CN105087473A - 人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：使用至少一种诱导剂对人胚胎干细胞进行定向诱导，得到诱导分化成的角化细胞；步骤(2)：将角化细胞分组接种于至少一种细胞外基质包被的培养皿中培养，得到分组培养后的角化细胞组；步骤(3)：观察角化细胞组的生长情况，检测其增殖能力、CK14的表达量并测定其灰度值，筛选出增值能力最强、表达量和灰度值最好的角化细胞组，并得出该角化细胞组采用的细胞外基质。其通过对E-KCS的生物活性、增殖能力及角化细胞标志物CK14表达量的检测发现细胞增殖能力最强，最能促进E-KCS生长的细胞外基质，简便，易行。

Description

人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法

技术领域

本发明涉及细胞学领域，特别涉及细胞培养领域，具体是指一种人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法。

背景技术

种子细胞、生长因子、生物支架是组织工程的三大要素，而种子细胞的获得是决定组织或器官能否成功构建的基础。胚胎干细胞(HumanEmbryonicStemCells，hESCs)具有多能性及无限增殖能力，通过诱导胚胎干细胞获得增殖能力强的种子细胞有望推动组织工程的进展。hESCs与成体干细胞相比具有更明显的优势，它可以分化成为各种不同组织的细胞，从而进一步构建机体各种复杂的组织器官。但是，如何诱导hESCs定向分化为高纯度的组织细胞成为难点。在组织工程化口腔黏膜或皮肤领域，人们也一直在研究如何通过诱导人胚胎干细胞来获得高纯度的角化细胞，目前在此领域相关的研究还比较不成熟。且其培养体系也是个十分重要的研究方向。

胚胎干细胞向角化细胞诱导分化受多种因素影响，各种信号分子及细胞外基质都会影响干细胞的生长及分化。作为细胞最初生长繁殖的＂温床＂，细胞外基质包含的各种成分对细胞的生长、分化、繁殖、迁移具有重要作用，在胚胎干细胞向角化细胞诱导分化的研究中，选择适合胚胎干细胞向角化细胞定向分化的细胞外基质尤为重要。细胞外基质是细胞合成并分泌到细胞外或细胞表面的大分子物质，其中占绝大部分的是胶原物质，这些胶原物质构成复杂的网架结构，调节组织发生和细胞的生理活动，并能促进细胞增殖、分化、迁移，从而调节细胞的生长。随着研究的不断深入，如Matrigel，明胶，细胞滋养层，Ⅰ型胶原，Ⅳ型胶原等细胞外基质已经被用于胚胎干细胞诱导分化的研究。Matrigel是由富含胞外基质蛋白，可模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，可促进细胞的贴壁与分化。Ⅰ型胶原是通过Birkedal－Hansen方法从鼠尾中提取，Ⅳ型胶原来源于人胎盘，它们常被用于包被细胞培养器皿来培养一些在普通培养皿中不易贴壁的细胞，明胶是从动物的骨骼、结缔组织和皮肤中所获得的蛋白质，近几年也被用于包被培养皿来促进细胞贴壁。细胞在细胞外基质包被的培养皿中易贴壁生长，还有其他细胞外基体，但哪一种细胞外基质最有利于E-KCS生长并能提高E-KCS的纯度，目前尚不明确。

所以一种能够弥补上述领域不足的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基体的筛选方法是十分具有实用价值的。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种能够进一步优化胚胎干细胞向角化细胞诱导分化的，弥补现有技术不足的、人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，包括以下步骤：

步骤(1)：使用至少一种诱导剂对人胚胎干细胞进行定向诱导，得到诱导分化成的角化细胞；

步骤(2)：将所述的角化细胞分组接种于至少一种细胞外基质包被的培养皿中培养，得到分组培养后的角化细胞组；

步骤(3)：观察所述的角化细胞组的生长情况，检测其增殖能力、CK14的表达量并测定其灰度值，筛选出增值能力最强、表达量和灰度值最好的角化细胞组，并得出该角化细胞组采用的细胞外基质。

较佳地，所述的诱导剂为维甲酸、骨形成蛋白、抗坏血酸中的至少一种。

较佳地，所述的细胞外基质为Matrigel、明胶、I型胶原、IV型胶原中的至少一种。

较佳地，步骤(3)中，通过CCK8法检测细胞的增殖能力。

较佳地，步骤(3)中，通过WesternBlot检测CK14表达量。

较佳地，步骤(3)，中，通过倒置显微镜观察细胞生长情况。

较佳地，步骤(2)中，还设有无包被培养皿作为空白对照组。

采用本发明的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，通过对E-KCS的生物活性、增殖能力及角化细胞标志物CK14表达量的检测筛选细胞增殖能力最强，最能促进E-KCS生长的细胞外基质，且方法简便，易行，十分具有实用价值。本发明进一步优化了胚胎干细胞向角化细胞诱导分化的培养体系，为体外构建口腔黏膜组织提供高活力高纯度的胚胎干细胞源性角化细胞打下了基础，对胚胎干细胞向角化细胞诱导分化及体外构建口腔黏膜组织的研究具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例中对培养后的角化细胞的倒置显微镜观察图；

图2为本发明实施例中各组细胞形成百分率比较图；

图3为本发明实施例中E-KCS细胞增殖能力及生长曲线图；

图4为本发明实施例中CK14蛋白表达图；

图5为本发明实施例的灰度值比较显示图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一步说明。实施例

1材料

1.1人类胚胎干细胞来源由美国WiCellResearchInstitute提供(合同号：WicellAgreement：12－W0328)。

1.2主要试剂和仪器

mTeSR1培养基(StemCell，美国)，胰蛋白酶(Hyclone，美国)，Dispase(StemCell，美国)，DMEM/F12(Hyclone，美国)，N2添加剂(Invitrogen，美国)，骨形成蛋白(BoneMorphogeneticProtein，BMP4，R&D，美国)、维甲酸(RetinoicAcid，RA，Sigma美国)，抗坏血酸(AscorbicAcid，AA，北京双鹤药业股份有限公司)角化细胞培养液(KSFM，Gibico，美国)，Ⅰ型胶原(CollagenⅠ，杭州生友生物技术有限公司)、Ⅳ型胶原(CollagenⅣ，上海领潮生物)、明胶(Gelatin，Sigma，美国)Matrigel(MAT，BD，美国)。抗CK14抗体(Anti－Cytokeratin14antibody，abcam，美国)，二抗(AlexaFluor488GoatAnti－RabbitIgG(H+L)，highlycross－adsorbed，invitrogen，美国)，CellCountingKit－8(CCK8，上海前尘生物科技有限公司)，扫膜仪(LI－COR，美国)，酶标仪(BIO－RAD，美国)，倒置显微镜(Olympus，日本)。

2方法

2.1胚胎干细胞诱导

hESCs复苏后加2mLmTeSR1培养基重悬后离心，1200r/min×5min，弃上清并加2mLmTeSR1培养基重悬，将重悬后细胞混合液加入培养皿，2mL/孔，待细胞长满培养皿80％后加入2mLDispase处理5min，弃旧液并加入1mLmTeSR1，用细胞刷刮落细胞，离心1200r/min×5min，加6mLmTeSR1重悬并按1：6传代，待细胞接种后第4d加入以下试剂进行诱导：1％N2添加剂、99％DMEM/F12培养液、25ng/mLBMP4和1uM维甲酸(RA)，0.3mmol/L抗坏血酸(AA)。细胞诱导4d后改用角化细胞培养液KSFM培养，此时称培养中的细胞为EKCS，待E-KCS长满培养皿80％时将细胞传代并接种于不同细胞外基质包被的培养皿中。

分组方法如下：设A、B、C、D4个试验组，设E为空白对照组，各组培养皿包被试剂：A组：Matrigel；B组：CollagenⅠ；C组：CollagenIV；D组：Gelatin；E组：无包被处理。将各组培养皿放培养箱静置30min备用。hESC经1mg/mL的diaspase处理后吹打成单细胞悬液，于6孔板中，每孔加入2×104个细胞，每组3孔。

2.2倒置显微镜观察细胞

倒置显微镜下每天观察各组细胞贴壁生长情况，并在传代1周后计数每孔中的集落数，以50个细胞以上者为一个集落，测定细胞集落形成百分率。

集落形成百分率＝集落数/每皿接种的单细胞个数×100％。

2.3细胞增殖能力检测(CellCountingKit－8)

获得E-KCS单细胞悬液，分别加入以上4种细胞外基质包被的96孔板，每组设3个复孔，每孔3×103个细胞，每24h加入CCK810uL/孔，培养1h后再测定各组细胞在450nm波长时的OD值，并绘制1～8d细胞的生长曲线。

2.4WesternBlot检测CK14蛋白表达取A、B、C、D、E组诱导后第21d的细胞，以正常口腔黏膜角化细胞(Oralkeratinocytecell，OKC)作为阳性对照组。0.25％胰蛋白酶消化5min获得细胞悬液，离心3000r/min×5min，PBS洗涤2次，裂解液裂解细胞，通过蛋白含量测定确定标准曲线后进行SDS－PAGE电泳1～2h，电压80V，转膜后摇动封闭1h，加抗体Anti－Cytokeratin14antibody，4℃过夜摇动孵育，PBST及PBS清洗2～3次，加二抗AlexaFluor488GoatAnti－RabbitIgG(H+L)，室温避光孵育90min，再用PBST及PBS清洗2～3次，加入GAPDH抗体，室温避光孵育90min，上机，扫膜仪扫膜检测蛋白含量，并对条带进行灰度值测量。

3统计方法：实验数据采用SPSS19.0统计软件进行独立样本T检验检测各组差异情况，P＜0.05为差异有统计学意义。

4结果

(1)倒置显微镜观察

如图1所示，各组细胞集落形成百分率不同，细胞形态亦不同，其中A组细胞集落形成百分率最高，并且细胞边界清晰，大小均等，形态为均一的多边形，与正常角化细胞铺路石样排列的形态及特征最为相似。B组细胞呈三角形或多边形，细胞均一性稍差；C组见少量细胞集落形成，细胞少见多边形，细胞排列不规则，见细胞富集。D组细胞亦呈多边形，铺路石样排列，少量细胞集落形成；E组未见细胞生长，故后续检测无结果。(A：Matrigel包被生长的E-KCS；BⅠ型胶原包被生长的E-KCS；C：Ⅳ型胶原包被生长的E-KCS；D：Gelatin包被生长的E-KCS)

(2)细胞集落形成百分率比较：

如图2所示，Matrigel组与其他组比较细胞集落形成率最高，其他组与其比较P＜0.05，具有显著性差异，其余组集落形成率大小依次为CollagenⅠ、Gelatin、CollagenⅣ。

(3)各组E-KCS增殖能力

如图3所示，细胞在Matrigel包被的孔中第1d就开始贴壁生长，A组OD值在细胞接种后第24h后即高出其它组，并且A组细胞较其他组细胞更早进入对数期生长阶段，细胞增殖能力比其他组更强。而C组细胞在第6天才表现出增殖现象，细胞生长缓慢。

(4)各组CK14表达量的比较

如图4、5所示，各实验组均表达CK14，但正常角化细胞(OKC)及Matrigel(MAT)包被的培养皿中培养的E-KCS中CK14表达条带最宽，说明其CK14蛋白含量较其他组高，在MAT上生长的E-KCS表达CK14的量同正常角化细胞相似。

本发明实施例通过对E-KCS的生物活性、增殖能力、细胞标志物CK14表达量的检测发现，以Matrigel的培养皿中E-KCS细胞集落形成率最高，同时细胞呈多边形，具有正常角化细胞铺路石样特胞生长曲线能反应出细胞生长的基本规律，角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，其中CK14主要分布于口腔黏膜或皮肤基底层细胞中，因为未经诱导的胚胎干细胞无CK14的表达而正常角化细胞有CK14表达，故CK14是鉴别角化细胞常用标记物，HowardGreen、JiL、RudolphD等人的研究还发现，胚胎干细胞自诱导后20天开始表达CK14。检测CK14表达量可以反映角化细胞的数量，同时可以测定胚胎干细胞向角化细胞的诱导分化效率。本实施例实验通过测定不同组中CK14蛋白表达量并同正常角化细胞CK14表达比较发现，以Matrigel包被的培养皿中细胞表达CK14的量同正常口腔黏膜角化细胞CK14表达量相同，同其他三组比较，P＜0.01，统计学差异明显，初步表明Matrigel在胚胎干细胞向角化细胞诱导分化过程中不仅能够促进细胞的分化、增殖，而且能够提高诱导后角化细胞的纯度，获得大量高纯度的角化细胞。所以本发明实施例筛选出了最适合人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质。

采用本发明的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，本实验通过对E-KCS的生物活性、增殖能力及角化细胞标志物CK14表达量的检测筛选出细胞增殖能力最强，最能促进E-KCS生长的细胞外基质，且方法简便，易行，十分具有实用价值。本发明进一步优化了胚胎干细胞向角化细胞诱导分化的培养体系，为体外构建口腔黏膜组织提供高活力高纯度的胚胎干细胞源性角化细胞打下了基础，对胚胎干细胞向角化细胞诱导分化及体外构建口腔黏膜组织的研究具有重要意义。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (7)

1.一种人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：使用至少一种诱导剂对人胚胎干细胞进行定向诱导，得到诱导分化成的角化细胞；

步骤(2)：将所述的角化细胞分组接种于至少一种细胞外基质包被的培养皿中培养，得到分组培养后的角化细胞组；

步骤(3)：观察所述的角化细胞组的生长情况，检测其增殖能力、CK14的表达量并测定其灰度值，筛选出增值能力最强、表达量和灰度值最好的角化细胞组，并得出该角化细胞组采用的细胞外基质。

2.根据权利要求1所述的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，其特征在于，所述的诱导剂为维甲酸、骨形成蛋白、抗坏血酸中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，其特征在于，所述的细胞外基质为Matrigel、明胶、I型胶原、IV型胶原中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，通过CCK8法检测细胞的增殖能力。

5.根据权利要求1所述的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，通过WesternBlot检测CK14表达量。

6.根据权利要求1所述的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，其特征在于，步骤(3)，中，通过倒置显微镜观察细胞生长情况。

7.根据权利要求1所述的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的细胞外基质筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，还设有无包被培养皿作为空白对照组。