CN106701662A - 一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法 - Google Patents

一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106701662A
CN106701662A CN201611062175.0A CN201611062175A CN106701662A CN 106701662 A CN106701662 A CN 106701662A CN 201611062175 A CN201611062175 A CN 201611062175A CN 106701662 A CN106701662 A CN 106701662A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cells
cell
embryonic stem
culture medium
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611062175.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106701662B (zh
Inventor
韩红兵
伍椰南
张力
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201611062175.0A priority Critical patent/CN106701662B/zh
Publication of CN106701662A publication Critical patent/CN106701662A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106701662B publication Critical patent/CN106701662B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法。本发明提供了鸡胚胎干细胞的体外培养基，为在基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子和白血病抑制因子得到的培养基；所述碱性成纤维细胞生长因子、所述干细胞因子和所述白血病抑制因子在所述体外培养基的配比为1:1:1。本发明首次利用可传代的鸡胚成纤维细胞系DF‑1细胞系作为饲养层，通过外源添加人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),重组小鼠干细胞因子(mSCF)和人白血病抑制因子(hLIF)三种细胞因子，从而可以实现在体外长期、稳定培养鸡胚胎干细胞且维持其自我更新能力。

Description

一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域的方法，尤其涉及一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法。
背景技术
近年来，胚胎干细胞在农业、医学、基础发育生物学等领域扮演着重要角色。而鸡由于生殖生理特点独特，其胚胎干细胞对转基因鸡制备，药物生产，禽类发育动物模型建立等方面意义重大。而为禽类胎发育研究提供了一个新动物模型。而如何实现在体外简便、稳定的培养鸡胚胎干细胞就成为开展这些工作的前提。目前，主要采用9N2体系和403体系体外培养鸡胚胎干细胞，这两种体系都以STO细胞(SIM小鼠胚胎成纤维细胞系)为饲养层。9N2体系需要外源添加多种细胞因子以维持鸡胚胎干细胞的多潜能性，此方法饲养成本较高；403体系则是利用布法罗大鼠干细胞分泌的因子维持胚胎干细胞增殖且不分化，此方法较为复杂且稳定性差。
发明内容
本发明一个目的是提供鸡胚胎干细胞的体外培养基。
本发明提供的鸡胚胎干细胞的体外培养基，为在基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子和白血病抑制因子得到的培养基；
所述碱性成纤维细胞生长因子、所述干细胞因子和所述白血病抑制因子在所述体外培养基的质量比为1:1:1。
上述培养基中，所述碱性成纤维细胞生长因子和所述白血病抑制因子分别为人源碱性成纤维细胞生长因子和人源白血病抑制因子；
所述干细胞因子为小鼠干细胞因子。
上述培养基中，所述碱性成纤维细胞生长因子在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/ml；
所述干细胞因子在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/ml；
所述白血病抑制因子在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/ml。
上述培养基中，所述基础培养基为培养动物干细胞的培养基；
或，所述基础培养基为培养动物干细胞的培养基；所述培养动物干细胞的培养基具体为培养鸡胚胎干细胞的培养基；所述培养鸡胚胎干细胞的培养基具体由高糖DMEM、浓度为2mM谷氨酰胺，浓度为1mM丙酮酸钠，浓度为0.16mMβ-巯基乙醇，浓度为100U/ml链霉素、浓度为100U/ml青霉素及质量百分含量为5％胎牛血清组成。
本发明另一个目的是提供鸡胚胎干细胞的体外培养试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述培养基和/或鸡胚成纤维细胞系。
上述试剂盒中，所述鸡胚成纤维细胞系为DF-1。
本发明另一个目的是提供一种体外培养鸡胚胎干细胞的方法，包括如下步骤：在鸡胚成纤维细胞系饲养层细胞和上述培养基中培养离体鸡胚胎干细胞，得到体外培养后鸡胚胎干细胞。
上述方法中，所述鸡胚成纤维细胞系为DF-1；
或所述培养时间为7天。
由上述方法制备得到的鸡胚胎干细胞。
上述鸡胚胎干细胞在分化得到脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和神经细胞中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，本发明首次利用可传代的鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞系作为饲养层，通过外源添加人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),重组小鼠干细胞因子(mSCF)和人白血病抑制因子(hLIF)三种细胞因子，从而可以实现在体外长期、稳定培养鸡胚胎干细胞且维持其自我更新能力。
附图说明
图1为不同饲养层条件下Passage4鸡胚胎干细胞结晶紫染色结果(A)及统计结果(B)。
图2为EdU以及多能性标志基因Nanog免疫荧光共染结果(A)及统计分析(B)。
图3为不同因子组合(A)及因子浓度(C)下克隆数的差异及统计分析(B,D)。
图4为不同代次鸡胚胎干细胞的端粒酶活性检测。
图5为鸡胚干细胞定向诱导分化成脂细胞(A,D)、成骨细胞(B)、心肌细胞(C)、平滑肌细胞(E)、神经细胞(F)的染色鉴定。
图6为注射培养的白来航鸡胚胎干细胞形成嵌合体鸡的检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、体外培养鸡胚胎干细胞的方法
一、体外培养鸡胚胎干细胞的方法
1、配制鸡胚干细胞培养用完全培养基；
1)配制基础培养基：由高糖DMEM(Gibco,31053028)，浓度为2mM谷氨酰胺，浓度为1mM丙酮酸钠，浓度为0.16mMβ-巯基乙醇，浓度为100U/ml链霉素、浓度为100U/ml青霉素及质量百分含量为5％胎牛血清组成；
2)完全培养基：由上述基础培养基，浓度为20ng/ml hbFGF(R&D Systems，233-FB-025/CF),20ng/ml mSCF(R&D Systems，455-MC-010/CF)和20ng/ml hLIF(R&D Systems，7734-LF-025/CF)三种细胞因子组成；可在4℃保存1周左右。
2、灭活处理DF-1饲养层细胞进行铺板
1)在处理前24h将UMNSAH/DF-1鸡胚成纤维细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，GNO30)进行传代，24小时时细胞处于对数生长期，此时对细胞进行处理；
2)用工作浓度为20μg/ml的丝裂霉素C灭活处理DF-1细胞，处理1h；
3)弃上清，用不含钙镁离子的PBS清洗细胞3次，后加入胰蛋白酶消化，重悬收集细胞，以105个细胞/cm2的密度铺于96孔板，待细胞完全贴壁后即可使用；
3、培养鸡胚胎干细胞
1)选用新鲜白来航鸡种蛋，用纸环法取完胚盘后，将细胞重悬离心3次，每次600×g，5mim，将卵黄颗粒洗掉大部分；
2)用提前配制好的完全培养基将细胞重悬吹散，镜检直至单个细胞为止，得到鸡胚胎干细胞；
3)将重悬的鸡胚胎干细胞以1.5×104个细胞/96孔的密度铺上述2得到的灭活处理DF-1饲养层细胞，培养7天后，饲养层几乎完全死亡，此时按1:1.5-2的比例传代，得到体外培养后鸡胚胎干细胞。
二、体外培养鸡胚胎干细胞的方法的条件优化
1、不同饲养层条件对鸡胚胎干细胞克隆面积及增殖率的影响
1)、配制鸡胚干细胞培养用完全培养基：与上述一的1相同；
2)、灭活处理饲养层细胞进行铺板：
分为如下3个组：
DF-1饲养层细胞组：与上述一的2相同；
STO饲养层细胞：与上述一的2基本相同，仅将DF-1细胞分别替换为STO细胞；
PCEF饲养层细胞进行铺板：与上述一的2基本相同，仅将DF-1细胞分别替换为PCEF细胞；
3)培养鸡胚胎干细胞：与上述一的3相同；
结晶紫染色上述各饲养层组得到的鸡胚胎干细胞，结果如图1所示，经结晶紫染色(图1A)，可见DF-1饲养层上的鸡胚胎干细胞其克隆状更为饱满，形成的克隆较大，通过Image-Pro Plus软件分析(图1B)，DF-1饲养层上鸡胚胎干细胞克隆总面积远远高于STO和PCEF作为饲养层上的克隆总面积，差异均显著(P<0.01)。
分别用NANOG免疫荧光染色和EDU免疫荧光染色上述各饲养层组得到的鸡胚胎干细胞，结果为DF-1饲养层鸡胚胎干细胞的增值率高于STO饲养层(图2A，B)。
因此，最佳的饲养层细胞为DF-1细胞。
NANOG免疫荧光染色为常规方法。上述EDU免疫荧光染色：用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基。每孔加入100μl 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基。PBS清洗细胞1～2次，每次5分钟。每孔加入50μl细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟。弃固定液后，每孔加入50μl 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液。每孔加入100μlPBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS。加入封闭液，室温封闭60min。弃去封闭液，加入NANOG一抗，4℃过夜。弃一抗，PBS洗3次，每次5min。加入二抗，室温静置60min。弃二抗，PBS洗3次，每次5min。加入100μl的1×Apollo(1×Apollo染色液现用现配)。加入100μl渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟。每孔加入100μl 1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。每孔每次加入100μl PBS清洗1～3次。
2、外源添加不同细胞因子及因子浓度对鸡胚胎干细胞培养的影响
1)、配制鸡胚干细胞培养用完全培养基：
分为如下几组：
LIF组：与上述一的1基本相同，唯一不同的就是完全培养基由上述基础培养基和浓度为20ng/ml hLIF组成；
bFGF组：与上述一的1基本相同，唯一不同的就是完全培养基由上述基础培养基和浓度为20ng/ml hbFGF组成；
SCF组：与上述一的1基本相同，唯一不同的就是完全培养基由上述基础培养基和浓度为20ng/ml mSCF组成；
LIF+bFGF组：与上述一的1基本相同，唯一不同的就是完全培养基由上述基础培养基、浓度为20ng/ml hbFGF和20ng/ml hLIF组成；
bFGF+SCF组：与上述一的1基本相同，唯一不同的就是完全培养基由上述基础培养基、浓度为20ng/ml hbFGF和20ng/ml mSCF组成；
LIF和SCF组：与上述一的1基本相同，唯一不同的就是完全培养基由上述基础培养基、20ng/ml mSCF和20ng/ml hLIF组成；
3F-20组：与上述一的1相同，完全培养基由上述基础培养基、浓度为20ng/mlhbFGF,20ng/ml mSCF和20ng/ml hLIF三种细胞因子组成；
3F-10组：与上述一的1基本相同，完全培养基由上述基础培养基、浓度为10ng/mlhbFGF,10ng/ml mSCF和10ng/ml hLIF三种细胞因子组成；
Con组：与上述一的1基本相同，仅将完全培养基替换为基础培养基。
2)、灭活处理饲养层细胞进行铺板：与上述一的2相同；
3)培养鸡胚胎干细胞：与上述一的3相同。
培养后鸡胚胎干细胞经结晶紫染色后，利用Image-Pro Plus软件进行统计分析克隆面积，结果如图3A,B所示，在单因子实验组中，bFGF组克隆面积最高，显著高于SCF组(P<0.05)，极显著高于LIF组(P<0.01)。另外，LIF+BFGF组分别显著高于LIF组和SCF组(P<0.05)，BFGF+SCF组显著高于LIF组(P<0.05)。同时，3F-20组分别极显著高于3F-10组，5％组，STO组，PCEF组(P<0.01)，显著高于LIF+SCF组(P<0.05)。由此可知，对于STO，DF-1，PCEF这三个不同的饲养层，DF-1的效果最优，STO和PCEF之间差异不显著。对于LIF,bFGF,SCF这三个不同的因子而言，bFGF的效果最为明显(图1A,B)。在结果中可知，培养液中含有bFGF因子的实验组明显优于未加bFGF实验组的。而对于因子浓度而言(图3C,D)，20ng/ml组优于10ng/ml组。
因此，最佳的完全培养基由上述基础培养基、浓度为20ng/ml hbFGF,20ng/mlmSCF和20ng/ml hLIF三种细胞因子组成。
一所示的方法为最佳的体外鸡胚胎干细胞培养方法。
三、体外培养的鸡胚胎干细胞的效果验证
对于上述培养体系培养的鸡胚胎干细胞，从端粒酶检测，体外诱导分化，体内分化等方面做了一系列验证。
1、端粒酶活性检测
按照一所示的方法得体外培养鸡胚胎干细胞，分别收集原代，3代,5代和12代体外培养的鸡胚胎干细胞，用以提取总蛋白，按照如下过程进行端粒酶活性检测。
(1)细胞总蛋白的提取：收集细胞(2000r/min离心5min)，预冷的PBS洗涤1次，预冷的洗涤缓冲液洗涤1次，后加入4-5倍体积的裂解缓冲液，吹打均匀后，冰上孵育30min，孵育过程中不时吹打。然后4℃18000g离心10min，转移上清液到新的1.5ml EP管中。将提取的蛋白分装10μl/管，迅速放入-80℃。用BCA法(PierceTM Microplate BCA Protein Assay Kit，thermo 23252)测定提取的蛋白浓度。用人结肠癌细胞系HCT8(美国模式培养物保藏，ATCC，AA-CELL-125)作为阳性对照。以不添加细胞提取物的反应作为阴性对照。
细胞总蛋白提取过程中用到的缓冲液配方如下：
洗涤缓冲液:在DEPC水中，浓度为10mM HEPES–KOH(pH 7.5),浓度为1.5mM氯化镁,浓度为10mM氯化钾,浓度为1mM二巯基苏糖醇(DTT)，DTT用前再加。
裂解缓冲液:在DEPC水中，浓度为10mM Tris–HCl(pH 7.5),浓度为1.5mM氯化镁,浓度为1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸),质量百分含量为0.5–1％CHAPS(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐),质量百分含量为10％甘油,浓度为5mMβ-巯基乙醇，浓度为0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟化物)。β-巯基乙醇和PMSF用前再加。
(2)TRAP反应：稀释蛋白样品，使蛋白量在0.001-1μg/5μl，可稍大一些。采用50μlTRAP体系，即稀释好的蛋白样品5μl，TRAP反应缓冲液39μl，2.5mM dNTP 2.5μl，引物TS(AATCCGTCGAGCAGAGTT)和CX(CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA)各1.25μl，Hot-start Taqpolymerase 1μl。反应程序是30℃反应60min,然后95℃30s,50℃30s，72℃30s进行35个循环，72℃反应5min。
反应过程中用到的TRAP反应缓冲液配方如下：在DEPC水中，浓度为20mM Tris–HCl(pH 8.3),浓度为1.5mM氯化镁,浓度为63mM氯化钾,质量百分含量为0.005％吐温20，浓度为1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸)。
(3)PAGE胶垂直电泳：配制12％PAGE凝胶。将上步反应后产物在100V电压下跑胶，跑胶时间约为80-100min。PAGE电泳完成后，将PAGE胶经银染(超快核酸银染试剂盒，北京天恩泽基因科技有限公司，81104-1000)。DNA ladder(New England Biolabs，N3233)用来指示片段大小。
图4为经银染后的PAGE胶，可以看出，培养至3代，5代甚至12代的cESCs均检测到一系列相差6bp的条带，且与HCT8条带分布相似。3代的条带数量几乎和原代相同，5代和12代条带数量虽然略有降低，但依旧维持在一个较高的水平。结果表明，新体系体外培养的cESCs，在长期培养过程中依旧保持高端粒酶活性。
2、鸡胚胎干细胞定向诱导分化
按照表1对体外培养到一定时期的鸡胚胎干细胞进行定向诱导,每两天换一次液。
1)脂肪细胞
按照一所示的方法体外培养鸡胚胎干细胞到第5代，在第5代鸡胚胎干细胞传代6天后，饲养层大多数死亡，鸡胚胎干细胞形成明显克隆。此时，换用由高糖DMEM(Gibco,31053028)，质量百分含量为10％胰岛素，浓度为1nM三碘甲腺原氨酸(T3)，浓度为0.125mM吲哚美辛，浓度为5μM地塞米松，浓度为0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，质量百分含量为10％胎牛血清组成的脂肪诱导培养基培养4天后，再换用由高糖DMEM(Gibco,31053028)，浓度为20nM胰岛素，浓度为1nM三碘甲腺原氨酸(T3)，质量百分含量为10％胎牛血清组成的脂肪分化培养基继续培养24天，可诱导形成脂肪细胞。每两天换一次液。
对诱导形成的脂肪细胞进行油红O染色，结果如图5A，细胞中充满脂滴，可见明显的脂肪细胞形态。图5D为脂肪细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)(红色)免疫荧光结果，细胞核用DAPI(蓝色)标记。图5中体外培养到第5代的鸡胚胎干细胞被定向诱导形成脂肪细胞，说明一所示的方法体外培养的鸡胚胎干细胞有体外定向诱导分化成脂肪细胞的潜能。
2)成骨细胞
按照一所示的方法体外培养鸡胚胎干细胞到第5代，在第5代鸡胚胎干细胞传代6天后，饲养层大多数死亡，鸡胚胎干细胞形成明显克隆。此时，换用由高糖DMEM(Gibco,31053028)，浓度为0.1μM地塞米松，浓度为10mMβ-甘油磷酸，浓度为50μg/ml维生素C(抗坏血酸)，质量百分含量为10％胎牛血清组成的成骨分化培养基培养，每两天换一次液。定向诱导4周后形成成骨细胞。
对诱导形成的成骨细胞进行茜素红染色，结果如图5B，成骨细胞被染成深红色，说明一所示的方法体外培养的鸡胚胎干细胞有体外定向诱导分化成成骨细胞的潜能。
3)心肌细胞
照一所示的方法体外培养鸡胚胎干细胞到第5代，在第5代鸡胚胎干细胞传代6天后，饲养层大多数死亡，鸡胚胎干细胞形成明显克隆。此时，换用由高糖DMEM(Gibco,31053028)，质量百分含量为0.1％二甲基亚砜(DMSO)，浓度为5uM 5-氮杂胞苷，浓度为0.1uM维生素C(抗坏血酸)，质量百分含量为10％胎牛血清组成的心肌分化培养基培养，每两天换一次液。定向诱导4周后形成心肌细胞。
图5C为心肌细胞myosin heavy chain(MHC)(红色)免疫荧光染色，细胞核用DAPI(蓝色)染色，结果表明有心肌细胞形成，说明该体系长期培养的cESCs有体外定向诱导分化成为心肌细胞的潜能。
4)平滑肌细胞
照一所示的方法体外培养鸡胚胎干细胞到第5代，在第5代鸡胚胎干细胞传代6天后，饲养层大多数死亡，鸡胚胎干细胞形成明显克隆。此时，换用由高糖DMEM(Gibco,31053028)，浓度为1mM硫代甘油(MTG)，浓度为10μM维甲酸，质量百分含量为15％胎牛血清组成的平滑肌分化培养基培养，每两天换一次液，定向诱导10天后，换用由高糖DMEM(Gibco,31053028)，浓度为1mM硫代甘油(MTG)，质量百分含量为15％胎牛血清组成的培养基再继续培养2周可诱导形成平滑肌细胞。每两天换一次液。
图5E为平滑肌细胞desmin(红色)染色结果，细胞核用DAPI(蓝色)染色，结果表明有平滑肌细胞形成，说明该体系长期培养的cESCs有体外定向诱导分化成为平滑肌细胞的潜能。
5)神经细胞
照一所示的方法体外培养鸡胚胎干细胞到第4代，在第4代鸡胚胎干细胞传代6天后，饲养层大多数死亡，鸡胚胎干细胞形成明显克隆。此时，换用由高糖DMEM(Gibco,31053028)，浓度为5μg/ml胰岛素，浓度为30nM三碘甲腺原氨酸(T3)，浓度为20nM氢化可的松，浓度为20nM孕酮，浓度为10μg/ml牛血清白蛋白组成的神经分化培养基培养，每两天换一次液。定向诱导5周后形成神经细胞。
图5F为神经细胞PAX6(绿色)免疫荧光标记，细胞核用DAPI(蓝色)染色，结果表明有神经细胞形成，说明该体系长期培养的cESCs有体外定向诱导分化成为神经肌细胞的潜能。
3、培养后鸡胚胎干细胞形成嵌合体鸡
已知催乳素PRL(prolactin,PRL)基因调控区-377～-354bp处(GenBankaccession no.AB011438)的PRLpro2位点存在24bp的插入/缺失突变，即5’-ACAAGAAGAGACAAGACAAGGAAG-3’。不同品种(系)鸡群PRLpro2基因型频率分布不同，白来航鸡全为+/+型，寿光鸡几乎全为－/－型。照一所示的方法体外培养鸡胚胎干细胞到第25代，用完全培养基收集细胞并吹散制成细胞悬液，通过显微注射1.5-2μl到寿光鸡受体种蛋的胚下腔中制备嵌合体鸡。待鸡胚胎发育提取组织DNA，PCR反应体系为25μl，引物为PRLpro2-F GGTGGGTGAAGAGACAAGGA，PRLpro2-R TGCTGAGTATGGCTGGATGT，按照反应程序是95℃反应5min,然后95℃30s,57℃30s，72℃20s进行35个循环，72℃反应5min。然后通过3％的琼脂糖凝胶电泳检测PRLpro2基因片段大小，白来航的片段大小为177bp，寿光鸡为201bp，可以根据基因片段的大小区分不同的品系，从而鉴定是否发生嵌合。
分别检测孵化到8d，10d，12d，13d的鸡胚嵌合情况，并对孵化15d的鸡胚解剖检测心，肝，脾，胃，眼，肌肉，肺，肠，气管，皮肤，脑，食道等各个器官的嵌合情况。3％的琼脂糖凝胶电泳结果如图6，分别在12d和13d各成功获得一只嵌合体。证明作为供体注入寿光鸡Ⅹ期胚盘的体外培养25代的白来航的cESCs在寿光鸡体内发生增殖分化。嵌合体鸡的获得充分证明了新体系培养至25代的cESCs仍然具有分化的多潜能性。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 1
aatccgtcga gcagagtt 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 2
cccttaccct tacccttacc ctaa 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ggtgggtgaa gagacaagga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 4
tgctgagtat ggctggatgt 20

Claims (10)

1.鸡胚胎干细胞的体外培养基，为在基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子和白血病抑制因子得到的培养基；
所述碱性成纤维细胞生长因子、所述干细胞因子和所述白血病抑制因子在所述体外培养基的质量比为1:1:1。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：
所述碱性成纤维细胞生长因子和所述白血病抑制因子分别为人源碱性成纤维细胞生长因子和人源白血病抑制因子；
所述干细胞因子为小鼠干细胞因子。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：
所述碱性成纤维细胞生长因子在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/ml；
所述干细胞因子在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/ml；
所述白血病抑制因子在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/ml。
4.根据权利要求1-3中任一所述的培养基，其特征在于：
所述基础培养基为培养动物干细胞的培养基；
或，所述基础培养基为培养动物干细胞的培养基；所述培养动物干细胞的培养基具体由高糖DMEM、浓度为2mM谷氨酰胺，浓度为1mM丙酮酸钠，浓度为0.16mMβ-巯基乙醇，浓度为100U/ml链霉素、浓度为100U/ml青霉素及质量百分含量为5％胎牛血清组成。
5.鸡胚胎干细胞的体外培养试剂盒，包括权利要求1-4中任一所述培养基和/或鸡胚成纤维细胞系。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述鸡胚成纤维细胞系为DF-1。
7.一种体外培养鸡胚胎干细胞的方法，包括如下步骤：在鸡胚成纤维细胞系饲养层细胞和权利要求1-4中任一所述培养基中培养离体鸡胚胎干细胞，得到体外培养后鸡胚胎干细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述鸡胚成纤维细胞系为DF-1；
或所述培养时间为7天。
9.由权利要求7或8得到的鸡胚胎干细胞。
10.权利要求9所述鸡胚胎干细胞在分化得到脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和神经细胞中的应用。
CN201611062175.0A 2016-11-28 2016-11-28 一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法 Active CN106701662B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611062175.0A CN106701662B (zh) 2016-11-28 2016-11-28 一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611062175.0A CN106701662B (zh) 2016-11-28 2016-11-28 一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106701662A true CN106701662A (zh) 2017-05-24
CN106701662B CN106701662B (zh) 2019-09-27

Family

ID=58934813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611062175.0A Active CN106701662B (zh) 2016-11-28 2016-11-28 一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106701662B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110283779A (zh) * 2019-07-17 2019-09-27 吉林省农业科学院 一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法及培养基

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1935984A (zh) * 2006-10-13 2007-03-28 扬州大学 一种禽类精原干细胞的体外培养方法
CN102329771A (zh) * 2011-10-12 2012-01-25 佛山科学技术学院 长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养基

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1935984A (zh) * 2006-10-13 2007-03-28 扬州大学 一种禽类精原干细胞的体外培养方法
CN102329771A (zh) * 2011-10-12 2012-01-25 佛山科学技术学院 长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养基

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EIMAAS R等: "Replacement of primary chicken embryonic fibroblasts (CEF) by the DF-1 cell line for detection of avian leucosis viruses", 《BIOLOGICALS》 *
YANG Z等: "Use of avian cytokines in mammalian", 《POULT SCI》 *
邹清雁等: "鸡胚胎干细胞饲养层培养体系的建立", 《上海实验动物科学》 *
陈志胜等: "不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响", 《生物技术通讯》 *
陈胜峰等: "鸡胚胎干细胞的离体培养与鉴定", 《兽医科技》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110283779A (zh) * 2019-07-17 2019-09-27 吉林省农业科学院 一种鸡胚胎干细胞的分离培养方法及培养基

Also Published As

Publication number Publication date
CN106701662B (zh) 2019-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Quattrocelli et al. Mouse and human mesoangioblasts: isolation and characterization from adult skeletal muscles
CN102344906B (zh) 一种毛囊干细胞的分离培养方法
CN106635966B (zh) 一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法
Wiley et al. Generation of xeno‐free, cGMP‐compliant patient‐specific iPSCs from skin biopsy
Gignac et al. Derivation of a continuous myogenic cell culture from an embryo of common killifish, Fundulus heteroclitus
CN106032527A (zh) 一种耐受低密度的无饲养层人多能干细胞培养基
CN108795850A (zh) 一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法
CN109628404A (zh) 猪皮下脂肪前体细胞永生化细胞系的构建方法及用途
CN103555661A (zh) 一种无血清、无饲养层的多能干细胞培养方法
CN103589686B (zh) 一种运用人脐带间充质干细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法
Alkobtawi et al. Characterization of Pax3 and Sox10 transgenic Xenopus laevis embryos as tools to study neural crest development
CN104531763A (zh) 利用过表达hoxa10基因制备转基因猪的方法
CN104059877B (zh) 一种“仿比利时蓝牛”mstn基因型的基因编辑猪的制备方法
CN103966169A (zh) 一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系ctsc-1及其建立方法
CN106701662B (zh) 一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法
Saxena et al. Role of stem cell research in therapeutic purpose--a hope for new horizon in medical biotechnology.
Link et al. Development of the avian iris and ciliary body: mechanisms of cellular differentiation during the smooth-to-striated muscle transition
CN105670989A (zh) 高效诱导成体细胞表观重编程的试剂盒及其方法
CN102409021A (zh) 金华猪成纤维细胞系的建立及其培养方法
JP4267689B2 (ja) 鳥類由来の細胞の培養方法および該培養方法によって得られた細胞系
CN105420187A (zh) 一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒及采用所述试剂盒获得的hUC-MSC
CN106350490B (zh) 利用无血清培养基从成纤维细胞中获得神经细胞的方法
KR20240004086A (ko) 인간 유래 유도 만능 줄기 세포 기반 부착형 3d 모낭 오가노이드 및 이의 제조 방법
CN105087473A (zh) 人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法
CN107056895A (zh) 诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的人工多肽及其生物制品

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant