CN110283779A - 一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法及培养基 - Google Patents

一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法及培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法及培养基，该培养基为在基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、白血病抑制因子、胰岛素样生长因子‑1、伴清蛋白、核苷酸腺苷、重组白细胞介素‑6和重组白细胞介素‑11得到的培养基。本发明首次通过外源添加胰岛素样生长因子‑1、伴清蛋白、核苷酸腺苷、IL‑6和IL‑11等细胞因子，实现鸡胚胎干细胞的体外长期稳定培养且具有良好的扩增及更新能力。

Description

一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法及培养基
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法及培养基。
背景技术
胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团中分离出来的一类细胞，不仅具有与其他干细胞一样的无限增殖、自我更新和多向分化潜能，而且具有发育的全能性，在一定条件下，能被诱导分化为机体内、中、外三胚层几乎所有的细胞类型。1981年，Evans和Kaufmanz首先在研究上皮细胞的基础上，对延迟着床的小鼠早期胚胎进行体外培养，首次分离得到小鼠胚胎干细胞，并建立了胚胎干细胞细胞系。胚胎干细胞具有种系传递能力，为基因修饰、基因打靶、基因敲除、基因转染及生产转基因动物提供良好的种子资源。
禽类以其独特的生殖结构和生理特征及较为快速的胚胎发育过程，为胚胎干细胞研究提供了理想的动物模型。胚胎干细胞体外培养的关键是保证其维持未分化状态，最常用的是采用STO细胞株、CEF、MEF及同源动物胚胎成纤维细胞等作为饲养层来促进cESCs细胞增殖，并在基础培养基中添加所需细胞因子配制成的培养基，以抑制其分化。传统培养基通常添加bFGF、SCF、LIF来促进细胞增殖、抑制细胞分化及维持cESCs的多能性。
中国发明专利CN106701662A公开了一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法，该方法在基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子和白血病抑制因子得到的培养基，可以实现在体外长期、稳定培养鸡胚胎干细胞且维持其自我更新能力。但是该方法仍存在获得克隆率低、细胞增殖慢、易分化的缺点，故有必要对鸡胚胎干细胞的分离培养方法做进一步的研究。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法及培养基。
本发明提供的鸡胚胎干细胞的体外培养基，为在基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、白血病抑制因子、胰岛素样生长因子-1、伴清蛋白、核苷酸腺苷、重组白细胞介素-6和重组白细胞介素-11得到的培养基。
所述基础培养基为高糖DMEM，含有如下成分：1-2mmol/L丙酮酸钠、2-3mmol/L L-谷氨酰胺、10-15％胎牛血清(体积比)、2-3％鸡血清(体积比)、1-2％非必需氨基酸、5.0-5.5×10-5mmol/Lβ-巯基乙醇、1％青/链霉素(体积比)。
所述的青/链霉素商品货号为Gibco15140-122，青/链霉素混合液，俗称双抗。
优选的，培养基中，所述的碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、胰岛素样生长因子-1分别为人源碱性成纤维细胞生长因子、人源干细胞因子和人源胰岛素样生长因子-1。
所述白血病抑制因子为鼠源白血病抑制因子。
所述重组白细胞介素-6和重组白细胞介素-11分别为人源重组白细胞介素-6和人源重组白细胞介素-11。
上述培养基中，所述碱性成纤维细胞生长因子在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/mL；
所述干细胞因子在所述体外培养基中的终浓度为5-10ng/mL；
所述白血病抑制因子在所述体外培养基中的终浓度为0.1-0.2ng/mL；
优选的，所述胰岛素样生长因子-1在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/mL；
优选的，所述伴清蛋白在所述体外培养基中的终浓度为20-30ng/mL；
优选的，所述核苷酸腺苷在所述体外培养基中的终浓度为1-2μmol/L；
优选的，所述重组白细胞介素-6和重组白细胞介素-11在所述体外培养基中的终浓度为1-2ng/mL。
本发明还提供了一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：用胰酶消化法获得鸡胚胎干细胞，然后将细胞重悬于所述的胚胎干细胞培养基中，再置于预先用丝裂霉素-C处理的明胶包被的鸡胚成纤维细胞饲养层上进行原代培养。
优选的，所述鸡胚成纤维细胞饲养层接种密度为(3-5)×105细胞/孔。
本发明的有益之处在于：本发明公开了一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法及其因子培养基。本发明提供的鸡胚胎干细胞培养基，为在基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、白血病抑制因子、胰岛素样生长因子-1、伴清蛋白、核苷酸腺苷、人重组白细胞介素-6和人重组白细胞介素-11得到的培养基。本发明首次通过外源添加胰岛素样生长因子-1、伴清蛋白、核苷酸腺苷、IL-6和IL-11等细胞因子，实现鸡胚胎干细胞的体外长期稳定培养且具有良好的扩增及更新能力。
附图说明
图1：原代鸡胚胎干细胞克隆(×400)；
图2：传至第3代鸡胚胎干细胞克隆(×400)；
图3：鸡胚胎干细胞碱性磷酸酶染色结果(×400)；
图4：鸡胚胎干细胞胚胎阶段特异性表面抗原鉴定结果(×400)；
图5：实施例1和对比例1-6条件下，cESCs AKP的阳性克隆率对比图。
具体实施方式
实施例1：
1、试验动物
海蓝褐蛋鸡新鲜种蛋及孵化9-10d的鸡胚：采自吉林省公主岭市麦龙牧业和新辉养殖合作社。
2、配制鸡胚成纤维细胞培养基
含有如下溶质的高糖DMEM：10％胎牛血清(体积比)，1％青/链霉素(体积比)。
3、配制基础培养基
含有如下溶质的高糖DMEM：10％FBS(体积比)、2％鸡血清(体积比)、1mmol/L丙酮酸钠、2mmol/L L-谷氨酰胺、1％非必须氨基酸(体积比)、5.5×10-5mmol/Lβ-巯基乙醇、1％青/链霉素(体积比)。
4、配制鸡胚胎干细胞完全培养基
上述基础培养基中添加：浓度为10ng/mL bFGF、0.1ng/mL mLIF、5ng/mL hSCF、10ng/mL hIGF、20ng/mL伴清蛋白、1μmol/L核苷酸腺苷、1ng/mL hIL-6、1ng/mL hIL-11。
5、鸡胚成纤维细胞的分离
取9-10日龄的鸡胚，胰酶消化法分离鸡胚成纤维细胞。按常规方法传代，备用。
6、鸡胚成纤维细胞饲养层的制备
选取生长良好、传至第2代的成纤维细胞，用含有10μg/mL丝裂霉素-C的培养液作用2.5-3h，PBS洗涤至少7-8次，待完全去除丝裂霉素-C后，用胰酶消化，以3-5×105个/mL密度接种到预先0.1％明胶包被的24孔板中培养，观察CEF饲养层铺展情况，24h待细胞铺满后可进行接种。
7、鸡胚胎干细胞分离
取产蛋5h内未孵化的新鲜受精蛋，用75％酒精消毒蛋壳，医用手术镊敲开钝头蛋壳，待蛋白流出后，用药匙小心拨动蛋黄，切忌戳破卵黄膜，找到胚盘并将其朝上暴露，用眼科剪沿胚盘周围小心将卵黄膜剪开，用药匙把胚盘取出，将胚盘置于PBS溶液中清洗2遍，1800rpm离心8min收集胚盘，用眼科剪将胚盘剪碎，置于振荡器上振荡数秒，用0.25％胰酶消化10-15min，待胚盘组织块肉眼不可见时，加入鸡胚胎干细胞完全培养基终止消化，然后1800rpm离心8min，弃上清，沉淀用因子培养液充分吹散重悬，接种到明胶包被的24孔板的饲养层上，于24h后换液，以后每天半量换液，培养5-6d后即可传代。
刚分离出的cESCs呈单细胞状态，体积较小，有一个或者几个细胞核，细胞核较大，且有少量细胞质。当体外培养至4-5d时，cESCs开始形成集落，细胞克隆形态多样，多呈现巢状或岛状，而形成克隆的细胞之间界限不明显。见图1。
8、鸡胚胎干细胞的传代及体外培养
待有大克隆形成时，加新鲜的PBS(无Ca2+、Mg2+)于37℃培养箱孵育10min，用自制口吸管吸取生长状态良好、隆起明显、未分化的细胞集落，1000rpm离心6-8min，弃上清，加PBS溶液重悬，离心收集细胞沉淀。加入1mL胶原蛋白酶IV重悬，消化3-5min，再加0.25％胰酶-EDTA室温消化2min，并用枪头不断吹打，用鸡胚胎干细胞因子培养液终止消化，1800rpm离心6-8min以去除胶原蛋白酶IV和胰酶，最后用鸡胚胎干细胞因子培养液重悬细胞，接种于明胶包被的饲养层上，放置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。除初次传代采用上述方法外，均采用全消化法进行传代。
培养的原代细胞中有大量的卵黄颗粒，会随着细胞传代而逐渐减少。见图2。
9、鸡胚胎干细胞的鉴定
9.1碱性磷酸酶活性鉴定
参照上海翊圣生物的碱性磷酸酶染色试剂盒(40749ES50)操作步骤进行染色鉴定。
AKP染色结果显示，未分化的原代细胞呈蓝紫色，提示AKP活性高，传至第3代的cESCs经AKP染色后仍具有较高的AKP活性，表明细胞状态良好，且保持未分化状态。见图3。
9.2SSEA-1鉴定
选取第2代生长状态良好的鸡胚胎干细胞进行SSEA-1免疫荧光检测。用预冷的丙酮：无水乙醇(3：2)作用30min，PBS清洗3次，用含10％FCS的PBS液封闭2h，PBS洗3次后加入标记的SSEA-1抗体稀释液，于37℃水浴避光孵育1h，PBST反复清洗3次，5min/次，再加入FITC标记的羊抗鼠IgG的二抗，于37℃水浴避光孵育45min，PBST漂洗后自然风干。每孔加1滴60％甘油后荧光显微镜下观察结果。
倒置荧光显微镜下观察cESCs，细胞克隆表面呈现绿色荧光。胚胎阶段特异性表面抗原SSEA-1鉴定表明，传至P3的cESCs表达胚胎阶段特异性表面抗原，说明细胞仍处于未分化状态，且具有多能性。见图4。
对比例1
将实施例1中的胰岛素样生长因子-1去除，其余分离培养方法不变。
对比例2
将实施例1中的伴清蛋白去除，其余分离培养方法不变。
对比例3
将实施例1中的核苷酸腺苷去除，其余分离培养方法不变。
对比例4
将实施例1中的IL-6去除，其余分离培养方法不变。
对比例5
将实施例1中的IL-11去除，其余分离培养方法不变。
对比例6
将实施例1中的胰岛素样生长因子-1、伴清蛋白、核苷酸腺苷、IL-6和IL-11等细胞因子全部去除，其余分离培养方法不变。
以下对实施例1和对比例1-6条件下，cESCs AKP的阳性克隆率(每组3个重复)进行检测，详见图5。
由图5可见，采用本发明提供的鸡胚胎干细胞的分离培养方法，cESCs AKP的阳性克隆率显著提升。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种鸡胚胎干细胞的培养基，其特征在于，为在基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、白血病抑制因子、胰岛素样生长因子-1、伴清蛋白、核苷酸腺苷、重组白细胞介素-6和重组白细胞介素-11得到的培养基。
2.如权利要求1所述的鸡胚胎干细胞的培养基，其特征在于，所述基础培养基为高糖DMEM，含有如下成分：1-2mmol/L丙酮酸钠、2-3mmol/L L-谷氨酰胺、10-15％胎牛血清(体积比)、2-3％鸡血清(体积比)、1-2％非必需氨基酸、5.0-5.5×10-5mmol/Lβ-巯基乙醇、1％青/链霉素(体积比)。
3.如权利要求1所述的鸡胚胎干细胞的培养基，其特征在于，培养基中，所述的碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、胰岛素样生长因子-1分别为人源碱性成纤维细胞生长因子、人源干细胞因子和人源胰岛素样生长因子-1。
4.如权利要求1所述的鸡胚胎干细胞的培养基，其特征在于，所述胰岛素样生长因子-1在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/mL。
5.如权利要求1所述的鸡胚胎干细胞的培养基，其特征在于，所述伴清蛋白在所述体外培养基中的终浓度为20-30ng/mL。
6.如权利要求1所述的鸡胚胎干细胞的培养基，其特征在于，所述核苷酸腺苷在所述体外培养基中的终浓度为1-2μmol/L。
7.如权利要求1所述的鸡胚胎干细胞的培养基，其特征在于，所述重组白细胞介素-6和重组白细胞介素-11在所述体外培养基中的终浓度为1-2ng/mL。
8.一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：用胰酶消化法获得鸡胚胎干细胞，然后将细胞重悬于所述的胚胎干细胞培养基中，再接种到预先用10μg/mL丝裂霉素-C处理的0.1％明胶包被的鸡胚成纤维细胞饲养层上进行原代培养。
9.如权利要求8所述的鸡胚胎干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述鸡胚成纤维细胞饲养层接种至24孔板，接种密度为(3-5)×105细胞/孔。
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