CN101423819A - 一种培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养液。本发明提供的胚胎干细胞培养液，是将80％(体积比)大鼠肝细胞条件培养基和20％(体积比)ES细胞基础培养液混合得到的；所述大鼠肝细胞条件培养基是培养BRL细胞得到的培养液；所述ES细胞基础培养液为高糖DMEM，含有如下溶质：3.5－4.5g/L葡萄糖、10－15％胎牛血清(体积比)、1.5－2.5mM L－谷氨酰胺、0.1－0.15mM β－巯基乙醇、1－1.5mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、1－3％鸡血清(体积比)、抗菌素。本发明还提供了应用所述胚胎干细胞培养液培养鸡胚胎干细胞的方法。本发明提供的培养CES的方法，具有经济、高效的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养液。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ES细胞)是通过分离内细胞团(Inner CellMass，ICM)细胞或早期胚胎的原始生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs)，在体外合适的条件下抑制分化培养而得到的具有无限增殖能力，能进行自我更新(self-renewing)，具有分化为包括生殖系细胞在内的多种细胞的潜能的未分化细胞。ES细胞具有早期胚胎细胞的特征，在体外能进行传代、冷冻、复苏等操作仍保持正常二倍体核型。自从1981年英国剑桥大学的Evans和Kaufman、美国加州大学的Martin分别成功建立了小鼠的ES细胞系以来，胚胎干细胞的研究成为全世界范围内关注的焦点。1999年末，美国Science(《科学》杂志)公布的年度世界十大科学成果评选中，“干细胞研究的新发现”荣登榜首，而人类基因组计划工程却屈居第二。美国Time(《时代》周刊)将干细胞研究成果列为20世纪末世界十大科技成就之首。干细胞尤其是胚胎干细胞的研究成为21世纪生命科学领域中最具有发展和应用前景的一大热门话题，已成为继人类基因大规模测序完成后生命科学中最活跃的领域之一。
ES细胞在生命科学多个领域都有着广泛的用途，其中最令人兴奋的是医学应用潜能。ES细胞具有多向分化潜能，可在体外诱导分化为各种类型的干细胞或成熟细胞，在合适的条件下可能发育为完整器官，因此可能成为临床组织或器官移植材料的新来源，以取代病人体内损坏的细胞组织或器官，达到治疗组织缺损、遗传缺陷、器官障碍等难治疾病的目的。动物实验显示，ES细胞来源的血液细胞、神经细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌肉细胞等移植入体内可发挥相应功能，体外培养膀胱组织已经取得成功，表明ES细胞走入临床应用已经为期不远(Thomson，2000)。“治疗性克隆”是ES细胞在医学上应用的又一途径，具体程序是将病人体细胞(如皮肤细胞)的细胞核，移植到去核的卵母细胞内，然后使之融合，体外培养胚胎，发育到囊胚后取其内细胞团，建成ES细胞系，再诱导分化成供医疗使用的细胞或组织(Solter，1999)。
ES细胞研究提供了在细胞和分子水平上研究人及动物早期发育过程中相关问题的方法，可以帮助我们解决动物发育过程中的复杂问题，促进胚胎发育细节的基础研究，是研究脊椎动物早期胚胎发育的理想模型，有着广阔的应用前景。ES细胞技术结合基因打靶技术，用来研究动物体某些基因的功能。传统上，多用转基因或基因敲除动物模型作为基因功能分析方法，但周期较长。而利用ES细胞系可通过基因缺失和过度表达两种途径进行研究，缩短了周期。
利用ES细胞介导的转基因技术是目前认为最有效的转基因途径之一，可将所有的优良基因直接转入待改良的种群中，可形成有优良遗传品质的品系和高抗病力的品系。转移到鸡体内的基因有：牛生长激素基因、人类生长因子基因、鸡生长因子基因、潮霉素抗病毒基因、鸡抗马立克抗体基因、乙酰氯霉素转移酶基因等(Allioili，1994；Ebara，2000)。
ES细胞提供了对新药的药理、药效、毒理和药物代谢等研究的细胞水平研究手段，可大大减少药物检测所需动物的数量，降低成本。类胚体(EB)可用于某种新药或化学物质的毒性及效能的评估，这对药理学、化肥工业等领域的发展有重要意义。
关于鸡胚胎干细胞(CES细胞)的研究是目前国际上研究的热点之一。CES细胞的研究具有非常重要的意义。首先，鸡胚胎是研究脊椎动物早期发育的主要模型之一。其次，CES技术的一个主要应用就是通过对ES细胞的体外遗传操作，并筛选阳性细胞获得转基因鸡。通过ES途径用商品鸡生产药物蛋白。第三，生产有生物功能的治疗性药物。第四，进行转基因育种。在CES细胞细胞的研究的20年里，其ES细胞的建系很大程度上受小鼠全能或多能干细胞研究方法的影响，鸡的ES细胞系大都是通过分离培养未孵化的X期胚盘细胞或发育早期鸡胚PGCs所获得。
发明内容
本发明的目的是提供一种培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养液。
本发明提供的胚胎干细胞培养液，是将80％(体积比)大鼠肝细胞条件培养基和20％(体积比)ES细胞基础培养液混合得到的；
所述大鼠肝细胞条件培养基是培养BRL细胞得到的培养液；
所述ES细胞基础培养液为高糖DMEM，含有如下溶质：3.5-4.5g/L葡萄糖、10-15％胎牛血清(体积比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0.1-0.15mMβ-巯基乙醇、1-1.5mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3％鸡血清(体积比)、抗菌素。
所述ES细胞基础培养液中，所述抗菌素具体可为青霉素、链霉素和庆大霉素；所述ES细胞基础培养液中含有100-150IU/ml青霉素、100-120μg/ml链霉素、10-12ng/ml庆大霉素。
所述ES细胞基础培养液具体含有如下溶质：4.5g/L葡萄糖、15％胎牛血清(体积比)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、2％鸡血清(体积比)、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10ng/ml庆大霉素。
具体可采用含有如下溶质的高糖DMEM培养BRL细胞：4.5g/L葡萄糖、10％胎牛血清(体积比)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
所述培养BRL细胞得到的培养液，自接种开始每3天收集一次，可以收集1-5次。
本发明还提供了一种培养鸡胚胎干细胞的方法，包括将鸡的胚胎干细胞重悬于所述的胚胎干细胞培养液中，然后置于密度为(2-3)×105细胞/孔的小鼠成纤维细胞饲养层上进行原代培养的步骤。
所述小鼠成纤维细胞的密度具体可为2.5×105细胞/孔。
所述方法中还包括将原代培养后的细胞重悬于ES细胞完全培养液或所述胚胎干细胞培养液中，然后置于密度为(2-3)×105的小鼠成纤维细胞饲养层上进行继代培养的步骤；
所述ES细胞完全培养液为高糖DMEM，含有如下溶质：3.5-4.5g/L葡萄糖、10-15％胎牛血清(体积比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0.1-0.15mM β-巯基乙醇、1-1.5mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3％鸡血清(体积比)、15-25ng/ml伴白蛋白、抗菌素。
所述ES细胞完全培养液中，所述抗菌素具体可为青霉素、链霉素和庆大霉素；所述ES细胞完全培养液中，含有100-150IU/ml青霉素、100-120μg/ml链霉素、10-12ng/ml庆大霉素。
所述ES细胞完全培养液具体含有如下溶质：4.5g/L葡萄糖、10％胎牛血清(体积比)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、2％鸡血清(体积比)、20ng/ml伴白蛋白、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10ng/ml庆大霉素。
所述小鼠成纤维细胞的密度具体可为2.5×105细胞/孔。
1 IU青霉素的定义：1IU＝0.60μg结晶青霉素G钠盐。
本发明提供的培养CES的方法，具有经济、高效的优点。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中用到的试验材料如下：
(一)试验动物
寿光黑鸡：寿光慈伦种鸡场，毛色基因型为CCOOEE，E为色素扩散基因，黑色对显性白羽为隐性，C为色素基因，O为氧化酶基因。
海兰白种蛋：山东省泰安市东岳种鸡场，海兰白鸡的毛色基因型为IICCOO，I为色素抑制基因，可掩盖黑色和浅黄色。
(二)试验材料
高糖DMEM(高葡萄糖)：Gibco Cat No 12800-058；
伴白蛋白(Conalbumin)：Sigma Cat No C-7786；
PBS：Gibco Cat No 21600-051；
L-谷氨酰胺(L-Glutamine)：Gibico Cat No 5445；
丝裂霉素-C：Sigma Cat No M0503；
鼠白血病抑制因子(mLIF)：Sigma Cat No L5158；
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：Sigma Cat No F-5392；
人干细胞生长因子(hSCF)：Sigma Cat No S7901；
类胰岛素生长因子-1(IGF-I)：Sigma Cat No I3769；
胎牛血清(FBS)：Gibco Cat No 16141-061；
BCIP/NBT染色液：上海生工 E116；
胰蛋白酶(Trypsin)：Gibco Cat No 27250-034；
鸡血清(CBS)：Gibco Cat No 16110-082；
β-巯基乙醇：Gibco Cat No 21985-023。
(三)溶液
1、BRL培养液
含有如下溶质的高糖DMEM：4.5g/L葡萄糖、10％胎牛血清(体积比)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
2、成纤维细胞培养液
含有如下溶质的高糖DMEM：4.5g/L葡萄糖、10％新生牛血清(NCS)(体积比)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
3、ES细胞基础培养液
含有如下溶质的高糖DMEM：4.5g/L葡萄糖、15％胎牛血清(体积比)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇、1mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、2％鸡血清(体积比)、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10ng/ml庆大霉素。
5、ES细胞完全培养液
含有如下溶质的高糖DMEM：4.5g/L葡萄糖、10％胎牛血清(体积比)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇、1mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、2％鸡血清(体积比)、20ng/ml伴白蛋白、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10ng/ml庆大霉素。
6、0.1％明胶的配制
称取100mg明胶，溶于无菌PBS，过夜使其充分溶解于100ml超纯水中。15磅高压灭菌，30min。5ml分装，4℃保存备用。
7、消化液的配制
称取胰蛋白酶0.25g、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)0.040g溶于100ml PBS中，置于37℃水浴中使其完全溶解，以0.22μm微孔滤膜过滤除菌，1ml/管分装，4℃保存备用。
8、大鼠肝细胞条件培养基(BRL-CM)的制备
以1×105cells/ml密度接种BRL细胞(上海锐聪科技发展有限公司)，待细胞铺满后，每75cm2细胞加入13ml BRL培养液，于37℃、5％CO2、饱和湿度下培养，每3d收集一次培养液(培养液可连续收集多次)，-20℃保存，用前调节PH到7.5并用0.22μm的微孔滤膜过滤。
9、胚胎干细胞培养液
将80％(体积比)大鼠肝细胞条件培养基(BRL-CM)和20％(体积比)ES细胞基础培养液混合，得到胚胎干细胞培养液。
(四)小鼠成纤维细胞系(STO)饲养层的制备
取生长良好的小鼠成纤维细胞(上海亚培生物科技有限公司)，用PBS洗两遍后加入含10μg/ml丝裂霉素-C的成纤维细胞培养液，37℃孵育1.5-2h。吸出溶液并用PBS液洗多次，完全去除丝裂霉素-C。常规胰蛋白酶消化，轻轻吹打使其分散为单细胞悬液。调整细胞至合适密度，接种于明胶包被的24孔培养板。37℃、5％CO2、饱和湿度下培养。24h后观察细胞生长情况，若发现细胞过稀则补加处理后的细胞以保证细胞能铺成单层。将制备好的饲养层放置在培养箱中备用，在5d内使用。
实施例1、鸡胚胎干细胞(CES)的培养
一、鸡胚X期胚盘细胞的分离
(1)取新鲜的寿光黑鸡种蛋，0.1％(体积比)新洁尔灭浸洗后，用75％(体积比)的酒精擦拭消毒。
(2)在超净工作台内小心的剥去卵壳，取出胚盘。
(3)将胚盘放入PBS中，小心的除去附着的卵黄和卵黄膜。
(4)去除胚盘暗区，将明区用无菌PBS洗2-3遍，放入离心管中轻轻吹打后，100g离心8-10min，去上清。
(5)高糖DMEM重悬细胞团，100g离心8-10min，去上清。
(6)将胚盘细胞加入100μl消化液，37℃消化1-2min后，高糖DMEM中和消化液，吹打使其分散为单细胞悬液。100g离心8-10min，去上清，收集细胞团。
二、鸡胚X期胚盘细胞的原代培养
饲养层是密度为2.5×105细胞/孔(24孔板)的小鼠成纤维细胞系，每孔再加500μl用胚胎干细胞培养液重悬的步骤一制备的细胞团，尽量保持培养板平衡，以避免细胞分布不均匀。置于培养箱中37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，每24h换液一半。
三、CES细胞的继代培养
(1)注意观察鸡胚盘细胞的生长情况，选择细胞克隆生长良好，隆起明显，形态未表现分化或刚刚表现分化迹象的集落进行传代。
(2)用口吸管和剥离针剥离周围的饲养层细胞和有分化迹象的细胞，选择好的克隆和未分化部分挑出，置于PBS中洗一次后，移入消化液中，37℃消化2-3min。
(3)用口吸管将细胞克隆从消化液中吸出，置于高糖DMEM中，洗2次后，移入ES细胞完全培养液中，用口吸管轻轻吹打并借助剥离针的作用将细胞团分散为小细胞团(20-40个)悬液，置于新制备的饲养层(饲养层是密度为2.5×105细胞/孔(24孔板)的小鼠成纤维细胞系)中37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，每24h换液一半。
实施例2、CES细胞的鉴定
1、形态学鉴定
对实施例1中传至3代的CES细胞进行形态学鉴定。借助倒置显微镜及体视显微镜，每天观察细胞集落的外部特征。
培养4h后CES细胞大部分细胞都已经贴壁，24h后开始出现小的克隆，以后克隆逐渐长大，克隆上有液滴，6d左右长成较大的克隆，将要分化时便需要传代。CES细胞克隆具有和小鼠ES细胞相似的形态：ES细胞呈克隆状生长，边缘光滑，细胞致密的聚集在一起，细胞间界限不清，形成鸟巢样集落，也有的呈不规则形态(如山包样、葵花样等)；克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状细胞。核大，核质比高，核仁明显。
2、AKP染色鉴定
对实施例1中传至3代的CES细胞进行AKP染色鉴定。吸去培养板中的培养液，用PBS洗涤两遍后，用4％的多聚甲醛4℃固定15min，然后用AKP染色液在37℃或室温染5-30min，直至出现理想的颜色。该反应可用添加EDTA或PBS洗涤而终止。流水轻轻冲洗，晾干后中性树胶封片，在倒置显微镜下观察染色结果。AKP染色阳性的细胞呈蓝紫色。
BRL-CM培养的CES细胞表现出强AKP阳性，染色后呈蓝紫色；分化的细胞及饲养层细胞不着色。
3、自发分化
不更换饲养层，长时间不进行传代，观察鸡的ES细胞克隆自发分化的形态。
分别对实施例1中传至3、4、5、6、7代的CES细胞进行自发分化鉴定。第3至5代的CES克隆在长期不更换饲养层、不传代、无分化抑制因子的情况下，1-2d即可出现分化现象，分化的克隆形态发生明显变化，边界变得不清晰甚至消失，同时伸展面积增大。3-4d大部分可观察到几种细胞类型。培养至第6、7代的CES细胞可以自发分化为成纤维样细胞、肌肉样细胞、神经细胞等多种细胞类型。这些分化的细胞或呈区域性集中分布，或散落生长，或互相混杂，有时可见血管样结构出现，表明体外培养的CES细胞具有自发分化为多种细胞的潜能。
4、悬浮培养
为了鉴定所培养的CES细胞是否可形成类胚体，将生长良好的实施例1中传至3代的CES细胞克隆挑出后置于无饲养层细胞、无mLIF的ES细胞培养体系中悬浮培养，培养液每隔一天更换一次。每天镜检，观察类ES细胞克隆形成类胚体的情况。聚集的CES细胞集落去除培养液中的生长因子，不更换饲养层，长时间不进行传代，观察其自发分化的集落形态。
将形态生长良好的CES细胞克隆挑出，在预先铺有明胶的无饲养层培养板上，用普通无外源LIF的ES培养液培养，每2d更换一次培养液。3-5d时有类似前述的自发分化情况；5d后有囊胚样结构出现。
5、嵌合体鸡的培养
①实施例1培养的传至3代的CES细胞为供体。首先挑选细胞克隆，PBS清洗后用消化液37℃消化2～3min。
②将CES细胞克隆移入高糖DMEM中洗两次后移入PBS中。
③用口吸管轻轻吹打并借助剥离针的作用将细胞团分散为单细胞悬液，1000rpm离心8～10min，去上清，收集细胞团。
④用PBS重悬细胞团，制成细胞密度为100个/ul的细胞悬液备用。
⑤以海兰白种蛋为受体(45枚)，将供体细胞注入受体种蛋的胚下腔内，转入代用蛋壳I中，补加蛋清(双抗终浓度为青霉素250IU/ml、链霉素250ug/ml)至满，保鲜膜封口(38.2℃、RH50％、90°翻蛋角)孵化至72小时。
⑥然后转入代用蛋壳II中(38.2℃、RH60％、30°翻蛋角)孵化直至21天出雏。
孵化率及嵌合率分别为45％和10.5％，证明CES具有参与受体体细胞发育的潜能。
Claims (10)
1、一种胚胎干细胞培养液，是将80％(体积比)大鼠肝细胞条件培养基和20％(体积比)ES细胞基础培养液混合得到的；
所述大鼠肝细胞条件培养基是培养BRL细胞得到的培养液；
所述ES细胞基础培养液为高糖DMEM，含有如下溶质：3.5-4.5g/L葡萄糖、10-15％胎牛血清(体积比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0.1-0.15mMβ-巯基乙醇、1-1.5mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3％鸡血清(体积比)、抗菌素。
2、如权利要求1所述的培养液，其特征在于：所述ES细胞基础培养液中，抗菌素为青霉素、链霉素和庆大霉素；所述ES细胞基础培养液中含有100-150IU/ml青霉素、100-120μg/ml链霉素、10-12ng/ml庆大霉素。
3、如权利要求2所述的培养液，其特征在于：所述ES细胞基础培养液含有如下溶质：4.5g/L葡萄糖、15％胎牛血清(体积比)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、2％鸡血清(体积比)、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10ng/ml庆大霉素。
4、如权利要求1至3中任一所述的培养液，其特征在于：所述培养BRL细胞得到的培养液，自接种BRL细胞开始每3天收集一次。
5、如权利要求4所述的培养液，其特征在于：所述培养液收集1-5次。
6、一种培养鸡胚胎干细胞的方法，包括将鸡的胚胎干细胞重悬于所述的胚胎干细胞培养液中，然后置于密度为(2-3)×105细胞/孔的小鼠成纤维细胞饲养层上进行原代培养的步骤。
7、如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述小鼠成纤维细胞的密度为2.5×105细胞/孔。
8、如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将原代培养后的细胞重悬于ES细胞完全培养液或权利要求1至5中任一所述胚胎干细胞培养液中，然后置于密度为(2-3)×105的小鼠成纤维细胞饲养层上进行继代培养的步骤；
所述ES细胞完全培养液为高糖DMEM，含有如下溶质：3.5-4.5g/L葡萄糖、10-15％胎牛血清(体积比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0.1-0.15mMβ-巯基乙醇、1-1.5mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3％鸡血清(体积比)、15-25ng/ml伴白蛋白、抗菌素。
9、如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述ES细胞完全培养液中，所述抗菌素为青霉素、链霉素和庆大霉素；所述ES细胞完全培养液中含有100-150IU/ml青霉素、100-120μg/ml链霉素、10-12ng/ml庆大霉素。
10、如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述小鼠成纤维细胞的密度为2.5×105细胞/孔；
所述ES细胞完全培养液含有如下溶质：4.5g/L葡萄糖、10％胎牛血清(体积比)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、2％鸡血清(体积比)、20ng/ml伴白蛋白、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10ng/ml庆大霉素。
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| CN102329771A (zh) * | 2011-10-12 | 2012-01-25 | 佛山科学技术学院 | 长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养基 |
| CN108384749A (zh) * | 2017-12-07 | 2018-08-10 | 广西大学 | 鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法 |
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2008
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20090506 |