구아노신, 8-아자구아노신, 6-티오-7-데아자구아노신, 6-티오-8-아자구아노신, 7-데아자-8-아자구아노신, 및 6-티오-7-데아자-8-아자구아노신 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 구체예들에서, 비-정규 뉴클레오티드들의 적어도 2개는 각각 합성 RNA 분자의 20% 미만을 포함한다. 여전히 다른 구체예들에서, 비-정규 뉴클레오티드들는 슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-아자우리딘, 5-히드록시우리딘, 5-아미노우리딘, 5-메틸우리딘, 2-티오슈도우리딘, 4-티오슈도우리딘, 5-히드록시슈도우리딘, 5-메틸슈도우리딘, 및 5-아미노슈도우리딘 중 적어도 하나와, 슈도이소시티딘, 5-메틸시티딘, N4-메틸시티딘, 2-티오시티딘, 5-아자시티딘, 5-히드록시시티딘, 5-아미노시티딘, N4-메틸슈도이소시티딘, 2-티오슈도이소시티딘, 5-히드록시슈도이소시티딘, 5-아미노슈도이소시티딘, 및 5-메틸슈도이소시티딘 중 적어도 하나를 포함한다. 추가 구체예에서, 비-정규 뉴클레오티드들은 N6-메틸아데노신, 7-데아자아데노신, 6-티오구아노신, 7-데아자구아노신, 8-아자구아노신, 6-티오-7-데아자구아노신, 6-티오-8-아자구아노신, 7-데아자-8-아자구아노신, 및 6-티오-7-데아자-8-아자구아노신 중 적어도 하나를 더 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비-정규 뉴클레오티드를 포함하고, 유전자-에디팅 단백질을 인코딩하는 합성 RNA 분자를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 합성 RNA 분자를 포함하는 치료 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유전자-에디팅 단백질을 인코딩하는 합성 RNA 분자와 형질감염 시약을 포함하는 치료 조성물을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 세포에 본 명세서에서 설명된 합성 RNA 분자를 접촉시키는 것을 포함하는, 핵산으로 세포를 형질감염시키는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 관심 단백질을 발현시키기 위하여 포유류 세포를 유도하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 명세서에서 설명된 합성 RNA 분자들을 이 세포에 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 합성 RNA 분자들을 이 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 세포를 재프로그래밍하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 합성 RNA 분자들을 이 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 세포를 유전자-에디팅하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포를 핵산으로 형질감염시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: 세포를 히드로코르티손 및/또는 알부민을 함유하는 배지에 접촉시키는 단계로서, 상기 알부민은 이온-교환 수지 또는 목탄으로 처리되는 단계, 및 이 세포에 이 핵산을 접촉시킨다. 한 구체예에서, 알부민은 단-쇄 지방산으로 처리되거나, 및/또는 적어도 40℃의 온도에 가져간다. 한 구체예에서. 다른 구체예들에서, 이 방법은 이 세포에 형질감염 시약을 접촉시키는 것을 더 포함한다. 다른 구체예들에서, 이 세포는 포유류 세포이며, 포유류 세포는 관심 단백질을 발현시키도록 유도된다. 다른 구체예들에서, 이 방법은 5일 연속 이 세포에 이 핵산을 적어도 2회 접촉시키는 것을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 핵산은 재프로그래밍 단백질을 인코딩한다. 다른 구체예들에서, 이 세포는 재프로그래밍화된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 피부 세포이고, 그리고 피부 세포들, 다능성 줄기 세포들, 포도당-반응성 인슐린-생산 세포들, 조혈 세포들, 심장 세포들, 그리고 망막 세포들 중 적어도 하나의 세포 성장을 지원하는 조건하에 피부 세포를 배양하는 것을 더 포함하고, 이때 피부 세포는 피부 세포, 다능성 줄기 세포, 포도당-반응성 인슐린-생산 세포, 조혈 세포, 심장 세포, 및 망막 세포로부터 선택된 세포로 재프로그래밍화된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 핵산은 Oct4 단백질을 인코딩한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 방법은 Sox2 단백질, Klf4 단백질, 및 c-Myc 단백질 중 적어도 하나를 인코딩하는 핵산을 세포에 접촉시키는 것을 더 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 방법은 Sox2 단백질, Klf4 단백질, 및 c-Myc 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 세포에 접촉시키는 것을 더 포함한다. 여전히 다른 구체예들에서, 이 핵산은 유전자-에디팅 단백질을 인코딩한다. 여전히 다른 구체예들에서, 이 핵산은 단독으로 작용하거나 또는 하나 이상의 다른 분자들과 조합되어, 작용하는 단백질을 인코딩하고, DNA 분자 안에 단일-가닥 또는 이중-가닥 브레이크를 만든다. 다양한 구체예들에서, 이 세포는 유전자-에디팅된다. 일부 구체예들에서, 단일-가닥 또는 이중-가닥 브레이크는 CCR5, CXCR4, GAD1, GAD2, CFTR, HBA1, HBA2, HBB, HBD, FANCA, XPA, XPB, XPC, ERCC2, POLH, HTT, DMD, SOD1, APOE, APP, LRRK2, PRNP, BRCA1, 및 BRCA2 또는 이의 유사체, 이의 변이체 또는 이의 패밀리-구성원으로부터 선택된 유전자의 전사 개시 부위의 약 5,000,000개 염기 안에 있다. 일부 구체예들에서, 이 방법은 이 세포에 폴리-L-리신, 폴리-L-오르니틴, RGD 펩티드, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 및 라미닌, 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 이의 기능적 변이체 또는 이의 패밀리-구성원 중 적어도 하나를 접촉시키는 것을 더 포함한다. 여전히 다른 구체예들에서, 이 핵산은 슈도우리딘, 5-메틸슈도우리딘, 및 5-메틸시티딘 중 적어도 하나를 함유하는 합성 RNA 분자다. 일부 구체예들에서, 이 방법은 이 세포에 분화 인자를 접촉시키고 및/또는 환자로부터 이 세포를 거둬들이고 및/또는 이 세포를 환자에게 전달하는 것을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 알부민을 포함하는 배지를 제공하며, 이때 알부민은 재조합된 것이며, 이온-교환 수지 또는 목탄으로 처리된다. 또 다른 구체예에서, 이 배지는 완충된 염 용액과 아미노산들 및/또는 하나 이상의 인슐린, 트란스패린, 그리고 셀레늄 및/또는 콜레스테롤 및/또는 스테로이드 (가령, 예를 들면, 히드로코르티손) 및/또는 면역억제제(가령, 예를 들면, B18R)를 더 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 히드로코르티손 및/또는 알부민 그리고 합성 RNA 분자를 포함하는 키트를 제공하는데, 이때 알부민은 이온-교환 수지 또는 목탄으로 처리된다. 한 구체예에서, 합성 RNA 분자는 Oct4 단백질, Sox2 단백질, Klf4 단백질, c-Myc 단백질, Nanog 단백질, Lin28 단백질, 그리고 Utfl 단백질 중 적어도 하나를 인코딩한다. 또 다른 구체예에서, 이 키트는 본 명세서에서 설명된 형질감염 시약 및/또는 합성 RNA 분자들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 키트는 재프로그래밍용 키트 및/또는 유전자-에디팅용 키트다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산과 형질감염 시약을 포함하는 핵산 형질감염-시약 복합물을 제공하고, 이때 이 핵산 형질감염-시약 복합물은 냉각에 의해 응고된다. 일부 구체예들에서, 이 핵산 형질감염-시약 복합물은 이 핵산 형질감염-시약 복합물에 액체 및/또는 증기 상태에서 액화 질소를 접촉시킴으로써 응고된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포에 본 명세서에서 설명된 핵산 형질감염-시약 복합물을 접촉시키는 것을 포함하는, 세포를 형질감염시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 형질감염 배지를 세포에게 접촉시키는 수단과 핵산 형질감염-시약 복합물들을 세포들에게 접촉시키는 수단을 포함하는, 세포를 형질감염시키는 시스템을 제공한다. 일부 구체예들에서, 이 세포들을 둘어싼 대기는 대략 5% 이산화탄소 및/또는 대략 5% 산소를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 방법들에 의해 만들어진 세포 및/또는 유기체 및/또는 치료 조성물 및/또는 본 명세서에서 설명된 세포를 포함하는 치료 조성물을 제공한다.
일부 측면들에서, 낮은 독성 및 높은 해독(translation) 효과를 가진 합성 RNA 분자들이 제공된다. 다른 측면들에서, 합성 RNA 분자들을 생산하고, 세포들로 전달하는 방법들, 키트들, 그리고 장치들이 제공된다. 여전히 다른 측면들에서, 세포들의 고-효율 형질감염, 재프로그래밍, 그리고 유전자 에디팅을 위한 세포-배양 배지가 제공된다. 다른 측면들은 유형 1 당뇨병, 허혈성 및 확장성 심근증이 포함된 심장 질환, 황반 변성, 파킨슨병, 낭포성 섬유증, 겸상-적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 판코니 빈혈, 중증 복합형 면역결핍증, 유전성 감각 신경병, 색조피부건조증, 헌팅턴병, 근위축증, 근위축성 측색 경화증, 알츠하이머병, 암, 그리고 간염 및 HIV/AIDS가 포함된 감염병의 치료용, 합성 RNA 분자들을 포함하는 치료제에 관계한다. 추가 측면들은 유형 1 당뇨병, 허혈성 및 확장성 심근증이 포함된 심장 질환, 황반 변성, 파킨슨병, 낭포성 섬유증, 겸상-적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 판코니 빈혈, 중증 복합형 면역결핍증, 유전성 감각 신경병, 색조피부건조증, 헌팅턴병, 근위축증, 근위축성 측색 경화증, 알츠하이머병, 암, 그리고 간염 및 HIV/AIDS가 포함된 감염병의 치료용 세포들을 포함하는 치료제들에 관계한다.
본 발명은 다음의 첨부 도면과 함께 실시예들에 의해 설명되나 이에 제한되지 않는다:
도 1은 변성 포름알데히드-아가로즈 겔 상에서 해리된, 명시된 단백질들을 인코딩하는 RNA를 나타낸다.
도 2a는 Oct4를 인코딩하고, 명시된 뉴클레오티드들을 포함하는, 합성 RNA로 형질감염된 1차(primary) 인간 섬유아세포들을 나타낸다. "A"는 아데노신을 지칭하며, "G"는 구아노신을 지칭하며, "U"는 우리딘을 지칭하며, "C"는 시티딘을 지칭하며, "psU"는 슈도우리딘을 지칭하며, "5mC"는 5-메틸시티딘을 지칭하며, "N4mC"는 N4-메틸시티딘을 지칭하며, "7dG"는 7-데아자구아노신을 지칭하며, 그리고 "psisoC"는 슈도이소시티딘을 지칭한다. 뉴클레오티드들 앞에 붙은 숫자는 시험관내-전사 반응에서 대응하는 뉴클레오티드-5'-삼인산염의 분획을 나타낸다. 예를 들면, 0.5 N4mC는 동량의 N4-메틸시티딘-5'-삼인산염과 시티딘-5'-삼인산염을 함유하는 시험관내-전사 반응에서 합성된 RNA를 지칭한다. 세포들은 고정되고, 형질감염 후 20시간 동안 Oct4 단백질에 대해 착색되었다.
도 2b는 Oct4를 인코딩하고, 명시된 뉴클레오티드들을 포함하는, 합성 RNA로 형질감염된 1차(primary) 인간 섬유아세포들의 배양물의 Oct4 발현 및 세포 밀도를 나타낸다. 뉴클레오티드들은 도 2a에서와 같이 약어로 나타내었지만, 단, "7dA" 는 7-데아자아데노신을 지칭하며, 그리고 "piC"는 슈도이소시티딘을 나타낸다. 세포 밀도는 형질감염안된 세포들에 대하여 표준화된 것으로 나타낸다. Oct4 발현은 오직 정규(canonical) 뉴클레오티드들만을 가지는 합성 RNA에 대해 표준화된 것으로 나타낸다. 에러바(Error bars)는 표준 오차를 나타낸다(n = 3).
도 3a는 단백질 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc-2 (T58A), 및 Lin28을 인코딩하는 RNA로 1차 인간 섬유아세포들을 형질감염시키고, 콜로니를 찍어낸 후 하루 뒤, 기저막 추출물-피복된 플레이트상에 도말함으로써 생성된, 재프로그래밍화된 세포 계통을 나타낸다.
도 3b는 다능성 줄기-세포 지표들 Oct4 및 SSEA4에 대해 착색된, 도 3a에서 생성된 재프로그래밍화된 세포 계통을 나타낸다. "Hoechst"로 라벨된 패널은 핵을 보여주고, "Merge"로 라벨된 패널은 3개 채널로부터 병합된 신호들을 보여준다.
도 3c는 도 3a에서와 같이 형질감염되고, 배양된 1차 인간 섬유아세포들을 나타낸다. 총 5회 형질감염이 실행되었다. 사진은 7일차에 촬영하였다. 재프로그래밍화된 형태를 가진 세포의 몇 개 콜로니들을 볼 수 있다.
도 4a는 1.5mm-직경 피부 펀치 생검 조직 시료를 나타낸다.
도 4b는 도 4a에서와 같이 수거되고, 그리고 효소를 함유하는 용액의 공기-액체 인터페이스에서 현탁된 조직 시료를 나타낸다.
도 4c는 도 4a에서와 같이 수거되고, 도 4b에서와 같이 분리되고, 그리고 96-웰 플레이트의 웰 안에 도말된 1차 인간 섬유아세포들을 나타낸다.
도 5a는 인슐린-생산 세포들로 재프로그래밍화된 1차 인간 섬유아세포들을 나타낸다. 세포들은 고정되고 그리고 인슐린에 대해 착색된다.
도 5b는 조혈 세포들로 재프로그래밍화된 1차 인간 섬유아세포들을 나타낸다. 세포들은 고정되고 그리고 CD34에 대해 착색된다.
도 5c는 고동치는(beating) 심장 세포들로 재프로그래밍화된 1차 인간 섬유아세포들을 나타낸다.
도 6a는 RNA TALEN™ 백본(backbone)을 생산하기 위하여 시험관내-전사 주형의 전방 가닥(forward strand)을 나타낸다.
도 6b는 일련의 단량체 반복을 혼입시켜, 완전한 RNA TALEN™ 주형을 형성하기 위하여 Golden-Gate 클로닝 반응 이후 도 6a의 주형을 나타낸다.
도 6c는 도 6b의 주형으로부터 생성된 5'-캡결합, 3'-폴리(A)-꼬리로 된 RNA TALEN™을 나타낸다.
도 7은 도 6b의 주형의 서열을 나타내는데, 이때 RNA TALEN™은 DNA의 20bp 영역에 결합하도록 기획되며, 이때 "X(02)X", "X(03)X", 및 이와 같은 것들로 표시된 영역들은 특정 DNA 서열을 표적하도록 선택될 수 있는 반복 가변 도메인들 (RVD)을 나타낸다. 이 주형은 RNA TALEN™을 인코딩하고, 이때 RVD와 무관하게 RNA TALEN™가 결합된 첫 잔기는 티미딘 잔기이며, 따라서 첫 RVD는 "X(01)X"가 아닌 "X(02)X"로 표시된다.
도 8은 유전자-에디팅된 그리고 재프로그래밍화된 1차 인간 섬유아세포들을 나타낸다. 화살표들은 재프로그래밍화된 형태를 가진 세포들의 콜로니들을 가리킨다.
도 9a는 자동화된 또는 반-자동화된 방식으로 세포들을 형질감염시키고 및/또는 재프로그래밍화시킬 수 있는 시스템의 정면도다.
도 9b는 도 9a의 시스템의 후면 판넬을 나타낸다.
도 9c는 도 9a의 시스템의 주요 구성요소들을 나타낸다.
도 10a는 복합 배지 안에서 RNA와 형질감염 시약의 복합화를 나타낸다.
도 10b는 핵산들을 함유하는 사전-복합된 펠렛을 분배하는 2가지 방법들을 나타낸다.
도 10c는 흡입을 이용하여 웰 플레이트로부터 뚜껑을 제거하는 방법을 설명한다.
도 10d는 그리퍼(gripper)를 이용하여 웰 플레이트로부터 뚜껑을 제거하는 방법을 설명한다.
도 11은 세포들의 영상화, 항온처리 및 다른 조작을 위한 장비들과 조합하여 작용가능한 자동화된 또는 반-자동화된 방식으로 세포들을 형질감염시키고 및/또는 재프로그래밍화시킬 수 있는 시스템을 나타낸다.
정의
"분자"는 분자 실체 (분자, 이온, 복합물, 등등)를 의미한다.
"단백질"은 폴리펩티드를 의미한다.
"RNA 분자"는 RNA를 포함하는 분자를 의미한다.
"합성 RNA 분자"는 생명공학을 이용하여 세포의 외부 또는 세포의 내부에서 생산되는 RNA 분자를 말하는데, 예를 들면, 시험관내-전사 반응에서 생산된 RNA 분자, 직접적인 화학 합성에 의해 생산된 RNA 분자 또는 유전공학적으로-조작된 대장균(E.coli) 세포에서 생산된 RNA 분자가 된다.
"뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 또는 이의 단편 또는 이의 유도체, 예를 들면, 핵염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드-삼인산염, 등등을 말한다.
"뉴클레오시드"는 뉴클레오티드를 말한다.
"형질감염"은 세포에 분자를 접촉시키는 것을 의미하고, 이때 이 분자는 이 세포에 의해 내화된다.
"형질감염 시"란 형질감염 동안 또는 이후를 말한다.
"형질감염 시약"은 분자와 연합되고, 세포로 이 분자의 운반을 촉진 및/또는 세포에 의해 이 분자가 내화되는 것을 촉진시키는 물질 또는 물질들의 혼합물을 말하는데, 예를 들면, 양이온 지질, 하전된 중합체 또는 세포-침투 펩티드가 있다.
"시약-기반 형질감염"이란 형질감염 시약을 이용한 형질감염을 말한다.
"세포-배양 배지"는 세포 배양에 이용될 수 있는 배지를 말하는데, 예를 들면, Dulbecco 변형된 Eagle 배지 (DMEM) 또는 DMEM + 10% 우태 혈청 (FBS)이 있다.
"복합 배지"는 형질감염 시약과 형질감염될 분자가 추가된 배지를 말하고, 이때 형질감염 시약은 형질감염될 분자와 연합된다.
"형질감염 배지"는 형질감염에 이용될 수 있는 배지를 말하고, 예를 들면, Dulbecco 변형된 Eagle 배지 (DMEM) 또는 DMEM/F12가 있다.
"재조합 단백질"은 동물 또는 인간에서 만들어지지 않는 단백질 또는 펩티드를 말한다. 비-제한적인 예로는 세균에서 생산되는 인간 트란스패린, 마우스 세포의 시험관 배양에서 생산되는 인간 피브로넥틴, 그리고 쌀에서 생산되는 인간 혈청 알부민을 포함한다.
"지질 운반체"는 수성 용액에서 지질 또는 지질-가용성 분자의 용해도를 증가시킬 수 있는 물질을 말하는데, 예를 들면, 인간 혈청 알부민 또는 메틸-베타-시클로덱스트린이 있다.
"Oct4 단백질"은 POU5F1 유전자, 또는 이의 천연 또는 조작된 변이체, 패밀리-구성원, 상동체(ortho10gue), 단편 또는 융합 구조체에 의해 인코딩된 단백질을 말하는데, 예를 들면, 인간 Oct4 단백질 (서열 번호: 1), 마우스 Oct4 단백질, Oct1 단백질, POU5F1 슈도유전자 2에 의해 인코딩된 단백질, Oct4 단백질 또는 Oct4-GFP 융합 단백질의 DNA-결합 도메인이 있다. 일부 구체예들에서 Oct4 단백질은 서열 번호: 1과 적어도 70% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고, 또는 다른 구체예들에서, 서열 번호: 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, Oct4 단백질은 서열 번호: 1에 대하여 1 내지 20개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환체 (집합적으로)를 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, Oct4 단백질은 서열 번호: 1에 대하여 1 내지 15개 또는 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환체 (집합적으로)를 보유하는 아미노산 서열을 포함한다.
"Sox2 단백질"은 SOX2 유전자, 또는 이의 천연 또는 조작된 변이체, 패밀리-구성원, 상동체, 단편 또는 융합 구조체에 의해 인코딩된 단백질을 말하며, 예를 들면, 인간 Sox2 단백질 (서열 번호:2), 마우스 Sox2 단백질, Sox2 단백질 또는 Sox2-GFP 융합 단백질의 DNA-결합 도메인이 있다. 일부 구체예들에서 Sox2 단백질은 서열 번호:2와 적어도 70% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고, 또는 다른 구체예들에서, 서열 번호: 2와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, Sox2 단백질은 서열 번호:2에 대하여 1 내지 20개 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환체 (집합적으로)를 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, Sox2 단백질은 서열 번호:2에 대하여 1 내지 15개 또는 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환체 (집합적으로)를 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
"Klf4 단백질"은 KLF4 유전자, 또는 이의 천연 또는 조작된 변이체, 패밀리-구성원, 상동체, 단편 또는 융합 구조체에 의해 인코딩된 단백질을 말하며, 예를 들면, 인간 Klf4 단백질 (서열 번호:3), 마우스 Klf4 단백질, Klf4 단백질 또는 Klf4-GFP 융합 단백질의 DNA-결합 도메인이 있다. 일부 구체예들에서 Klf4 단백질은 서열 번호:3과 적어도 70% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고, 또는 다른 구체예들에서, 서열 번호: 3과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, Klf4 단백질은 서열 번호:3에 대하여 1 내지 20개 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환체(집합적으로)를 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, Klf4 단백질은 서열 번호:3에 대하여 1 내지 15개 또는 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환체 (집합적으로)를 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
"c-Myc 단백질"은 MYC 유전자, 또는 이의 천연 또는 조작된 변이체, 패밀리-구성원, 상동체, 단편 또는 융합 구조체에 의해 인코딩된 단백질을 말하고, 예를 들면, 인간 c-Myc 단백질 (서열 번호:4), 마우스 c-Myc 단백질, 1-Myc 단백질, c-Myc (T58A) 단백질, c-Myc 단백질 또는 c-Myc-GFP 융합 단백질의 DNA-결합 도메인이 있다. 일부 구체예들에서 c-Myc 단백질은 서열 번호:4와 적어도 70% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고, 또는 다른 구체예들에서, 서열 번호: 4와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, c-Myc 단백질은 서열 번호:4에 대하여 1 내지 20개 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환체 (집합적으로)를 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, c-Myc 단백질은 서열 번호:4에 대하여 1 내지 15개 또는 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환체(집합적으로)를 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
"재프로그래밍"이란 세포의 표현형에 변화를 일으킨다는 것을 말하는데, 예를 들면, β-세포 선조가 성숙 β-세포의 분화를 야기하는, 섬유아세포가 다능성 줄기 세포로의 탈분화를 야기하는, 케라틴생성세포가 심장 줄기 세포로의 전이분화를 야기하는 또는 뉴런의 엑손의 성장을 야기하는 것을 말한다.
"재프로그래밍 인자"는 세포가 이 분자와 접촉될 때 및/또는 이 세포가 이 분자를 발현시킬 때, 단독으로 또는 다른 분자들과 함께, 재프로그래밍을 야기하는 분자를 말하는데, 예를 들면, Oct4 단백질이 있다.
"영양공급세포(feeder)"란 조건 배지에 이용될 수 있는 세포 또는 배양에서 다른 세포들의 생장을 지원하는 세포를 말한다.
"조건화(conditioning)"란 배지에 하나 이상의 영양공급세포를 접촉시키는 것을 말한다.
"지방산"이란 적어도 2개의 탄소 원자의 지방족 쇄를 포함하는 분자를 말하는데, 예를 들면, 리놀산, α-리놀렌산, 옥탄산, 류코트리엔, 프로스타글란딘, 콜레스테롤, 글루코코르티코이드, 레졸빈, 프로텍틴, 트롬복산, 리폭신, 마레신, 스핑고리피드, 트립토판, N-아세틸 트립토판 또는 이의 염, 이의 메틸 에스테르 또는 이의 유도체가 있다.
"단-쇄(short-chain) 지방산"은 2 내지 30개 탄소 원자의 지방족 쇄를 포함하는 지방산을 말한다.
"알부민"은 물에 용해성이 매우 큰 단백질을 말하는데, 예를 들면, 인간 혈청 알부민이다.
"연합된 분자"는 또 다른 분자에 비-공유적으로 결합된 분자를 말한다.
"알부민에 연합된-분자-성분"이란 알부민 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 분자들을 말하는데, 예를 들면, 알부민 폴리펩티드에 결합된 지질들, 호르몬들, 콜레스테롤, 칼슘 이온 등이 된다.
"처리된 알부민"이란 알부민에 연합된-분자-성분을 감소, 제거 또는 비활성화시키기 위하여 처리된 알부민을 말하는데, 예를 들면, 상승된 온도에서 항온처리된 인간 혈청 알부민, 옥타노에이트 나트륨과 접촉된 인간 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민이 있다.
"이온-교환 수지"는 이온을 포함하는 용액과 접촉시 하나 이상의 이온이 하나 이상의 상이한 이온으로 대체될 수 있는 물질을 말하는데, 예를 들면, 하나 이상의 칼슘 이온은 하나 이상의 나트륨 이온을 대체할 수 있는 물질이 된다.
"생식 세포"는 정자 세포 또는 난 세포를 말한다.
"다능성 줄기 세포"란 생체내에서 3가지 모든 배엽(내배엽, 중배염 및 외배염)의 세포들로 분화될 수 있는 세포를 말한다.
"체세포"는 다능성 줄기 세포 또는 생식 세포가 아닌 세포, 예를 들면, 피부 세포를 말한다.
"포도당-반응성 인슐린-생산 세포"는 이 세포가 상이한 농도의 포도당에 노출될 때 이 세포가 생산 및/또는 분비하는 인슐린의 양과 상이한(더 많거나 더 적은) 양의 인슐린을 생산 및/또는 분비할 수 있는 세포를 말하며, 예를 들면, β-세포를 말한다.
"조혈 세포"는 혈액 세포로 분화될 수 있는 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포 또는 백혈구를 말한다.
"심장 세포"는 심장 세포로 분화될 수 있는 세포, 예를 들면, 심장 줄기 세포 또는 심근세포를 말한다.
"망막 세포"는 망막의 세포 또는 망막의 세포로 분화될 수 있는 세포, 예를 들면, 망막 착색된 상피 세포를 말한다.
"피부 세포"는 피부에서 정상적으로 볼 수 있는 세포, 예를 들면, 섬유아세포, 케라틴생성세포, 멜라닌 세포, 함지방세포, 간엽성 줄기 세포, 지방의 줄기 세포 또는 혈액 세포를 말한다.
"Wnt 신호생성 항진제"는 Wnt 단백질 패밀리의 하나 이상의 구성원의 하나 이상의 생물학적 기능을 수행할 수 있는 분자들을 말하는데, 예를 들면, Wntl, Wnt2, Wnt3, Wnt3a 또는 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘이 있다.
"IL-6 신호생성 항진제"는 IL-6 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능을 수행할 수 있는 분자를 말하는데, 예를 들면, IL-6 단백질 또는 IL-6 수용체 (가용성 IL-6 수용체, IL-6R, IL-6R 알파, 등으로도 또한 알려짐)가 있다.
"TGF-β 신호생성 항진제"는 TGF-β 단백질의 슈퍼패밀리의 하나 이상의 구성원의 하나 이상의 생물학적 기능을 수행할 수 있는 분자를 말하는데, 예를 들면, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP-4 또는 Nodal이 있다.
"면역억제제"는 면역계의 하나 이상의 양태를 억제할 수 있고, 포유동물에서 정상적으로 존재하지 않는 물질, 예를 들면, B18R 또는 덱사메타손을 말한다.
"유전자 에디팅"은 세포의 DNA 서열을 변경시키는 것을 말한다.
"유전자-에디팅 단백질"이란 단독으로 또는 또 다른 분자와 조합되어 세포의 DNA 서열을 변경시키는 단백질을 말하는데, 예를 들면, 뉴클레아제, 전사 활성화물질-유사 효과물질 뉴클레아제 (TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 니카제(nickase) 또는 이의 천연 또는 조작된 변이체, 패밀리-구성원, 상동체, 단편 또는 융합 구조체가 있다.
"단일-가닥 브레이크"는 한 가닥 또는 두 가닥에서 뉴클레오티드들을 연결시키는 공유 결합중 하나 이상이 부서진 단일-가닥의 또는 이중-가닥의 DNA의 영역을 말한다.
"이중-가닥 브레이크"는 두 가닥의 각각에서 뉴클레오티드들을 연결시키는 공유 결합중 하나 이상이 부서진 이중-가닥의 DNA의 영역을 말한다.
혈청 알부민은 무혈청 세포-배양 배지의 공통 성분이다. 혈청 알부민은 형질감염을 저해할 수 있고, 무혈청 세포-배양 배지에서 보통 이용되는 농도로 형질감염 배지 안에 처리안된 혈청 알부민이 포함되면 형질감염시 낮은 형질감염 효과 및/또는 낮은 세포 생존능을 초래할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 혈청 알부민 폴리펩티드는 시험관 및 생체내 모두에서 지질들, 이온들, 콜레스테롤, 등등이 포함된, 다양한 분자들에 결합할 수 있고, 혈액으로부터 단리된 혈청 알부민과 재조합 혈청 알부민은 모두 폴리펩티드 성분과 연합된-분자 성분을 포함한다. 혈청 알부민에 의해 야기되는 낮은 형질감염 효과 및 낮은 세포 생존능은 혈청 알부민에 연합된-분자 성분에 의해 부분적으로 초래될 수 있음이 현재 밝혀졌다. 혈청 알부민에 연합된-분자 성분을 부분적으로 또는 완전하게 감소, 제거, 대체 또는 비활성화시킴으로써 형질감염 효과는 증가될 수 있고, 형질감염-연합된 독성은 감소될 수 있음이 추가로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예들은 이 단백질에 연합된-분자 성분을 부분적으로 또는 완전하게 감소, 제거, 대체 또는 비활성화시키기 위하여 이 단백질을 처리하는 방법에 관계된다. 다른 구체예들은 이 단백질에 연합된-분자 성분을 부분적으로 또는 완전하게 감소, 제거, 대체 또는 비활성화시키기 위하여 처리된 단백질에 관계된다.
특정 구체예들은 단백질에 의해 야기되는 형질감염시 낮은 형질감염 효과 및/또는 낮은 세포 생존능을 감소시키는 하나 이상의 분자들을 이 단백질에 접촉시킴으로써, 이 단백질을 처리하는 방법에 관계된다. 혈청 알부민을 단-쇄 지방산, 옥타노에이트 나트륨 ("옥탄산", "옥타노에이트", "카프릴레이트" 또는 "카프릴산"으로도 또한 공지됨)에 접촉시키는 것은 특정 상황에서 혈청 알부민에 의해 야기되는 형질감염시 낮은 형질감염 효과 및/또는 낮은 세포 생존능을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 단백질을 처리하는데 이용될 수 있는 다른 물질들은 다음을 포함한다: 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키돈산, 베헨산, 리그노세르산, 세로트산, 미리스토레산, 팔미토레산, 사피엔산, 올레산, 엘라이드산, 바센산, 리놀산, 리노엘라이드산, 알파-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜테논산, 에루씨산, 도코사헥사논산, 트립토판, N-아세틸 트립토판, 콜레스테롤, 다른 지방산들, 이의 염들, 혼합물들, 단편들, 및 유도체들. 단백질을 처리하기 위한 물질들은 순수 물질들, 특정된 혼합물들 또는 복합물 또는 특정화안된 혼합물들 가령 동물-계통 또는 식물-계통 오일, 예를 들면, 대구-간 오일일 수 있다. 특정 구체예들에서, 단백질은 이 단백질이 정제된 후, 처리된다. 다른 구체예들에서, 단백질은 이 단백질이 정제되기 전, 처리된다. 여전히 다른 구체예들에서, 단백질은 이 단백질이 정제와 동시에 처리된다. 여전히 다른 구체예들에서, 단백질은 처리되며, 이 단백질은 정제되지 않는다.
상승된 온도에서 단백질을 항온처리하면 단백질의 폴리펩티드 성분이 부분적으로 또는 완전한 변성될 수 있고, 이로써 단백질에 연합된-분자 성분을 유지하는데 결정적일 수 있는 결합 부위들이 감소 또는 제거될 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 상승된 온도에서 단백질을 항온처리함으로써 이 단백질을 처리하는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 이 단백질은 적어도 약 40℃의 온도에서 적어도 약 10 분 동안 항온처리된다. 또 다른 구체예에서, 이 단백질은 적어도 약 50℃의 온도에서 적어도 약 10 분 동안 항온처리된다. 또 다른 구체예에서, 이 단백질은 적어도 약 55℃의 온도에서 적어도 약 30 분 동안 항온처리된다. 한 구체예에서, 이 단백질은 옥타노에이트 나트륨에 접촉되고, 그 다음 약 60℃에서 몇 시간, 가령, 가령 약 1 시간 내지 약 24 시간, 또는 약 2 시간 내지 약 6 시간 동안 항온처리된다. 또 다른 구체예에서, 옥타노에이트 나트륨의 농도는 약 5mM 내지 약 50mM, 또는 약 10mM 내지 약 40mM이다. 특정 구체예들에서, 옥타노에이트 나트륨은 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키돈산, 베헨산, 리그노세르산, 세로트산, 미리스토레산, 팔미토레산, 사피엔산, 올레산, 엘라이드산, 바센산, 리놀산, 리노엘라이드산, 알파-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜테논산, 에루씨산, 도코사헥사논산, 트립토판, N-아세틸 트립토판, 및 콜레스테롤 또는 이의 염, 혼합물, 단편, 및 유도체 중 적어도 하나의 요소로 대체되거나, 또는 복합되어 이용된다.
당화(glycation) 및 글리코실화(glycosylation)는 하나 이상의 슈가 분자들을 단백질에 결합시키는 공정이다. 당화 및 글리코실화는 단백질의 결합 성질에 영향을 줄 수 있고, 그리고 혈청 알부민은 몇 가지 잠재적인 당화 부위들을 함유한다. 따라서, 특정 구체예들은 단백질의 당화 또는 글리코실화에 의해 단백질을 처리하는 방법에 관계된다.
음이온-교환, 양이온-교환, 및 혼합형-베드 수지들을 포함하는, 이온-교환 수지는 용액들을 탈이온화시키는데 통상적으로 이용된다. 단백질들 가령, 혈청 알부민에 연합된-분자 성분은 이온들을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 단백질을 하나 이상의 이온-교환 수지에 접촉시킴으로써, 이 단백질을 처리하는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 하나 이상의 이온-교환 수지는 프로톤 (H+) 및 히드록실 (OH-) 형태를 가진 기능기들이 함유된 혼합형-베드 수지를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 이온-교환 수지는 이 수지가 이온들에 의해 포화될 때 색이 변화되는 표시기를 포함한다. 하나 이상의 이온-교환 수지에 접촉시키는 것에 추가적으로, 단백질에 연합된-분자 성분을 감소, 제거, 대체 또는 비활성화시키기 위하여, 단백질에 목탄을 접촉시키고, 이는 화학물질 가령 덱스트란 술페이트에 의해 활성화된 또는 처리될 수 있고, 투석(연합된-분자 성분의 해리를 야기하고, 탈-연합된 분자들은 후속적으로 용액으로부터 제거되는 희석을 포함하는), 결정화, 크로마토그래피, 전기영동, 열 처리, 저온 처리, 높은-pH 처리, 낮은-pH 처리, 유기-용매 침전, 그리고 친화력 정제를 포함하는 다른 방법들이 이용될 수 있다.
단백질을 처리하는 특정 방법들은 특정 유형의 분자들을 선호적으로 감소, 제거, 대체 또는 비활성화시킬 수 있다. 따라서, 특정 상황에서, 단백질에 의해 야기되는 형질감염시 낮은 형질감염 효과 및/또는 낮은 세포 생존능을 감소시키기 위하여 단백질을 처리하는 2가지 또는 그 이상의 방법들을 복합하는 것이 유익할 것이다. 따라서, 특정 구체예들은 단백질에 연합된-분자 성분을 감소, 제거, 대체 또는 비활성화시키기 위하여 2 가지 또는 그 이상의 방법들을 이용하여 단백질을 처리하는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 단백질은 하나 이상의 이온-교환 수지와 활성화된 목탄에 접촉된다. 또 다른 구체예에서, 단백질은 옥타노에이트 나트륨에 접촉되고, 상승된 온도에서 항온처리되며, 하나 이상의 이온-교환 수지에 접촉되며, 활성화된 목탄에 접촉된다. 또 다른 구체예에서, 이 단백질은 혈청 알부민이며, 상승된 온도는 적어도 약 50℃다.
단백질에 연합된-분자 성분의 특정 요소들은 배양에서 세포들에게 유익하거나, 및/또는 형질감염에 유익할 수 있는데, 예를 들면, 특정 레졸빈, 프로텍틴, 리폭신, 마레신, 에이코사노이드, 프로스타시클린, 트롬복산, 류코트리엔, 시클로펜테논 프로스타글란딘, 및 글루코코르티코이드가 있다. 따라서, 특정 구체예들은 단백질에 연합된-분자 성분의 하나 이상의 유익한 요소들의 감소, 제거, 대체 또는 비활성화 없이, 단백질에 연합된-분자 성분을 감소, 제거, 대체 또는 비활성화시키기 위하여 단백질을 처리하는 방법에 관계된다. 다른 구체예들은 단백질에 연합된-분자 성분을 감소, 제거, 대체 또는 비활성화시키기 위하여 단백질을 처리하고, 그리고 단백질에 연합된-분자 성분의 하나 이상의 유익한 요소들을 포함하는 하나 이상의 분자들에 이 단백질을 더 접촉시키는 방법에 관계된다.
여전히 다른 구체예들은 단백질에 의해 야기되는 형질감염시 낮은 형질감염 효과 및/또는 낮은 세포 생존능을 감소시키기 위하여, 이 단백질에 연합된-분자 성분의 하나 이상의 유익한 요소들을 포함하는 하나 이상의 분자들을 이 단백질에 접촉시킴으로써 이 단백질을 처리하는 방법에 관계된다. 여전히 다른 구체예들은 단백질에 연합된-분자 성분의 하나 이상의 유익한 요소들을 포함하는 하나 이상의 분자들을 세포에 접촉시킴으로써, 형질감염시 형질감염 효과를 증가시키거나 및/또는 세포 생존능을 증가시키는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 이 단백질은 하나 이상의 이온-교환 수지 또는 목탄에 접촉되며, 글루코코르티코이드, 가령 히드로코르티손, 프레드니손, 프레드니졸론, 메틸프레드니졸론, 덱사메타손 또는 베타메타손에 더 접촉된다. 또 다른 구체예에서, 이 세포는 글루코코르티코이드, 가령 히드로코르티손, 프레드니손, 프레드니졸론, 메틸프레드니졸론, 덱사메타손 또는 베타메타손에 접촉된다. 특정 상황에서, 형질감염 배지 안에 하나 이상의 스테로이드 및/또는 하나 이상의 항산화제들이 포함되면 형질감염 효과, 재프로그래밍 효과, 그리고 유전자-에디팅 효과가 증가될 수 있다는 것이 더 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 관심 단백질을 발현시키기 위하여, 스테로이드를 함유하는 배지에 세포를 배양시키고, 이 세포에 하나 이상의 합성 RNA 분자들을 접촉시킴으로써, 이 세포를 유도하는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 스테로이드는 히드로코르티손이다. 또 다른 구체예에서, 히드로코르티손은 이 배지 안에 약 0.1uM 내지 약 10uM, 또는 약 1uM의 농도로 존재한다. 다른 구체예들은 관심 단백질을 발현시키기 위하여 항산화제를 포함하는 배지에 세포를 배양하고, 그리고 이 세포에 하나 이상의 합성 RNA 분자들을 접촉시켜, 세포를 유도하는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 항산화제는 아스코르브산 또는 아스코르브산-2-포스페이트다. 또 다른 구체예에서, 아스코르브산 또는 아스코르브산-2-포스페이트는 이 배지 안에 약 50mg/L를 포함하는, 약 0.5mg/L 내지 약 500mg/L 농도로 존재한다. 여전히 또 다른 구체예들은 스테로이드 및/또는 항산화제를 포함하는 배지에서 세포를 배양하고, 이 세포에 하나 이상의 합성 RNA 분자들을 접촉시킴으로써, 세포의 재프로그래밍 및/또는 유전자-에디팅을 위한 방법에 관계되는데, 이때 하나 이상의 합성 RNA 분자들은 하나 이상의 재프로그래밍 및/또는 유전자-에디팅 단백질들을 인코딩한다. 특정 구체예들에서, 이 세포는 유기체 안에 존재하며, 스테로이드 및/또는 항산화제는 유기체로 운반된다.
트란스패린을 복합 배지에 추가하면 특정 상황에서 플라스미드 형질감염 효과가 증가된다고 보고되었다. 트란스패린을 복합 배지에 추가하면 합성 RNA 분자들에 의한 형질감염 효과가 또한 증가될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 하나 이상의 합성 RNA 분자들 및 형질감염 시약을 트란스패린을 함유하는 용액에 추가시킴으로써 관심 단백질을 발현시키기 위하여 세포를 유도하는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 트란스패린은 약 1mg/L 내지 약 100mg/L, 가령 약 5mg/L의 농도로 용액에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 트란스패린은 재조합 트란스패린이다.
다른 구체예들은 본 발명의 하나 이상의 방법에 따라 처리된 단백질이 포함된 배지에 관계된다. 특정 구체예들에서, 이 단백질은 배지의 하나 이상의 다른 성분들과 혼합에 앞서 처리된다. 한 구체예에서, 이 배지는 형질감염 배지다. 또 다른 구체예에서, 이 배지는 효율적인 형질감염과 높은 세포 생존능을 또한 지원한다. 특정 구체예들에서, 단백질에 의해 야기되는 형질감염시 낮은 형질감염 효과 및/또는 낮은 세포 생존능을 감소시키는 단백질과 하나 이상의 분자들이 이 배지에 독립적으로 추가된다. 한 구체예에서, 이 단백질은 이 배지의 하나 이상의 다른 성분들과 혼합되기에 앞서 처리된다. 또 다른 구체예에서, 이 배지는 혈청 알부민의 농축된 용액을 하나 이상의 이온-교환 수지에 접촉시킴으로써 혈청 알부민의 농축된 용액을 우선 처리하고, 그 다음 처리된 혈청 알부민의 농축된 용액을 이 배지의 다른 성분에 추가함으로써 준비된다. 또 다른 구체예에서, 혈청 알부민의 농축된 용액은 혈청 알부민의 농축된 용액이 배지의 다른 성분들에 추가하기에 앞서 목탄에 더 접촉된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 혈청 알부민의 농축된 용액은 옥타노에이트 나트륨에 우선 접촉되고, 그 다음 적어도 10분간 적어도 약 50℃의 온도로 상승시키고, 그 다음 하나 이상의 이온-교환 수지에 접촉되며, 그 다음 활성화된 목탄에 접촉되며, 이 배지의 다른 성분들에 추가된다.
완충된 염 용액, 아미노산들, 콜레스테롤, 히드로코르티손, 및 혈청 알부민을 함유하는 배지를 이용하여 세포들을 형질감염시키면 효율적인 형질감염이 이루어질 수 있고, 그리고 완충된 염 용액, 아미노산들, 인슐린, 트란스패린, 콜레스테롤, 히드로코르티손, 혈청 알부민, 및 섬유아세포 성장 인자로 기본적으로 구성된 배지를 이용하여 세포들을 형질감염시키면 형질감염과 재프로그래밍이 효율적으로 이루어질 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 완충된 염 용액, 아미노산들, 콜레스테롤, 히드로코르티손, 및 혈청 알부민을 함유하는 형질감염 배지에 관계된다. 다른 구체예들은 완충된 염 용액, 아미노산들, 인슐린, 트란스패린, 콜레스테롤, 히드로코르티손, 혈청 알부민, 그리고 섬유아세포 성장 인자로 기본적으로 구성된 및/또는 이들이 포함된 형질감염 배지에 관계된다. 여전히 다른 구체예들은 완충된 염 용액, 아미노산들, 인슐린, 트란스패린, 콜레스테롤, 히드로코르티손, 혈청 알부민, 및 섬유아세포 성장 인자로 기본적으로 구성된 및/또는 이들이 포함된 재프로그래밍 배지에 관계된다. 한 구체예에서, 이 배지는 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트 및/또는 D-알파-토코페롤 아세테이트를 또한 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 배지는 예를 들면, 약 1mg/L 내지 약 1OOmg/L의 농도의 아스코르브산 또는 아스코르브산-2-포스페이트를 또한 포함한다. 한 구체예에서, 히드로코르티손은 약 1uM의 농도로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 섬유아세포 성장 인자는 염기성 섬유아세포 성장 인자이며, 염기성 섬유아세포 성장 인자는 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL의 농도, 가령 약 4ng/mL 내지 약 100ng/mL, 또는 약 10ng/mL 내지 약 50ng/mL, 또는 약 20ng/mL의 농도로 존재한다. 한 구체예에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민이며, 인간 혈청 알부민은 약 0.1% 내지 약 1%, 가령 약 0.5%를 포함하는, 약 0.05% 내지 약 2% 농도로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 인간 혈청 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 콜레스테롤은 약 4.5mg/L의 농도로 존재한다. 한 구체예에서, 이 배지는 임의의 동물로부터 유도된 성분들을 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 이 배지는 임의의 특정화안된 성분들, 예를 들면, 대구 간-오일 지방산들 또는 혈청을 함유하지 않는다. 한 구체예에서, 이 배지는 TGF-β 저해제, 예를 들면, A83-01 또는 SB431542를 함유한다. 한 구체예에서, TGF-β 저해제는 약 0.1uM 내지 약 10uM의 농도로 존재한다. 한 구체예에서, 이 배지는 Wnt 신호생성 항진제, 가령 Wnt3a를 함유한다. 또 다른 구체예에서, Wnt 신호생성 항진제는 약 50ng/mL 내지 약 200ng/mL을 포함하는, 약 10ng/mL 내지 약 500ng/mL 농도로 존재한다. 한 구체예에서, 이 배지는 셀레늄의 원천, 가령 셀레나이트 나트륨을 함유한다.
특정 상황에서, 동물로부터 유도된 성분들은 일부 동물로부터 유도되지 않은 및/또는 재조합 성분들로 대체하는 것이 바람직할 수 있는데, 그 이유는 동물로부터 유도되지 않은 및/또는 재조합 성분들은 동물로부터 유도된 성분들보다 더 높은 수준의 일관성으로 만들어질 수 있고, 그리고 동물로부터 유도되지 않은 및/또는 재조합 성분들은 동물로부터 유도된 성분들보다 독성 및/또는 병원성 물질들의 오염 위험을 덜 가지고 있기 때문이도 하다. 따라서, 특정 구체예들은 동물로부터 유도되지 않은 및/또는 재조합에 의한 단백질에 관계된다. 다른 구체예들은 배지의 전체 또는 일부 성분들이 동물로부터 유도되지 않은 및/또는 재조합 성분인 배지에 관계된다. 한 구체예에서, 이 단백질은 재조합 혈청 알부민이다. 또 다른 구체예에서, 이 단백질은 재조합 인간 혈청 알부민이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 단백질은 재조합 혈청 알부민이며 그리고 이 배지의 모든 성분들은 동물로부터 유도되지 않은 및/또는 재조합에 의한 것이다.
혈청 알부민의 N-말단은 니켈- 및 구리-결합 도메인을 함유할 수 있는데, 이들은 중요한 항원 결정인자일 수 있다. 혈청 알부민의 N-말단으로부터 아스파르트산 잔기를 제거하면 혈청 알부민의 니켈- 및 구리-결합 활성을 감소시킬 수 있고, 이 단백질의 저자극성 변이체가 생성될 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 변형된 결합 특징 및/또는 다른 바람직한 특징 가령 저자극성을 보유하는 단백질에 관계된다. 한 구체예에서, 이 단백질은 혈청 알부민이며, 혈청 알부민은 N-말단 아스파르트산이 부족하다.
다른 구체예들은 세포를 형질감염시키는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 세포는 하나 이상의 핵산들에 의해 형질감염되고, 형질감염은 형질감염 시약, 가령 지질-기반 형질감염 시약을 이용하여 실행된다. 한 구체예에서, 하나 이상의 핵산들은 적어도 한 개의 RNA 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 세포는 하나 이상의 핵산들로 형질감염되고, 하나 이상의 핵산들은 p53, TERT, 시토킨, 분비된 단백질, 막-결합된 단백질, 효소, 유전자-에디팅 단백질, 크로마틴-변형 단백질, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 히스톤 탈아세틸화효소, 병인균-연합된 분자 패턴, 그리고 종양-연합된 항원 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 유사물, 변이체 또는 패밀리-구성원 중 적어도 하나를 인코딩한다. 또 다른 구체예에서, 이 세포는 반복적으로 형질감염되는데, 가령 연속적으로 약 10일간 적어도 2회, 또는 연속적으로 약 7일간 적어도 약 3 회, 또는 연속적으로 약 6일간 적어도 약 4회 형질감염된다.
세포들은 하나 이상의 핵산들 인코딩된 하나 이상의 재프로그래밍 인자로 형질감염되고, 재프로그래밍화된 세포들을 지원하는 배지에서 이 세포들을 배양함으로써 재프로그래밍이 실행될 수 있다. 재프로그래밍 인자의 예로는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: Oct4 단백질, Sox2 단백질, Klf4 단백질, c-Myc 단백질, 1-Myc 단백질, TERT 단백질, Nanog 단백질, Lin28 단백질, Utfl 단백질, Aicda 단백질, miR200 micro-RNA, miR302 micro-RNA, miR367 micro-RNA, miR369 micro-RNA 그리고 이의 생물학적으로 활성 단편들, 유사물들, 변이체들 그리고 패밀리-구성원들. 따라서, 특정 구체예들은 세포를 재프로그래밍화시키는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산들로 세포를 형질감염시켜, 이 세포는 재프로그래밍화된다. 한 구체예에서, 하나 이상의 핵산들은 Oct4 단백질을 인코딩하는 RNA 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 핵산들은 Sox2 단백질, Klf4 단백질, 및 c-Myc 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 RNA 분자들을 또한 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 핵산들은 Lin28 단백질을 인코딩하는 RNA 분자들을 또한 포함한다. 한 구체예에서, 이 세포는 인간 피부 세포이고, 인간 피부 세포는 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍된다. 또 다른 구체예에서, 이 세포는 인간 피부 세포이고, 인간 피부 세포는 포도당-반응성 인슐린-생산 세포로 재프로그래밍된다. 재프로그래밍화될 수 있는 다른 세포들의 예로는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 피부 세포들, 다능성 줄기 세포들, 간엽성 줄기 세포들, β-세포들, 망막 착색된 상피 세포들, 조혈 세포들, 심장 세포들, 기도 상피 세포들, 신경의 줄기 세포들, 뉴우런, 교(glial) 세포들, 뼈 세포들, 혈액 세포들, 그리고 치수(dental pulp) 줄기 세포들. 한 구체예에서, 이 세포는 재프로그래밍화된 세포를 지원하는 배지에서 배양된다. 한 구체예에서, 이 배지는 또한 이 세포를 지원한다.
중요한 것은, 피부 세포들을 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc를 인코딩하는 바이러스들을 감염시키고, 심근세포의 성장을 지원하는 배지에서 이 세포들을 배양시키면, 피부 세포들의 다능성 줄기 세포들로의 우선적인 재프로그래밍화 없이, 피부 세포들이 심근세포로의 재프로그래밍화를 야기한다고 보고된 바 있다 (Efs et al Nat Cell Biol. 2011;13:215-22, 이의 내용들은 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 특정 상황에서, 예를 들면 개인별 치료제를 만들 때, 직접적인 재프로그래밍 (체세포가 다능성 줄기 세포로 우선적으로 재프로그래밍되지 않고, 하나의 체세포가 또 다른 체세포로 재프로그래밍됨, "전이분화"라고도 알려짐)이 바람직할 수 있는데, 그 이유는 다능성 줄기 세포들을 배양하는 것은 시간-소모적이며 비용이 많이 들고, 안정적 다능성 줄기 세포 계통을 확립하고, 특징화하는 것과 관련된 추가 취급은 오염 위험의 증가, 그리고 다능성 줄기 세포들을 먼저 생산하는 것과 연합된 배양의 추가 시간은 게놈 불안정성의 위험 증가와 점 돌연변이들을 포함하는 돌연변이, 복사체-수 변화, 그리고 핵형(karyotypic) 비정상의 획득을 가져올 수 있기 때문이다. 따라서, 특정 구체예들은 세포가 체세포로 재프로그래밍되고, 이때 특징화된 다능성 줄기-세포계통이 만들어지지 않는, 세포를 재프로그래밍시키는 방법에 관계된다.
재프로그래밍 인자들을 인코딩하는 RNA로 세포들을 형질감염시킴으로써, 세포를 재프로그래밍화시키는 기존의 보고된 방법들은 영양공급세포의 이용을 필요로 한다. 많은 상황에서, 영양공급세포의 이용은 바람직하지 않을 수 있는데, 그 일부 이유로는 영양공급세포가 동물 또는 이질유전적 원천으로부터 유도될 수 있고, 따라서 면역원성 및 병원균에 의한 감염 위험을 수반할 수 있기 때문이다. 본 발명의 배지는 영양공급세포 없이 RNA 재프로그래밍화를 가능하게 할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 세포에 영양공급세포의 접촉없이, 본 발명의 방법에 따른 세포의 재프로그래밍은 신속하고, 효율적이고, 신뢰할 수 있다는 것이 현재 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 세포에 영양공급세포의 접촉없이, 세포를 재프로그래밍화시키는 방법에 관계된다.
재프로그래밍 효과는 본 발명의 방법들에 따라 세포들이 재프로그래밍될 때 출발 세포 밀도와 관련될 수 있다고 현재 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 약 100개 세포들/㎠ 내지 약 100,000개 세포들/㎠의 밀도로 도말된 세포들의 재프로그래밍화를 위한 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 이 세포들은 약 100개 세포들/㎠ 내지 약 10,000개 세포들/㎠ 또는 약 2000개 세포들/㎠ 내지 약 20,000개 세포들/㎠, 또는 약 1000개 세포들/㎠ 내지 약 2000개 세포들/㎠의 밀도로 도말된다.
특정 상황에서 다른 방법들보다는 본 발명의 방법에 따라 세포를 재프로그래밍시키는데 전체적으로 더 적은 형질감염이 요구될 수 있다는 것이 더 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 연속 약 20일 동안 약 2 내지 약 12회 형질감염이 실행되며, 또는 연속 약 15일 동안 약 4 내지 약 10회의 형질감염이 실행되며, 또는 연속 약 10일 동안 약 4 내지 약 8회의 형질감염이 실행되는, 세포를 재프로그래밍화시키는 방법에 관계된다. 세포가 배양되는 배지에 핵산이 추가될 때, 이 세포는 동시에 또는 상이한 시점에서 하나 이상의 핵산 분자에 접촉되거나 및/또는 하나 이상의 핵산 분자를 내화시킬 수 있다는 것이 확인된다. 따라서, 이 세포가 배양되는 배지에 핵산이 단지 1회 추가되는 경우에도 세포는 1회 이상, 가령 반복적으로 핵산과 접촉될 것이다.
영양공급세포는 표면에 결합되는 분자들 가령 콜라겐("세포-흡착 분자들")을 분비함으로써 표면에 세포들의 흡착을 촉진시킬 수 있다. 인테그린을 포함하는 단백질들은 세포들의 표면에서 세포-흡착 분자들에 결합될 수 있고, 이로 인하여 세포들이 표면에 흡착될 수 있다. 하나 이상의 세포-흡착 분자들로 표면을 피복시킴으로써, 세포들은 영양공급세포 없이 재프로그래밍될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 세포-흡착 분자들 피브로넥틴 및 비트로넥틴은 이러한 목적에 특히 적합하다는 것이 더 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 세포를 하나 이상의 세포-흡착 분자들과 접촉된 표면에 접촉됨으로써, 세포를 형질감염, 재프로그래밍, 및/또는 유전자-에디팅시키는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 하나 이상의 세포-흡착 분자들은 폴리-L-리신, 폴리-L-오르니틴, RGD 펩티드, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 및 라미닌 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 유사물, 변이체 또는 패밀리-구성원 중 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 세포-흡착 분자들은 피브로넥틴 또는 이의 생물학적으로 활성 단편이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 피브로넥틴은 재조합 피브로넥틴이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 세포-흡착 분자들은 피브로넥틴 및 비트로넥틴 또는 이의 생물학적으로 활성 단편들의 혼합물이다. 또 다른 구체예에서, 피브로넥틴 및 비트로넥틴은 각각 표면상에서 약 100ng/㎠의 농도 및/또는 표면을 피복하는데 이용되는 용액 안에 약 1ug/mL의 농도의 농도로 존재한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 피브로넥틴과 비트로넥틴은 모두 재조합에 의한 것이다. 표면에 하나 이상의 세포-흡착 분자들을 접촉시키는 것은 독립적인 단계로 실행될 수 있거나 배지 안에 하나 이상의 세포-흡착 분자들을 포함시킴으로써 실행될 수 있다.
핵산들은 하나 이상의 비-정규, 또는 "변형된" 잔기들(가령, 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실, 및 시토신 또는 표준 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오시드 또는 이의 데옥시뉴클레오티드 유도체들이외의 잔기)을 함유할 수 있다. 특히, 슈도우리딘-5'-삼인산염은 시험관내-전사 반응에서 합성 RNA를 만들기 위하여 우리딘-5'-삼인산염을 대신할 수 있으며, 이때 합성 RNA의 우리딘 잔기들의 최대 100%가 슈도우리딘 잔기들로 대체될 수 있다. 슈도우리딘과 5-메틸시티딘이 각각 우리딘과 시티딘을 대신하여 완벽하게 대체될 경우에도 시험관내-전사는 잔기 면역원성을 가진 RNA를 만들 수 있다(Angel Reprogramming Human Somatic Cells to Pluripotency Using RNA [Doctoral Thesis]. Cambridge, MA: MIT; 2011 참고, 이의 내용들은 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 이러한 이유로 세포들을 RNA로 형질감염시킬 때, 형질감염 배지에 면역억제제를 흔히 첨가한다. 특정 상황에서, 면역억제제를 형질감염 배지에 추가하는 것이 바람직하지 않을 수도 있는데, 부분적인 이유로는 이러한 목적에 가장 흔히 이용되는 재조합 면역억제제, B18R이 비싸고, 제작이 곤란하기 때문일 것이다. B18R 또는 임의의 다른 면역억제제의 사용 없이도 본 발명의 방법들에 따라 세포들을 형질감염시키고 및/또는 재프로그래밍화시킬 수 있음이 또한 발견되었다. 다른 면역억제제들을 이용하지 않고, 본 발명의 방법들에 따라 세포들을 재프로그래밍시키는 것은 신속하고, 효율적이며, 신뢰성있다는 것이 더 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 면역억제제를 함유는 형질감염 배지에서 세포를 형질감염시키는 방법들에 관계된다. 다른 구체예들은 면역억제제를 함유하지 않는 형질감염 배지에서 세포를 재프로그래밍화시키는 방법에 관계된다. 특정 상황에서, 예를 들면 높은 세포 밀도를 이용할 경우, 면역억제제를 형질감염 배지에 추가하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 면역억제제가 함유된 형질감염 배지에서 세포를 형질감염시키는 방법에 관계된다. 다른 구체예들은 면역억제제가 함유된 형질감염 배지에서 세포를 재프로그래밍화시키는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 면역억제제는 B18R 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 유사물, 변이체 또는 이의 패밀리-구성원 또는 덱사메타손 또는 이의 유도체다. 한 구체예에서, 세포들은 약 20,000개 세포/㎠ 미만의 밀도에서 도말되고, 형질감염 배지는 면역억제제를 함유하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 형질감염 배지는 면역억제제를 함유하지 않고, 과도한 독성을 방지하기 위하여 핵산 분량(dose)이 선택된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 핵산 분량은 6-웰 플레이트에서 웰당 2μg 미만, 가령 6-웰 플레이트에서 웰당 약 0.25μg또는 약 1μg이다.
본 발명의 특정 구체예들에 따라 생성된 재프로그래밍된 세포들은 외인성 DNA 서열들을 함유하지 않고, 그리고 특정화안된, 그리고 독성 및/또는 병원성 오염물질들을 함유할 수도 있는 동물 또는 인간으로부터 유도된 생성물에 노출되지 않기 때문에, 환자로 이식을 포함하는 치료제 적용에 적합하다. 더욱이, 본 발명의 특정 구체예들의 고감도, 고효과 및 고신뢰성은 돌연변이들의 획득 및 축적의 위험과 다른 염색체 비정상의 획득 위험성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예들은 치료제 적용에 사용이 적합한 안전 프로파일을 보유한 세포들을 생산하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 RNA 및 배지(동물 또는 인간으로부터 유도된 성분들을 함유하지 않는)를 이용한 세포의 재프로그래밍은 이질유전적 물질에 노출된 적이 없는 세포들을 만들 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 바람직한 안전 프로파일을 보유한 재프로그래밍화된 세포에 관계된다. 한 구체예에서, 재프로그래밍화된 세포는 정상적인 핵형을 가진다. 또 다른 구체예에서, 재프로그래밍화된 세포는 환자 게놈과 비교하여 약 5회 미만의 복사체-수 변이 (CNVs), 가령 환자의 게놈과 비교하여 약 3회 미만의 복사체-수 변이, 또는 환자 게놈과 비교하여 0의 복사체-수 변이를 보유한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 재프로그래밍화된 세포는 정상적인 핵형을 보유하고, 환자 게놈과 비교하여 코딩 영역내 약 100개 미만의 단일 뉴클레오티드 변이체들, 또는 환자 게놈과 비교하여 코딩 영역내 약 50개 미만의 단일 뉴클레오티드 변이체들, 또는 환자 게놈과 비교하여 코딩 영역내 약 10개 미만의 단일 뉴클레오티드 변이체들을 가진다.
엔도톡신과 뉴클레아제는 공동-정제될 수 있거나 및/또는 다른 단백질들, 가령 혈청 알부민과 연합될 수 있다. 재조합 단백질들은 특히, 연합된 엔도톡신과 뉴클레아제의 높은 수준을 보유할 수 있는데, 이들 생산 동안 일어날 수 있는 세포들의 용해 때문일 수 있다. 엔도톡신과 뉴클레아제는 예를 들면, 아세틸화에 의해, 안정화제 가령 옥타노에이트 나트륨의 추가와, 이어서 열 처리에 의해, 뉴클레아제 저해제들을 알부민 용액 및/또는 배지에 추가에 의해, 결정화에 의해, 하나 이상의 이온-교환 수지와의 접촉에 의해, 목탄과의 접촉에 의해, 준비된 전기영동에 의해 또는 친화력 크로마토그래피에 의한 것을 포함하는 본 발명의 많은 방법에 의해 감소, 제거, 대체 또는 비활성화될 수 있다. 배지 및/또는 배지의 하나 이상의 성분들으로부터 엔도톡신 및/또는 뉴클레아제를 부분적으로 또는 완전하게 감소, 제거, 대체 또는 비활성화시키면 세포들이 형질감염 및 재프로그래밍화되는 효과가 증가될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 하나 이상의 엔도톡신 및/또는 뉴클레아제가 부분적으로 또는 완전하게 감소, 제거, 대체 또는 비활성화되도록 형질감염 배지가 처리된, 세포를 형질감염시키는 방법에 관계된다. 다른 구체예들은 핵산들의 최소 분해를 야기하는 배지에 관계된다. 한 구체예에서, 이 배지는 약 1EU/mL 미만, 또는 약 0.1EU/mL 미만, 또는 약 0.01EU/mL 미만을 함유한다.
특정 상황에서, 단백질-기반 지질 운반체들 가령, 혈청 알부민은 비-단백질-기반 지질 운반체들 가령, 메틸-베타-시클로덱스트린으로 대체될 수 있다. 본 발명의 배지는 지질 운반체 없이 또한 이용될 수 있으며, 예를 들면, 지질 운반체의 존재를 요구하지 않거나, 또는 이의 존재로 이익을 얻지 못하는 방법을 이용하여 형질감염이 실행될 때, 예를 들면, 하나 이상의 중합체-기반 형질감염 시약들 또는 펩티드 -기반 형질감염 시약들을 이용할 때, 이용될 수 있다.
단백질-연합된 많은 분자들, 가령 금속들은 세포에 독성이 매우 클 수 있다. 이 독성은 배양에서 생존능의 감소를 야기할 뿐만 아니라, 돌연변이의 획득을 초래할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 독성 분자들이 없는 세포들을 생산하는 추가적인 장점을 가진다.
용액에 단백질을 현탁시키고, 용액의 전도율을 측정함으로써, 단백질 연합된-분자 성분이 측정될 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 물 안에 10% 단백질 용액은 약 500 μmho/cm 미만의 전도율을 가지는, 단백질을 함유하는 배지에 관계된다. 한 구체예에서, 이 용액은 약 50 μmho/cm 미만의 전도율을 가진다.
낮은-산소 환경은 많은 유형의 세포들의 배양에 유익할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 세포들이 낮은-산소 환경에서 배양되고, 형질감염되고, 재프로그래밍되고 및/또는 유전자-에디팅된, 세포들을 배양, 형질감염, 재프로그래밍화, 및/또는 유전자-에디팅하는 방법들에 관계된다. 한 구체예에서, 낮은-산소 환경은 약 2% 내지 약 10% 산소, 또는 약 4% 내지 약 6% 산소를 함유한다.
세포들로 전달되는 핵산의 양은 핵산의 바람직한 효과를 증가시키기 위하여 증가될 수 있다. 그러나, 세포들로 전달되는 핵산의 양이 특정수준을 초과하여 증가되는 경우, 일부 형질감염 시약의 독성으로 인하여 세포들의 생존능 감소를 초래할 수 있다. 핵산이 고정된 용적(예를 들면, 세포-배양 용기내에서 성장된 조직 또는 세포들의 영역내 세포)으로 세포 집단으로 전달될 때, 각 세포로 전달되는 핵산의 양은 세포들 집단 및 세포들의 밀도로 전달되는 전체 핵산의 양에 따라 달라지며, 세포 밀도가 높을수록 각 세포로 전달되는 핵산이 적어진다는 것이 밝혀졌다. 특정 구체예들에서, 세포는 1회 이상 하나 이상의 핵산들로 형질감염된다. 특정 조건들, 예를 들면 세포들이 증식하고 있을 때, 이 세포 밀도는 1회 형질감염으로부터 다음 형질감염에서 변화될 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 세포가 1회 이상 형질감염되고, 이 세포로 전달되는 핵산의 양이 두 형질감염에 있어서 상이한, 핵산으로 세포를 형질감염시키는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 이 세포는 두 형질감염 사이에서 증식되며, 세포로 전달되는 핵산의 양은 첫 번째 형질감염보다는 두 번째 형질감염에서 더 많다. 또 다른 구체예에서, 세포는 2회 이상 형질감염되고, 세포로 전달되는 핵산의 양은 3번의 형질감염중 첫 번째 보다는 두 번째 형질감염에서 더 많고, 세포로 전달되는 핵산의 양은 동일한 3번의 형질감염중 두 번째보다는 세번째 형질감염에서 더 많다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 1회 이상 형질감염되고, 각 형질감염에서 이 세포로 전달되는 핵산의 최대량은 적어도 2회의 연속 형질감염에 대해 적어도 약 80% 생존능을 만드는데 충분히 낮다.
일련의 형질감염에서 증식하는 세포 집단으로 전달되는 핵산의 양을 조절하면, 핵산의 증가된 효과와 세포의 생존능의 증가 모두를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 특정 상황에서, 일련의 형질감염에서 세포들에게 하나 이상의 재프로그래밍 인자들을 인코딩하는 하나 이상의 핵산들을 접촉시킬 때, 재프로그래밍의 효과는 일련의 형질감염중 적어도 일부분에서 나중에 일어나는 형질감염에서 전달되는 핵산의 양이 앞선 형질감염에서 전달되는 핵산의 양보다 더 많을 때, 증가될 수 있다는 것이 더 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 세포를 재프로그래밍화시키는 방법에 관계되는데, 이때 일련의 형질감염에서 하나 이상의 핵산들이 세포로 반복적으로 전달되며, 나중에 일어나는 적어도 1회의 형질감염에서 세포로 전달되는 핵산의 양이 먼저 일어나는 적어도 1회의 형질감염의 것보다 더 많다. 한 구체예에서, 이 세포는 약 2 내지 약 10회, 또는 약 3 내지 약 8 회, 또는 약 4 내지 약 6 회 형질감염된다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 핵산들은 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 이 세포는 약 2 내지 약 10 회 형질감염되고, 그리고 각 형질감염에서 세포로 전달되는 핵산의 양은 가장 최근에 앞서 일어난 형질감염에서 세포로 전달되는 핵산의 양과 동일하거나 또는 이보다 더 많다. 여전히 또 다른 구체예에서, 제 1 형질감염에서 이 세포로 전달되는 핵산의 양은 약 20ng/㎠ 내지 약 250ng/㎠, 또는 100ng/㎠ 내지 600ng/㎠이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 약 12 내지 약 48 시간의 간격으로 약 5회 형질감염되며, 이 세포로 전달되는 핵산의 양은 제1 형질감염의 경우 약 25ng/㎠이며, 제2 형질감염의 경우 약 50ng/㎠이며, 제3 형질감염의 경우 약 100ng/㎠이며, 제4 형질감염의 경우 약 200ng/㎠, 그리고 제5 형질감염의 경우 약 400ng/㎠이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 제5의 형질감염 이후 적어도 1회 더 형질감염되며, 이 세포로 전달되는 핵산의 양은 약 400ng/㎠이다.
특정 구체예들은 세포를 형질감염시키는 방법에 관계되는데, 이때 핵산의 양은 세포 밀도를 측정하고, 그리고 세포 밀도의 측정치에 근거하여 형질감염된 핵산의 양을 선택함으로써 결정된다. 한 구체예에서, 이 세포는 시험관 배양에 존재하며, 세포 밀도는 광학적 수단에 의해 측정된다. 또 다른 구체예에서, 이 세포는 반복적으로 형질감염되며, 이 세포 밀도는 두 형질감염 사이에서 증가되며, 형질감염된 핵산의 양에서 두 차례 형질감염중 두 번째의 양이 첫 번째 형질감염의 양보다 더 많다.
특정 상황에서, 본 발명의 배지에서 배양된 세포들의 형질감염 효과 및 생존능은 배지를 조건화시킴으로써 개선될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 배지를 조건화시키는 방법에 관계된다. 다른 구체예들은 조건화된 배지에 관계된다. 한 구체예에서, 영양공급세포는 섬유아세포들이며, 배지는 대략 24 시간 동안 조건화된다. 다른 구체예들은 세포를 형질감염시키는 방법에 관계되는데, 이때 형질감염 배지는 조건화된다. 다른 구체예들은 세포의 재프로그래밍화 및/또는 유전자-에디팅 방법에 관계되는데, 이때 배지는 조건화된다. 한 구체예에서, 영양공급세포는 유사분열적으로 비활성화되는데, 예를 들면, 화학물질 가령 미토마이신-C에 노출에 의해 또는 감마 방사선에 노출됨으로써 비활성화된다. 특정 구체예들에서, 예를 들면, 그리고 이론에 결부되는 것을 원하지 않지만, 영양공급세포로부터 이 세포로 질병 전파 위험을 회피하기 위하여 부분적으로 자가조직 재료들만을 이용하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 세포를 형질감염시키는 방법에 관계되는데, 이때 형질감염 배지는 조건화되며, 영양공급세포는 형질감염되는 세포와 동일한 개체로부터 유도된다. 다른 구체예들은 세포의 재프로그래밍화 및/또는 유전자-에디팅하는 방법에 관계되는데, 이때 배지는 조건화되고, 영양공급세포는 재프로그래밍화 및/또는 유전자-에디팅되는 개체와 동일한 개체로부터 유도된다.
조건화에 의해 배지에 몇 가지 분자들이 추가될 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 조건화된 배지에 존재하는 하나 이상의 분자들이 보충된 배지에 관계된다. 한 구체예에서, 이 배지에는 Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 유사물, 변이체, 항진제, 또는 패밀리-구성원이 보충된다. 또 다른 구체예에서, 이 배지에는 TGF-β 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 유사물, 변이체, 항진제, 또는 패밀리-구성원이 보충된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 세포는 본 발명의 방법에 따라 재프로그래밍화되는데, 이때 배지에는 약 1 내지 5일 동안 TGF-β가 보충되지 않으며, 그 다음 적어도 약 2일 동안 TGF-β가 보충된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 배지에는 IL-6, IL-6R 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 유사물, 변이체, 항진제, 또는 패밀리-구성원이 보충된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 배지에는 스핑고리피드 또는 지방산이 보충된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 스핑고리피드는 리소포스파티드산, 리소스핑고미엘린, 스핑고신-1-포스페이트 또는 이의 생물학적으로 활성 유사물, 변이체 또는 유도체다.
특정 조건하에서 세포를 유사분열적으로 비활성화시키는 것에 추가하여, 조사(irradiation)에 의해 세포들의 유전자 발현을 변화시켜, 조사를 받지 않은(non-irradiated) 세포들보다 이 세포들이 특정 단백질을 덜 생산하고, 특정 다른 단백질들, 예를 들면, Wnt 패밀리 단백질들의 구성성분을 더 생산하도록 할 수 있다. 추가로, Wnt 패밀리 단백질들의 특정 구성성분은 세포들의 성장 및 형질변환을 촉진시킬 수 있다. 특정 상황에서, RNA 재프로그래밍의 효과는 이 세포에 미토마이신-c-처리된 영양공급세포 대신 조사를 받은(irradiated) 영양공급 세포를 이용하여 조건화된 배지를 접촉시킴으로써 상당히 증가될 수 있음이 밝혀졌다. 조사를 받은(irradiated) 영양공급세포를 이용하였을 때 관찰되는 재프로그래밍 효과의 증가는 영양공급세포에 의해 분비되는 Wnt 단백질들에 의해 일부 야기된다는 것이 더 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 세포를 재프로그래밍화시키는 방법에 관계되는데, 이때 이 세포는 Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 유사물, 변이체, 패밀리-구성원 또는 Wnt 단백질들의 하류 표적들의 항진제들을 포함하는 항진제, 및/또는 Wnt 단백질들의 하나 이상의 생물학적 효과들을 모방하는 물질들, 예를 들면, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘에 접촉된다.
본 발명의 배지는 배양시 섬유아세포들 및 인간 다능성 줄기 세포들을 포함하는 세포들을 유지시키는데 이용(가령, "유지 배지"로써)될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 유지 배지로 이용되는 배지에 관계된다. 한 구체예에서, 이 배지는 인간으로부터 유도된 임의의 성분들을 함유하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 이 배지는 화학적으로 특정화된다.
DNA-기반의 많은 재프로그래밍 방법들의 낮은 효율로 인하여, 이들 방법은 단지 소수의 세포들만을 포함할 수 있는 환자 시료들로부터 유도된 세포들을 이용하는 것이 곤란하거나 또는 불가능할 수 있다. 대조적으로, 본 발명의 특정 구체예의 높은 효율은 단일 세포를 포함하는 소수의 세포로부터 신뢰할 수 있는 재프로그래밍을 허용할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 많은 배양물을 우선적으로 확립하지 않고, 생검 시료로부터 세포를 재프로그래밍하는데 이용될 수 있다. 생검으로부터 직접적으로 세포들을 재프로그래밍하는 것은 특정 상황에서 바람직할 수 있는데, 예를 들면 개인별 치료제를 만들 때, 1차 세포들의 많은 배양물을 확립하는 것은 부분적인 이유로써 시간 소모적일 수 있고, 많은 배양물의 확립에 관련된 추가 취급으로 오염 위험을 증가시킬 수 있고, 그리고 배양에서의 추가적인 시간은 게놈 불안정성의 위험 증가 및 점 돌연변이들, 복사체-수 변이, 그리고 핵형 비정상을 포함하는 돌연변이의 획득 위험을 수반할 수 있기 때문이다. 따라서, 특정 구체예들은 환자 또는 생검 시료로부터 세포를 우선 수거하고, 그 다음 이 세포를 재프로그래밍함으로써, 세포를 재프로그래밍화시키는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 이 세포는 많은 배양물을 우선적으로 확립하지 않고도 재프로그래밍화되는데, 선호적으로 제 1 형질감염은 배양물이 2회 이상 계대되기 전에 실행된다. 또 다른 구체예에서, 이 세포는 환자로부터 수거되고, 제 1 형질감염은 이 세포가 처음 도말된 시점으로부터 약 14일 후에 실행된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 생검 시료로부터 수거되고, 그리고 제 1 형질감염은 이 세포가 처음 도말된 시점으로부터 약 7일 후에 실행된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 생검은 온전한-두께의 피부 펀치 생검이며, 이 세포는 하나 이상의 효소로 처리하여 생검 시료로부터 수거되고, 이 세포는 하나 이상의 세포-흡착 분자들이 피복된 표면 상에 도말되거나 및/또는 이 세포는 세포-흡착 분자를 함유하는 배지에 도말되고, 이 세포는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는 하나 이상의 핵산들로 형질감염되고, 그리고 제 1 형질감염은 이 세포가 처음 도말된 시점으로부터 약 14일 후에 실행된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 효소는 콜라게나제다. 여전히 또 다른 구체예에서, 콜라게나제는 동물-성분이 없다. 또 다른 구체예에서, 콜라게나제는 약 0.1mg/mL 내지 약 10mg/mL, 또는 약 0.5mg/mL 내지 약 5mg/mL의 농도로 존재한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 혈액으로부터 수거된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 환자의 혈액으로부터 유도된 하나 이상의 단백질을 함유하는 배지에 도말된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 DMEM/F12 + 2mM L-알라닐-L-글루타민 + 약 5% 내지 약 25% 환자-유도된 혈청, 또는 약 10% 내지 약 20% 환자-유도된 혈청, 또는 약 20% 환자-유도된 혈청에서 도말된다.
특정 상황에서, 본 발명의 배지를 이용하여 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc를 인코딩하는 RNA 혼합물로 세포들을 형질감염시키면 세포의 증식 속도를 증가시킬 수 있다는 것이 확인되었다. 이 세포들로 전달되는 RNA의 양이 너무 적어서 모든 세포들이 형질감염되었음이 확신되지 않을 경우, 세포의 일부 분획만 증가된 증식 속도를 보일 수 있다. 특정 상황에서, 가령 개인별 치료제를 만들 때, 세포들의 증식 속도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있는데, 일부 그 이유는 증식 속도를 증가시킴으로써 이 치료제를 만드는데 필요한 시간을 감소시키고, 따라서 치료제의 비용을 줄일 수 있기 때문이다. 따라서, 특정 구체예들은 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc를 인코딩하는 RNA 혼합물로 세포를 형질감염시키는 방법에 관계되는데, 이때 이 세포는 증가된 증식 속도를 나타낸다. 한 구체예에서, 증가된 증식 속도를 보이는 세포들은 배양물로부터 단리된다. 또 다른 구체예에서, 증가된 증식 속도를 보이는 세포들은 하나 이상의 세포 유형의 성장을 지원하는 배지에서 확장 및 배양되고, 그리고 하나 이상의 세포 유형중 하나의 세포로 재프로그래밍된다.
많은 질환들은 하나 이상의 돌연변이들과 연합된다. 단독으로 또는 다른 분자들과 복합되어 돌연변이 (예를 들면, 유전자-에디팅)를 교정하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포에 접촉시킴으로써, 돌연변이들은 교정될 수 있다. 이러한 단백질의 예로는 아연 핑거 뉴클레아제와 TALEN들을 포함한다. 따라서, 특정 구체예들은 핵산으로 세포를 형질감염시키는 방법에 관계되는데, 이때 이 핵산은 단독으로 또는 다른 분자들과 복합되어 DNA 분자에서 단일-가닥 또는 이중-가닥 브레이크를 만드는 단백질을 인코딩한다. 한 구체예에서, 이 단백질은 아연 핑거 뉴클레아제 또는 TALEN이다. 또 다른 구체예에서, 이 핵산은 RNA 분자다. 여전히 또 다른 구체예에서, 단일-가닥 또는 이중-가닥 브레이크는 다음에서 선택된 유전자의 전사 개시 부위의 약 5,000,000개 염기 안에 있다: CCR5, CXCR4, GAD1, GAD2, CFTR, HBA1, HBA2, HBB, HBD, FANCA, XPA, XPB, XPC, ERCC2, POLH, HTT, DMD, SOD1, APOE, PRNP, BRCA1, 및 BRCA2 또는 이의 유사체, 변이체 또는 패밀리-구성원. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 단일-가닥 또는 이중-가닥 브레이크의 영역 안에 DNA 서열을 삽입시킴으로써, 또는 단일-가닥 또는 이중-가닥 브레이크의 영역 안에 DNA 서열의 변화를 야기시킴으로써 복구 주형으로 작용하는 핵산으로 형질감염된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 재프로그래밍화되고, 후속적으로 이 세포는 유전자-에디팅된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 유전자-에디팅되고, 후속적으로 이 세포는 재프로그래밍화된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 유전자-에디팅과 재프로그래밍은 서로 약 7일 이내에 실행된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 유전자-에디팅과 재프로그래밍은 동시에 또는 동일 날짜에 실행된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 피부 세포이며, 피부 세포는 유전자-에디팅되어, CCR5 유전자를 파괴하고, 피부 세포는 조혈 줄기 세포로 재프로그래밍되고, 따라서 HIV/AIDS용 치료제를 만들며, 이 치료제는 HIV/AIDS 환자로 도입된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 피부 세포는 치료제가 도입될 동일한 환자로부터 유도된다.
본 발명의 치료제를 만들기 위하여 본 발명의 방법에 따라 에디팅될 수 있는 유전자들에는 정상적인 기능으로 복원되기 위하여 에디팅되는 유전자들, 뿐만 아니라 기능의 감소 또는 제거를 위하여 에디팅되는 유전자들이 포함된다. 이러한 유전자들은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 베타 글로빈 (HBB), 이의 돌연변이는 겸상 세포 질환 (SCD) 및 β-지중해빈혈을 야기시킬 수 있고, 유방암 1 초기 개시 (BRCA1) 및 유방암 2 초기 개시 (BRCA2), 이의 돌연변이는 유방암에 대한 민감성을 증가시킬 수 있고, C-C 케모킨 수용체 유형 5 (CCR5) 및 C-X-C 케모킨 수용체 유형 4 (CXCR4), 이의 돌연변이는 HIV 감염, 낭포성 섬유증에 대한 저항성을 부여할 수 있고, 막통과 전도성 조절물질 (CFTR), 이의 돌연변이는 낭포성 섬유증을 야기시킬 수 있고, 디스트로핀(DMD), 이의 돌연변이는 Duchenne 근위축증 및 Becker 근위축증을 포함하는 근위축증을 야기할 수 있고, 글루탐산염 데카르복실라제 1 및 글루탐산염 데카르복실라제 2 (GAD1, GAD2), 이의 돌연변이는 β-세포들의 자가면역 파괴를 예방할 수 있고, 헤모글로빈 알파 1, 헤모글로빈 알파 2, 및 헤모글로빈 델타 (HBA1, HBA2, 및 HBD), 이의 돌연변이는 지중해빈혈을 야기시킬 수 있고, Huntington (HTT), 이의 돌연변이는 헌팅턴병을 야기시킬 수 있고, 슈퍼옥시드 디스무타제 1 (SOD1), 이의 돌연변이들은 근위축성 측색 경화증 (ALS)을 야기할 수 있고, XPA, XPB, XPC, XPD (ERCC6) 및 폴리머라제 (DNA 지향된), eta (POLH), 이의 돌연변이들은 색조피부건조증을 야기시킬 수 있고, 류신-풍부한 반복 키나제 2 (LRRK2), 이의 돌연변이들은 파킨슨병, 및 판코니 빈혈을 야기할 수 있고, 보체 집단 A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M, N, P (FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ, FANCL, FANCM, FANCN, FANCP), 및 RAD51 homo10g C (S. cerevisiae) (RAD51C), 이의 돌연변이들은 판코니 빈혈을 야기할 수 있다.
특정 구체예들은 하나 이상의 유전자-에디팅 단백질들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 치료제에 관계된다. 다른 구체예들은 본 발명의 방법에 따라 형질감염된, 재프로그래밍화된, 및/또는 유전자-에디팅된 하나 이상의 세포들을 포함하는 치료제에 관계된다. 한 구체예에서, 세포는 형질감염되고, 재프로그래밍화되고, 및/또는 유전자-에디팅되고, 그리고 형질감염된, 재프로그래밍화된, 및/또는 유전자-에디팅된 세포는 환자에게 도입된다. 또 다른 구체예에서, 이 세포는 형질감염된, 재프로그래밍화된 및/또는 유전자-에디팅된 세포가 도입되는 동일한 환자로부터 수거된다. 본 발명의 치료제로 치료될 수 있는 질환의 예로는 알츠하이머병, 척추 손상, 근위축성 측색 경화증, 낭포성 섬유증, 허혈성 및 확장성 심근증을 포함하는 심장 질환, 황반 변성, 파킨슨병, 헌팅턴병, 당뇨병, 겸상-적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 판코니 빈혈, 색조피부건조증, 근위축증, 중증 복합형 면역결핍증, 유전성 감각 신경병, 암, 및 HIV/AIDS를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에서, 치료제는 화장품을 포함한다. 한 구체예에서, 세포는 환자로부터 수거되고, 이 세포는 재프로그래밍화되고, 그리고 다수의 지방 세포들로 확장되며, 따라서 화장품이 생산되고, 이 화장품은 환자에게 도입된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 화장품은 조직 재건에 이용된다.
특정 유형들의 세포들을 생산하고, 그리고 특정 유형의 세포들을 포함하는 치료제들의 생산을 위한 상세한 실시예들이 본 명세서에서 제공되지만, 본 발명의 방법들은 예를 들면, 본 발명의 방법들에 따라 세포를 재프로그래밍하고, 그리고 개발하는 동안 세포의 현미환경에 존재하는 조건과 닮은 조건들을 제공함으로써 하나 이상의 개발 양태들을 모방하는 조건들하에서 이 세포를 배양함으로써, 다른 많은 유형의 세포들을 생산하고, 하나 이상의 다른 많은 유형의 세포들들을 포함하는 치료제들을 만드는데 이용될 수 있다.
특정 구체예들은 다양한 인간 백혈구 항원 (HLA) 유형 ("HLA-정합된 라이브러리들")를 가진 세포들의 라이브러리에 관계된다. HLA-정합된 라이브러리는 환자 세포들로부터 생산되는 치료제를 환자가 기다릴 필요없이 치료제의 신속한 생산 및 신속한 공급을 제공하기 때문에 부분적으로 유익할 수 있다. 이러한 라이브러리는 심장 질환 및 혈액 질환들의 치료 및/또는 치료제의 즉각적 이용으로부터 이익을 얻을 수 있는 면역계 환자의 치료에 특히 유익할 수 있다.
특정 구체예들은 조직/장기 모델링 및/또는 질환 모델링에 이용되는 세포에 관계된다. 한 구체예에서, 피부 세포는 다수의 심장 세포들로 재프로그래밍화되고, 그리고 확장되고, 그리고 심장 세포들은 심독성(안전성 테스트의 예로써)에 대한 생물활성 분자들을 선별하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 알츠하이머병을 가진 환자의 피부 세포가 다수의 피질 뉴우런으로 재프로그래밍화되고, 확장되어, 피질 뉴우런은 불용성 플라그의 축적을 감소시키는 생물활성 분자 (효과 테스트의 예로써)를 선별하는데 이용된다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예들은 안전성 테스트 및/또는 효과 테스트에 유용하다.
특정 구체예들은 스캐폴드 안에 세포들을 포집 및/또는 접종시키는 방법에 관계되며, 스캐폴드 안에 포집 및/또는 접종된 세포들에 관계된다. 특정 상황에서, 세포들을 포집시키는 것이 유리할 수 있는데, 부분적인 이유는 포집된 세포들은 포집되지 않은 세포들보다 면역원성이 적을 수 있기 때문이다. 한 구체예에서, 세포는 포도당-반응성 인슐린-생산 세포로 재프로그래밍되고, 포도당-반응성 인슐린-생산 세포는 물질 가령, 알긴산염에 포집되고, 그리고 포집된 포도당-반응성 인슐린-생산 세포는 유형 1 당뇨병 환자에게 도입된다. 또 다른 구체예에서, 복막내 주사 또는 문맥내 주사에 의해 도입된다. 특정 상황에서, 스캐폴드 안에 세포를 접종시키는 것은 스캐폴드가 물리적인 안정성을 제공할 수 있기 때문에 일부 유익할 수 있다. 한 구체예에서, 세포는 섬유아세포들과 케라틴생성세포로 재프로그래밍화되고, 다수의 섬유아세포들과 케라틴생성세포으로 확장되며, 섬유아세포들과 케라틴생성세포들은 콜라겐을 포함하는 스캐폴드에 접종되며, 접종된 스캐폴드는 상처에 적용되어, 합성 피부 이식편을 형성한다. 또 다른 구체예에서, 세포는 재프로그래밍화되고, 재프로그래밍화된 세포는 액체 또는 슬러리 형태에서 스캐폴드와 혼합되고, 이 혼합물은 환자에게 도입되고, 스캐폴드의 단단함은 도입시 또는 도입후 증가된다.
특정 구체예들은 세포들을 정제하는 방법에 관계된다. 형질감염, 재프로그래밍, 및 유전자-에디팅으로 원하는 표현형을 가진 세포들과 하나 이상의 원하지 않는 표현형을 가진 세포들이 포함된 세포 집단이 대개 만들어질 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 형질감염된, 재프로그래밍화된, 및/또는 유전자-에디팅된 세포들을 정제하는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 이 세포들은 밀도 구배(gradient)를 이용하여 정제된다. 또 다른 구체예에서, 이 세포들은 하나 이상의 원하지 않는 표현형을 보유하는 세포들로부터 하나 이상의 원하는 표현형을 가진 세포들의 분리를 허용하는 하나 이상의 항체에 세포를 접촉시킴으로써, 정제된다. 또 다른 구체예에서, 항체는 기질, 바람직하게는 자석 비드에 결합된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 항체는 형광 분자에 결합되고, 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 다른 유사한 수단에 의해 분리가 실행된다. 또 다른 구체예에서, 원하지 않는 표현형을 가진 세포들은 증식이 억제되는데, 바람직하게는 이 세포들을 세포의 분할을 방지하는 하나 이상의 분자들, 바람직하게는 미토마이신-c, 5-아자-데옥시시티딘, 플루오르우라실 또는 이의 생물학적으로 활성 유사물 또는 이의 유도체에 접촉시킴으로써 증식이 억제된다. 다른 구체예들은 하나 이상의 원하는 표현형을 가진 세포 분획이 농축되도록 정제된 세포들을 포함하는 치료제에 관계된다.
특정 구체예들은 돌연변이들과 질환들의 모델을 포함하는 동물 모델을 생산하는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 동물 피부 세포는 유전자-에디팅되고, 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍된다. 또 다른 구체예에서, 재프로그래밍화된 그리고 유전자-에디팅된 약 1-100개의 세포들은 배반포로 주입되고, 이 배반포는 동물의 자궁각 안으로 이식된다. 한 구체예에서, 동물은 고양이, 개, 마우스, 돼지, 말, 소, 닭, 양, 염소, 물고기, 영장류 및 렛으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 동물은 렛이다.
합성 RNA 분자들에 혼입된 비-정규 특정 뉴클레오티드들은 외인성 핵산들을 탐지하는 단백질, 예를 들면, 단백질 키나제 R, Rig-1 및 올리고아데닐레이트 합성효소 패밀리 단백질들의 결합을 간섭함으로써 부분적으로 합성 RNA 분자들의 독성을 감소시킬 수 있다. 합성 RNA 분자들에 혼입되어, 합성 RNA 분자들의 독성을 감소시키는 것으로 보고된 비-정규 뉴클레오티드들은 슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 2-티오우리딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 그리고 이의 특정 조합을 포함한다. 그러나, 합성 RNA 분자들의 독성을 더 낮출 수 있는 비-정규 뉴클레오티드들의 화학적 특징은 현재까지 알려지지 않고 있다. 더욱이, 대부분의 비-정규 뉴클레오티드들, 예를 들면, 5-메틸우리딘, 2-티오우리딘, 5-메틸시티딘, 및 N6-메틸아데노신의 다량의 혼입으로 단백질로 해독될 수 있는 효과를 감소시킬 수 있고, 단백질 발현을 필요로 하는 용도에서 이들 뉴클레오티드을 함유하는 합성 RNA 분자들의 이용성을 제한시킨다. 추가적으로, 합성 RNA 분자들이 단백질로 해독될 수 있는 효과의 감소없이, 합성 RNA 분자들 안에서 우리딘이 슈도우리딘으로 완전하게 대체될 수 있지만, 특정 상황에서, 예를 들면, 빈번하게 반복된 형질감염을 실행할 때, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 및 슈도우리딘 만을 함유하는 합성 RNA 분자들은 과도한 독성을 나타낼 수 있다.
피리미딘의 경우 2C 및/또는 4C 및/또는 5C 위치 또는 퓨린의 경우 6C 및/또는 7N 및/또는 8C 위치에서 하나 이상의 치환체를 포함하는 하나 이상의 비-정규 뉴클레오티드들을 함유하는 합성 RNA 분자들은 정규 뉴클레오티드들만을 함유하는 합성 RNA 분자들보다 독성이 덜 할 수 있다는 것이 밝혀졌는데, 일부 이유로는 이들 위치에서 치환체가 외인성 핵산들을 탐지하는 단백질에 의한 합성 RNA 분자들의 인지를 간섭하는 치환체의 능력으로 인한 것이며, 더욱더, 이들 위치에서 치환체는 염기-쌍형성(pairing) 및 염기-쌓기(stacking) 상호작용의 간섭이 부족하기 때문에 합성 RNA 분자들이 단백질로 해독되는 효과에 적어도의 영향을 가질 수 있기 때문이다.
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피리미딘의 경우 2C 및/또는 4C 및/또는 5C 위치 또는 퓨린의 경우 6C 및/또는 7N 및/또는 8C 위치에서 하나 이상의 치환체를 포함하는 하나 이상의 비-정규 뉴클레오티드들의 예로는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:2-티오우리딘, 5-아자우리딘, 슈도우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, 5-아미노우리딘, 5-히드록시우리딘, 5-메틸-5-아자우리딘, 5-아미노-5-아자우리딘, 5-히드록시-5-아자우리딘, 5-메틸슈도우리딘, 5-아미노슈도우리딘, 5-히드록시슈도우리딘, 4-티오-5-아자우리딘, 4-티오슈도우리딘, 4-티오-5-메틸우리딘, 4-티오-5-아미노우리딘, 4-티오-5-히드록시우리딘, 4-티오-5-메틸-5-아자우리딘, 4-티오-5-아미노-5-아자우리딘, 4-티오-5-히드록시-5-아자우리딘, 4-티오-5-메틸슈도우리딘, 4-티오-5-아미노슈도우리딘, 4-티오-5-히드록시슈도우리딘, 2-티오시티딘, 5-아자시티딘, 슈도이소시티딘, N4-메틸시티딘, N4-아미노시티딘, N4-히드록시시티딘, 5-메틸시티딘, 5-아미노시티딘, 5-히드록시시티딘, 5-메틸-5-아자시티딘, 5-아미노-5-아자시티딘, 5-히드록시-5-아자시티딘, 5-메틸슈도이소시티딘, 5-아미노슈도이소시티딘, 5-히드록시슈도이소시티딘, N4-메틸-5-아자시티딘, N4-메틸슈도이소시티딘, 2-티오-5-아자시티딘, 2-티오슈도이소시티딘, 2-티오-N4-메틸시티딘, 2-티오-N4-아미노시티딘, 2-티오-N4-히드록시시티딘, 2-티오-5-메틸시티딘, 2-티오-5-아미노시티딘, 2-티오-5-히드록시시티딘, 2-티오-5-메틸-5-아자시티딘, 2-티오-5-아미노-5-아자시티딘, 2-티오-5-히드록시-5-아자시티딘, 2-티오-5-메틸슈도이소시티딘, 2-티오-5-아미노슈도이소시티딘, 2-티오-5-히드록시슈도이소시티딘, 2-티오-N4-메틸-5-아자시티딘, 2-티오-N4-메틸슈도이소시티딘, N4-메틸-5-메틸시티딘, N4-메틸-5-아미노시티딘, N4-메틸-5-히드록시시티딘, N4-메틸-5-메틸-5-아자시티딘, N4-메틸-5-아미노-5-아자시티딘, N4-메틸-5-히드록시-5-아자시티딘, N4-메틸-5-메틸슈도이소시티딘, N4-메틸-5-아미노슈도이소시티딘, N4-메틸-5-히드록시슈도이소시티딘, N4-아미노-5-아자시티딘, N4-아미노슈도이소시티딘, N4-아미노-5-메틸시티딘, N4-아미노-5-아미노시티딘, N4-아미노-5-히드록시시티딘, N4-아미노-5-메틸-5-아자시티딘, N4-아미노-5-아미노-5-아자시티딘, N4-아미노-5-히드록시-5-아자시티딘, N4-아미노-5-메틸슈도이소시티딘, N4-아미노-5-아미노슈도이소시티딘, N4-아미노-5-히드록시슈도이소시티딘, N4-히드록시-5-아자시티딘, N4-히드록시슈도이소시티딘, N4-히드록시-5-메틸시티딘, N4-히드록시-5-아미노시티딘, N4-히드록시-5-히드록시시티딘, N4-히드록시-5-메틸-5-아자시티딘, N4-히드록시-5-아미노-5-아자시티딘, N4-히드록시-5-히드록시-5-아자시티딘, N4-히드록시-5-메틸슈도이소시티딘, N4-히드록시-5-아미노슈도이소시티딘, N4-히드록시-5-히드록시슈도이소시티딘, 2-티오-N4-메틸-5-메틸시티딘, 2-티오-N4-메틸-5-아미노시티딘, 2-티오-N4-메틸-5-히드록시시티딘, 2-티오-N4-메틸-5-메틸-5-아자시티딘, 2-티오-N4-메틸-5-아미노-5-아자시티딘, 2-티오-N4-메틸-5-히드록시-5-아자시티딘, 2-티오-N4-메틸-5-메틸슈도이소시티딘, 2-티오-N4-메틸-5-아미노슈도이소시티딘, 2-티오-N4-메틸-5-히드록시슈도이소시티딘, 2-티오-N4-아미노-5-아자시티딘, 2-티오-N4-아미노슈도이소시티딘, 2-티오-N4-아미노-5-메틸시티딘, 2-티오-N4-아미노-5-아미노시티딘, 2-티오-N4-아미노-5-히드록시시티딘, 2-티오-N4-아미노-5-메틸-5-아자시티딘, 2-티오-N4-아미노-5-아미노-5-아자시티딘, 2-티오-N4-아미노-5-히드록시-5-아자시티딘, 2-티오-N4-아미노-5-메틸슈도이소시티딘, 2-티오-N4-아미노-5-아미노슈도이소시티딘, 2-티오-N4-아미노-5-히드록시슈도이소시티딘, 2-티오-N4-히드록시- 5-아자시티딘, 2-티오-N4-히드록시슈도이소시티딘, 2-티오-N4-히드록시-5-메틸시티딘, N4-히드록시-5-아미노시티딘, 2-티오-N4-히드록시-5-히드록시시티딘, 2-티오-N4-히드록시-5-메틸-5-아자시티딘, 2-티오-N4-히드록시-5-아미노-5-아자시티딘, 2-티오-N4-히드록시-5-히드록시-5-아자시티딘, 2-티오-N4-히드록시-5-메틸슈도이소시티딘, 2-티오-N4-히드록시-5-아미노슈도이소시티딘, 2-티오-N4-히드록시-5-히드록시슈도이소시티딘, N6-메틸아데노신, N6-아미노아데노신, N6-히드록시아데노신, 7-데아자아데노신, 8-아자아데노신, N6-메틸-7-데아자아데노신, N6-메틸-8-아자아데노신, 7-데아자-8-아자아데노신, N6-메틸-7-데아자-8-아자아데노신, N6-아미노-7-데아자아데노신, N6-아미노-8-아자아데노신, N6-아미노-7-데아자-8-아자아데노신, N6-히드록시아데노신, N6-히드록시-7-데아자아데노신, N6-히드록시-8-아자아데노신, N6-히드록시-7-데아자-8-아자아데노신, 6-티오구아노신, 7-데아자구아노신, 8-아자구아노신, 6-티오-7-데아자구아노신, 6-티오-8-아자구아노신, 7-데아자-8-아자구아노신, 및 6-티오-7-데아자-8-아자구아노신. 비-정규 특정 뉴클레오티드들의 경우 또 다른 명명안이 존재한다. 예를 들면, 특정 상황에서, 5-메틸슈도우리딘은 "3-메틸슈도우리딘" 또는 "N3-메틸슈도우리딘"으로 지칭될 수 있다.
접두어 "아미노"를 가진 뉴클레오티드는 이 뉴클레오티드의 시작 위치에서 원자에 결합된 질소 원자를 보유하는 임의의 뉴클레오티드를 지칭할 수 있는데, 예를 들면, 5-아미노시티딘은 5-아미노시티딘, 5-메틸아미노시티딘, 그리고 5-니트로시티딘으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 접두어 "메틸"을 가진 뉴클레오티드는 이 뉴클레오티드의 시작 위치에서 원자에 결합된 탄소 원자를 보유하는 임의의 뉴클레오티드를 지칭할 수 있는데, 예를 들면, 5-메틸시티딘은 5-메틸시티딘, 5-에틸시티딘, 및 5-히드록시메틸시티딘으로 지칭될 수 있고, 접두어 "티오"를 가진 뉴클레오티드는 이 뉴클레오티드의 주어진 위치에서 원자에 결합된 황 원자를 보유하는 임의의 뉴클레오티드를 지칭할 수 있고, 그리고 접두어 "히드록시"를 가진 뉴클레오티드는 이 뉴클레오티드의 주어진 위치에서 원자에 결합된 산소 원자를 보유하는 임의의 뉴클레오티드를 지칭할 수 있다.
따라서, 특정 구체예들은 합성 RNA 분자에 관계되는데, 이때 합성 RNA 분자는 피리미딘의 경우 2C 및/또는 4C 및/또는 5C 위치 또는 퓨린의 경우 6C 및/또는 7N 및/또는 8C 위치에서 하나 이상의 치환체를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드들을 함유한다. 다른 구체예들은 치료제에 관계되는데, 이때 이 치료제는 하나 이상의 합성 RNA 분자들을 함유하며, 하나 이상의 합성 RNA 분자들은 피리미딘의 경우 2C 및/또는 4C 및/또는 5C 위치 또는 퓨린의 경우 6C 및/또는 7N 및/또는 8C 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드들을 함유한다. 한 구체예에서, 이 치료제는 형질감염 시약을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 형질감염 시약은 양이온 지질, 리포좀 또는 미셀을 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 리포좀 또는 미셀은 엽산을 포함하고, 이 치료제 조성물은 항-암 활성을 가진다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들는 슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-아자우리딘, 5-히드록시우리딘, 5-메틸우리딘, 5-아미노우리딘, 2-티오슈도우리딘, 4-티오슈도우리딘, 5-히드록시슈도우리딘, 5-메틸슈도우리딘, 5-아미노슈도우리딘, 슈도이소시티딘, N4-메틸시티딘, 2-티오시티딘, 5-아자시티딘, 5-히드록시시티딘, 5-아미노시티딘, 5-메틸시티딘, N4-메틸슈도이소시티딘, 2-티오슈도이소시티딘, 5-히드록시슈도이소시티딘, 5-아미노슈도이소시티딘, 5-메틸슈도이소시티딘, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 6-티오구아노신, 및 6-티오-7-데아자구아노신 중 적어도 하나를 가진다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들은 슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-아자우리딘, 5-히드록시우리딘, 5-메틸우리딘, 5-아미노우리딘, 2-티오슈도우리딘, 4-티오슈도우리딘, 5-히드록시슈도우리딘, 5-메틸슈도우리딘, 및 5-아미노슈도우리딘 중 적어도 하나와, 그리고 슈도이소시티딘, N4-메틸시티딘, 2-티오시티딘, 5-아자시티딘, 5-히드록시시티딘, 5-아미노시티딘, 5-메틸시티딘, N4-메틸슈도이소시티딘, 2-티오슈도이소시티딘, 5-히드록시슈도이소시티딘, 5-아미노슈도이소시티딘, 및 5-메틸슈도이소시티딘 중 적어도 하나를 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들은 슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-아자우리딘, 5-히드록시우리딘, 5-메틸우리딘, 5-아미노우리딘, 2-티오슈도우리딘, 4-티오슈도우리딘, 5-히드록시슈도우리딘, 및 5-메틸슈도우리딘, 5-아미노슈도우리딘 중 적어도 하나와, 그리고 슈도이소시티딘, N4-메틸시티딘, 2-티오시티딘, 5-아자시티딘, 5-히드록시시티딘, 5-아미노시티딘, 5-메틸시티딘, N4-메틸슈도이소시티딘, 2-티오슈도이소시티딘, 5-히드록시슈도이소시티딘, 5-아미노슈도이소시티딘, 및 5-메틸슈도이소시티딘 중 적어도 하나와, 그리고 7-데아자구아노신, 6-티오구아노신, 및 6-티오-7-데아자구아노신 중 적어도 하나를 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들은 5-메틸시티딘과 7-데아자구아노신을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들은 슈도우리딘 또는 4-티오우리딘 또는 5-메틸우리딘 또는 5-아미노우리딘 또는 4-티오슈도우리딘 또는 5-메틸슈도우리딘 또는 5-아미노슈도우리딘을 또한 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들은 또한 7-데아자아데노신을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들은 슈도이소시티딘, 7-데아자구아노신 그리고 4-티오우리딘을 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들은 슈도이소시티딘 또는 7-데아자구아노신 그리고 슈도우리딘을 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들는 5-메틸우리딘, 5-메틸시티딘 그리고 7-데아자구아노신을 포함한다. 추가 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들은 슈도우리딘 또는 5-메틸슈도우리딘 그리고 5-메틸시티딘 그리고 7-데아자구아노신을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들은 슈도이소시티딘, 7-데아자구아노신 그리고 슈도우리딘을 포함한다.
특정 비-정규 뉴클레오티드들은 다른 비-정규 뉴클레오티드들보다 시험관 전사에 흔히 이용되는 RNA 폴리머라제에 의해 RNA 합성 분자에 더 효율적으로 혼입될 수 있는데, 부분적 이유로 대응하는 정규 뉴클레오티드가 RNA 폴리머라제와 상호작용하는 것과 유사한 방식으로, 표준 염기-쌍형성 상호작용과 염기-쌓기 상호작용에 참여하고, 그리고 RNA 폴리머라제와 상호작용하는 이들 비-정규 뉴클레오티드의 특정 경향 때문이다. 그 결과, 이들 뉴클레오티드 혼합물들을 함유하는 시험관내-전사 반응으로 다량의 합성 RNA가 생성될 수 있기 때문에 하나 이상의 비-정규 뉴클레오티드들을 함유하는 특정 뉴클레오티드 혼합물은 일부 유익할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 피리미딘의 경우 2C 및/또는 4C 및/또는 5C 위치 또는 퓨린의 경우 6C 및/또는 7N 및/또는 8C 위치에서 하나 이상의 치환체를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 혼합물에 관계된다. 뉴클레오티드 혼합물들은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: (각 뉴클레오티드 앞의 숫자는 시험관내-전사 반응에서 예시적인 분획의 비-정규 뉴클레오티드 삼인산염을 나타낸다, 예를 들면, 0.2 슈도이소시티딘은 아데노신-5'-삼인산염, 구아노신-5'-삼인산염, 우리딘-5'-삼인산염, 시티딘-5'-삼인산염, 그리고 슈도이소시티딘-5'-삼인산염을 함유하는 반응물을 나타내는데, 이때 슈도이소시티딘-5'-삼인산염은 반응물에서 반응물에 존재하는 슈도이소시티딘-5'-삼인산염 + 시티딘-5'-삼인산염의 총량의 대략 0.2배에 대등한 양으로 존재하고, 이양은 몰 또는 질량 기준으로 측정되며, 뉴클레오시드 앞에 하나 이상의 숫자는 예시적인 분획의 범위를 나타낸다): 1.0 슈도우리딘, 0.1 - 0.8 2-티오우리딘, 0.1 -0.8 5-메틸우리딘, 0.2 - 1.0 5-히드록시우리딘, 0.1 - 1.0 5-아미노우리딘, 0.1 - 1.0 4-티오우리딘, 0.1 - 1.0 2-티오슈도우리딘, 0.1 - 1.0 4-티오슈도우리딘, 0.1 - 1.0 5-히드록시슈도우리딘, 0.2 - 1 5-메틸슈도우리딘, 0.1 - 1.0 5-아미노슈도우리딘, 0.2 - 1.0 2-티오시티딘, 0.1 - 0.8 슈도이소시티딘, 0.2 - 1.0 5-메틸시티딘, 0.2 - 1.0 5-히드록시시티딘, 0.1 - 1.0 5-아미노시티딘, 0.2 - 1.0 N4-메틸시티딘, 0.2 - 1.0 5-메틸슈도이소시티딘, 0.2 - 1.0 5-히드록시슈도이소시티딘, 0.2 - 1.0 5-아미노슈도이소시티딘, 0.2 - 1.0 N4-메틸슈도이소시티딘, 0.2 - 1.0 2-티오슈도이소시티딘, 0.2 - 1.0 7-데아자구아노신, 0.2 - 1.0 6-티오구아노신, 0.2 - 1.0 6-티오-7-데아자구아노신, 0.2 - 1.0 8-아자구아노신, 0.2 - 1.0 7-데아자-8-아자구아노신, 0.2 - 1.0 6-티오-8-아자구아노신, 0.1 - 0.5 7-데아자아데노신, 그리고 0.1 - 0.5 N6-메틸아데노신.
특정 비-정규 뉴클레오티드들의 조합은 유익할 수 있다는 것이 밝혀졌는데, 일부 그 이유는 합성 RNA 분자들의 독성을 낮추는 비-정규 뉴클레오티드들의 기여가 부가적일 수 있기 때문이다. 따라서, 특정 구체예들은 상기 열거된 하나 이상의 비-정규 뉴클레오티드들을 함유하는 뉴클레오티드 혼합물에 관계되는데, 예를 들면, 이 뉴클레오티드 혼합물은 슈도이소시티딘과 7-데아자구아노신을 모두 함유하고, 또는 이 뉴클레오티드 혼합물은 N4-메틸시티딘과 7-데아자구아노신을 모두 함유한다. 한 구체예에서, 이 뉴클레오티드 혼합물은 상기 열거된 하나 이상의 비-정규 뉴클레오티드들을 함유하는데, 각 비-정규 뉴클레오티드들은 상기 열거된 분획으로 혼합물에 포함되며, 예를 들면, 이 뉴클레오티드 혼합물은 0.1 - 0.8 슈도이소시티딘과 0.2 - 1.0 7-데아자구아노신을 포함하며 또는 이 뉴클레오티드 혼합물은 0.2 - 1.0 N4-메틸시티딘과 0.2 - 1.0 7-데아자구아노신을 포함한다.
특정 상황에서, 예를 들면, 시험관-전사 반응의 수율을 최대화하는 것이 필수적이지 않거나 또는 바람직하지 않을 때, 상기 제공된 분획 이외의 뉴클레오티드 분획들이 이용될 수 있다. 상기 열거된 예시적인 분획과 분획의 범위는 전형적인 순도(90% 이상의 순도)의 뉴클레오티드-삼인산염 용액에 관계된다. 이들 뉴클레오티드와 다른 뉴클레오티드들의 더 많은 분획이 이용될 수 있는데, 더 큰 순도의 뉴클레오티드-삼인산염 용액, 예를 들면, 예를 들면, 기존의 화학물질-정제 기술 가령 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 다른 수단들을 이용하여 뉴클레오티드 삼인산염 용액을 정제함으로써 획득될 수 있는, 약 95% 이상의 순도 또는 약 98% 이상의 순도 또는 약 99% 이상의 순도 또는 약 99.5% 이상의 순도의 용액이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 다중의 이성질체들을 가진 뉴클레오티드들은 원하는 이성질체로 농축되도록 정제된다.
다른 구체예들은 피리미딘의 경우 2C 및/또는 4C 및/또는 5C 위치 또는 퓨린의 경우 6C 및/또는 7N 및/또는 8C 위치에서 하나 이상의 치환체를 포함하는 하나 이상의 비-정규 뉴클레오티드들을 함유하는 합성 RNA 분자에 세포를 접촉시킴으로써, 관심 단백질을 발현시키기 위하여 세포를 유도하는 방법에 관계된다. 여전히 다른 구체예들은 피리미딘의 경우 2C 및/또는 4C 및/또는 5C 위치 또는 퓨린의 경우 6C 및/또는 7N 및/또는 8C 위치에서 하나 이상의 치환체를 포함하는 하나 이상의 비-정규 뉴클레오티드들을 함유하는 합성 RNA 분자에 세포를 접촉시킴으로써, 세포를 형질감염, 재프로그래밍, 및/또는 유전자-에디팅시키는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 합성 RNA 분자는 시험관 전사에 의해 생성된다. 한 구체예에서, 합성 RNA 분자는 하나 이상의 재프로그래밍 인자들을 인코딩한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자는 Oct4 단백질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 세포는 Sox2 단백질을 인코딩하는 합성 RNA 분자에 또한 접촉된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 Klf4 단백질을 인코딩하는 합성 RNA 분자에 또한 접촉된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 c-Myc 단백질을 인코딩하는 합성 RNA 분자에 또한 접촉된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 세포는 Lin28 단백질을 인코딩하는 합성 RNA 분자에 또한 접촉된다.
효소들 가령, T7 RNA 폴리머라제는 정규 및 비-정규 뉴클레오티드들을 모두 함유하는 시험관내-전사 반응에서 정규 뉴클레오티드들을 선호적으로 혼입시킬 수 있다. 그 결과, 특정 분획의 비-정규 뉴클레오티드를 함유하는 시험관내-전사 반응은 비-정규 뉴클레오티드가 반응물 안에 존재하는 분획보다 대개 더 낮은, 상이한 분획의 비-정규 뉴클레오티드를 함유하는 RNA를 생성시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 따라서 비록 이러한 반응은 비-정규 뉴클레오티드가 반응물에 존재하는 분획과는 상이한 분획의 뉴클레오티드를 함유하는 RNA를 만들 수 있지만, 뉴클레오티드 혼입 분획 (예를 들면, "50% 슈도이소시티딘을 함유하는 합성 RNA 분자" 또는 "0.1 - 0.8 슈도이소시티딘을 함유하는 합성 RNA 분자")에 대한 언급은 이 뉴클레오티드의 언급된 분획을 함유하는 RNA 분자, 그리고 이 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유도체, 예를 들면, 뉴클레오티드-삼인산염)의 언급된 분획을 함유하는 반응물에서 합성된 RNA 분자를 모두 지칭할 수 있다.
상이한 뉴클레오티드 서열들은 대체 코돈들을 이용함으로써 동일한 단백질을 인코딩할 수 있다. 특정 구체예들에서, 따라서, 뉴클레오티드 혼입 분획에 대한 언급은 명시된 분획의 뉴클레오티드를 함유하는 RNA 분자, 그리고 상이한 RNA 분자와 동일한 단백질을 인코딩하는 RNA 분자들을 모두 지칭할 수 있는데, 이때 상이한 RNA 분자는 명시된 분획의 뉴클레오티드를 함유한다.
특정 구체예들는 본 발명을 실행하는데 필요한 하나 이상의 재료들을 담고있는 키트에 관계된다. 한 구체예에서, 이 키트는 합성 RNA 분자들을 담고있다. 한 구체예에서, 이 키트는 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및/또는 유전자-에디팅 단백질들을 인코딩하는 합성 RNA 분자들을 담고있다. 또 다른 구체예에서, 합성 RNA 분자들은 피리미딘의 경우 2C 및/또는 4C 및/또는 5C 위치 또는 퓨린의 경우 6C 및/또는 7N 및/또는 8C 위치에서 하나 이상의 치환체를 포함하는 하나 이상의 비-정규 뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 이 키트는 형질감염 배지, 형질감염 시약, 복합 배지, 그리고 코팅 용액중 하나 이상을 담고 있다. 한 구체예에서, 코팅 용액은 피브로넥틴 및/또는 비트로넥틴, 바람직하게는 재조합 피브로넥틴 및/또는 재조합 비트로넥틴을 포함한다. 한 구체예에서, 키트의 하나 이상의 성분들은 복수개의 부문(aliquot)으로 존재된다. 한 구체예에서, 이 키트는 핵산 형질감염-시약 복합물들의 부문을 담고있다. 또 다른 구체예에서, 이 키트는 고체형, 예를 들면, 동결된 또는 동결건조된 펠렛으로 제공되는 핵산 형질감염-시약 복합물들의 부문을 담고 있다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 키트는 배지 부문을 담고 있는데, 이때 각 부문은 화학물질 처리 또는 동결에 의해 안정화되는 형질감염 시약-핵산 복합물들을 담고 있다.
총체적으로, 형질감염과 재프로그래밍은 특히, 어렵고, 시간-소모적인 기술로써 반복적이며, 오류가 발생될 경향이 있다. 그러나, 이들 기술은 자동화된 형질감염 장비의 부족으로 인하여 대개 수작업으로 실행된다. 따라서, 특정 구체예들은 자동화된 또는 반-자동화된 방식으로 세포를 형질감염시키고, 재프로그래밍시키고, 및/또는 유전자-에디팅할 수 있는 시스템을 제공한다.
도 9a 내지 도 11을 참고하며, 특정 구체예들은 다수-웰 플레이트 (2)에서 세포들을 형질감염시킬 수 있는 시스템(1)에 관계된다. 한 구체예에서, 플레이트는 시스템에서 꺼낼 수 있는 트레이(3)에 로딩된다. 또 다른 구체예에서, 시스템은 다수의 플레이트 (12)를 보관할 수 있다. 여전히 또 다른 구체예에서, 시스템은 형질감염 배지를 보관하는 수단(4)을 포함한다. 한 구체예에서, 시스템은 정해진 온도, 바람직하게는 2C 내지 6C에서 배지를 보관하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 시스템은 액체, 폐기물, 및/또는 웰로부터 제거된 세포들을 보관하는 수단(5)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 시스템은 전력을 공급하는 연결구(6) 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 시스템은 컴퓨터 (34)와 통신되는 포트(33)를 포함한다. 한 구체예에서, 이 포트는 USB 포트다. 한 구체예에서, 시스템은 통기공 팬 (7)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 시스템은 진공을 공급하는 연결구 (8)를 포함한다.
세포 주변의 환경을 조절함으로써 세포 생존능이 유리해질 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 지정된 또는 원하는 온도에서 세포를 배양하는 수단을 포함하는 시스템에 관계된다. 한 구체예에서, 이 세포들은 35C 내지 39C 사이의 하나 이상의 온도에서 배양된다. 한 구체예에서, 이 세포들은 약 37C의 온도에서 배양된다. 다른 구체예들은 세포들이 배양되는 대기를 조절하는 수단을 포함하는 시스템에 관계된다. 한 구체예에서, 시스템은 대기의 이산화탄소 농도를 조절하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 이산화탄소 농도는 3% 내지 7% 사이, 바람직하게는 약 5%다. 또 다른 구체예에서, 시스템은 대기의 산소 농도를 조절하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 시스템은 도입 질소를 도입함으로써 산소 농도를 조절한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 산소 농도는 약 3% 내지 약 7% 사이, 가령 약 5%다. 한 구체예에서, 시스템은 세포들이 배양되는 대기의 산소 및 이산화탄소 농도를 모두 조절하는 수단을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 시스템은 이산화탄소를 공급하는 연결구(9)를 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 시스템은 질소를 공급하는 연결구(10)를 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 시스템은 산소를 공급하는 연결구 (11)를 포함한다.
특정 구체예들은 핵산 형질감염-시약 복합물들 및/또는 배지를 분배하는 수단 (24)을 포함하는 시스템에 관계된다. 한 구체예에서, 시스템은 복합물들 및/또는 배지를 분배할 수 있는 하나 이상의 정면에 실린 피펫을 포함한다. 복합물들을 분배하는 다른 수단의 예로는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 후면에 실린 피펫, 연동 펌프, 미니 유동 장치, 전자분무 노즐, 압전성 이젝트, 그리고 음향 방울 이젝터. 특정 구체예들은 핵산 형질감염-시약 복합물들을 생성하는 수단(13)을 포함하는 시스템에 관계된다. 한 구체예에서, 시스템은 하나 이상의 형질감염 시약들 (14)과 하나 이상의 핵산들 (15)을 복합하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 복합 수단은 하나 이상의 정면에 실린 피펫을 포함한다. 복합에 이용되는 다른 수단의 예로는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 후면에 실린 피펫, 연동 펌프, 미니 유동 장치, 전자분무 노즐, 압전성 이젝트, 그리고 음향 방울 이젝터. 한 구체예에서, 시스템은 하나 이상의 제거가능한 팁(tip)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 제거가능한 팁은 멸균될 수 있다. 또 다른 구체예에서 하나 이상의 제거가능한 팁은 1회용이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 제거가능한 팁은 플라스틱 또는 유리로 만들어진다. 여전히 또 다른 구체예에서, 플라스틱은 폴리프로필렌이다. 한 구체예에서, 시스템은 하나 이상의 복합 배지 (16)에서 하나 이상의 형질감염 시약들과 함께 하나 이상의 핵산들을 배양하는 수단을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 시스템은 하나 이상의 핵산들, 하나 이상의 형질감염 시약들, 그리고 하나 이상의 복합 배지를 보관하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 복합은 실온에서 일어난다. 한 구체예에서, 시스템은 세포들을 배지에 노출시키기에 앞서, 이 배지를 예를 들면, 약 20℃ 내지 약 39℃, 또는 약 30℃ 내지 약 39℃로 따뜻하게 하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 이 배지는 열선 (25)에 의해 따뜻하게 된다. 한 구체예에서, 시스템은 다중의 배양물 배지를 보관 및/또는 분배하는 수단을 포함한다.
특정 구체예들은 핵산 형질감염-시약 복합물들을 보관하는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 하나 이상의 핵산들과 하나 이상의 형질감염 시약들은 하나 이상의 복합 배지와 함께 복합되고, 냉각되어 핵산 형질감염-시약 펠렛이 만들어진다. 한 구체예에서, 액체 질소에 접촉됨으로써 냉각이 실시된다. 다른 냉각 방법들은 다음의 것에 접촉되는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다: Peltier 냉각기, 냉각된 액체 프로판, 냉각된 액체 에탄, 그리고 냉각된 광택을 낸 금속 표면. 한 구체예에서, 이 방법은 실질적으로 RNase가 없다. 특정 구체예들은 핵산 형질감염-시약 펠렛을 이용하여 세포들을 형질감염시키는 방법에 관계된다. 한 구체예에서, 이 펠렛은 형질감염 배지에 첨가되기 전에 따뜻하게 데워진다. 한 구체예에서, 펠렛은 이 펠렛을 소량의 따뜻한 형질감염 배지에 두어 데워지게 하고, 그 다음 형질감염되는 세포와 접촉된다. 또 다른 구체예에서, 이 펠렛은 바로 형질감염 배지에 추가된다. 특정 구체예들은 핵산 형질감염-시약 펠렛들을 이용하여 형질감염을 실시하는 시스템에 관계된다. 한 구체예에서, 시스템은 정해진 온도 범위 안에서 펠렛(17)을 저장하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 온도 범위는 약 -90℃ 내지 약 0℃ 이며, 바람직하게는 약 -30℃ 내지 약 -4℃이다. 한 구체예에서, 시스템은 펠렛들을 분배하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 이 펠렛들은 플런져 (19)를 이용하여 분배된다. 또 다른 구체예에서, 이 펠렛들은 회전 디스크 (20)를 이용하여 분배되는데, 이 디스크에는 구멍(21)이 있어, 이 구멍을 통하여 펠렛이 분배된다. 한 구체예에서, 이 장치는 펠렛을 형질감염 배지에 추가하기 전에 펠렛을 따뜻하게 하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 따뜻한 형질감염 배지를 담고 있는 작은 용기(22)에 펠렛을 둠으로써 따뜻해지도록 한 후, 그 다음 형질감염되는 세포와 접촉된다. 또 다른 구체예에서, 이 장치는 펠렛들을 직접적으로 형질감염 배지에 분배하는 수단을 담고있다. 여전히 또 다른 구체예에서, 이 펠렛들은 카트릿지 (16)에 보관된다. 한 구체예에서, 시스템은 카트릿지를 교체하는 수단(36)을 포함한다.
세포 배양 동안, 영양분을 추가하거나, 및/또는 이 배지에 존재할 수 있는 비활성 세포 폐기물 또는 잔류 복합물을 포함하는 다른 바람직하지 못한 성분을 감소, 제거 또는 비활성화시키기 위하여, 배양물 배지의 전부 또는 일부를 교체하거나 또는 배양 배지에 추가량의 배지 또는 다른 보충물을 보충하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 세포들로부터 배양 배지 전부 또는 일부를 제거하는 수단(23)을 포함하는 시스템에 관계된다. 한 구체예에서, 시스템은 흡출기를 포함한다.
특정 구체예들은 웰 플레이트의 뚜껑을 제거하는 수단을 포함하는 시스템에 관계된다. 한 구체예에서, 시스템은 석션 (27)을 이용하여 웰 플레이트의 뚜껑 (26)을 제거하는 수단을 포함한다. 웰 플레이트의 뚜껑을 제거하는 다른 수단은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 접착제, 연결된 부속물 (28), 클램프, 자석 및 전자석. 특정 구체예들에서, 시스템은 세포들을 영상화시키는 수단 (29)을 포함한다. 한 구체예에서, 세포 밀도는 이 세포들을 담고있는 용기의 광학 밀도를 측정함으로써 결정된다. 또 다른 구체예에서, 이 세포 밀도는 세포들의 영상화에 의해 결정된다.
특정 구체예들은 다른 장비, 예를 들면, 세포들을 배양, 영상화 또는 조작하는 장비와 실시가능한 조합에 이용되는 시스템에 관계된다. 한 구체예에서, 시스템 (1)은 로봇 팔(30)을 이용하여 로딩된다. 또 다른 구체예에서, 로봇 팔은 플레이트를 또 다른 배양기(31)로 이동 또는 배양기로부터 이동하는데 이용된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 플레이트 화상 촬영기 (32)를 이용하여 이 세포들을 영상화한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 시스템은 컴퓨터 (34)를 이용하여 조절된다. 한 구체예에서, 시스템은 세포들의 형질감염, 재프로그래밍, 및/또는 유전자-에디팅에 이용된다.
따라서, 본 발명은 연구 및 치료제 사용 모두를 위한 생성물들을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 상세한 내용은 아래 설명에서 제시된다. 설명되는 방법들과 재료들이 설명되지만, 본 명세서에서 설명된 방법 및 재료와 유사한 또는 등가의 방법들과 재료들이 본 발명의 실시 또는 테스트에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 특징들, 목적들 및 장점들은 설명 및 청구범위로부터 자명할 것이다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 단수 형태는 명시적인 언급이 없는 한 복수개념을 또한 포함한다. 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상적인 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
실시예
실시예 1 RNA 합성
인간 단백질들 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc-2 (T58A), 및 Lin28을 인코딩하고, 그리고 정규 및 비-정규 뉴클레오티드들의 다양한 조합을 포함하는 RNA는 DNA 주형들로부터 합성되었다 (표 1). 이 RNA의 시료들은 이 RNA의 질을 평가하기 위하여 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되었다 (도 1). 그 다음 RNA는 100ng/㎕ 내지 500ng/㎕ 사이로 희석되었다. 특정 실험을 위하여, RNase 저해제 (Superase·In™, Life Techno10gies Corporation)는 RNA 100㎍당 1㎕ 농도로 첨가되었다. RNA 용액는 4C에 보관되었다. RNA 혼합물들과 관련된 특정 실험의 경우, RNA 인코딩된 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc-2 (T58A), 및 Lin28을 인코딩하는 RNA는 3:1:1:1:1의 몰 비율로 혼합되었다.
표 1.
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
"A"는 아데노신-5'-삼인산염을 나타내고, "G"는 구아노신-5'-삼인산염을 나타내고, "U"는 우리딘-5'-삼인산염을 나타내고, "C"는 시티딘-5'-삼인산염을 나타내고, "psU"는 슈도우리딘-5'-삼인산염을 나타내고, "5mC"는 5-메틸시티딘-5'-삼인산염을 나타내고, "2sU"는 2-티오우리딘-5'-삼인산염을 나타내고, "psisoC"는 슈도이소시티딘-5'-삼인산염을 나타내고, "5mU"는 5-메틸우리딘-5'-삼인산염을 나타내고, "7dA"는 7-데아자아데노신-5'-삼인산염을 나타내고, "7dG"는 7-데아자구아노신-5'-삼인산염을 나타내고, 그리고 "N4mC"는 N4-메틸시티딘-5'-삼인산염을 나타낸다.
실시예 2 형질감염 배지 제형
세포들의 효율적인 형질감염, 재프로그래밍, 그리고 유전자-에디팅을 지원하기 위하여 배지가 개발되었다:
DMEM/F12 + 10μg/mL 인슐린 + 5.5㎍/mL 트란스패린 + 6.7ng/mL 셀레나이트 나트륨 + 20ng/mL bFGF + 5mg/mL 처리된 인간 혈청 알부민.
특정 형질감염 시약들, 특정 핵산들, 특정 세포 유형과 함께 이용될 때 개선된 성능을 제공하기 위하여 이 배지의 변형이 또한 개발되었다: DMEM/F12 + 10μg/mL 인슐린 + 5.5㎍/mL 트란스패린 + 6.7ng/mL 셀레나이트 나트륨 + 4.5㎍/mL 콜레스테롤 + 20ng/mL bFGF + 5mg/mL 처리된 인간 혈청 알부민, DMEM/F12 + 10μg/mL 인슐린 + 5.5㎍/mL 트란스패린 + 6.7ng/mL 셀레나이트 나트륨 + 1μΜ 히드로코르티손 + 20ng/mL bFGF + 5mg/mL 처리된 인간 혈청 알부민, 그리고 DMEM/F12 + 10μg/mL 인슐린 + 5.5㎍/mL 트란스패린 + 6.7ng/mL 셀레나이트 나트륨 + 4.5㎍/mL 콜레스테롤 + 1 μΜ 히드로코르티손 + 20ng/mL bFGF + 5mg/mL 처리된 인간 혈청 알부민.
특정 실험들에서 이 세포-배양 배지에 추가되었던 추가 성분들의 예 (예시적인 농도로 열거된)은 다음을 포함한다: 15mM HEPES, 2mM L-알라닐-L-글루타민, 2μg/mL 에탄올아민, 10㎍/mL 지방산들, 10㎍/mL 대구 간 오일 지방산들 (메틸 에스테르s), 25μg/mL 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트, 2μg/mL D-알파-토코페롤 아세테이트, 1-50㎍/mL L-아스코르브산 2-포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물, 200ng/mL B18R, 그리고 0.1% Pluronic F-68.
이 배지를 조건화시킨 특정 실험들의 경우 다음의 변형이 이용되었다: DMEM/F12 + 15mM HEPES + 2mM L-알라닐-L-글루타민 + 10㎍/mL 인슐린 + 5.5㎍/mL 트란스패린 + 6.7ng/mL 셀레나이트 나트륨 + 2μg/mL 에탄올아민 + 4.5㎍/mL 콜레스테롤 + 10μg/mL 대구 간 오일 지방산들 (메틸 에스테르) + 25μg/mL 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트 + 2μg/mL D-알파-토코페롤 아세테이트 + 1㎍/mL L-아스코르브산 2-포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물 + 0.1% Pluronic F-68 + 20ng/mL bFGF + 5mg/mL 처리된 인간 혈청 알부민.
이 배지를 조건화시키지 않은 특정 실험들의 경우 다음의 변형이 이용되었다: DMEM/F12 + 15mM HEPES + 2mM L-알라닐-L-글루타민 + 10㎍/mL 인슐린 + 5.5㎍/mL 트란스패린 + 6.7ng/mL 셀레나이트 나트륨 + 2μg/mL 에탄올아민 + 4.5㎍/mL 콜레스테롤 + 1 μΜ 히드로코르티손 + 0-25μg/mL 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트 + 2μg/mL D-알파-토코페롤 아세테이트 + 50μg/mL L-아스코르브산 2-포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물 + 20ng/mL bFGF + 5mg/mL 처리된 인간 혈청 알부민.
이러한 변형을 준비하기 위하여, 처리된 인간 혈청 알부민은 32mM 옥타노에이트 나트륨을 첨가하여 처리되고, 4시간 동안 60C에서 가열하고, 실온에서 6시간 동안 이온-교환 수지 (AG501-X8(D))로 처리하고, 덱스트란-피복된 활성화된 목탄 (C6241, Sigma-Aldrich Co. LLC.) 으로 실온에서 하룻밤 동안 처리하고, 원심분리, 여과한 후, 뉴클레아제-없는 물로 10% 용액으로 조정한 후, 이 배지의 다른 성분이 추가된다. 이 배지를 조건화시킨 특정 실험들의 경우, 이 배지는 조사를 받은(irradiated) 인간 신생 섬유아세포 영양공급세포에서 24시간 동안 조건화된다. 이 세포들은 다른 명시가 없는 한, 피브로넥틴-피복된 플레이트 또는 피브로넥틴과 비트로넥틴-피복된 플레이트 상에 도말되었다.
이 배지의 제형은 배양되는 특정 세포 유형의 요구에 부합되도록 조정될 수 있다. 더욱이, 특정 상황에서, 처리된 인간 혈청 알부민은 다른 처리된 알부민, 예를 들면, 처리된 소의 혈청 알부민으로 대체될 수 있으며, 다른 글루타민 원천, 예를 들면, L-글루타민은 L-알라닐-L-글루타민을 대신하여 또는 이에 추가하여 이용될 수 있고, 다른 완충 시스템 예를 들면, 포스페이트, 중탄산염, 등이 HEPES을 대신하여 또는 이에 추가하여 이용될 수 있고, 셀레나이트 나트륨을 대신하여 또는 이에 추가하여 다른 형태의 셀레늄, 예를 들면, 아셀렌산(selenous acid)으로 제공될 수 있고, L-아스코르브산 2-포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물 및/또는 D-알파-토코페롤 아세테이트를 대신하여 또는 이에 추가하여, 다른 항산화제들 예를 들면, L-아스코르브산이 이용될 수 있고, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트 및/또는 Pluronic F-68을 대신하여 또는 이에 추가하여, 다른 계면활성제, 예를 들면, Pluronic F-127이 이용될 수 있고, DMEM/F12를 대신하여, 또는 이에 추가하여 다른 기초 배지, 예를 들면, MEM, DMEM, 등이 이용될 수 있고, 그리고 배양물 배지의 성분들은 시간에 따라 변화될 수 있는데, 예를 들면, 0일부터 5일차까지 TGF-β가 없는 배지를 이용하고, 그 다음 5일차 이후 2ng/mL TGF-β를 함유하는 배지를 이용한다. 특정 상황에서, 다른 성분들, 예를 들면, 지방산들, 리소포스파티드산, 리소스핑고미엘린, 스핑고신-1-포스페이트, 다른 스핑고리피드들, TGF-β/NODAL 패밀리 단백질들의 구성원들, IL-6, Wnt 패밀리 단백질들의 구성원들, 등이 적절한 농도에서 이용될 수 있고, 그리고 특정 세포 유형의 성장을 촉진 또는 억제하는 것으로 알려진 성분들 및/또는 특정 세포 유형의 성장을 촉진 또는 억제하는 것으로 알려진 단백질 또는 다른 분자들의 항진제들 및/또는 길항제들이 이들 세포 유형과 함께 이용될 때 적절한 농도에서 이 배지에 추가될 수 있는데, 예를 들면, 스핑고신- 1-포스페이트와 다능성 줄기 세포들이다. 성분들은 정제된 화합물들의 형태, 잘-특정된 혼합물들의 일부, 복합물 또는 특정화안된 혼합물들, 예를 들면, 동물 또는 식물 오일의 일부 형태를 취할 수 있고, 그리고 생물학적 공정, 예를 들면, 조건화(conditioning)에 의해 추가될 수 있다. 성분들의 농도는 열거된 값으로부터 당업자들에게 자명한 범위 안에서 변화될 수 있다.
실시예 3 세포들을 합성 RNA로 형질감염
6-웰 플레이트에서 형질감염을 위하여, 2μg RNA와 6㎕의 형질감염 시약 (Lipofectamine™ RNAiMAX, Life Techno10gies Corporation)을 우선 별도로 복합 배지 (Opti-MEM®, Life Techno10gies Corporation)에서 각각 총 용적이 60㎕이 되도록 각각 희석시켰다. 그 다음 희석된 RNA와 형질감염 시약을 혼합하고, 형질감염 시약-제조업자의 지시에 따라, 실온에서 15분간 항온처리하였다. 그 다음 배양물 안의 세포에 복합물이 첨가되었다. 30㎕ 내지 240㎕의 복합물들이 6-웰 플레이트의 각 웰에 추가되었고, 이때 이 웰에는 웰당 2mL의 형질감염 배지가 담겨있었다. 그 다음 플레이트를 부드럽게 흔들어, 웰 안에서 이 복합물들이 분포되도록 하였다. 세포들은 2 시간 내지 하룻밤 동안 복합물과 함께 항온처리되었고, 이 배지는 새로운 형질감염 배지 (2mL/웰)로 대체되었다. 24-웰 및 96-웰 플레이트에서 형질감염을 위하여 용적이 상향되었다. 세포들은 Oct4에 대항하는 항체를 이용하여 형질감염되고 20~24 시간 후 고정되고, 착색되었다 (도 2a). 핵이 착색되었고, 이 RNA의 상대적인 독성을 결정하기 위하여 카운트되었다(도 2b).
실시예 4 처리안된 인간 혈청 알부민 조제들의 핵산 형질감염 및 RNA 재프로그래밍을 지원하는 능력 분석
1차 인간 신생 섬유아세포들은 5mg/mL HSA와 함께, 또는 5mg/mL HSA 없이 배지에서 배양되었다. Cohn Fraction V (A6784, Sigma-Aldrich Co. LLC), 그리고 4가지 상이한 재조합 HSA 조제물(A6608, A7736, A9731, 및 A9986, 모두 Sigma- Aldrich Co. LLC.제품)이 선별되었다. 실시예 1에 따라 합성된 RNA를 이용하여, 실시예 3에 따라 세포들은 형질감염되었다. 형질감염안된 세포들은 임의의 HSA 조제물을 담고있는 배지에서 잘 자랐지만, 형질감염된 웰들에서 각각 HSA 조제물은 상당히 상이한 세포 형태 및 세포 밀도를 만들었고, 그 어느 것도 재프로그래밍화를 나타내는 형태학적 변화를 야기하지는 않았다.
실시예 5 옥타네이트-처리된 인간 혈청 알부민의 생산
HSA의 10% 용액은 22mM 염화 나트륨과 16mM 옥타노에이트 나트륨 (Sigma-Aldrich Co. LLC)으로 사전-항온처리되었고, 그리고 완전한 배지의 어셈블리에 앞서 3시간 동안 37C에서 항온처리되었다.
실시예 6 이온-교환 크로마토그래피를 이용한 인간 혈청 알부민의 처리
피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (A7736, Sigma-Aldrich Co. LLC.)에서 생산된 재조합 HSA의 20% 용액은 실온에서 약하게 교반시키면서 10mL의 뉴클레아제-없는 물에 2g의 HSA를 용해시켜 준비되었다. 그 다음 HSA 용액은 1g의 혼합형-베드 탈이온화 수지 (AG 501-X8(D), Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 우선 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 회전시킴으로써 탈이온화되었다. 그 다음 HSA 용액은 5g의 새로운 수지를 담고있는 튜브로 옮겼고, 실온에서 4시간 동안 흔들리도록 두었다. 끝으로, 탈이온화된 HSA 용액을 따라내고, 뉴클레아제-없는 물로 총 단백질 함량이 10%가 되도록 조정되었고, 0.2㎛ PES-막 필터를 이용하여 필터-살균된 후, 4C에서 보관되었다.
실시예 7 옥타네이트-처리된 인간 혈청 알부민을 함유하는 배지에서 배양된 세포들의 형질감염 효과 및 생존능의 분석
1차 인간 신생 섬유아세포들은 실시예 4에 따라 처리된 재조합 HSA를 함유하거나 또는 처리된 혈액-유도된 HSA (Bio-Pure HSA, Bio10gical Industries)를 함유하는 배지에서 배양되었다. 세포들은 실시예 3에 따라, 실시예 1에서 합성된 RNA로 0일차부터 시작하여 매일 형질감염되었다. 3일차에 사진촬영하였다. 옥타노에이트를 함유하는 웰에서 간엽성에서 상피 전이를 모방한 형태학적 변화를 겪는 세포들의 몇몇 작은 영역들이 관찰되었는데, 이는 형질감염 효과의 증가를 나타낸다. 간엽성에서 상피 전이를 닯은 형태학적 변화의 많은 큰 영역들이 처리된 혈액-유도된 HSA를 함유하는 시료들에서 관찰되었다. 두 가지 경우 모두에서, 형태학적 변화는 재프로그래밍의 특징들이었다.
실시예 8 옥타네이트-처리된 인간 혈청 알부민을 함유하는 배지를 이용하여 인간 섬유아세포들의 재프로그래밍화
1차 인간 신생 섬유아세포들은 섬유아세포 배지 (DMEM + 10% 우태 혈청)에서 웰당 5000개의 세포 밀도로 6-웰 플레이트상에서 도말되었다. 6 시간 후, 이 배지는 옥타노에이트-처리된 HSA를 함유하는 형질감염 배지로 대체되었다. 세포들은 실시예 3에 따라, 실시예 1에서 합성된 RNA로 0일차부터 시작하여 매일 형질감염되었다. 5일 시점에, 웰에는 재프로그래밍화와 일치되는 형태를 나타내는 세포들의 몇몇 영역들이 포함되었다. 이 실험은 영양공급세포 또는 면역억제제들의 사용을 포함하지 않았다.
실시예 9 이온-교환-수지-처리된 인간 혈청 알부민을 포함하는 배지에서 배양된 세포들의 형질감염 효과 및 생존능의 분석
1차 인간 신생 섬유아세포들은 실시예 3에 따라, 실시예 1에서 합성된 RNA로 0일차부터 시작하여 형질감염되었다. 2일차에 사진촬영하였다. 처리안된 HSA를 담고있는 웰 안의 세포들은 처리된 혈액-유도된 HSA 또는 이온-교환 -수지-처리된 재조합 HSA를 담고있는 웰과 비교하여 낮은 생존능을 나타내었다.
실시예 10 이온-교환-수지-처리된 인간 혈청 알부민을 이용하여 인간 섬유아세포들의 재프로그래밍화
1차 인간 신생 섬유아세포들은 섬유아세포 배지 (DMEM + 10% 우태 혈청)에서 웰당 10,000개 세포의 밀도로 영영공급세포 상에서 6-웰 플레이트 안에 도말되었다. 이 세포들은 실시예 3에 따라, 실시예 1에서 합성된 RNA로 0일차부터 시작하여 매일 형질감염되었다. 4일 차에 1:20의 균열 비율로 계대가 실행되었다. 10일차에 사진촬영하였다. 웰에는 재프로그래밍화와 일치되는 형태를 나타내는 세포들의 많은 큰 콜로니를 담고있었다. 처리안된 HSA를 담고있는 세포-배양 배지에 노출된 웰에서는 콜로니가 관찰되지 않았다.
실시예 11 영양공급세포 또는 면역억제제들을 이용하지 않고, 인간 섬유아세포들의 재프로그래밍화
1차 인간 신생 섬유아세포들은 섬유아세포 배지 (DMEM + 10% 우태 혈청)에서 웰당 20,000개 세포의 밀도로 영영공급세포 상에서 6-웰 플레이트 안에 도말되었다. 6 시간 후, 이 배지는 처리된 HSA를 포함하고, 면역억제제들을 포함하지 않는 형질감염 배지로 대체되었고, 이 세포들은 실시예 3에 따라, 실시예 1에서 합성된 RNA로 매일 형질감염되었는데, 단, RNA의 분량은 웰당 1 μg으로 감소되었고, 총 5회의 형질감염이 실행되었다. 7일차에 사진촬영하였다. 재프로그래밍화와 일치되는 형태를 나타내는 세포들의 작은 콜로니들이 이르면 5일차에서 보이기 시작하였다. 7일 차에, 이 배지는 DMEM/F12 + 20% Knockout™ Serum Replacement (Life Techno10gies Corporation) + 1X 비필수 아미노산들 + 2mM L-글루타민으로 대체되었고, 조사를 받은(irradiated) 마우스 배 섬유아세포들 상에서 24시간 동안 조건화되었고, 그리고 그 다음 20ng/mL bFGF 및 10μΜ Y-27632가 보충되었다. 재프로그래밍화 형태를 나타내는 많은 콜로니들이 이르면 8일차에서 보이기 시작하였다. 10일차에 콜로니들을 찍어내었고, 기저막 추출물 (Cultrex® Human BME Pathclear®, Trevigen Inc.)로 피복된 웰에 도말하였다 (도 3a). 세포들은 신속하게 성장하였고, 계통을 확립하기 위하여 계대되었다. 확립된 계통은 다능성 줄기-세포 지표들 Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성 착색되었다(도 3b). 전체 프로토콜이 반복되었고, 유사한 결과들을 얻었다(도 3c).
실시예 12 인간 피부 생검 조직으로부터 세포들의 효과적이고 신속한 유도 및 재프로그래밍화
승인된 프로토콜에 따라 건강한 31세의 지원자에서 전체-두께 피부 펀치 생검이 실시되었다. 간략하게 설명하자면, 좌측 상박 피부 영역을 2.5% 리도카인을 국소 제공하여 마취시켰다. 이 부분은 70% 이소프로판올로 소독되었고, 1.5 mm-직경 펀치를 이용하여 전체-두께 피부 생검이 실시되었다 (도 4a). 조직은 포스페이트-완충된 염수(PBS)에서 헹궈내었고, 250㎕ TrypLE™ Select CTS™ (Life Techno10gies Corporation)를 담고 있는 1.5mL 튜브에 넣고 37C에서 30분간 항온처리하였다. 그 다음 이 조직은 250㎕ DMEM/F12-CTS™ (Life Techno10gies Corporation) + 5mg/mL 콜라게나제를 담고 있는 1.5mL 튜브로 옮겨지고, 그리고 37C에서 2시간 동안 항온처리되었다(도 4b). 핀셋으로 상피를 제거하였고, 조직은 기계적으로 분리되었다. 세포들은 DMEM/F12-CTS™에서 2회 헹궈내었고, 피브로넥틴-피복된 24-웰 및 96-웰 플레이트의 웰에 도말되었다. 동일한 지원자로부터 사혈(Phlebotomy)이 또한 실시되어, 정맥혈은 Vacutainer® SST™ 튜브 (Becton, Dickinson and Company)에 수집되었다. 제조사의 프로토콜에 따라 혈청이 단리되었다. 동계(Isogenic) 도말 배지는 DMEM/F12-CTS™ + 2mM L-알라닐-L-글루타민 (Sigma-Aldrich Co. LLC.) + 20% 인간 혈청을 혼합하여 만들었다. 피부 조직 시료의 세포들은 형질감염 배지 또는 동계 도말 배지에 도말되었다. 2일 후, 웰은 헹궈내고, 배지는 형질감염 배지로 대체되었다. 섬유아세포 형태를 가진 많은 세포들이 부착되었고, 2일 시점에 전파되기 시작되었다(도 4c). 이 세포들은 실시예 3에 따라, 실시예 1에서 합성된 RNA로 2일차부터 시작하여 형질감염되었고, 모든 용적은 더 작은 웰에 순응되도록 조정되었다. 5일 시점에, 재프로그래밍화와 일치되는 형태를 가진 세포 영역들이 관찰되었다.
실시예 13 비-정규 뉴클레오티드들을 함유하는 합성 RNA를 이용한 인간 섬유아세포의 재프로그래밍화
1차 인간 섬유아세포들은 재조합 인간 피브로넥틴 및 재조합 인간 비트로넥틴(DMEM/F12에서 1㎍/mL, 1mL/웰 농도로 각각 희석되었고, 실온에서 1시간 동안 항온처리되었다)으로 피복된 6-웰 플레이트 안에서 형질감염 배지에서 웰당 20,000 세포의 밀도로 도말되었다. 다음 날, 이 세포들은 실시예 3에 따라, 실시예 1에서 합성된 RNA로 형질감염되었는데, 단, RNA의 분량은 1일차에 0.5㎍/웰, 2일 차에 0.5㎍/웰, 그리고 3일차에 2μg/웰이었다. 4일차에 사진촬영하였다. 재프로그래밍화와 일치되는 형태를 가진 세포의 작은 콜로니들이 4일차에 관찰되었다.
실시예 14 비-조건화된 형질감염 배지로 인간 섬유아세포들의 재프로그래밍화
1차 인간 섬유아세포들은 재조합 인간 피브로넥틴 및 재조합 인간 비트로넥틴(DMEM/F12에서 1㎍/mL, 1mL/웰 농도로 각각 희석되었고, 실온에서 1시간 동안 항온처리되었다)으로 피복된 6-웰 플레이트 안에서 형질감염 배지에서 웰당 20,000 세포의 밀도로 도말되었다. 다음 날, 이 세포들은 실시예 3에 따라, 실시예 1에서 합성된 RNA로 형질감염되었는데, 단, RNA의 분량은 1일차에 0.5㎍/웰, 2일 차에 0.5㎍/웰, 3일차에 2μg/웰, 4일차에 2μg/웰, 그리고 5일차에 4μg/웰이었다. 재프로그래밍화와 일치되는 형태를 가진 세포의 작은 콜로니들이 빠르면 5일차에 보이기 시작하였다. 7일차에, 이 배지는 DMEM/F12 + 20% Knockout™ Serum Replacement (Life Techno10gies Corporation) + 1X 비-필수 아미노산들 + 2mM L-글루타민으로 대체되었고, 조사를 받은(irradiated) 마우스 배 섬유아세포들 상에서 24시간 동안 조건화되었고, 그 다음 20ng/mL bFGF 와 10μΜ Y-27632가 보충되었다. 재프로그래밍화와 일치되는 형태의 큰 콜로니들이 빠르면 8일차에 보이기 시작하였다. 10일차에 콜로니들을 찍어내었고, 기저막 추출물 (Cultrex® Human BME Pathclear®, Trevigen Inc.)로 피복된 웰에 도말하였다. 세포들은 신속하게 성장하였고, 계통을 확립하기 위하여 계대되었다.
실시예 15 포도당-반응성 인슐린-생산 세포들의 생성
세포들은 실시예 11 또는 실시예 12에 따라 재프로그래밍되며, 그 다음 DMEM/F12 + 0.2% HSA + 0.5X N2 보충물 + 0.5X B27 보충물 + 100ng/mL 액티빈 A + 1 μΜ 월트만닌에서 4일간 배양되며, 1:1의 F12/IMDM + 0.5% HSA + 0.5% ITS 보충물 + 0.5X B27 보충물 + 2μΜ 레티논산 + 20ng/mL FGF7 + 50ng/mL NOGGIN에서 4일간 배양되며, 이어서 DMEM + 0.5% HSA + 1% ITS 보충물 + 1X N2 보충물 + 50ng/mL EGF에서 5일간 배양되고, 이어서 DMEM/F12 + 1% ITS 보충물 + 10ng/mL bFGF + 10mM 니코틴아미드 + 50ng/mL 엑센딘-4 + 10ng/mL BMP4에서 7-9일간 배양되어, 포도당-반응성 인슐린-생산 세포들이 생성된다. 대안으로, 세포들은 실시예 11 또는 실시예 12에 따라 재프로그래밍되고, 그 다음 1:1의 F12/IMDM + 0.5% HSA + 0.5% ITS 보충물 + 0.5X B27 보충물 + 2μΜ 레티논산 + 20ng/mL FGF7 + 50ng/mL NOGGIN에서 4일간 배양되고, 이어서 DMEM + 0.5% HSA + 1% ITS 보충물 + 1X N2 보충물 + 50ng/mL EGF에서 5일간 배양되며, 이어서 DMEM/F12 + 1% ITS 보충물 + 10ng/mL bFGF + 10mM 니코틴아미드 + 50ng/mL 엑센딘-4 + 10ng/mL BMP4에서 7-9일간 배양되어 완전한 형태의 내배엽 세포들의 생성없이, 포도당-반응성 인슐린-생산 세포들이 생성된다. 대안으로, 세포들은 실시예 11 또는 실시예 12에 따라 재프로그래밍되고, 그 다음 1:1의 F12/IMDM + 0.5% HSA + 0.5% ITS 보충물 + 0.5X B27 보충물 + 2μΜ 레티논산 + 20ng/mL FGF7 + 50ng/mL NOGGIN에서 4일간 배양되고, 이어서 DMEM/F12 + 1% ITS 보충물 + 10ng/mL bFGF + 10mM 니코틴아미드 + 50ng/mL 엑센딘-4 + 10ng/mL BMP4에서 7-9일간 배양되어, 내배엽 세포들의 생성없이, 그리고 선조 세포들의 확장없이, 포도당-반응성 인슐린-생산 세포들이 생성된다. 내피 세포들 또는 인슐린-생산 세포들은 배양물에 존재하는 다른 세포들로부터 단리될 수 있는데, 이 방법은 충분히 높은 비율의 포도당-반응성 인슐린 생산 세포들을 만들고, 이러한 분리가 일반적으로 요구되지 않는다. 그 다음 생성된 세포들은 당뇨병 연구용 생물활성 분자의 선별 또는 당뇨병 치료제 개발을 위하여 시험관 또는 생체내에서 이용될 수 있다.
실시예 16 재조합 단백질들을 이용한 포도당-반응성 인슐린-생산 세포들의 생산
세포들은 실시예 11에 따라 재프로그래밍되었으며, 그 다음 DMEM/F12, 100 ng/ml 액티빈 A, 25 ng/ml Wnt3a, 0.01% 재조합 HSA, 1X ITSE에서 1일간 배양되었고, 이어서 DMEM/F12, 100 ng/ml 액티빈 A, 0.01% 재조합 HSA, 1X ITSE에서 2일간 배양되었고, 이어서 DMEM/F12, 50 ng/ml FGF10, 0.25 μΜ KAAD-시클로파민, 0.01% 재조합 HSA, 1X ITSE에서 3일간 배양되었고, 이어서 DMEM/F12, 1% B27, 2 μΜ 모두 트란스인 레티논산, 50 ng/ml FGF10, 0.25 μΜ KAAD-시클로파민에서 4일간 배양되었고, 이어서 DMEM/F12, 1% B27, 1μΜ γ-씨크리타제 저해제 DAPT, 50 ng/ml 엑센딘-4, 10 nM 베타셀룰린, 10 mM 니코틴아미드에서 2일간 배양되었고, 이어서 DMEM/F12, 50mg/L 아스코르브산-2-포스페이트, 1% B27, 1μΜ γ-씨크리타제 저해제 DAPT, 50 ng/ml 엑센딘-4, 50 ng/ml IGF-1, 50 ng/ml HGF, 10 nM 베타셀룰린, 10 mM 니코틴아미드에서 6일간 배양되어 포도당-반응성 인슐린-생산 세포들이 생성되었다 (도 5a). 생성된 세포들은 당뇨병 연구용 생물활성 분자의 선별 또는 당뇨병 치료제 개발을 위하여 시험관 또는 생체내에서 이용될 수 있다.
실시예 17 유형 1 당뇨병 치료용 재프로그래밍화된 세포들을 포함하는, 개인맞춤화된 세포-대체 치료
환자 피부 세포들은 실시예 12 및 실시예 14에 따라 포도당-반응성 인슐린-생산 세포들로 재프로그래밍된다. 그 다음 배양 용기로부터 효소적으로 세포들이 방출되고, 약 1×106 내지 약 1×107 세포들이 복막내 공간 또는 문맥으로 주사된다. 복막내 주사의 경우, 과도안 이동을 방지하기 위하여 세포들은 세포외매트릭스 단백질과 사전-혼합된다. 세포들이 접합되고, 인슐린을 생산하기 시작한다. 인슐린/C-펩티드 수준이 모니터되고, 필요에 따라 추가 주사를 시행한다.
실시예 18 RNA TALEN들의 합성
20bp-정합(matching) TALEN들을 인코딩하는 RNA는 실시예 1에서와 같이 DNA 주형들로부터 합성되었다(도 6a-c 및 도 7) (표 2). 생성된 RNA는 그 질을 평가하기 위하여 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되었다. 그 다음 RNA는 200ng/㎕로 희석되었고, RNase 저해제 (Superase·In™, Life Techno10gies Corporation)가 100μg RNA당 1μL 농도로 추가되었다. RNA 용액은 4C에 보관되었다. TALEN 쌍의 각 절반을 인코딩하는 RNA는 1 : 1 몰 비로 혼합되었다.
표 2.
Figure pat00005
실시예 19 CCR5 유전자를 표적으로 하는 RNA TALEN들의 합성
TALEN L1 : TCATTTTCCATACAGTCAGT, L2: TTTTCCATACAGTCAGTATC, R1 : TGACTATCTTTAATGTCTGG, 및 R2: TATCTTTAATGTCTGGAAAT를 인코딩하는 RNA가 실시예 18에 따라 합성되었다. 이들 TALEN는 센스 가닥(L1 및 L2) 상에서 또는 안티센스 가닥 상(R1 및 R2)의 CCR5 유전자내 20-bp 부위를 표적으로 한다. 다음의 TALEN 쌍들이 준비되었다: L1&R1, L1&R2, L2&R1, 및 L2&R2.
실시예 20 RNA TALEN들을 이용한 CCR5 유전자의 유전자-에디팅과, DNA-없이, 영양공급세포-없이, 면역억제제-없이, 조건화-없이 인간 섬유아세포들의 재프로그래밍화
1차 인간 섬유아세포들은 재조합 인간 피브로넥틴과 재조합 인간 비트로넥틴 (DMEM/F12에서 1㎍/mL, 1mL/웰의 농도로 각각 희석되며, 1시간 동안 실온에서 항온처리됨)이 피복된 6-웰 플레이트 상에서 형질감염배지에서 웰당 10,000개의 세포 밀도로 도말되었다. 다음 날, 실시예 3과 같이 이 세포들이 형질감염되었는데, 단, RNA의 분량은 0.5㎍/웰이었고, 이 RNA는 실시예 19에 따라 합성되었다. 다음날부터 실시예 11에 따른 세포들의 재프로그래밍이 시작되었다. 재프로그래밍의 형태적 특징을 가진 세포의 많은 콜로니들이 실시예 11에서와 같이 보이기 시작되었다. 9일차에 사진촬영이 있었다 (도 8).
실시예 21 RNA TALEN들과 DNA 복구 주형으로 세포들의 형질감염
0.5ug RNA + 표적이된 이중-가닥 브레이크 위치의 500bp 상류에서부터 표적이된 이중-가닥 브레이크 위치의 500bp 하류까지 걸쳐진 1001 bp-영역을 함유하는 0.5ug DNA 그리고 6㎕ 형질감염 시약(Lipofectamine™ 2000, Life Techno10gies Corporation)은 우선 복합 배지 (Opti-MEM®)에서 각각 최종 60㎕가 되도록 별도로 희석되었다. 그 다음 희석된 RNA+DNA 그리고 형질감염 시약은 혼합되며, 형질감염 시약-제조업자의 시시에 따라 실온에서 15분간 항온처리된다. 복합물들은 배양물 내 세포들에게 첨가된다. 60㎕ 내지 120㎕가 6-웰 플레이트의 각 웰에 추가되며, 이때 이 웰에는 웰당 2mL의 형질감염 배지가 이미 담겨있다. 그 다음 플레이트를 가볍게 흔들어 웰을 통하여 복합물들이 분포되도록 한다. 이 배지를 새로운 형질감염 배지 (2mL/웰)로 대체하기에 앞서 2시간 내지 하룻밤 동안 세포들은 이 복합물과 함께 항온처리된다.
실시예 22 RNA TALEN들 및 DNA 복구 주형을 이용한 유전자-에디팅과, DNA-없이, 영양공급세포-없이, 면역억제제-없이, 조건화-없이 인간 섬유아세포들의 재프로그래밍화
1차 인간 섬유아세포들은 섬유아세포 배지 (DMEM + 10% 우태 혈청)에서 웰당 10,000개 세포의 밀도로 6-웰 플레이트 상에 도말된다. 6 시간 이후, 이 배지는 처리된 HSA를 함유하나, 면역억제제들은 함유되지 않은 형질감염 배지로 대체되며, 이 세포들은 실시예 21에 따라 형질감염된다. 실시예 11 또는 12에 따라 세포의 재프로그래밍이 다음날부터 시작되지만, 단, 초기 도말 및 배지 교환 단계들이 생략된다.
실시예 23 조혈 세포들의 생성
실시예 11에 따라 세포는 재프로그래밍되었고, 그 다음 IMDM + 0.5% HSA + 1x ITS 보충물 + 450μΜ 모노티오글리세롤 + 2mM L-글루타민 + 1X 비-필수 + 50ng/mL BMP4 + 50ng/mL VEGF + 50ng/mL bFGF에서 6일간 배양되어 조혈 세포들이 생성되었다 (도 5b). 대안으로, 실시예 11 또는 실시예 12 또는 실시예 20 또는 실시예 22에 따라 세포는 재프로그래밍되었고, 그 다음 IMDM + 0.5% HSA + 1x ITS 보충물 + 450μΜ 모노티오글리세롤 + 2mM L-글루타민 + 1X 비-필수 아미노산들 + 50ng/mL BMP4 + 50ng/mL VEGF + 50ng/mL bFGF에서 6일간 배양되며, 이어서 IMDM + 0.5% HSA + 1x ITS 보충물 + 0.1 mM 2-멀캅토에탄올 + 5U/mL 헤파린 + 10ng/mL TPO + 25ng/mL SCF + 25ng/mL FLT3L + 10ng/mL IL-3 + 10ng/mL IL-6에서 8일간 배양되어 조혈 세포들이 생성되었다. 대안으로, 실시예 11 또는 실시예 12 또는 실시예 20 또는 실시예 22에 따라 세포는 재프로그래밍되었고, 그 다음 콜라겐 IV에서 재도말되었고, 그리고 IMDM + 0.5% HSA + 1x ITS 보충물 + 450μΜ 모노티오글리세롤 + 2mM L-글루타민 + 1X 비-필수 아미노산들 + 50ng/mL BMP4 + 50ng/mL VEGF + 50ng/mL bFGF에서 6일간 배양되며, 이어서 IMDM + 0.5% HSA + 1x ITS 보충물 + 0. 1mM 2-멀캅토에탄올 + 5U/mL 헤파린 + 10ng/mL TPO + 25ng/mL SCF + 25ng/mL FLT3L + 10ng/mL IL-3 + 10ng/mL IL-6에서 8일간 배양되어 조혈 세포들이 생성되었다. 대안으로, 실시예 11 또는 실시예 12 또는 실시예 20 또는 실시예 22에 따라 세포는 재프로그래밍되었고, 그 다음 1:1의 F12/IMDM + 0.5% HSA + 1x ITS 보충물 + 4.5㎍/mL 콜레스테롤 +10㎍/mL 대구 간 오일 지방산들 + 25μg/mL 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트 + 2μg/mL D-α-토코페롤아세테이트 + 450μΜ 모노티오글리세롤 + 2mM L-글루타민 + 25ng/mL BMP4 + 25ng/mL VEGF + 25ng/mL bFGF + 20ng/mL SCF에서 10일간 배양되어, 조혈 세포들이 생성되었다.
실시예 24 혈액 질환 치료용 재프로그래밍화된 세포들을 포함하는, 개인맞춤화된 세포-대체 치료
환자 피부 세포들은 실시예 23에 따라 조혈 세포들로 재프로그래밍된다. 그 다음 배양 용기로부터 효소적으로 세포들이 방출되고, 환자 체중 kg 당 약 1×106 내지 약 1×107 세포들이 몇 시간에 걸쳐 주요 정맥으로 주입된다.
실시예 25 HIV/AIDS 치료용 유전자-에디팅 및 재프로그래밍화된 세포들을 포함하는, 개인맞춤화된 세포-대체 치료
환자 피부 세포들은 유전자-에디팅되고, 실시예 23에 따라 조혈 세포들로 재프로그래밍된다. 세포들은 배양 용기로부터 효소적으로 방출되며, 환자 체중 kg 당 약 1×106 내지 약 1×107 세포들이 몇 시간에 걸쳐 주요 정맥으로 주입된다. 조혈 줄기 세포들은 뼈 골수 강 및 이식편으로 회귀한다. 대안으로, 환자 피부 세포들은 유전자-에디팅되고, 실시예 23에 따라 조혈 세포들로 재프로그래밍되고, 그 다음 세포들은 배양 용기로부터 효소적으로 방출되며, CD34+/CD90+/Lin- 또는 CD34+/CD49f+/Lin-세포들이 단리된다. 약 1×103 내지 약 1×105 세포들이 몇 시간에 걸쳐 환자의 주요 정맥으로 주입된다. 조혈 줄기 세포들은 뼈 골수 강 및 이식편으로 회귀한다.
실시예 26 생물활성 분자들을 선별하기 위한 심장 질환 모델
세포들은 실시예 11에 따라 재프로그래밍되고, DMEM/F12 + 0.2% HSA + 0.5X N2 보충물 + 0.5X B27 보충물 + 100ng/mL 액티빈 A + 1μΜ 월트만닌에서 4일간 배양되고, 이어서 1:1의 F12/IMDM + 0.5% HSA + 0.5% ITS 보충물 + 0.5X B27 보충물 + 2μΜ 레티논산 + 20ng/mL FGF7 + 50ng/mL NOGGIN에서 4일간 배양되며, 이어서 DMEM/F12 + 1% ITS 보충물 + 10 ng/mL bFGF + 10 mM 니코틴아미드 + 50ng/mL 엑센딘-4 + 10ng/mL BMP4에서 7-9일간 배양되어 심장 세포들이 생성된다 (도 5c). 대안으로, 세포들은 실시예 12에 따라 재프로그래밍되었다. 심장 세포들은 배양물에 존재하는 다른 세포들로부터 단리될 수 있지만, 이 방법은 이러한 단리가 일반적으로 요구되지 않는, 상당히 높은 비율의 심장 세포들을 생산한다. 생성된 세포들은 심장질환의 연구용 생물활성 분자의 선별 또는 심장 질환의 치료제 개발을 위하여 시험관 또는 생체내에서 이용될 수 있다. 생성된 세포들은 또한 심독성 선별에 이용될 수 있다.
실시예 27 허혈성 심근증 치료용 재프로그래밍화된 세포들을 포함하는, 개인맞춤화된 세포-대체 치료
환자 피부 세포들은 실시예 26에 따라 심장 세포들로 재프로그래밍된다. 그 다음 배양 용기로부터 효소적으로 세포들이 방출되고, 약 1×106 내지 약 1×107 세포들이 심막으로 주입되거나 또는 약 1×103 내지 약 1×105 세포들이 하나 이상의 관상 동맥으로 주입된다. 세포들이 접합되고, 필요에 따라 추가 주사가 실행된다.
실시예 28 생물활성 분자들을 선별하기 위한 망막 질환 모델
세포들은 실시예 11 또는 실시예 12에 따라 재프로그래밍되고, 그 다음 DMEM/F12 + 0.2% HSA + 0.5X N2 보충물 + 0.5X B27 보충물에서 7일간 배양되어 망막 세포들이 생성된다. 생성된 세포들은 망막 질환의 연구용 생물활성 분자의 선별 또는 망막 질환의 치료제 개발을 위하여 시험관 또는 생체내에서 이용될 수 있다.
실시예 29 황반 변성 치료용 재프로그래밍화된 세포들을 포함하는, 개인맞춤화된 세포-대체 치료
환자 피부 세포들은 실시예 28에 따라 망막 세포들로 재프로그래밍된다. 그 다음 배양 용기로부터 효소적으로 세포들이 방출되고, 약 1×104 내지 약 1×105 세포들이 망막으로 또는 망막 아래로 주사된다. 세포들이 접합되고, 필요에 따라 추가 주사가 실행된다.
균등론
당업계 숙련자는 단순 실험에 의해 본 명세서에서 구체적으로 설명된 특정 구체예에 대해 다수의 균등물들을 인지하거나, 확신할 수 있을 것이다. 이러한 균등물들은 다음의 청구범위의 영역에 포괄된다.
참고자료에 편입
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공개물들은 전문이 참고자료에 편입된다.
<110> Factor Bioscience Inc. <120> METHODS AND PRODUCTS FOR TRANSFECTING CELLS <130> FABI-001/01WO <150> US 61/566,948 <151> 2011-12-05 <150> US 61/569,595 <151> 2011-12-12 <150> US 61/637,570 <151> 2012-04-24 <150> US 13/465,490 <151> 2012-05-07 <150> US 61/664,494 <151> 2012-06-26 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro 20 25 30 Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly 35 40 45 Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser Glu Val Trp Gly Ile Pro Pro Cys Pro 50 55 60 Pro Pro Tyr Glu Phe Cys Gly Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val 65 70 75 80 Gly Val Gly Leu Val Pro Gln Gly Gly Leu Glu Thr Ser Gln Pro Glu 85 90 95 Gly Glu Ala Gly Val Gly Val Glu Ser Asn Ser Asp Gly Ala Ser Pro 100 105 110 Glu Pro Cys Thr Val Thr Pro Gly Ala Val Lys Leu Glu Lys Glu Lys 115 120 125 Leu Glu Gln Asn Pro Glu Glu Ser Gln Asp Ile Lys Ala Leu Gln Lys 130 135 140 Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Leu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly 165 170 175 Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu 180 185 190 Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Arg Pro Leu Leu Gln Lys Trp Val 195 200 205 Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ala Glu 210 215 220 Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg 225 230 235 240 Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn Leu Phe Leu Gln Cys Pro Lys Pro Thr 245 250 255 Leu Gln Gln Ile Ser His Ile Ala Gln Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp 260 265 270 Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser 275 280 285 Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg Glu Asp Phe Glu Ala Ala Gly Ser Pro 290 295 300 Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser Phe Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Phe 305 310 315 320 Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro His Phe Thr Ala Leu Tyr Ser Ser 325 330 335 Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala Phe Pro Pro Val Ser Val Thr Thr 340 345 350 Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn 355 360 <210> 2 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Tyr Asn Met Met Glu Thr Glu Leu Lys Pro Pro Gly Pro Gln Gln 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Asn Gln Lys Asn Ser Pro Asp Arg Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe 35 40 45 Met Val Trp Ser Arg Gly Gln Arg Arg Lys Met Ala Gln Glu Asn Pro 50 55 60 Lys Met His Asn Ser Glu Ile Ser Lys Arg Leu Gly Ala Glu Trp Lys 65 70 75 80 Leu Leu Ser Glu Thr Glu Lys Arg Pro Phe Ile Asp Glu Ala Lys Arg 85 90 95 Leu Arg Ala Leu His Met Lys Glu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Arg Pro 100 105 110 Arg Arg Lys Thr Lys Thr Leu Met Lys Lys Asp Lys Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Gly Gly Leu Leu Ala Pro Gly Gly Asn Ser Met Ala Ser Gly Val Gly 130 135 140 Val Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Val Asn Gln Arg Met Asp Ser Tyr 145 150 155 160 Ala His Met Asn Gly Trp Ser Asn Gly Ser Tyr Ser Met Met Gln Asp 165 170 175 Gln Leu Gly Tyr Pro Gln His Pro Gly Leu Asn Ala His Gly Ala Ala 180 185 190 Gln Met Gln Pro Met His Arg Tyr Asp Val Ser Ala Leu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Met Thr Ser Ser Gln Thr Tyr Met Asn Gly Ser Pro Thr Tyr Ser 210 215 220 Met Ser Tyr Ser Gln Gln Gly Thr Pro Gly Met Ala Leu Gly Ser Met 225 230 235 240 Gly Ser Val Val Lys Ser Glu Ala Ser Ser Ser Pro Pro Val Val Thr 245 250 255 Ser Ser Ser His Ser Arg Ala Pro Cys Gln Ala Gly Asp Leu Arg Asp 260 265 270 Met Ile Ser Met Tyr Leu Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Pro Ala Ala 275 280 285 Pro Ser Arg Leu His Met Ser Gln His Tyr Gln Ser Gly Pro Val Pro 290 295 300 Gly Thr Ala Ile Asn Gly Thr Leu Pro Leu Ser His Met 305 310 315 <210> 3 <211> 479 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ser Asp Met Ala Val Ser Asp Ala Leu 1 5 10 15 Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser Gly Pro Ala Gly Arg Glu Lys 20 25 30 Thr Leu Arg Gln Ala Gly Ala Pro Asn Asn Arg Trp Arg Glu Glu Leu 35 40 45 Ser His Met Lys Arg Leu Pro Pro Val Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp 50 55 60 Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly 65 70 75 80 Ala Ala Cys Gly Gly Ser Asn Leu Ala Pro Leu Pro Arg Arg Glu Thr 85 90 95 Glu Glu Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser 100 105 110 Leu Thr His Pro Pro Glu Ser Val Ala Ala Thr Val Ser Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala 130 135 140 Pro Ser Thr Cys Ser Phe Thr Tyr Pro Ile Arg Ala Gly Asn Asp Pro 145 150 155 160 Gly Val Ala Pro Gly Gly Thr Gly Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Arg Glu 165 170 175 Ser Ala Pro Pro Pro Thr Ala Pro Phe Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp 180 185 190 Val Ser Pro Ser Gly Gly Phe Val Ala Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu 195 200 205 Asp Pro Val Tyr Ile Pro Pro Gln Gln Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly 210 215 220 Leu Met Gly Lys Phe Val Leu Lys Ala Ser Leu Ser Ala Pro Gly Ser 225 230 235 240 Glu Tyr Gly Ser Pro Ser Val Ile Ser Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp 245 250 255 Gly Ser His Pro Val Val Val Ala Pro Tyr Asn Gly Gly Pro Pro Arg 260 265 270 Thr Cys Pro Lys Ile Lys Gln Glu Ala Val Ser Ser Cys Thr His Leu 275 280 285 Gly Ala Gly Pro Pro Leu Ser Asn Gly His Arg Pro Ala Ala His Asp 290 295 300 Phe Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Ser Arg Thr Thr Pro Thr Leu Gly 305 310 315 320 Leu Glu Glu Val Leu Ser Ser Arg Asp Cys His Pro Ala Leu Pro Leu 325 330 335 Pro Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly Pro Asn Tyr Pro Ser Phe Leu 340 345 350 Pro Asp Gln Met Gln Pro Gln Val Pro Pro Leu His Tyr Gln Glu Leu 355 360 365 Met Pro Pro Gly Ser Cys Met Pro Glu Glu Pro Lys Pro Lys Arg Gly 370 375 380 Arg Arg Ser Trp Pro Arg Lys Arg Thr Ala Thr His Thr Cys Asp Tyr 385 390 395 400 Ala Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Lys Ser Ser His Leu Lys Ala His 405 410 415 Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly 420 425 430 Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg 435 440 445 Lys His Thr Gly His Arg Pro Phe Gln Cys Gln Lys Cys Asp Arg Ala 450 455 460 Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Ala Leu His Met Lys Arg His Phe 465 470 475 <210> 4 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met 1 5 10 15 Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp 20 25 30 Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln 35 40 45 Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile 50 55 60 Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg 65 70 75 80 Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser 85 90 95 Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp 100 105 110 Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln 115 120 125 Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile 130 135 140 Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val 145 150 155 160 Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser 165 170 175 Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr 180 185 190 Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val 195 200 205 Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala 210 215 220 Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser 225 230 235 240 Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His 245 250 255 Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu 260 265 270 Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro 275 280 285 Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys 290 295 300 Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His 305 310 315 320 Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala 325 330 335 Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser 340 345 350 Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn 355 360 365 Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu 370 375 380 Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu 385 390 395 400 Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala 405 410 415 Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 420 425 430 Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln 435 440 445 Leu Arg Asn Ser Cys Ala 450

Claims (1)

  1. 3개 이상의 비-정규 뉴클레오티드들을 포함하는 합성 RNA 분자이며, 이들 각 뉴클레오티드는 피리미딘 위치 2C, 피리미딘 위치 4C, 피리미딘 위치 5C, 퓨린 위치 6C, 퓨린 위치 7N, 및 퓨린 위치 8C로부터의 하나 이상의 치환체를 포함하는 것인, 합성 RNA 분자의 용도.


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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AU2011308496A1 (en) 2010-10-01 2013-05-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AU2012225497A1 (en) * 2011-03-07 2013-10-24 Massachusetts Institute Of Technology Methods for transfecting cells with nucleic acids
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013052523A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 modeRNA Therapeutics Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
MX354995B (es) 2011-12-05 2018-03-27 Factor Bioscience Inc Metodos y productos para transfeccion de celulas.
CA2859387A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013151669A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
EP3473707A1 (en) 2012-05-25 2019-04-24 Cellectis Methods for engineering allogeneic and immunosuppressive resistant t cell for immunotherapy
CN104769112A (zh) * 2012-11-01 2015-07-08 菲克特生物科学股份有限公司 用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品
US9597380B2 (en) 2012-11-26 2017-03-21 Modernatx, Inc. Terminally modified RNA
WO2014130909A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compounds, compositions, methods, and kits relating to telomere extension
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EP4249036A3 (en) * 2014-01-31 2023-10-25 Factor Bioscience Inc. Methods and products for nucleic acid production and delivery
EP3177302A4 (en) * 2014-08-07 2018-04-11 Duke University Compositions and methods for the reprogramming of cells into cardiomyocytes
WO2016076434A1 (ja) * 2014-11-14 2016-05-19 Ｊｃｒファーマ株式会社 歯髄由来多能性幹細胞を含有する筋ジストロフィー治療剤
WO2016131052A1 (en) * 2015-02-13 2016-08-18 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
EP3819372A3 (en) 2015-04-24 2021-10-06 University of Copenhagen Isolation of bona fide pancreatic progenitor cells
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
EP3384038A4 (en) * 2015-11-23 2019-12-04 The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate METHODS AND COMPOSITIONS FOR CELL REPROGRAMMING
US10253316B2 (en) * 2017-06-30 2019-04-09 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
AU2017312113B2 (en) 2016-08-17 2023-05-25 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
CA3054120A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Koji Tanabe Nerve cell production method by introduction of inducing factor rna
CN106967686B (zh) * 2017-03-31 2019-11-08 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨
CN108728903A (zh) * 2017-04-21 2018-11-02 深圳市乐土精准医疗科技有限公司 基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法
CN109280701A (zh) * 2017-07-21 2019-01-29 深圳华大基因股份有限公司 用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及制备方法和应用
WO2019068022A1 (en) * 2017-09-30 2019-04-04 Inscripta, Inc. CONTINUOUS FLOW ELECTROPORATION INSTRUMENTATION
CA2983845C (en) 2017-10-26 2024-01-30 University Of Copenhagen Generation of glucose-responsive beta cells
CN108103027B (zh) * 2018-02-02 2021-12-24 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法
JP7364560B2 (ja) * 2018-06-15 2023-10-18 扶桑薬品工業株式会社 生殖補助医療用培地
RU2746162C2 (ru) * 2019-07-30 2021-04-08 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") Способ трансфекции и культивирования клеток, синтезирующих рекомбинантный белок глутаматдекарбоксилазу
US10501404B1 (en) 2019-07-30 2019-12-10 Factor Bioscience Inc. Cationic lipids and transfection methods
WO2021030268A2 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Nutcracker Therapeutics, Inc. Microfluidic apparatus and methods of use thereof
WO2021231549A2 (en) * 2020-05-12 2021-11-18 Factor Bioscience Inc. Engineered gene-editing proteins
SE544701C2 (en) * 2020-12-17 2022-10-18 Cellink Bioprinting Ab A biodispensing or bioprinting system comprising an apparatus for handling a sample container having a lid

Family Cites Families (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2705230A (en) * 1949-09-23 1955-03-29 Allen F Reid Method of purifying albumin
US3539465A (en) 1968-10-08 1970-11-10 Ncr Co Encapsulation of hydrophilic liquid-in-oil emulsions
FR2322871A1 (fr) * 1975-09-08 1977-04-01 New Zealand Inventions Dev Procede d'isolement d'albumine
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
AT403989B (de) * 1996-09-16 1998-07-27 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines plasmaprotein-hältigen arzneimittels
WO1998030679A1 (en) 1997-01-10 1998-07-16 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
GB9703554D0 (en) 1997-02-20 1997-04-09 Dow Corning Polymerisation of cyclosiloxanes
JP2002508299A (ja) 1997-09-19 2002-03-19 セクイター， インク． センスｍＲＮＡ治療
GB9827085D0 (en) 1998-12-09 1999-02-03 Dow Corning Polymerisation of siloxanes
GB9827069D0 (en) 1998-12-09 1999-02-03 Dow Corning Polymerisation catalyst
GB9827036D0 (en) * 1998-12-09 1999-02-03 Dow Corning Polymerisation of siloxanes
GB9902000D0 (en) * 1999-01-30 1999-03-17 Delta Biotechnology Ltd Process
US20110171185A1 (en) 1999-06-30 2011-07-14 Klimanskaya Irina V Genetically intact induced pluripotent cells or transdifferentiated cells and methods for the production thereof
US7262286B2 (en) 2000-09-26 2007-08-28 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
WO2003018767A2 (en) 2001-08-27 2003-03-06 Advanced Cell Technology, Inc. Trans-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies
JPWO2003027277A1 (ja) 2001-09-21 2005-01-06 独立行政法人 科学技術振興機構 再プログラム化因子のスクリーニング方法、該方法によりスクリーニングされた再プログラム化因子および該再プログラム化因子を利用する方法、並びに、未分化融合細胞を分化させる方法および細胞、組織、臓器の製造方法
CA2463914A1 (en) 2001-10-18 2003-04-24 Ixion Biotechnology, Inc. Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
US7276489B2 (en) 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
GB0202149D0 (en) 2002-01-30 2002-03-20 Univ Edinburgh Pluripotency determining factors and uses thereof
GB0202633D0 (en) * 2002-02-05 2002-03-20 Delta Biotechnology Ltd Stabilization of protein preparations
WO2005002507A2 (en) 2003-06-03 2005-01-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of survivin expression
US7682828B2 (en) 2003-11-26 2010-03-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for reprogramming somatic cells
CN101044235B (zh) 2004-09-08 2013-01-02 威斯康星校友研究基金会 胚胎干细胞的培养基和培养
GB2432835B (en) 2004-09-08 2009-04-08 Wisconsin Alumni Res Found Culturing human embryonic stem cells
TW200740999A (en) 2005-07-15 2007-11-01 Primegen Biotech Llc Therapeutic reprogramming of germ-line stem cells
EP1913149A4 (en) 2005-07-26 2009-08-05 Sangamo Biosciences Inc TARGETED INTEGRATION AND EXPRESSION OF EXOGENOUS NUCLEIC ACID SEQUENCES
US8323666B2 (en) 2005-08-01 2012-12-04 Allergan, Inc. Botulinum toxin compositions
EP3611266B1 (en) 2005-08-23 2022-11-09 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
US9012219B2 (en) * 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
EP3354723B1 (en) 2005-08-29 2023-12-13 Technion Research & Development Foundation Ltd. Media for culturing stem cells
ATE552334T1 (de) * 2005-09-13 2012-04-15 Takara Bio Inc Serumfreies medium zur herstellung von retroviralen vektoren
US8129187B2 (en) 2005-12-13 2012-03-06 Kyoto University Somatic cell reprogramming by retroviral vectors encoding Oct3/4. Klf4, c-Myc and Sox2
US8048999B2 (en) 2005-12-13 2011-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
KR20080078010A (ko) 2005-12-22 2008-08-26 체에스엘 베링 게엠베하 옥타노에이트-감소된 사람 알부민
RU2008137975A (ru) 2006-02-24 2010-03-27 Релайанс Лайф Сайенсиз Пвт Лтд. (In) Конъюнктивальная тканевая система
US20090014055A1 (en) * 2006-03-18 2009-01-15 Solyndra, Inc. Photovoltaic Modules Having a Filling Material
JP2008077874A (ja) * 2006-09-19 2008-04-03 Shin Etsu Polymer Co Ltd 色素増感型太陽電池
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
GB0623635D0 (en) 2006-11-27 2007-01-03 Stem Cell Sciences Uk Ltd Pluripotent cell growth media
US10829733B2 (en) 2007-01-04 2020-11-10 Biolamina Ab Composition and method for enabling proliferation of pluripotent human stem cells
EP2099911A2 (en) * 2007-01-11 2009-09-16 Yale University Compositions and methods for targeted inactivation of hiv cell surface receptors
US8859229B2 (en) 2007-02-02 2014-10-14 Yale University Transient transfection with RNA
US9249423B2 (en) 2007-02-02 2016-02-02 Yale University Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA
US8440461B2 (en) 2007-03-23 2013-05-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Reprogramming somatic cells using retroviral vectors comprising Oct-4 and Sox2 genes
EP3878949A1 (en) 2007-04-07 2021-09-15 Whitehead Institute for Biomedical Research Reprogramming of somatic cells
ES2612538T3 (es) * 2007-05-29 2017-05-17 Christopher B. Reid Métodos para producción y usos de poblaciones de células multipotentes, poblaciones de células pluripotentes, poblaciones de células diferenciadas, y poblaciones de células resistentes a VIH
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
WO2009062157A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Michigan State University Epigenetic modification of cell phenotype, fate and/or function by rna transfer
JP5558097B2 (ja) 2007-12-10 2014-07-23 国立大学法人京都大学 効率的な核初期化方法
EP2072618A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-24 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Use of RNA for reprogramming somatic cells
MX2010010165A (es) 2008-03-17 2010-11-25 Scripps Research Inst Procedimientos quimicos y geneticos combinados para generacion de celulas madre pluripotentes inducidas.
WO2009120963A2 (en) 2008-03-27 2009-10-01 President And Fellows Of Harvard College Paper-based cellular arrays
US20110045001A1 (en) 2008-03-28 2011-02-24 Biontex Laboratories Gmbh Transfection results of non-viral gene delivery systems by influencing of the innate immune system
EP2275531B1 (en) * 2008-03-31 2015-12-23 Oriental Yeast Co., Ltd. Method for proliferation of pluripotent stem cells
CN101550406B (zh) * 2008-04-03 2016-02-10 北京大学 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
JP2011160661A (ja) * 2008-06-02 2011-08-25 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 血球細胞の初期化法
ES2587395T3 (es) 2008-06-04 2016-10-24 Cellular Dynamics International, Inc. Procedimientos para la producción de células IPS usando un enfoque no vírico
WO2009147400A1 (en) 2008-06-05 2009-12-10 Iti Scotland Limited Stem cell culture media and methods
US8669048B2 (en) 2008-06-24 2014-03-11 Parkinson's Institute Pluripotent cell lines and methods of use thereof
US20100184033A1 (en) 2008-07-16 2010-07-22 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
WO2010022194A2 (en) 2008-08-20 2010-02-25 Virxsys Corporation Compositions and methods for generation of pluripotent stem cells
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US8268620B2 (en) 2008-10-24 2012-09-18 Wisconsin Alumni Research Foundation OCT4 and SOX2 with SV40 T antigen produce pluripotent stem cells from primate somatic cells
EP2192174B1 (en) 2008-11-21 2015-11-11 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Reprogramming cells toward a pluripotent state
WO2010065123A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
US20100209404A1 (en) 2009-02-10 2010-08-19 University Of Dayton Enhanced method for producing stem-like cells from somatic cells
US10894944B2 (en) * 2009-04-10 2021-01-19 Monash University Cell culture media
US10837020B2 (en) 2009-04-22 2020-11-17 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long RNA molecules
EP2421563B1 (en) 2009-04-22 2017-04-12 Massachusetts Institute of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
EP3904505A1 (en) 2009-04-22 2021-11-03 Viacyte, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
US8496941B2 (en) 2009-06-03 2013-07-30 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Vectors for generating pluripotent stem cells and methods of producing pluripotent stem cells using the same
KR20120097483A (ko) 2009-07-24 2012-09-04 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 게놈 편집을 위한 방법
KR20140119197A (ko) 2009-07-31 2014-10-08 에트리스 게엠베하 단백질 발현을 위한 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드의 조합을 가진 ｒｎａ
KR101775926B1 (ko) 2009-11-04 2017-09-07 셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드 화학 물질을 이용한 에피솜 재프로그래밍
KR20120107088A (ko) 2009-11-11 2012-09-28 샌포드-번햄 메디칼 리서치 인스티튜트 ⅰＰＳ 세포들의 생산 및 조절 방법 및 그들의 조성물들
JP6276918B2 (ja) * 2009-11-12 2018-02-07 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド 多能性幹細胞を未分化状態で培養する培地、細胞培養および方法
US20130189741A1 (en) 2009-12-07 2013-07-25 Cellscript, Inc. Compositions and methods for reprogramming mammalian cells
PL3112467T3 (pl) * 2009-12-07 2018-07-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Preparaty RNA zawierające oczyszczony zmodyfikowany RNA do przeprogramowywania komórek
HUE041436T2 (hu) 2009-12-10 2019-05-28 Univ Minnesota Tal-effektor-közvetített DNS-módosítás
US8557972B2 (en) 2009-12-21 2013-10-15 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Compositions and methods for transfection of RNA and controlled stabilization of transfected RNA
CA2788635A1 (en) 2010-02-01 2011-08-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced efficiency of induced pluripotent stem cell generation
WO2011110886A1 (en) 2010-03-09 2011-09-15 Biolamina Ab Composition and method for enabling proliferation of pluripotent human stem cells
CA2796464C (en) 2010-04-16 2021-08-03 Immune Disease Institute, Inc. Sustained polypeptide expression from synthetic, modified rnas and uses thereof
WO2011132799A1 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into skeletal muscle or skeletal muscle progenitor cells
CA2796600C (en) * 2010-04-26 2019-08-13 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a rosa locus using zinc-finger nucleases
CN102234627B (zh) * 2010-04-30 2015-06-03 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种培养基添加剂及其应用
WO2011140397A2 (en) 2010-05-05 2011-11-10 The Regents Of The University Of California Office Of The President Stem cell defined media for xeno-free and feeder free conditions and uses thereof
US20130145487A1 (en) 2010-05-12 2013-06-06 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from the dystrophin gene and uses thereof
US8048675B1 (en) 2010-05-12 2011-11-01 Ipierian, Inc. Integration-free human induced pluripotent stem cells from blood
JP6208580B2 (ja) 2010-05-17 2017-10-04 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 新規のｄｎａ結合タンパク質及びその使用
EP2392208B1 (en) 2010-06-07 2016-05-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusion proteins comprising a DNA-binding domain of a Tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use
EP2601288B1 (en) 2010-08-05 2016-04-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US20140127814A1 (en) * 2010-08-10 2014-05-08 Srinivasan Chandrasegaran Generation and use of pluripotent stem cells
WO2012036299A1 (en) 2010-09-14 2012-03-22 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
AU2011308496A1 (en) 2010-10-01 2013-05-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US20130273656A1 (en) 2010-10-08 2013-10-17 Regents Of The University Of Minnesota Method to increase gene targeting frequency
US9637732B2 (en) 2010-11-04 2017-05-02 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
AU2012225497A1 (en) * 2011-03-07 2013-10-24 Massachusetts Institute Of Technology Methods for transfecting cells with nucleic acids
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
EP2694660B1 (en) 2011-04-03 2018-08-08 The General Hospital Corporation Efficient protein expression in vivo using modified rna (mod-rna)
WO2013003475A1 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Cellscript, Inc. Inhibition of innate immune response
JP2014520551A (ja) * 2011-07-11 2014-08-25 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 細胞のリプログラミング方法およびゲノムの改変方法
WO2013052523A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 modeRNA Therapeutics Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
MX354995B (es) 2011-12-05 2018-03-27 Factor Bioscience Inc Metodos y productos para transfeccion de celulas.
CA2859387A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
JP2015510495A (ja) 2011-12-21 2015-04-09 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 器官または器官移植片の生存可能性または寿命を延長する方法
DK2798064T3 (en) 2011-12-30 2016-12-19 Cellscript Llc PRODUCTION AND USE OF IN VITRO synthesized ssRNA TO FEED IN MAMMALIAN CELLS FOR INDUCTION OF A BIOLOGICAL OR BIOCHEMICAL EFFECT
WO2013151669A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
CA2885576A1 (en) 2012-04-24 2013-10-31 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Generating pluripotent cells de novo
KR102215413B1 (ko) 2012-05-13 2021-02-16 알렐 바이오테크놀로지 앤 파마슈티칼스, 인크. 합성 메신저 rna에 의한 인간 유도 만능 줄기 세포의 피더프리 유래
US10119150B2 (en) 2012-05-13 2018-11-06 Allele Biotechnology & Pharmaceuticals, Inc. Feeder-free Derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger RNA
US10155929B2 (en) 2012-05-13 2018-12-18 Allele Biotechnology & Pharmaceuticals, Inc. Feeder-free derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger RNA
WO2014130909A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compounds, compositions, methods, and kits relating to telomere extension
WO2017019010A1 (en) * 2015-07-27 2017-02-02 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Disinfectant composition with rapid antiviral efficacy

Also Published As

Publication number Publication date
US20140356906A1 (en) 2014-12-04
AU2022204659B2 (en) 2022-09-22
US9422577B2 (en) 2016-08-23
US20230033888A1 (en) 2023-02-02
AU2017225124B2 (en) 2019-02-28
AU2019203662A1 (en) 2019-06-13
HK1222203A1 (zh) 2017-06-23
MX2021000210A (es) 2021-03-25
RU2014127505A (ru) 2016-02-10
KR102196339B1 (ko) 2020-12-29
AU2016277545A1 (en) 2017-01-12
MX2021000211A (es) 2021-03-25
KR102320571B1 (ko) 2021-11-02
CN104080482B (zh) 2015-11-25
EP3260140A1 (en) 2017-12-27
US11708586B2 (en) 2023-07-25
US10472611B2 (en) 2019-11-12
US20200308544A1 (en) 2020-10-01
MX2021000209A (es) 2021-03-25
AU2020202780B2 (en) 2022-04-14
US20230323399A1 (en) 2023-10-12
MX354995B (es) 2018-03-27
KR20140109925A (ko) 2014-09-16
JP6073916B2 (ja) 2017-02-01
US9605277B2 (en) 2017-03-28
DK3260140T3 (da) 2021-04-19
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