CN103013909B - 一种高效分离禽类胚胎干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效分离禽类胚胎干细胞的方法。该方法包括以下步骤：1)将胚盘从种蛋中取出；2)将取出的胚盘消化、清洗并去除卵黄；3)将消化后的胚盘细胞进行原代培养；4)从原代培养的胚盘细胞中富集纯化胚胎干细胞。本发明的方法简单易行，准确有效，可重复性高并且成本低廉，整个分离培养体系中的设备或试剂均可自制或商品化，无需制备饲养层，无需酶消化及相关处理，无需血清，即使从一枚种蛋中也可分离培养出大约2万个纯化过的胚胎干细胞，可以供体外转染进行基因改造或表观修饰，为转基因家禽的制备夯实了技术基础，为生物反应器的发展和实现巨大商业化价值安装了助推加速器，具有极大的科研价值和推广意义。

Description

一种高效分离禽类胚胎干细胞的方法

技术领域

本发明涉及胚胎干细胞的分离技术领域，特别涉及一种高效分离禽类胚胎干细胞的方法。

背景技术

胚胎干细胞是能够长期增殖而不分化，可以在一定条件下分化为多种成体功能细胞的原始种子细胞。胚胎干细胞在适宜的生长条件下可以快速的增殖，人类胚胎干细胞的倍增时间大约为24小时，小鼠的胚胎干细胞的倍增时间更快，一般小于24小时。近年来以人类为代表的哺乳类胚胎干细胞技术发展迅速，其培养体系也逐渐由含血清非定量结合饲养层的培养体系向不含血清全定量无饲养层培养体系转化，干细胞的培养朝可工业化生产的方向发展，即通过干细胞的无限增殖机能，在体外通过工业化手段大量的生产干细胞，然后运用蛋白，激素等化学物质将干细胞定向分化为功能细胞如神经细胞，心肌细胞等。现在已有研究表明，在体外将胚胎干细胞定向分化成的神经细胞注入神经受损的小鼠中可以明显的改善神经损伤小鼠的运动机能，这为治疗人类神经退行性疾病如帕金森氏症和老年痴呆带来了现实可能，美日等国家利用化学小分子诱导胚胎干细胞可以高效的定向分化为具有与自然心肌细胞相似电生理等功能指标的再生心肌细胞，现在正在结合生物材料向体外构建人工心脏的方向努力。

与哺乳类动物胚胎干细胞研究应用于组织再生，器官重建等治疗性目的不同，禽类胚胎干细胞的研究相对滞后，分离培养的胚胎干细胞在体外结合基因工程改造后，利用禽类特有的胚胎发育过程特点，将遗传改造或修饰后的干细胞重新导入家禽体内制备转基因嵌合体，利用干细胞可以参与宿主胚胎发育并整合到生殖腺中的特性，可以更快的获得真正可以稳定遗传的带有外源基因片段的转基因家禽。家禽饲养周期短，可以大量繁育，不断的提供禽类，禽蛋，利用改造其胚胎干细胞来制备转基因家禽简单高效，国外已将鸡的胚胎干细胞分离并转染带有GFP基因片段质粒，再将改造后的胚胎干细胞通过胚盘注射导入另一只种蛋内，最后成功获得了可以激发绿色荧光蛋白的转基因鸡。如果将带有生产干扰素，瘦素基因片段的禽类胚胎干细胞导入鸡体内制备转基因鸡则可以源源不断的提供带有干扰素或瘦素蛋白的禽肉和禽蛋，这样可以利用生物反应器生产昂贵的药物蛋白并达到真正的食疗，具有巨大的经济利益。

灵长类胚胎干细胞从单细胞受精卵经体外培养到囊胚阶段，然后将囊胚移植到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，待其贴壁生长4-5天后，通过显微操作取得囊胚内细胞团细胞（inner cell mass，ICM）移植到新的小鼠成纤维细胞饲养层上，待其形成单克隆后用显微注射针划取8-10个细胞的小团块进行传代进一步扩增建系。

禽类具有独特的生殖生理特点使其不能像灵长类动物那样从单细胞受精卵建胚胎干细胞系，禽类受精卵在排出时就已经是5-6万个细胞的胚盘（囊胚）了。已有研究将鸡的胚盘从种蛋分离出来，将卵黄分离后，将胚盘细胞经胰酶消化后重新铺到鸡胚成纤维细胞饲养层上培养，采用含10%小牛血清和2%鸡血清的DMEM高糖培养基分离培养。虽然已有的方法也能分离建立禽类的胚胎干细胞系，但是还存在诸多问题，包括取材方法，消化方法，培养基质亟需改进以提高效率，降低成本和劳动强度，减少血清等不明确因子以提高实验的准确性和可重复性。

现有的将胚盘从种蛋中分离出的方法主要有药勺法，纸环法和发环法。纸环法在取得胚盘时撕裂胚盘，造成上胚层与下胚层剥离，造成预制液洗涤时丢失大量的上胚层胚胎干细胞；发环法操作极其繁琐，造成胚胎细胞在体外暴露的时间过长；药勺法容易引入大量的卵黄，不易分离胚盘，而且这几种方法均需要准备或制备小物件，在37度的预制液中洗涤胚盘，此过程中容易丢失大量的胚盘细胞，在此过程中，由于温度的刺激，过早的激活细胞复苏，在多次洗涤中容易造成胚胎干细胞的应激死亡。

已有的方法采用胰酶消化干细胞成单个细胞铺于饲养层细胞上进行分离培养，这并不符合干细胞培养的发展趋势，因为胰酶对细胞的消化作用很剧烈，胰酶消化成单细胞培养容易使干细胞发生失巢性死亡（Anoikis），并且长期使用胰酶会增加干细胞发生化学性畸变的可能性，造成染色体的丢失或损伤。

在培养基质方面，现有方法采用鸡胚成纤维饲养层贴壁培养并在培养基中添加10%小牛血清和2%鸡血清进行培养，鸡胚成纤维细胞饲养层需要提前制备，容易引入不同遗传背景的细胞影响，由于鸡胚成纤维细胞具有批次的差异，血清中含有多种未知成分，其中含有的激素类分子如雌激素（P4）容易导致干细胞的分化，这样就使所建立的胚胎干细胞系掺杂多种未知和不可控因素，造成实验的可靠性和可重复性降低，不利于后续的研究和转基因动物的制备。

现有的分离制备禽类干细胞的方法繁琐复杂，效率低下，存活率低，需要消耗数枚不同遗传基因的种蛋才能建立，并且可靠性和可重复性存在巨大的疑问，无法定量和准确控制质量，因此，建立一种高效的分离禽类胚胎干细胞的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效分离禽类胚胎干细胞的方法。

本发明所提供的高效分离禽类胚胎干细胞的方法包括以下步骤：

1)将胚盘细胞从种蛋中取出：将种蛋平放，在种蛋赤道面开口，暴露出胚盘，将胚盘周边卵黄膜剪开后用工具将胚盘细胞取出；

2)采用机械方法消化胚盘细胞，清洗胚盘细胞，并去除卵黄；

3)将消化清洗后的胚盘细胞进行原代培养；

4)从原代培养的胚盘细胞中富集纯化胚胎干细胞。

其中，步骤1)为将种蛋平放，在种蛋赤道面最高点开口，使胚盘暴露在开窗正下，平置种蛋的最高点，将胚盘上下左右周边卵黄膜剪开后用工具将胚盘细胞取出。

步骤1)中所述工具为移液枪，其带有剪掉尖端0.5-1cm的1ml枪头。

所述枪头为1ml规格，并经过剪去尖端约0.5-1cm预处理的灭菌枪头。

具体地，步骤1)中将胚盘细胞从种蛋中取出的方法为将种蛋平放，在种蛋赤道面最高点开口，使胚盘暴露在开窗正下，平置种蛋的最高点，将胚盘上下左右周边卵黄膜剪开，用装有剪去尖端的灭菌枪头的移液枪将胚盘整个吸出。

所述种蛋为刚出产0-2天的2-6℃条件下保存的种蛋。此时种蛋中的胚胎发育处于X期，此时期形成了具有近6万个细胞的盘状囊胚，相当于哺乳动物的囊胚期，含有类似ES细胞的干细胞和能发育成精子和卵子的原始生殖细胞。

优选地，所述种蛋为鸡的种蛋。

步骤1)将胚盘从种蛋中取出的方法与现有的三种方法不同，该步骤要求快速准确的将胚盘取出，在种蛋赤道面最高点开口，利用种蛋自身的结构特点，使胚盘暴露在开窗正下，平置种蛋的最高点，利用眼科剪快速将胚盘上下左右周边卵黄膜剪开，此时受浮力作用，胚盘仍然定位于种蛋的最高点，利用剪去尖端的枪头将胚盘整个吸出，简单快速，不会损失胚盘细胞。该过程要求快速准确。

其中，步骤2)中所述机械方法消化胚盘细胞为：将取出的胚盘细胞移入装有预制液的离心管中，用装有剪去尖端的灭菌枪头的移液枪吹打胚盘细胞，将含有胚胎干细胞的上胚层通过机械方法吹散消化为含8-10个细胞的小团块；所述清洗胚盘细胞的方法为：将消化后的细胞悬液离心，将所得的细胞沉淀用预制液重悬，再次离心，将所得的细胞沉淀最后一次用预制液重悬，并转入离心管中再一次离心，富集胚盘细胞并去除预制液；通过离心去除绝大部分卵黄。

具体地，步骤2)中所述机械方法消化胚盘细胞为：将取出的胚盘移入装有预制液的50ml离心管中，用装有剪去尖端的灭菌枪头的移液枪吹打胚盘细胞，将含有胚胎干细胞的上胚层通过机械方法吹散消化为含8-10个细胞的小团块；清洗胚盘细胞的方法为：将消化后的细胞悬液于2-6℃，600-1000rpm下离心3-5min，将所得的细胞沉淀在50ml离心管中用预制液重悬，于2-6℃，600-1000rpm下再次离心3-5min，将所得的细胞沉淀再次用预制液重悬，并转入1.5ml离心管中于2-6℃，600-1000rpm下再一次离心3-5min，富集胚盘细胞并去除预制液，通过离心去除绝大部分卵黄。

所述预制液为预冷至2-6℃的PBS。

优选地，所述预制液为预冷至4℃的PBS。

所述枪头为1ml规格，并经过剪去尖端约0.5-1cm预处理的灭菌枪头。

优选地，所述离心的转速为800rpm，时间为3min，温度为4℃。

其中，步骤3)中所述原代培养的方法为将由2)获得的胚盘细胞沉淀用37.5-38.5℃预热的培养基重新悬浮，均匀播种在已有37.5-38.5℃预热培养基的培养皿中，移入37.5-38.5℃，5%二氧化碳细胞培养箱中，培养过夜。

优选地，培养基预热的温度和培养箱培养的温度为38℃。

其中，所述培养基为无血清干细胞培养基；所述培养皿为对细胞低贴附性培养皿；所述原代培养的方式为不贴壁悬浮培养。

所述培养基优选为无血清mTeSR1培养基，培养基中添加Y-27632，其终浓度为10μM/ml。

所述培养皿优选为Petri皿。

其中，步骤4)将胚胎干细胞富集的方法是收集含有胚盘细胞的培养基，除去贴壁的卵黄颗粒。利用干细胞在悬浮状态下集聚成团特性，利用细胞筛除去单个细胞（包括死细胞和下胚层细胞）。

具体地，步骤4)将胚胎干细胞富集的方法是在24-36h后将收集培养基，残余的卵黄颗粒贴附在培养皿底壁上，将培养基过细胞筛，去除死细胞和下胚层细胞，将细胞筛反转，置于另一个培养皿上方，用培养基洗脱，获得大量的经过富集纯化的来源于胚盘上胚层的胚胎干细胞。

所述细胞筛为网口大小为35-50μm、灭菌后的细胞筛。

上述过程可能会有残留的少量卵黄膜碎块，可以在体式镜下用移液枪将其去除；富集纯化后的胚胎干细胞可以用于后续的基因转染操作，并可用于制备转基因家禽。

本发明方法在已有方法的基础上，创新出简单快速的抽吸法，绝无遗漏地取得完整的胚盘。利用禽类生殖发育的特点，利用2-6℃预冷的PBS洗涤胚盘，并在这一过程中完成胚盘细胞的机械消化，胚胎干细胞在单个细胞状态下易于凋亡，本发明利用枪头将含有大量胚胎干细胞的上胚层细胞轻轻吹打成含8-10个细胞的小团块进行培养，加上2-6℃可以使细胞处于低活性状态，这样胚胎干细胞便在半休眠状态中快速完成了洗涤分离消化，极大地提高了胚胎干细胞的存活率。本发明方法中所用的mTeSR1培养基是无血清成分全已知的商品化培养基，特别适合培养灵长类生物胚胎干细胞，本发明利用其成功的分离培养了非哺乳类禽类胚胎干细胞。

本发明的一种高效的分离培养禽类胚胎干细胞的方法具有的有益效果如下：

（1）本发明在取材，消化方法和培养基质方面进行改进创新，建立一种高效的分离禽类胚胎干细胞的方法，该方法简单易行，准确有效，可重复性高并且成本低廉，整个分离培养体系中的设备或试剂均可自制或商品化。

（2）本发明的方法中无需制备饲养层，无需酶消化及相关处理，无需血清，即使从一枚种蛋中也可分离培养出大约2万个纯化过的胚胎干细胞。

（3）本发明的方法可以供体外转染进行基因改造或表观修饰，为转基因家禽的制备夯实了技术基础，为生物反应器的发展和实现巨大商业化价值安装了助推加速器，具有极大的科研价值和推广意义。

（4）本发明的方法为禽类的发育研究提供了可靠素材，为转基因禽类的制备夯实了现实可行的技术基础。

附图说明

图1为鸡胚胎干细胞在悬浮条件下形成的干细胞和非干细胞的形态图；

其中A为鸡胚胎干细胞在悬浮条件下聚集成团，形成干细胞小球的形态；B为非干细胞的形态；

图2为对所分离鸡胚胎干细胞贴壁培养后第二天观察到的形态及染色结果；

其中，Phase contrast为典型干细胞克隆的形态图；SSEA-1为干细胞的细胞膜染色后的阳性特征图；DAPI标记的是干细胞的核。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1从一枚刚出产的鸡的种蛋中取得全部的胚盘细胞、消化清洗并进行原代培养

1、将用新洁尔灭清洗消毒后的、刚出产0-2天的2-6℃条件下保存的鸡的种蛋平放，置于低温冷藏柜过夜；

2、将平放的种蛋保持位置水平，移入超净工作台中，在种蛋赤道面最高点及周围2-3cm半径处用酒精棉球消毒；

3、在平放的种蛋赤道面最高点用无菌的眼科镊挑开半径2cm的窗口，可见其正下方胚盘所在的位置；

4、用眼科剪将胚盘上下左右周边卵黄膜剪开；

5、用装有1ml剪去尖端约0.5-1cm灭菌枪头的移液枪对准胚盘，将其吸出，迅速移入装有40ml预冷至4℃的PBS的50ml离心管中吹打3-5次，将含有胚胎干细胞的上胚层吹散消化为含8-10个细胞的小团块；

6、将离心管上下颠倒3次，4℃、800rpm离心3min；

7、用3ml预冷PBS重悬细胞沉淀，加入37ml预冷PBS；

8、将离心管上下颠倒3次，4℃、800rpm离心3min；

9、用1ml预冷PBS重悬细胞沉淀，移入1.5ml离心管中；

10、4℃、800rpm离心3min；

11、用1ml 38℃预热的含终浓度为10μM/ml Y-27632的无血清mTeSR1培养基重新悬浮细胞沉淀，将悬浮液均匀播种在装有3ml 38℃预热的前述无血清mTeSR1培养基的Petri皿中；

12、将培养皿前后左右水平晃动2次，轻轻移入38℃，5%二氧化碳培养箱中，培养过夜。

上述过程中，鸡胚胎干细胞在悬浮条件下形成的干细胞和非干细胞的形态图如图1所示；其中A为鸡胚胎干细胞在悬浮条件下聚集成团，形成干细胞小球的形态；B为非干细胞的下胚层细胞形态，非干细胞为单个球形细胞，直径约为25μm，下胚层细胞与单个死细胞及其他杂质可通过细胞筛一并除去。

实施例2从原代培养的胚盘细胞中富集纯化胚胎干细胞

1、将原代培养24h后的培养皿取出，倾斜30°，使用5ml移液管收集培养基；

2、将培养基从网口大小为40μm、灭菌的细胞筛滤过，去除死细胞和胚盘下胚层细胞；

3、将细胞筛反转，置于另一枚Petri皿上方，用5ml新鲜的含终浓度为10μM/ml Y-27632的无血清mTeSR1培养基洗脱，获得大量的经过富集纯化的来源于胚盘上胚层的胚胎干细胞。

上述过程可能会有残留的少量卵黄膜碎块，可以在体式镜下用移液枪将其去除；富集纯化后的鸡胚胎干细胞可以用于后续的基因转染操作，并可用于制备转基因鸡。

实施例3将分离培养的原代鸡胚胎干细胞进行SSEA-1和DAPI染色鉴定

将分离纯化后的鸡胚胎干细胞小球转入普通细胞培养皿中，待其贴壁培养后第二天（24h），观察其形态。

1、将贴壁的胚胎干细胞样品在4%多聚甲醛中固定10min，PBS洗两次，每次5min；

2、加入0.3%Ttiton-X1002mL，室温放置10min，随后PBS洗两次，每次5min；

3、样品在5%BSA中封闭20min，用PBS稀释一抗(鼠抗SSEA-1IgM)，稀释比例为1:500，将样品与一抗室温孵育1h，随后PBS洗2次，每次5min；

4、所用二抗为生物素化羊抗小鼠IgM，用PBS按1:100稀释后，将样品与二抗室温孵育30min，随后PBS洗2次，每次5min；

5、SABC-Cy3用PBS按1:100稀释，室温避光，与样品孵育30min，随后PBS洗3次，每次5min；

6、DAPI染色：DAPI用PBS按1:50稀释，与样品室温孵育10min，荧光显微镜观察。

如图2所示，所分离的胚胎干细胞能形成典型的干细胞克隆形态（见Phase contrast），使用SSEA-1多能型标志抗体染色，观察到并显示细胞膜染色后的阳性特征（见SSEA-1），通过DAPI染色来标记胚胎干细胞的核，可见胚胎干细胞克隆中细胞核很密集，所占比重大，符合干细胞核质比高的特征。

本发明的高效分离禽类胚胎干细胞的方法除了实施例中鸡的种蛋外，同样适用于其他禽类的种蛋，采用本发明所述的方法均能够富集纯化到所用禽类的胚胎干细胞。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种高效分离禽类胚胎干细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 

1)将胚盘细胞从种蛋中取出的方法为将种蛋平放，在种蛋赤道面最高点开口，使胚盘暴露在开窗正下，平置种蛋的最高点，将胚盘上下左右周边卵黄膜剪开，用装有剪去尖端的灭菌枪头的移液枪将胚盘整个吸出； 

2)采用机械方法消化胚盘细胞，清洗胚盘细胞，并去除卵黄； 

所述机械方法消化胚盘细胞为：将取出的胚盘细胞移入装有预制液的离心管中，用装有剪去尖端的灭菌枪头的移液枪吹打胚盘细胞，将含有胚胎干细胞的上胚层通过机械方法吹散消化为含8-10个细胞的小团块；所述清洗胚盘细胞的方法为：将消化后的细胞悬液离心，将所得的细胞沉淀用预制液重悬，再次离心，将所得的细胞沉淀最后一次用预制液重悬，并转入离心管中再一次离心，富集胚盘细胞并去除预制液；通过离心去除绝大部分卵黄；

3)将消化清洗后的胚盘细胞进行原代培养； 

所述原代培养的方法为将由步骤2)获得的胚盘细胞沉淀用37.5-38.5℃预热的培养基重新悬浮，均匀播种在已有37.5-38.5℃预热培养基的培养皿中，移入37.5-38.5℃，5%二氧化碳细胞培养箱中，培养过夜； 

所述培养基为无血清干细胞培养基；所述培养皿为Petri皿；所述原代培养的方式为不贴壁悬浮培养； 

4)从原代培养的胚盘细胞中富集纯化胚胎干细胞。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)将胚胎干细胞富集的方法是在24-36h后收集培养基，残余的卵黄颗粒贴附在培养皿底壁上，将培养基过细胞筛，去除死细胞和下胚层细胞，将细胞筛反转，置于另一个培养皿上方，用培养基洗脱，获得大量的经过 富集纯化的来源于胚盘上胚层的胚胎干细胞。 

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述种蛋为刚出产0-2天的2-6℃条件下保存的种蛋。 

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述预制液为预冷至2-6℃的PBS。 

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基为无血清mTeSR1培养基，培养基中添加Y-27632，其终浓度为10μM/ml。 

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞筛为网口大小为35-50μm、灭菌后的细胞筛。