CN112755177B - 一种含有鸡胚egf的口服液及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于兽用药物技术领域，涉及一种含有鸡胚EGF的口服液及制备方法和应用。本发明分离孵化蛋中胚盘干细胞，利用PBS溶液作为生物活性保护剂、反复冻融裂解细胞、利用冰乙酸调节pH值提取分离鸡胚EGF，使提取鸡胚EGF得率大于75％，口服液中鸡胚EGF含量大于20ng/L，有效地解决了现有畜牧生产中EGF来源有限、价格昂贵的问题。通过本发明制备得到的含有鸡胚EGF口服液能有效预防和治疗产房仔猪腹泻问题，可使产房仔猪腹泻率下降85％～91％，日增重增加7％～14％，在试验期后，每头产房仔猪的体重平均提高300g～600g。
Description
技术领域
本发明属于兽用药物技术领域，尤其涉及一种含有鸡胚EGF的口服液及制备方法和应用。
背景技术
随着我国养猪业的规模化发展，出现猪病越来越多、病因越来越复杂等新常态特性。产房仔猪腹泻是规模猪场典型混感多发疾病，关系到产房仔猪成活率的一个很重要因素，其蔓延流行给养猪业带来巨大损失。
新生仔猪本身没有保护性免疫机能，只有从初乳中获取免疫球蛋白建立免疫力，初乳中免疫球蛋白含量虽很高，但下降也快，造成仔猪肠道免疫应答能力低下，易受环境中病原微生物侵袭而患病，仔猪出生2～15日龄相继发生呕吐、腹泻，并迅速脱水死亡，死亡率高达70～100％，剖检仔猪胃内含未消化凝乳块，胃肠黏膜出血或溃疡。引起产房仔猪腹泻的原因很复杂：病毒性方面有轮状病毒、呼吸道猪冠状病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、博卡病毒等；细菌性方面有致病性大肠杆菌、沙门氏菌等；寄生虫方面有球虫等致病源。
目前产房仔猪腹泻的药物治疗效果差，很难控制其死亡率，寻求一种高效简便可行的预防和治疗方法成为当前规模化养殖产房仔猪育成的重要课题。
表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一条由53个氨基酸组成的单链多肽，特殊空间结构使其具有较高稳定性，对酸、热具有耐受性，能抵抗胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶的消化。EGF能刺激多种组织细胞分裂、增殖和分化；促进溃疡愈合及上皮组织再生，是促进新生动物胃肠道发育的重要生长因子。外源供给EGF是改善动物肠道结构和功能、修复损伤肠黏膜、调节肠道菌群平衡的重要途径，畜牧业生产上有十分广阔的应用前景，但是EGF有限的来源、昂贵的价格制约着其在畜牧领域的广泛应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含有鸡胚EGF的口服液及制备方法和应用，通过本发明制备得到的口服液可有效预防和治疗产房仔猪腹泻问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种提取鸡胚EGF制备口服液的方法，包括以下步骤：
1)收集受精孵化蛋中的胚盘与胚胎干细胞团，得到胚盘干细胞团；
2)将步骤1)所述胚盘干细胞团与10×PBS溶液混合，反复冷冻-融化，匀浆，得到的匀浆液与2×PBS溶液混合，离心，得到鸡胚干细胞上清液；
3)将步骤2)所述鸡胚干细胞上清液用冰乙酸溶液调节pH值至7～8，离心，得到含有鸡胚EGF的上清液；
4)将所述含有鸡胚EGF的上清液与2×PBS溶液混合，得到含有鸡胚EGF的口服液。
优选的，所述受精孵化蛋为3～8日龄健康发育鸡胚。
优选的，所述PBS溶液的制备方法包括，将1.09g无水磷酸氢二钠、0.32g无水磷酸二氢钾、9g氯化钠、0.2g氯化钾和0.5mL Tween 20溶解于纯水，溶解后定容至100mL，调节pH值为7.4，即得到所述PBS溶液。
优选的，步骤2)所述冷冻的条件为：先于-20℃中冷冻0.5～1.5h，再于-80℃中冷冻1～3h；所述融化的条件为37℃下融化20～30min。
优选的，所述冰乙酸溶液的浓度为0.1～0.3mol/L，所述鸡胚干细胞上清液与所述冰乙酸的质量比为1:(1～3)。
优选的，所述胚盘干细胞团与所述10×PBS溶液混合的质量比为1:(2～4)。
优选的，所述匀浆液与2×PBS溶液混合的质量比为1:(0.5～1.5)。
优选的，所述含有鸡胚EGF的上清液与2×PBS溶液混合的质量比为1:(0.5～1.5)。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的含有鸡胚EGF的口服液。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的含有鸡胚EGF的口服液在制备预防和治疗产房仔猪腹泻药物中的应用。
本发明提供了一种提取鸡胚EGF制备口服液的方法，分离孵化蛋中胚盘干细胞，利用PBS溶液作为生物活性保护剂、反复冻融裂解细胞、利用冰乙酸调节pH值提取分离鸡胚EGF，使提取鸡胚EGF得率大于75％，口服液中鸡胚EGF含量大于20ng/L，有效地解决了现有畜牧生产中EGF来源有限、价格昂贵的问题。
通过本发明制备得到的含有鸡胚EGF口服液能有效预防和治疗产房仔猪腹泻问题，可使产房仔猪腹泻率下降85％～91％，日增重增加7％～14％，在试验期后，每头产房仔猪的体重平均提高300g～600g。
具体实施方式
本发明提供了一种提取鸡胚EGF制备口服液的方法，包括以下步骤：
1)收集受精孵化蛋中的胚盘与胚胎干细胞团，得到胚盘干细胞团；
2)将步骤1)所述胚盘干细胞团与10×PBS溶液混合，反复冷冻-融化，匀浆，得到的匀浆液与2×PBS溶液混合，离心，得到鸡胚干细胞上清液；
3)将步骤2)所述鸡胚干细胞上清液用冰乙酸溶液调节pH值至7～8，离心，得到含有鸡胚EGF的上清液；
4)将所述含有鸡胚EGF的上清液与2×PBS溶液混合，得到含有鸡胚EGF的口服液。
在本发明中，所述受精孵化蛋优选为3～8日龄健康发育鸡胚，更优选为5日龄。本发明选择3～8日龄的健康发育鸡胚相对于其他日龄，采用本发明的制备方法得到的EGF含量更高。
在本发明中，得到所述胚盘干细胞团的制备方法优选为，在无菌环境下，将所述授精孵化蛋，用75％酒精消毒蛋壳表面，敲碎蛋壳钝端，剥去蛋壳与壳膜，吸取蛋清暴露出胚盘，剪取胚盘放入无菌1×PBS溶液，洗去胚盘上附着的卵黄和卵黄膜，收集备用；同时收集孵化蛋中剩余白色胚胎干细胞团，合并胚盘，得到所述胚盘干细胞团。
在本发明中，所述PBS溶液的制备方法优选包括，将1.09g无水磷酸氢二钠、0.32g无水磷酸二氢钾、9g氯化钠、0.2g氯化钾和0.5mLTween 20溶解于纯水，溶解后定容至100mL，调节pH值为7.4，即得到所述PBS溶液。在本发明中，所述PBS溶液在制备方法中可作为鸡胚EGF保护剂和稳定剂，以保护鸡胚EGF的活性。
在本发明中，步骤2)所述冷冻的条件优选为：先于-20℃中冷冻0.5～1.5h，更优选为1h，再于-80℃中冷冻1～3h，更优选为2h；所述融化的条件为37℃下融化20～30min，更优选为25min。在本发明中，所述冷冻-融化的次数优选为1～3次，更优选为2次。在本发明中，所述反复冷冻-融化步骤能够使所述胚盘干细胞团中的细胞裂解，释放细胞内物质，进而提高EGF的提取效果。本发明所采用的冷冻-融化温度在能够裂解细胞的同时，还能保证鸡胚EGF的活性。
在本发明中，步骤2)所述匀浆的时间优选为2～5min，更优选为3min。
在本发明中，步骤2)所述离心温度优选为-5℃～-3℃，更优选为-4℃，所述的离心转速优选为12000～14000r/min，更优选为13000r/min，所述的离心时间优选为25～35min，更优选为30min，在本发明中，所述离心能够去除大分子杂质，提高EGF多肽的提取率。
在本发明中，所述冰乙酸溶液的浓度优选为0.1～0.3mol/L，更优选为0.2mol/L，所述冰乙酸溶液的温度优选为2℃～6℃，更优选为4℃。所述鸡胚干细胞上清液与所述冰乙酸的质量比优选为1:(1～3)，更优选为1:2。在本发明中，所述冰乙酸将鸡胚干细胞上清液调节pH值至7～8，能沉淀蛋白质等大分子物质，提高上清液中鸡胚EGF的含量。
在本发明中，步骤3)所述调节pH值后还优选包括搅拌10～30min，更优选为20min，充分沉淀。
在本发明中，步骤3)所述离心温度优选为-5℃～-3℃，更优选为-4℃，所述的离心转速优选为12000～14000r/min，更优选为13000r/min，所述的离心时间优选为25～35min，更优选为30min。
在本发明中，所述胚盘干细胞团与所述10×PBS溶液混合的质量比优选为1:(2～4)，更优选为1:3。
在本发明中，所述匀浆液与2×PBS溶液混合的质量比优选为1:(0.5～1.5)，更优选为1:1。
在本发明中，所述含有鸡胚EGF的上清液与2×PBS溶液混合的质量比优选为1:(0.5～1.5)，更优选为1:1。
在本发明中，所述鸡胚EGF的口服液中鸡胚EGF含量优选大于20ng/L。
本发明涉及的原料来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员常规选用的产品即可。
本发明制备方法中对所使用的设备没有特殊的限定，采用本领域常规设备即可。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的含有鸡胚EGF的口服液。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的含有鸡胚EGF的口服液在制备预防和治疗产房仔猪腹泻药物中的应用。
在本发明中所述含有鸡胚EGF的口服液还适用于不吃固体饲料、只吃液体的动物。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
在无菌环境下，取10个5日龄孵化健康鸡胚，用75％酒精消毒蛋壳表面，敲碎蛋壳钝端，剥去蛋壳与壳膜，移液枪吸取蛋清，暴露出胚盘，剪取胚盘放入无菌1×PBS溶液，洗去胚盘上附着的卵黄和卵黄膜，收集备用；收集孵化蛋中剩余白色胚胎干细胞团，得到胚盘干细胞团，加入质量比1:3的10×PBS溶液，先放置于-20℃冰箱内冻1h，后于-80℃冰箱中冷冻2h，取出于37℃恒温水浴锅内融化25min，重复操作冷冻-融化2次，然后将鸡胚细胞高速匀浆3min，匀浆液加入质量比为1:1的2×PBS溶液，于-4℃，13000r/min条件下离心30min，收集上清液，添加0.2mol/L冰乙酸溶液，搅拌30min，上清液与冰乙酸溶液质量比为1:2，于-4℃，13000r/min条件下离心30min，收集上清液于2℃保存。鸡胚EGF得率大于76％，口服液中鸡胚EGF含量大于20ng/L。室温条件下，将上清液与质量比为1:1的2×PBS溶液混合，得到含有鸡胚EGF的口服液。
实施例2
在无菌环境下，取10个3日龄孵化健康鸡胚，用75％酒精消毒蛋壳表面，敲碎蛋壳钝端，剥去蛋壳与壳膜，移液枪吸取蛋清，暴露出胚盘，剪取胚盘放入无菌1×PBS溶液，洗去胚盘上附着的卵黄和卵黄膜，收集备用；收集孵化蛋中剩余白色胚胎干细胞团，得到胚盘干细胞团，加入质量比1:2的10×PBS溶液，先放置于-20℃冰箱内冻0.5h，后于-80℃冰箱中冷冻1h，取出于37℃恒温水浴锅内融化20min，重复操作冷冻-融化1次，然后将鸡胚细胞高速匀浆2min，匀浆液加入质量比为1:0.5的2×PBS溶液，于-5℃，12000r/min条件下离心35min，收集上清液，添加0.1mol/L冰乙酸溶液，搅拌10min，上清液与冰乙酸溶液质量比为1:1，于-5℃，12000r/min条件下离心35min，收集上清液于0℃保存。鸡胚EGF得率大于75％，口服液中鸡胚EGF含量大于20ng/L。室温条件下，将上清液与质量比为1:0.5的2×PBS溶液混合，得到含有鸡胚EGF的口服液。
实施例3
在无菌环境下，取10个8日龄孵化健康鸡胚，用75％酒精消毒蛋壳表面，敲碎蛋壳钝端，剥去蛋壳与壳膜，移液枪吸取蛋清，暴露出胚盘，剪取胚盘放入无菌1×PBS溶液，洗去胚盘上附着的卵黄和卵黄膜，收集备用；收集孵化蛋中剩余白色胚胎干细胞团，得到胚盘干细胞团，加入质量比1:4的10×PBS溶液，先放置于-20℃冰箱内冻1.5h，后于-80℃冰箱中冷冻3h，取出于37℃恒温水浴锅内融化30min，重复操作冷冻-融化3次，然后将鸡胚细胞高速匀浆5min，匀浆液加入质量比为1:1.5的2×PBS溶液，于-3℃，14000r/min条件下离心25min，收集上清液，添加0.3mol/L冰乙酸溶液，搅拌30min，上清液与冰乙酸溶液质量比为1:3，于-3℃，14000r/min条件下离心25min，收集上清液于4℃保存。鸡胚EGF得率大于77％，口服液中鸡胚EGF含量大于22ng/L。室温条件下，将上清液与质量比为1:1.5的2×PBS溶液混合，得到含有鸡胚EGF的口服液。
实施例4
将100头出生日龄相近的杜长大三元仔猪平均分为4组，每组每天自由吸吮母乳，在此基础上，分别每天口服5mL实施例1～3含有鸡胚EGF的口服液，对照组为每天口服5mL的PBS溶液，试验期20天，记录各组的仔猪腹泻率和日增重，具体结果见表1。
腹泻率＝试验期腹泻仔猪头次/(试验仔猪头数×试验天数)×100％；
日增重＝试验期总增重/试验天数。
表1各组断奶仔猪腹泻率和日增重
| 口服液种类 | 腹泻率(％) | 日增重(g) |
| 实施例1 | 1.2 | 230 |
| 实施例2 | 2.0 | 231 |
| 实施例3 | 2.0 | 245 |
| PBS溶液 | 13.3 | 215 |
由表1可知，本发明的实施例1～3相对于对照组，产房仔猪腹泻率下降85％～91％，日增重增加7％～14％，在试验期后，每头产房仔猪的体重平均提高300g～600g。本发明制备得到的含有鸡胚EGF的口服液能显著预防和治疗产房仔猪腹泻问题，并有效地解决了现有畜牧生产中EGF来源有限、价格昂贵的问题。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种提取鸡胚EGF制备口服液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)收集受精孵化蛋中的胚盘与胚胎干细胞团，得到胚盘干细胞团；所述受精孵化蛋为3～8日龄健康发育鸡胚；
2)将步骤1)所述胚盘干细胞团与10×PBS溶液混合，反复冷冻-融化，匀浆，得到的匀浆液与2×PBS溶液混合，离心，得到鸡胚干细胞上清液；
3)将步骤2)所述鸡胚干细胞上清液用冰乙酸溶液调节pH值至7～8，离心，得到含有鸡胚EGF的上清液；所述冰乙酸溶液的浓度为0.1～0.3mol/L，所述鸡胚干细胞上清液与所述冰乙酸的质量比为1:(1～3)；
4)将所述含有鸡胚EGF的上清液与2×PBS溶液混合，得到含有鸡胚EGF的口服液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PBS溶液的制备方法包括，将1.09g无水磷酸氢二钠、0.32g无水磷酸二氢钾、9g氯化钠、0.2g氯化钾和0.5mL Tween 20溶解于纯水，溶解后定容至100mL，调节pH值为7.4，即得到所述PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述冷冻的条件为：先于-20℃中冷冻0.5～1.5h，再于-80℃中冷冻1～3h；所述融化的条件为37℃下融化20～30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胚盘干细胞团与所述10×PBS溶液混合的质量比为1:(2～4)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述匀浆液与2×PBS溶液混合的质量比为1:(0.5～1.5)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含有鸡胚EGF的上清液与2×PBS溶液混合的质量比为1:(0.5～1.5)。
7.一种基于权利要求1～6任意一项所述制备方法得到的含有鸡胚EGF的口服液。
8.根据权利要求1～6任意一项所述制备方法得到的含有鸡胚EGF的口服液在制备预防和治疗产房仔猪腹泻药物中的应用。
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