ES2612538T3 - Métodos para producción y usos de poblaciones de células multipotentes, poblaciones de células pluripotentes, poblaciones de células diferenciadas, y poblaciones de células resistentes a VIH - Google Patents

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Abstract

Un método para producir células multipotentes, pluripotentes y/o autorrenovables de las células seleccionadas, que comprende: transfectar células seleccionadas obtenidas al seleccionar células del grupo de células somáticas con secuencias de nucleótidos que codifican las isoforma(s) de (inserción PRR +) "largas" de la proteína Numb de mamífero y con una secuencia de nucleótidos adicionales que codifica Notch; y hacer crecer las células seleccionadas en un medio de crecimiento que comprende citoquinas seleccionadas de EGF, bFGF, LIF, factor de acero, IL-6, hiper IL-6, IL-7, oncostatina-M, cardiotrofina-1 y otras citoquinas que mejoran el crecimiento efectivas que las células seleccionadas expanden a una velocidad, en la que se determina dicha velocidad a partir de los tiempos de duplicación de las células seleccionadas en dicho medio de cultivo de crecimiento; y mantener las células bajo estas condiciones de cultivo hasta que se alcanza la cantidad de células deseada.

Description

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DESCRIPCIÓN
Métodos para producción y usos de poblaciones de células multipotentes, poblaciones de células pluripotentes, poblaciones de células diferenciadas, y poblaciones de células resistentes a VIH
Antecedentes de la invención
5 El reto trascendente para la medicina en el siglo 21 será reemplazar células dañadas, desgastadas o comprometidas genéticamente. Los factores de transcripción que se unen específicamente al ADN cumplen una función vital en la regulación de expresión de genes. Es el complemento particular de factores de transcripción dentro de una célula individual, que determinan que programas celulares están activos y están apagados. En esta capacidad, los factores de transcripción cumplen una función decisiva en la determinación y mantenimiento de la identidad celular, así como la
10 determinación de vulnerabilidad celular.
Un informe escrito por VERDI JOSEPH M ET AL: "Distinct human NUMB isoforms regulate differentiation vs. proliferation in the neuronal lineage", publicado el 31 de agosto de 1999, divulga cuatro isoformas diferentes de Numb, y su expresión diferencial durante el desarrollo neuronal. Cada isoforma se expresó por separado en tres estirpes celulares (células de carcinoma embrionario P19 de murino pluripotente y células madre de la cresta neural
15 inmortalizadas (MONC-1), y las células madre de cresta neural primarias) para determinar sus diferentes funciones. Se encontró que las isoformas Numb (PRRL) largas para promover la proliferación de células madre/progenitoras no diferenciadas, pero no su diferenciación.
Un informe escrito por CHAPMAN GAVIN ET AL: "High levels of Notch signaling down-regulate Numb and Numblike", publicado en noviembre de 2006, demuestra una relación compleja entre Notch y los dos homólogos Numb de
20 vertebrados Numb y Numblike. Aunque Numb y Numblike a bajos niveles de señalización Notch negativamente regulan Notch, altos niveles de señalización de Notch inversamente llevan a una reducción de los niveles de proteína Numb y Numblike en células cultivadas y en el sistema nervioso central de pollos en desarrollo. Sin embargo, Chapman et al., 2006 se dirige exclusivamente a Numblike y PRR-Numb corto, pero no dice nada con respecto al PRR + Numb largo.
Un informe escrito por BANI-YAGHOUB MAHMUD ET AL: "A switch in numb Isoforms is a critical step in cortical
25 development", publicado en marzo de 2007, divulga el cambio de expresión de Numb (PRR+) larga a (PRR-) corta en células progenitoras corticales. También divulga que las isoformas Numb largas se inactivaron por morfolino antisentido en cultivos de células madre neuronales. La expresión de las largas Numb isoformas resultó en una reducción significativa de la diferenciación neuronal, que se correlaciona con una expansión de la agrupación de progenitor cortical.
30 Resumen de la invención
La capacidad de derivar poblaciones de células multipotentes y pluripotentes, proliferntes, de autorrenovación, a partir de células que no se autorrenuevan, no pluripotentes de otra forma pueden tener implicaciones positivas significativas para todos los campos que utilizan terapias celulares. Estos campos incluyen el trasplante de médula ósea, medicina transfusional y terapia génica y permiten la producción de células madre específicas a paciente y otros tipos de células 35 deseadas. Del mismo modo, es deseable la capacidad de iniciar la diferenciación de las células en nervios, músculos, y varias otras poblaciones de células y también será de valor significativo para procesos de medicina y comerciales que involucran animales. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona métodos para la producción genética y usos de poblaciones de células multipotentes, poblaciones de células pluripotentes, poblaciones de células neuronales, poblaciones de células musculares, y otras poblaciones de células deseadas tales como, por ejemplo,
40 poblaciones de células resistentes a VIH.
Es una proposición de la presente invención que la introducción eficiente o sobreexpresión de factores de transcripción específica, sola o en combinación con otros factores determinantes del destino celular (tales como notch, numb y numblike), permita la interconversión de lo que se ha considerado fenotipos celulares transitorios (multipotentes, pluripotentes, y/o de autorrenovación) o fijos (diferenciados o somáticos). La capacidad de inducir de forma confiable la
45 conversión fenotípica o reprogramación celular permite la producción de células madre, células de reemplazo, tejidos y órganos que corresponden a pacientes individuales. En combinación con técnicas de terapia génica y técnicas de cultivo celular, la interconversión de tipo celular también proporciona la producción de células resistentes a enfermedad y genéticamente reparadas que son adecuadas para trasplante.
Es un objeto de esta invención proporcionar diversas formas de generar poblaciones de células multipotentes y/o 50 pluripotentes, proliferantes, que se autorrenuevan, así como otras poblaciones de células deseables, ya sea que dividan
o no dividan las células sin el uso de oncogenes. Las poblaciones de células con diferenciación comprenden células que expresan algunos, pero no todos los marcadores asociados con la categorización tipo celular específica. Se divulga aquí que la expresión de la isoforma Numb apropiado en combinación con otros transgenes (especialmente factores de transcripción) permite la producción de poblaciones de células pluripotentes, que se dividen o poblaciones de células
55 diferenciadas.
La invención se puede utilizar con cualesquier células adecuadas, que incluyen células de vertebrados, y que incluyen células de peces, mamíferos, aves, anfibios, y reptiles.
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Descripción detallada
Una secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido) se denomina "ligada operablemente" a otra secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, un promotor) cuando la primera secuencia de ácidos nucleicos se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Por
5 ejemplo, un promotor se liga operablemente a una secuencia de codificación si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Como se utiliza aquí, el término "accionado por" se refiere a un gen o secuencia de codificación que se liga operablemente a una secuencia promotora, y que la secuencia promotora afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación.
Sin embargo, se describe aquí una base teórica para las realizaciones de la invención, esta discusión no se considera
10 de ninguna manera que se limita o restringe en la presente invención. Aquellos expertos en la técnica comprenderán que las diversas realizaciones de la invención se pueden poner en práctica independientemente del modelo utilizado para describir los fundamentos teóricos de la invención.
En una realización preferida, las células se "seleccionan" de poblaciones de células accesibles, que se dividen o que no se dividen con el propósito de generar a) poblaciones de células de proliferación, multipotentes o población de células
15 pluripotentes deseadas, que se diferencian de b) poblaciones de células neuronales, c) células musculares, d) y/o cualquier otra población de células deseada; más aún, la población de células deseada puede ser capaz de una mayor diferenciación in vitro, in vivo, y/o diferenciación apropiada a tejido y regionalmente apropiada in vivo.
Fuentes de células seleccionadas para uso en la invención:
Las células seleccionadas pueden incluir cualquier practicable celular en la presente invención. Las células
20 seleccionadas para uso en la presente invención (aquí denominadas "células seleccionadas") se puede originar como células endógenas del paciente que incluyen células derivadas de otros sistemas de órganos; o de fuentes exógenas (que incluyen aquellas derivadas de estirpes celulares, fuentes criopreservados, fuentes donadas, y donantes). Las células también se pueden seleccionar a partir de células genéticamente modificados con secuencias de ácidos nucleicos sintéticos o naturales. El término "células seleccionadas" como se utiliza aquí no incluye las células madre de
25 embriones humanas.
En realizaciones de la presente invención, con el fin de que se puedan aislar, sin la implicación de procedimientos invasivos, las células seleccionadas preferiblemente pueden ser células fácilmente accesibles (por ejemplo, leucocitos de sangre periférica, células madre hematopoyéticas circulantes, células epiteliales (por ejemplo células de la mejilla bucal), tejido adiposo, células de sangre de cordón umbilical, etc.). Sin embargo, las células madre de médula ósea, las
30 células germinales primordiales (PGC), células madre aisladas de membranas amnióticas, fluido amniótico, así como células aisladas de la piel, etc. también están cubiertas por la presente invención. Dichas células se pueden aislar a partir de los tejidos en los que residen por cualquier medio conocido en la técnica.
Las células seleccionadas pueden ser células genéticamente modificadas, especialmente células que se han modificado genéticamente por cualquier medio conocido en la técnica, para codificar secuencias de ácido desoxirribonucleico
35 (ADN) o de ácido ribonucleico (ARN) terapéutico o comercialmente útil.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una población de células deseada (por ejemplo pluripotentes, neuronales, musculares, etc.) de las células seleccionadas.
Obtener poblaciones de células multipotentes, pluripotentes, y/o de autorrenovación:
Con el fin de lograr a) una población de células pluripotentes de proliferación, autorrenovación, las células
40 seleccionadas y/o su progenie se transfectan con secuencias de nucleótidos que codifican la isoforma (PRR inserto +) "larga") del gen numb de mamíferos y con secuencia de nucleótidos adicional que codifica Notch. Luego se cultivan en condiciones que promueven el crecimiento de las células seleccionadas a una velocidad de crecimiento óptimo. Las células seleccionadas se mantienen bajo estas condiciones durante el período de tiempo suficiente para conseguir el número de células deseado.
45 Las células se hacen crecer a velocidad (óptima) de crecimiento alcanzado mediante incubación en un medio de crecimiento que comprende citoquinas seleccionadas de EGF, bFGF, LIF, factor de acero, y/o concentraciones equipotentes de IL-6, hiper IL-6, IL-7, oncostatina-M y/o cardiotrofina-1; o que la velocidad de crecimiento alcanzada en la presencia de otras citoquinas que mejoran el crecimiento (por ejemplo, aquellas condiciones descritas para el cultivo de células pluripotentes por ejemplo Guan et al., 2006). La velocidad de crecimiento se determina a partir de los tiempos
50 de duplicación de las células seleccionadas en dicho medio de cultivo de crecimiento. Del mismo modo, las condiciones de cultivo, tales como aquellas descritas en las patentes estadounidenses 6432711 y 5453357 también pueden ser adecuadas para la propagación y expansión, a una velocidad de crecimiento óptimo, de las células transfectadas con las isoformas (PRR+) largas. Otros protocolos adecuados y las concentraciones de citoquinas de referencia han sido enseñadas por Koshimizu et al., 1996; Keller et al., 1996; Piquet-Pellorce, 1994; Rose et al., 1994; Park y Han, 2000;
55 Guan et al., 2006; Dykstra et al., 2006; Zhang et al., 2007). Sin embargo, la práctica de la presente invención no se limita a los detalles de estas enseñanzas.
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En una realización preferida separada, se utilizan otros ácidos nucleicos o proteínas en concierto con los ácidos nucleicos o proteínas que corresponden a isoformas (PRR+) Numb largas siempre que se produzca una población de células multipotentes, pluripotentes y/o autorrenovables a partir de las células seleccionadas y el método es electroporación, liposomas, nanocápsulas, nanovaults, y/u otro método que evita la integración lentiviral/retroviral u otra
5 alteración aleatoria del genoma de célula.
Se debe entender que cualquier combinación de secuencias de ácidos nucleicos o proteínas descritas aquí se puede modificar al excluir aquellas correspondientes a Numb y/o Numblike siempre y cuando se alcance la población de células o comportamiento deseado.
En una realización preferida, las etapas de transfección descritas aquí representan la transfección transitoria.
10 Dicha transfección transitoria se logra utilizando vectores virales que no se integran en el genoma anfitrión.
En otra realización preferida, dicha transfección transitoria se logra utilizando técnicas de transfección estándar (electroporación, transfección mediada químicamente, liposomas fusogénicos o no fusogénicos, nanocápsulas, nanovaults, etc.).
Con el tiempo, otras combinaciones de genes que difieren de aquellos descritos aquí se pueden describir o descubrir
15 como capaces de provocar que las células se conviertan en multipotentes, pluripotentes, capaces de autorrenovación o para iniciar diferenciación. Sin embargo, esta solicitud de patente también cubre la reprogramación genética de cualquier célula nucleada que utiliza ácido nucleico o electroporación de proteínas (para métodos de ejemplo véase Gagne et al., 1991; Saito et al., 2001; Yuan, 2008; Huang et al., 2007; Xia y Zhang, 2007; Cemazar y Sersa 2007; Isaka y Imai, 2007; Luxembourg et al., 2007; Van Tendeloos, 2007; Takahashi, 2007; etc.) electroporación, liposomas,
20 nanocápsulas, nanovaults, y/u otro método que evita integración viral u otra alteración aleatoria del genoma de la célula como tal significa aumentar la seguridad y eficiencia.
Evaluación de potencia y diferenciación
Se puede evaluar la pluripotencia y multipotencia por cualquier medio conocido en la técnica, que incluye 1) trasplante, 2) cultivo bajo condiciones que promueven la formación de cuerpos de embrioides, 3) inyección de células en embriones 25 en fase de blastocisto de animales con desarrollo posterior, y 4) ensayos de expresión de ARN (por ejemplo, RT-PCR y análisis basados en micromatrices) para expresión de genes asociados con diferenciación, multipotencia, pluripotencia, etc. (véase Guan et al., 2006), 5) formación de colonias, así como morfología similar a ES. Un método descrito aquí para detectar pluripotencia en células seleccionadas y/o su progenie implica la transfección con una construcción indicadora que comprende el promotor Nanog ligado operablemente a un gen de proteína fluorescente. Esto permite la
30 identificación e enriquecimiento de células que expresan Nanog que utilizan fluorescencia de células activadas (FACS), etc.
En una realización preferida, las células endógenas (por ejemplo, células que rodean a un sitio de quemadura o lesión) son transfectadas in vivo con vectores genéticos que codifica las isoformas numb (PRR+) largas solas o en conjunto con otros transgenes se mencionan aquí para promover transitoriamente la proliferación de células renovadas o
35 aumentadas. Este método también se puede utilizar clínicamente en el establecimiento de tejidos de hipoplasia, trastornos en los que se agotan de forma anormal las células madre/progenitoras, y otros trastornos en los que se puede mostrar que el método es beneficioso.
Obtener poblaciones de células diferenciadas
Con el fin de lograr poblaciones de células b) neurales c) musculares d) y otras capaces de una mayor diferenciación
40 regulada ambientalmente in vivo, las células seleccionadas y/o su progenie se transfectan opcionalmente con secuencias de isoformas Numb (PRR+) y/o secuencias de oligonucleótidos sintéticos y se expanden mediante crecimiento durante un tiempo suficiente para lograr el número deseable de progenie de células in vitro (como se describió anteriormente).
Después de esta etapa opcional, las células seleccionadas y/o su progenie se lavan libres de citoquinas y agentes que
45 comprenden el medio de crecimiento en expansión/óptimo, y se transfectan opcionalmente con las secuencias de nucleótidos que codifican oligonucleótidos sintéticos que se dirigen a las isoformas (PRR+) largas, etc., después se cultivan bajo condiciones que promueven la diferenciación de células seleccionadas en el tipo celular deseado.
Obtener poblaciones de células neuronales o neurales
Cuando la población de células deseada es una población de células neurales, las células transfectadas se cultivan con
50 éxito en condiciones que promueven el crecimiento a una velocidad que es inferior a la velocidad óptima y en presencia de agente(s) que promueven la diferenciación de las células en células neurales. Se han descrito las condiciones que promueven la diferenciación en las neuronas en numerosas publicaciones, que incluyen (Benninger et al., 2003; Chung et al. 2005; Harkany et al., 2004; Ikeda et al., 2004; Ikeda et al., 2005; Wernig et al., 2002; y Wernig et al., 2004). Adicionalmente, la combinación de la exposición al ácido retinoico con la presencia de citoquinas adicionales favorece la
55 diferenciación del tipo de célula neuronal específica in vitro (por ejemplo, Soundararajan et al., 2006; Soundararajan et al., 2007; Patente Estadounidense 6432711).
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En una realización preferida, la diferenciación in vitro de las neuronas o células neuronales se produce en presencia de 50 ng/mL de factor de crecimiento nervioso (NGF).
Obtener poblaciones de células musculares
Cuando la población de células deseada es una población del músculo, las células transfectadas con éxito se cultivan
5 en presencia de un agente que promueve diferenciación de células en células musculares y crecimiento a una velocidad inferior a la velocidad óptima. También se han descrito previamente condiciones que promueven la diferenciación en las células musculares (Nakamura et al., 2003; Pal y Khanna, 2005; Pipes et al., 2005; Albilez et al., 2006; Pal y Khanna, 2007; Behfar et al., 2007; Patente Estadounidense 6432711). Adicionalmente, la exposición de células seleccionadas y/o su progenie a hexametileno bis-acrilamida o sulfóxido de dimetilo en presencia de citoquinas adicionales favorece la
10 iniciación de diferenciación tipo muscular in vitro.
En otra realización preferida, cuando una población de células del músculo cardiaco es la población deseada, las células también se transfectan con secuencias de nucleótidos que incluyen las seleccionadas de aquellas secuencias que codifican Gata 4, Gata 5 y Gata 6.
La transfección simultánea con cualquier subconjunto de estas secuencias de transgenes distintas enumeradas
15 anteriormente se puede lograr por cualquier medio conocido en la técnica, que incluye el uso de múltiples vectores genéticos, la transfección en serie, así como la selección basada en proteínas marcadoras distintas y/o resistencia a antibióticos.
Cuando la población de células deseada es una población de células hematopoyéticas, el medio de diferenciación incluye agentes específicos a concentraciones que promueven la diferenciación en células progenitoras
20 hematopoyéticas (por ejemplo, factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), trombopoyetina, etc. (por ejemplo Ohmizono, 1997; Wang et al., 2005; Srivastava et al., 2007; Gupta et al., 2007) o tipos de células hematopoyéticas diferenciadas (de acuerdo con métodos conocidos en la técnica para proporcionar tipos de células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células no diferenciadas o pluripotentes)
Cuando la población de células deseada es una población de células germinales, el medio de diferenciación incluye
25 agentes específicos a concentraciones que promueven diferenciación en las células germinales (por ejemplo Nayernia et al. 2006a, 2006b).
Cuando la población de células deseada es una población de células de endodermo y de islotes pancreáticos, el medio de diferenciación incluye agentes específicos a concentraciones que promueven la diferenciación en células del endodermo y de los islotes pancreáticos (por ejemplo Xu et al., 2006; Denner et al., 2007; Shim et al., 2007; Jiang et al.,
30 2007).
En las realizaciones, se utilizará un único vector que controla la expresión de la secuencia(s) de nucleótidos que codifica la isoforma (PRR+) "larga" del gen numb de mamífero bajo un promotor regulable (por ejemplo, un promotor regulado por tetraciclina), mientras que las isoformas Numblike y Numb cortas (y/o oligonucleótidos sintéticos que se dirigen a isoformas (PRR+) largas) se expresan bajo el control de otro promotor distinto, pero también regulable. Por lo tanto, la
35 isoforma(s) numb (PRR+) largas se pueden expresar (y/o isoformas cortas reprimidas) cuando se desea la expansión de las células seleccionadas y se agrega un agente inductor (por ejemplo tetraciclina) al medio de crecimiento; por último se pueden expresar las isoformas numblike y isoformas cortas (y/o isoforma numb (PRR+) larga reprimida) cuando se desea diferenciación.
Alternativamente, las proteínas y péptidos correspondientes a las Numb, Notch, enumeradas aquí se pueden aplicar de
40 manera análoga a las células seleccionadas y/o su progenie a través de electroporación (por ejemplo, Koken et al., 1994; Ritchie y Gilroy, 1998), utilizando nanopartículas, lípidos catiónicos, liposomas fusogénicos (por ejemplo, Yoshikawa et al., 2005; 2007), etc., en lugar de, o en combinación con transfección genética. En general, la electroporación permite una alta eficiencia de transfección (y la producción eficiente de las células deseadas) sin integración genómica del transgén y por lo tanto se asocia con un aumento de seguridad.
45 El ADN o ARN que codifica la proteína(s) o polipéptido(s) que promueve proliferación, pluripotencialidad, pluripotencialidad o diferenciación de las células seleccionadas se puede aislar de acuerdo con técnicas de ingeniería genética estándar (por ejemplo, al aislar dicho ADN a partir de una colección de cADN de la estirpe celular específica) y colocarlo en un vector de expresión apropiado, que luego se transfecta en las células seleccionadas.
En una realización preferida, los vectores genéticos que codifican las isoformas Numb largas (tales como aquellos
50 descritos aquí) se introducen de forma transitoria o bajo el control de un promotor regulable, en células endógenas in vivo con el fin de provocar que las células proliferen de forma transitoria.
En una realización preferida, las células endógenas (por ejemplo, células de la zona ependimal del sistema nervioso central) se transfectan in vivo con vectores genéticos que codifican la isoforma numb larga y/u otros transgenes mencionados aquí, con el fin de promover de forma transitoria la proliferación de células madre renovadas o 55 aumentadas (con posterior diferenciación de células de progenie). Esta renovación o aumento se mide en términos del número de células que muestran expresión de nueva aparición de “marlers” asociados a progenitores de división. Esto
imagen5
se puede lograr mediante la introducción de los vectores genéticos en el sistema de órganos utilizando métodos adecuados para este propósito (véase ejemplos).
En una realización preferida separada, se pueden utilizar otros ácidos nucleicos o proteínas en conjunto con el ácido nucleico(s) o proteína(s) que corresponde a un solo gen, o porción del mismo, (particularmente aquellas mencionadas
5 aquí, descubiertas de acuerdo con los métodos descritos aquí, descubiertos de acuerdo con otros métodos publicados, y/o conocidos que sean capaces de iniciar la forma deseable de diferenciación), siempre que se produzca una población de células diferenciadas a partir de las células seleccionadas y el método utilizado es electroporación, liposomas, nanocápsulas, nanovaults, y/u otro método que evita integración lentiviral/retroviral u otra alteración aleatoria del genoma de la célula.
10 Se debe entender que cualquier combinación de secuencias de ácidos nucleicos o proteínas descritas aquí se puede modificar al excluir aquellas que corresponden a Numb y/o Numblike siempre y cuando se logre la población de células
o comportamiento deseado.
Del mismo modo, se debe entender que los métodos descritos aquí (o en otra parte) para iniciar diferenciación son aplicables a cualesquier células madre multipotentes, pluripotentes, de auto-renovación inducidas o no inducidas, u
15 otras células seleccionadas, no sólo aquellas obtenidas de la manera descrita aquí.
Fuentes de células seleccionadas
La población de células seleccionadas se puede derivar de células somáticas. Sin embargo se excluyen específicamente las células somáticas que carecen de núcleos (por ejemplo, glóbulos rojos humanos maduros). Las células madre seleccionadas se pueden derivar de estirpes de células existentes o aislar de fuentes almacenadas, de 20 donantes, o criopreservadas. Las fuentes típicas de células madre incluyen médula ósea, sangre periférica, sangre de placenta, fluido amniótico (por ejemplo, De Coppi et al., 2007), sangre del cordón umbilical (por ejemplo, Zhao, et al., 2006; Tian et al., 2007), tejido adiposo (por ejemplo Gimble et al., 2007; Ma et al., 2007), embriones no humanos, y otros. Los leucocitos circulantes y otras células no madre se pueden seleccionar igualmente y someter a las mismas condiciones de cultivo como se describió anteriormente efectivas que adquieren multipotencia, pluripotencia y/o
25 autorrenovación como resultado. Ejemplos de otras células somáticas accesibles útiles en esta invención incluyen linfocitos y células epiteliales (por ejemplo, mejilla bucal). El aislamiento y recolección de células seleccionadas para uso en la presente invención se pueden realizar por cualquier método conocido en la técnica.
En una realización preferida, se cultivaron células seleccionadas en un formato tridimensional.
Por ejemplo, las células pluripotentes, multipotentes, y/o diferenciadas producidas o tratadas de acuerdo con los
30 métodos descritos aquí (u otros métodos publicados) se pueden hacer crecer en asociación con de andamios tridimensionales o bidimensionales diseñados por ingeniería para replicar la estructura de tejido normal y/o estructuras de órganos (por ejemplo Yarlagada et al., 2005; Kim et al, 1998; WO/2003/070084; EP1482871; WO03070084; Patentes Estadounidenses 2395698; 7297540; 6995013; 6800753; Isenberg et al., 2006).
De manera similar, los andamios de construcción que van a ser ocupados por células pluripotentes, multipotentes, y/o
35 diferenciadas se pueden derivar de órganos o tejido de cadáveres después se pueden tratar los órganos o tejidos cadavéricos (por ejemplo, hueso, corazón, riñón, hígado, de pulmón, etc.) se puede tratar en tal forma que se eliminan las células inmunitarias del anfitrión residentes en ese tejido, y otras células anfitrionas no deseables o auxiliares, (por ejemplo, mediante radiación por ionización, esterilización (por ejemplo Mroz et al., 2006), y/o diversos métodos de descelularización (Patentes Estadounidenses 6734018; 6962814; 6479064; 6376244;. Patentes Estadounidenses Nos.
40 5032508; 4902508; 4956178; 5281422, 5554389, 6099567, 6206931 y 4361552; 6576618; y 6753181; solicitud estadounidense No. 11/162,715; WO/2001/048153; WO/2002/024244; WO003002165; WO/2001/049210; WO/2007/025233; Patentes Europeas EP1482871; EP1246903; EP1244396; EP0987998; EP1244396; EP1333870;. Riederetal., 2004; Ott et al., 2008; Taylor et al., 1998)).
Del mismo modo, se anticipa que las células pluripotentes, multipotentes, y/o diferenciadas de la presente invención se
45 pueden utilizar en solicitudes que utilizan impresión al estilo de chorro de tinta para diseñar por ingeniería tejidos (por ejemplo, Boland et al., 2006. Xu et al., 2006; Campbell et al., 2007). Por lo tanto se cubre dicho uso de las células producidas o tratadas de acuerdo con los métodos descritos aquí.
En otra realización preferida, las células seleccionadas se cultivaron en piezas colgantes.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, las células seleccionadas de antemano se pueden modificar 50 genéticamente.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, las células seleccionadas se pueden modificar con ADN o ARN que codifica proteína(s) o polipéptido(s) que promueven diferenciación de la célula en una población de células deseada.
La presente invención divulga adicionalmente la diferenciación dirigida de células transfectadas con el vector(s) 55 terapéutico en tipos celulares deseados mediante incubación adicional en medios que contienen las citocinas adecuadas y factores de crecimiento tales como factores estimulantes de colonias, tales como M-CSF (CSF-1), GM-CSF, IL-7, cualquier citocina que promueve la diferenciación de células T CD4+, etc.
imagen6
Transfección
La modificación genética de células seleccionadas y células efectoras, ya sean células exógenas o células endógenas
5 se puede realizar de acuerdo con cualquier método publicado o no publicado conocido en la técnica Patente Estadounidense. Nos. 6,432,711, U.S. 05,593,875, U.S. 05,783,566, U.S. 5,928,944, U.S. 05,910,488, U.S. 05,824,547, etc.) o por otros medios generalmente aceptados. Los métodos adecuados para transformar células anfitrionas se pueden encontrar en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros libros de texto de laboratorio.
10 Las células transfectadas con éxito se pueden identificar mediante protocolos de selección que implican marcadores tales como genes de resistencia a antibióticos, además de ensayos de expresión de ARN y análisis morfológicos. Los clones de células transfectadas con éxito, que expresan el ADN exógeno apropiado en niveles apropiados, se pueden conservar como estirpes celulares mediante crioconservación (utilizando cualquier método apropiado de criopreservación conocido en la técnica).
15 Los marcadores seleccionables (por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos) pueden incluir aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina, ampicilina y blasticidina, etc. Las células que contienen el gen de interés se pueden identificar mediante selección de fármacos donde sobreviven las células que han incorporado el gen marcador seleccionable y otras mueren.
Se describe aquí, una base teórica de las realizaciones de la invención sin embargo, esta discusión de ninguna manera
20 se debe considerar como que se limita o restringe en la presente invención. Aquellos expertos en la técnica comprenderán que las diversas realizaciones de la invención se pueden poner en práctica independientemente del modelo utilizado para describir los fundamentos teóricos de la invención.
La invención se describe e ilustra con respecto a los siguientes ejemplos; sin embargo, el alcance de la presente invención no está destinada a ser limitada por los mismos.
25 Ejemplo 1: Medio de crecimiento para células seleccionadas
Se pueden expandir/hacer crecer las células seleccionadas en Medio Esencial Mínimo Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con glutamina, beta.-mercaptoetanol, 10% (en volumen) de suero de caballo, y Factor Inhibidor de Leucemia recombinante humano (LIF). El LIF reemplaza la necesidad de mantener las células seleccionadas en capas alimentadoras de células, (que también se pueden emplear) y es esencial para mantener células seleccionadas en un
30 estado indiferenciado, pluripotente o pluripotente, dichas células se pueden mantener en Medio Esencial Mínimo modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con glutamina, beta.-mercaptoetanol, 10% (en volumen) de suero de caballo, y Factor Inhibidor de Leucemia humana recombinante (LIF). El LIF reemplaza la necesidad de mantener las células en capas de alimentación de células, (que también se pueden emplear) y es esencial para mantener las células en un estado indiferenciado (por la patente Estadounidense 6432711).
35 Con el fin de iniciar la diferenciación de las células seleccionadas en las células neuronales, las células se tratan con tripsina y se lavan libres de LIF, y se colocan en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). Después de la resuspensión en DMEM y FBS al 10%, se colocan 1x106 células en 5 ml de DMEM, FBS al 10%, 0.5 microM de ácido retinoico en una placa grado bacteriológico Fisher de 60 mm, en la que se espera que las células formen pequeños agregados. La agregación ayuda en la diferenciación celular adecuada. La alta eficiencia de transfección con factores
40 de transcripción neuronales apropiados puede ocurrir antes o después de sembrar en DMEM, FBS, y ácido retinoico. (Véase patentes Estadounidenses 6432711 y 5453357 para detalles adicionales).
Ejemplo 2: Compatibilidad de HLA. Las células seleccionadas (por ejemplo, sangre o células del cordón umbilical de cualquier otra fuente adecuada y/o su progenie), se pueden cribar, modificar genéticamente (opcional), expandir, e inducir para comenzar la diferenciación en el tipo celular deseado (opcional). Las células luego se transplantan de
45 acuerdo con los protocolos de transplante de células madre estándar. En ciertos casos, las células se pueden trasplantar en pacientes sin la compatibilidad de HLA.
Ejemplo 3: La modificación genética de las células seleccionadas.
La modificación genética in Vitro de células exógenas o células endógenas del paciente se puede realizar de acuerdo con cualquier método publicado o no publicado conocido en la técnica (por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos.
50 6,432,711, U.S. 05,593,875, U.S. 05,783,566, U.S. 5,928,944, U.S. 05,910,488, U.S. 05,824,547, etc.) o por otros medios generalmente aceptados. Se pueden encontrar métodos adecuados para transformar células anfitrionas en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros libros de texto de laboratorio.
Las células transfectadas con éxito se identifican mediante protocolos de selección que implican marcadores tales como
55 genes con resistencia a antibióticos, además de ensayos de expresión de ARN y análisis morfológicos. Los clones de células transfectadas con éxito, que expresan ADN exógeno apropiado en los niveles apropiados, se pueden conservar como estirpes celulares mediante crioconservación (utilizando cualquier método apropiado de criopreservación conocido en la técnica).
imagen7
Los marcadores seleccionables (por ejemplo, genes con resistencia a antibióticos) pueden incluir aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Se pueden identificar las células que contienen el 5 gen de interés mediante selección de fármacos cuando sobreviven las células que han incorporado el gen marcador seleccionable y otras mueren.
La presente invención divulga la selección de células modificadas genéticamente como "células seleccionadas" de la invención. El término modificación genética se refiere a la alteración del genotipo celular al introducir ácidos nucleicos naturales o sintéticos en células seleccionadas y/o en su progenie o estirpes celulares inmortalizadas y/o su progenie
10 mediante cualquier medio conocido en la técnica. Alternativamente, las condiciones de cultivo que inducen cambios permanentes en los patrones de expresión de genes se consideran aquí que representan modificación genética. La modificación de las células madre, ya sea que se deriven del cerebro del anfitrión, fuentes de donantes endógenas, fuentes de donantes exógenas o estirpes celulares, representan un método factible para el tratamiento de ciertas enfermedades humanas, especialmente aquellas del sistema nervioso humano.
15 Las modificaciones genéticas cubiertas por esta descripción incluyen, pero no se limitan a: modificaciones genéticas realizadas in vivo; modificaciones que alteran la actividad o cantidad de enzimas metabólicas expresadas por células endógenas o exógenas seleccionadas y/o su progenie; modificaciones que alteran la actividad, cantidad o antigenicidad de las proteínas celulares; modificaciones que alteran la actividad o cantidad de proteínas implicadas en las rutas de transducción de señales; modificaciones que alteran el tipo HLA; modificaciones que alteran la diferenciación celular;
20 modificaciones que alteran el potencial neoplásico; modificaciones que alteran la diferenciación celular; modificaciones que alteran la cantidad o actividad de proteínas estructurales; modificaciones que alteran la cantidad o actividad de proteínas asociadas a membrana (estructural o enzimática); modificaciones que alteran la actividad o cantidad de proteínas implicadas en la reparación del ADN y mantenimiento del cromosoma; modificaciones que alteran la actividad
o cantidad de proteínas implicadas en el transporte celular; modificaciones que alteran la actividad o cantidad de
25 enzimas; modificaciones que alteran la actividad o cantidad de proteínas implicadas en la formación y mantenimiento de sinapsis; modificaciones que alteran la actividad o la cantidad de proteínas implicadas en el sobrecrecimiento de neuritas o sobrecrecimiento y formación del axón; modificaciones que alteran la cantidad o actividad de enzimas productoras de antioxidantes dentro de la célula; modificaciones que llevan a modificación postraduccional alterada de proteínas celulares; modificaciones que alteran la actividad o cantidad de proteínas implicadas en otros aspectos de la
30 reparación celular y alteraciones que aumentan la vida útil de la célula (tal como producción de telomerasa). Dichas proteínas como aquellas mencionadas anteriormente se pueden codificar por ADN o ARN derivado del genoma humano u otros genomas de animales, plantas, víricos o bacterianos. Esta invención también cubre secuencias diseñadas de novo.
Además, esta invención se relaciona con la modificación genética in situ de células seleccionadas y/o sus células de
35 progenie para el tratamiento de la enfermedad. Las células madre endógenas se pueden modificar in situ mediante inyección directa o aplicación de vectores de ADN o ARN, que incluyen virus, retrovirus, liposomas, etc., en la sustancia del tejido o en la porción apropiada del sistema ventricular del cerebro. Desde 1992, hemos modificado miles de células madre/progenitoras y muchos miles de células progenitoras de esta manera. Nuestros datos muestran que esta forma de modificar células progenitoras resulta en una tremenda variedad de tipos de células modificadas en todo el sistema
40 nervioso, y nunca ha resultado en efectos adversos.
Ejemplo 4: Ejemplos de transgenes expresados o efectores utilizados en la presente invención.
Cualesquier secuencias transgénicas efectivas para cumplir la presente invención es adecuada para uso en la presente invención. Las secuencias de nucleótidos adecuadas se pueden extraer de cualquier especie siempre que se alcance las células o comportamiento deseado. Del mismo modo, el método de nombrar dichas secuencias, ya sea en letras
45 minúsculas o mayúsculas aquí, no implica una especie particular. Las siguientes secuencias almacenadas en la base de datos de NCBI (enumeradas por el número de acceso) representan ejemplos de las secuencias mencionadas anteriormente en la presente solicitud. También son ejemplos de secuencias codificantes de transgenes específicas (cds) adecuadas para uso en la presente invención, pero no limitan en modo alguno la práctica de la invención:
cardiotrophin1: U43030 (SEQ ID NO: 18):
imagen8
imagen9
IL6:BC015511 (SEQ ID NO: 21):
imagen10
IL6R:NM_00565 (SEQ ID NO: 23):
imagen11
IL11:NM_133519 (SEQ ID NO: 24):
imagen12
imagen13
LIFR:NM_002310 (SEQ ID NO: 26):
imagen14
OnconstatinM (OSM) NM_020530 (SEQ ID NO: 34):
imagen15
Notch Notch1:NM_017617 (SEQ ID NO: 72):
imagen16
imagen17
imagen18
NOTCH2:NM_024408; NM_010928. NOTCH3:NM_000435 (SEQ ID NO: 73):
imagen19

Claims (1)

  1. imagen1
    Reivindicaciones
    1. Un método para producir células multipotentes, pluripotentes y/o autorrenovables de las células seleccionadas, que comprende:
    transfectar células seleccionadas obtenidas al seleccionar células del grupo de células somáticas con secuencias de 5 nucleótidos que codifican las isoforma(s) de (inserción PRR +) "largas" de la proteína Numb de mamífero y con una secuencia de nucleótidos adicionales que codifica Notch; y
    hacer crecer las células seleccionadas en un medio de crecimiento que comprende citoquinas seleccionadas de EGF, bFGF, LIF, factor de acero, IL-6, hiper IL-6, IL-7, oncostatina-M, cardiotrofina-1 y otras citoquinas que mejoran el crecimiento efectivas que las células seleccionadas expanden a una velocidad, en la que se determina dicha velocidad a
    10 partir de los tiempos de duplicación de las células seleccionadas en dicho medio de cultivo de crecimiento; y mantener las células bajo estas condiciones de cultivo hasta que se alcanza la cantidad de células deseada.
    85
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Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2367525T3 (es) 2005-12-13 2011-11-04 Kyoto University Factor de reprogramación celular.
US8129187B2 (en) 2005-12-13 2012-03-06 Kyoto University Somatic cell reprogramming by retroviral vectors encoding Oct3/4. Klf4, c-Myc and Sox2
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
KR101516833B1 (ko) 2007-03-23 2015-05-07 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 체세포 재프로그래밍
US11859168B2 (en) * 2007-05-29 2024-01-02 Christopher B. REID Electroporation, developmentally-activated cells, pluripotent-like cells, cell reprogramming and regenerative medicine
US9213999B2 (en) 2007-06-15 2015-12-15 Kyoto University Providing iPSCs to a customer
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
JP5346925B2 (ja) 2008-05-02 2013-11-20 国立大学法人京都大学 核初期化方法
KR101648019B1 (ko) 2008-06-04 2016-08-16 셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드 비-바이러스 접근법을 사용한 ｉＰＳ 세포의 생산 방법
AU2009282133B2 (en) * 2008-08-12 2015-12-10 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the Production of IPS Cells
JP2010148440A (ja) * 2008-12-25 2010-07-08 Japan Health Science Foundation 組換えアデノウイルス迅速構築システム
WO2010127166A2 (en) 2009-04-30 2010-11-04 The Regents Of The University Of California Combination anti-hiv vectors, targeting vectors, and methods of use
US9365866B2 (en) * 2009-06-03 2016-06-14 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Vectors for generating pluripotent stem cells and methods of producing pluripotent stem cells using the same
US9453205B2 (en) * 2009-10-31 2016-09-27 Genesis Technologies Limited Methods for reprogramming cells and uses thereof
JP2013534525A (ja) * 2010-06-23 2013-09-05 ヴィヴォスクリプト，インコーポレイテッド 心臓疾患の治療のために遺伝子改変を伴わずに細胞を再プログラミングするための組成物および方法
AU2011311344B2 (en) 2010-10-08 2016-09-08 Mina Therapeutics Limited Short RNA molecules
WO2012061075A2 (en) * 2010-10-25 2012-05-10 The Regents Of The University Of California Hiv resistant and functional hematopoietic stem/progenitor cells and macrophages from induced pluripotent stem cells
US20130210893A1 (en) * 2010-10-27 2013-08-15 Curna, Inc. Treatment of interferon-related developmental regulator 1 (ifrd1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ifrd1
BR112014013664A2 (pt) * 2011-12-05 2020-11-03 Factor Bioscience Inc. métodos e produtos para transfectar células
CN102659951A (zh) * 2012-05-29 2012-09-12 西安医学院 一种TAT结构域修饰的neurogenin2融合蛋白制备方法和用途
WO2014035433A1 (en) * 2012-08-31 2014-03-06 Jan Nolta Genetically modified msc and therapeutic methods
US20140065110A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 The Regents Of The University Of California Genetically modified msc and therapeutic methods
US9663564B2 (en) 2013-03-15 2017-05-30 The Regents Of The University Of California Vectors and methods to treat ischemia
US20140271923A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Christopher Brian Reid Compositions & formulations for preventing and treating chronic diseases that cluster in patients such as cardiovascular disease, diabetes, obesity, polycystic ovary syndrome, hyperlipidemia and hypertension, as well as for preventing and treating other diseases and conditions
JP6621409B2 (ja) 2013-11-22 2019-12-18 ミナ セラピューティクス リミテッド Ｃ／ＥＢＰα小分子活性化ＲＮＡ組成物
EP3929298A1 (en) * 2015-03-09 2021-12-29 Sinai Health System Tools and methods for using cell division loci to control proliferation of cells
JP6978079B2 (ja) * 2015-07-02 2021-12-08 メディジェン， インコーポレイテッド ウシ免疫不全ウイルスｇａｇタンパク質を使用する組換えウイルス様粒子
EP3319631A4 (en) * 2015-07-08 2019-01-09 American Gene Technologies International Inc. HIV PREMUNICATION AND IMMUNOTHERAPY
CN106338423B (zh) 2015-07-10 2020-07-14 三斯坎公司 组织学染色的空间复用
TWI808934B (zh) 2015-12-31 2023-07-21 美商伯克利之光生命科技公司 經工程化以表現促發炎多肽之腫瘤浸潤細胞
EP3429753A4 (en) 2016-03-16 2019-11-06 Berkeley Lights, Inc. METHODS, SYSTEMS AND DEVICES FOR SELECTION AND PRODUCTION OF GENERICALLY WORKED CLONES
CN115814097A (zh) * 2016-06-03 2023-03-21 霍夫耳科研究所 用于内耳感觉毛细胞再生/替换的联合疗法
CN106086075B (zh) * 2016-06-23 2019-08-06 福建医科大学 CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法
CN109890965A (zh) * 2016-07-19 2019-06-14 匹兹堡大学联邦系统高等教育 靶向stat3的溶瘤病毒
CN106497882A (zh) * 2016-10-29 2017-03-15 复旦大学 同时过表达R‑spondin1和Noggin的细胞株及其构建方法和应用
EP3562594A4 (en) 2016-12-30 2020-09-09 The Regents of University of California PROCESSES FOR SELECTING AND GENERATING T-LYMPHOCYTES MODIFIED BY THE GENOME
CN108977463A (zh) * 2017-05-31 2018-12-11 伯仕利生物科技发展（盐城）有限公司 一种用于抑制生产用干细胞分化的技术方法
WO2019156216A1 (ja) 2018-02-09 2019-08-15 国立大学法人京都大学 心筋細胞増殖促進剤及びその利用
US20210095258A1 (en) * 2018-02-22 2021-04-01 Celularity Inc. Post partum tissue-derived induced pluripotent stem cells and uses thereof
CN108715868A (zh) * 2018-05-31 2018-10-30 深圳市免疫基因治疗研究院 一种Gaucher慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
CN111484977B (zh) * 2019-01-25 2023-05-16 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 重编程产生功能性去甲肾上腺素能神经元的方法
CN110283779A (zh) * 2019-07-17 2019-09-27 吉林省农业科学院 一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法及培养基
AU2021352917A1 (en) * 2020-09-29 2023-05-25 NeuExcell Therapeutics Inc. Dlx2 vector

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2395698A (en) 1943-12-18 1946-02-26 Walter J Mathieu Electric switch
US4361552A (en) 1980-09-26 1982-11-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Wound dressing
US5032508A (en) 1988-09-08 1991-07-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US4956178A (en) 1988-07-11 1990-09-11 Purdue Research Foundation Tissue graft composition
US4902508A (en) 1988-07-11 1990-02-20 Purdue Research Foundation Tissue graft composition
JP2710967B2 (ja) * 1988-11-22 1998-02-10 株式会社日立製作所 集積回路装置の製造方法
US7479269B2 (en) 1988-11-23 2009-01-20 Genetics Institute, Llc Methods for selectively enriching TH1 and TH2 cells
US5281422A (en) 1991-09-24 1994-01-25 Purdue Research Foundation Graft for promoting autogenous tissue growth
US5453357A (en) 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
JP3626187B2 (ja) 1993-06-07 2005-03-02 バイカル インコーポレイテッド 遺伝子治療に適するプラスミド
US6217867B1 (en) 1993-09-13 2001-04-17 University Of Pittsburgh Non-lethal methods for conditioning a recipient for bone marrow transplantation
US6432711B1 (en) * 1993-11-03 2002-08-13 Diacrin, Inc. Embryonic stem cells capable of differentiating into desired cell lines
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
JP3351471B2 (ja) 1994-11-29 2002-11-25 タカラバイオ株式会社 形質転換細胞の製造方法
US5554389A (en) 1995-04-07 1996-09-10 Purdue Research Foundation Urinary bladder submucosa derived tissue graft
US5677139A (en) 1995-04-21 1997-10-14 President And Fellows Of Harvard College In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes
GB9518606D0 (en) * 1995-09-12 1995-11-15 Inst Of Psychiatry Neural transplantation
US5783566A (en) 1996-05-10 1998-07-21 California Institute Of Technology Method for increasing or decreasing transfection efficiency
CZ54899A3 (cs) 1996-08-23 1999-08-11 Cook Biotech, Incorporated Štěpová protéza, materiály s ní spojené a způsoby její výroby
US6099567A (en) 1996-12-10 2000-08-08 Purdue Research Foundation Stomach submucosa derived tissue graft
PT987998E (pt) 1997-04-11 2005-02-28 Cryolife Inc Descelularizacao de tecidos
CA2304983A1 (en) * 1997-09-24 1999-04-01 The Regents Of The University Of California Non-primate lentiviral vectors and packaging systems
US6734018B2 (en) 1999-06-07 2004-05-11 Lifenet Process for decellularizing soft-tissue engineered medical implants, and decellularized soft-tissue medical implants produced
BR0012528A (pt) 1999-06-22 2002-04-09 Res Dev Foundation Cobertura aperfeiçoada para feridas para melhorar a cicatrização de feridas
US6479064B1 (en) 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
US6376244B1 (en) 1999-12-29 2002-04-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for organ decellularization
AU2001284968B2 (en) 2000-08-16 2006-12-21 Duke University Decellularized tissue engineered constructs and tissues
US6733993B2 (en) * 2000-09-15 2004-05-11 Merck & Co., Inc. Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications
EP1333870A2 (en) 2000-09-20 2003-08-13 Regeneration Technologies, Inc. Method of preparing and processing transplant tissue
US6995013B2 (en) 2002-07-08 2006-02-07 Biomed Solutions, Llc Cell-scaffold composition containing five layers
US7211247B2 (en) 2001-04-09 2007-05-01 University Of Southern California Lentivirus vectors for gene transfer to alveolar epithelial cells
US7087089B2 (en) 2001-06-28 2006-08-08 Cook Biotech Incorporated Graft prosthesis devices containing renal capsule collagen
WO2003020191A1 (en) 2001-09-04 2003-03-13 University Of Iowa Research Foundation Cellulose membranes for biodegradable scaffolds
US20030109037A1 (en) * 2001-09-24 2003-06-12 Reid Christopher Brian Methods for application of genetically-modified endogenous or exogenous stem/progenitor or their progeny for treatment of disease
US20030099621A1 (en) 2001-11-29 2003-05-29 Robert Chow Stem cell screening and transplantation therapy for HIV infection
US7297540B2 (en) 2002-01-15 2007-11-20 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Methods of generating tissue using devitalized, acellular scaffold matrices derived from micro-organs
EP1482871A4 (en) 2002-02-19 2006-09-13 Bioarttis Inc ARTIFICIAL VESSELS AND ARTIFICIAL ORGANS THEREOF
CA2513679A1 (en) * 2003-01-17 2004-08-05 University Of Florida Small interference rna gene therapy
MX2008002589A (es) 2005-08-26 2008-03-14 Univ Minnesota Descelularizacion y recelularizacion de organos y tejidos.
ES2367525T3 (es) * 2005-12-13 2011-11-04 Kyoto University Factor de reprogramación celular.

Also Published As

Publication number Publication date
EP3128015A2 (en) 2017-02-08
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