CN109342153A - 一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，包括以下步骤：(1)悬液制备：取水牛睾丸剪成碎块，进行两步消化后使用移液器吹成单个细胞再重悬过滤；(2)细胞纯化：将悬液接种在培养皿中培养，收集悬浮及贴壁不牢的细胞，进行两次培养后收集贴壁细胞得到纯化后的样细胞；(3)细胞固定：使用组织固定液将细胞固定，以5μl/滴的量滴在载玻片涂抹开并烘干；(4)孵育：用免疫组化笔将样本圈住，对细胞质或细胞核中的基因进行定位透膜，分别用一抗二抗孵育清洗；(5)染色：在免疫组化圈内滴加染色剂，盖上盖玻片用指甲油封片保存。本发明提供了提供一种易于操作，染色效果好的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法。

Description

一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法
技术领域
本发明涉及干细胞与组织技术领域，特别涉及一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法。
背景技术
精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是形成精子的前体细胞，在雄性哺乳动物体内，精原干细胞的增殖、分化为精子的发生提供着源源不断的动力，同时也保证了遗传物质在亲子代之间的有效传递([1]Kanatsu-Shinohara et al.,2013)。自1994年成功开展精原干细胞移植技术以来([2]Brinster et al.,1994)，精原干细胞的研究成为了一个热点，且近年来又成功建立了精原干细胞的体外培养方法([3]Shinohara et al.,2003)。2011年，Shinohara等人又在体外成功开展了小鼠的无血清无饲养层的培养体系([4]Shinohara et al.,2011)，使小鼠的精原干细胞的体外培养迈上新台阶。水牛作为华南地区的特有物种，以传统役用为主，其产奶、产肉等生产性能较低，已难以满足当前人们对畜牧产品的需求。因此，若能将水牛SSCs在体外分离纯化并成功进行的体外培养，再结合移植技术和相应的遗传育种技术，将能够得到大规模的优良水牛品系。由于确定某种细胞是否为起始于干细胞十分困难，因此将这种具有水牛精原干细胞属性的细胞称为水牛精原干细胞样细胞。
水牛睾丸中有生精小管、睾丸间质、直精小管和睾丸网，要进行精原干细胞的体外培养首先要将精原干细胞分离出来，而分离效果的确认需要借助细胞染色进行观察，因此，需要寻找一个高效可行的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种易于操作，染色效果好的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，且该方法操作简便可行，易于实现。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)悬液制备：取水牛睾丸剪成碎块，加入依次一步消化液进行一步消化，消化完成后重悬滤去上层清液，再加入二步消化液进行消化，再次重悬滤去上层清液，得到底层重悬液的精细小管内部精原干细胞释放出来，使用移液器吹成单个细胞，使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管离心后，再使用培养液进行重悬后使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液；
(2)细胞纯化：将步骤(1)中获得的水牛睾丸单细胞悬液接种在铺有明胶的培养皿中，使用培养液过夜培养，收集悬浮及贴壁不牢的细胞，将其转移至铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中，进行一次培养收集上清细胞，转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中进行二次培养后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的水牛精原干细胞样细胞；
(3)细胞固定：将步骤(2)中的到的水牛精原干细胞样细胞使用组织固定液固定，将固定好的精原干细胞样细胞以5μl/滴的量滴在洁净的载玻片上并涂抹开，置于烘箱中烘干；
(4)孵育：在步骤(3)中做好的载玻片中用免疫组化笔将样本圈住，使用TritonX-100-PBS透膜对细胞质或细胞核中的基因进行定位通透，使用马血清封闭0.5～2h后，先用一抗孵育，清洗，在进行二抗孵育和清洗，得到孵育完成的样本；
(5)染色：在免疫组化圈内滴加含有抗荧光淬灭剂的染色剂，盖上盖玻片并用指甲油封片保存。
进一步地，所述一步消化液为质量比1～3％的胶原酶和质量比0.001～0.005％的DNase I酶，所述消化时间为5～15min，所述二步消化液为0.1～0.4％的trypsin-EDTA和0.003～0.007％的DNase I酶，所述血清为胎牛血清FBS和血清替代物KSR中任意一种或两种的混合物，所述血清的添加量为IMDM的10％。
进一步地，所述培养液包括以下体积份数的原料：78～88份IMDM基础培养液、6～13份血清替代物KSR、0.1～0.3份胎球蛋白Fetuin、0.01～0.03份非必需氨基酸NEAA、0.01～0.03份脂质混合物Lipid mixture 1,Chemically Defined、0.01～0.06份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.01～0.05ng/ml GDNF、0.05～0.2ug/ml GFRα1、0.01～0.07ng/ml bFGF、0.01～0.07U/ml Lif和10-5～10-3nM/Lβ-ME。
进一步地，在步骤(2)中，所述培养箱的温度为37℃，所述过夜培养的时间为16～24h，所述一次培养为放置37℃培养箱中培养4～6h，所述二次培养为放置37℃培养箱中培养30～50min。
进一步地，在步骤(3)中，所述组织固定液为4％多聚甲醛溶液、Bouin氏固定液或10％福尔马林固定液中的任意一种，所述组织固定液固定的时间为10～20min，所述烘箱的烘干温度为37℃。
进一步地，在步骤(4)中，所述Triton X-100-PBS透膜的含量为0.2％，所述定位通透的时间为5～10min，所述马血清的含量为6％，所述清洗是使用PBS++洗3～5次，每次清洗3～10min。
进一步地，所述染色剂为DAPI或PI。
进一步地，所述封片保存的时间为2～5个月，保存条件为常温避光。
综上所述，由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
本发明中先是制备好悬浮液后在进行水牛精原干细胞样细胞的纯化，纯化方法简单易操作，使用Triton X-100-PBS透膜对细胞质和细胞核的基因进行定位通透，使抗体更容易进入细胞膜进行染色，进行一抗二抗孵育之后使用含有钙离子、镁离子的PBS++进行清洗，可防止细胞脱落，细胞粘附力增加，在不影响干细胞样细胞数量的前提下进行染色，易于观察样本中干细胞样细胞的数量，后面使用指甲油封片可增加保存时间，使用本发明的步骤进行的染色效果清晰，易于辨认区分，能够清晰数出细胞数量，且能够确定抗体及阳性细胞的位置，对于细胞工程的研究具有重大意义。
附图说明
图1是DDX4抗体的免疫荧光染色图；
其中：图1-a为DAPI对细胞核的染色图，
图1-b为使用DDX4的特异性抗体Goat anti Rabbit对DDX4阳性细胞的染色图，
图1-c为图1-a和图1-b的合成图。
图2是PGP9.5抗体的免疫荧光染色图；
其中：
图2-a为DAPI对细胞核的染色图，
图2-b为使用PGP9.5的特异性抗体488Goat anti Rabbit对PGP9.5阳性细胞的染色，
图2-c为图2-a和图2-b的合成图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
实施例1
一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，包括以下步骤：
(1)悬液制备：取水牛睾丸剪成碎块，加入质量比1％的胶原酶和质量比0.001％的DNase I酶消化5min，消化完成后重悬滤去上层清液，再加入0.1％的trypsin-EDTA和0.003％的DNase I酶进行消化5min，再次重悬滤去上层清液，得到底层重悬液的精细小管内部精原干细胞释放出来，使用移液器吹成单个细胞，使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管离心后，再使用培养液进行重悬后使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液；血清为胎牛血清FBS和血清替代物KSR中任意一种或两种的混合物，所述血清的添加量为IMDM的10％。
培养液包括以下体积份数的原料：78份IMDM基础培养液、6份血清替代物KSR、0.1份胎球蛋白Fetuin、0.01份非必需氨基酸NEAA、0.01份脂质混合物Lipid mixture 1,Chemically Defined、0.01份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.01ng/ml GDNF、0.05ug/ml GFRα1、0.01ng/ml bFGF、0.01U/ml Lif和10-5nM/Lβ-ME。
(2)细胞纯化：将步骤(1)中获得的水牛睾丸单细胞悬液接种在铺有明胶的培养皿中，使用培养液过夜培养16h，收集悬浮及贴壁不牢的细胞，将其转移至铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中，放置37℃培养箱中培养4h收集上清细胞，转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，二次培养为放置37℃培养箱中培养30min后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的水牛精原干细胞样细胞；
(3)细胞固定：将步骤(2)中的到的水牛精原干细胞样细胞使用组织固定液固定，将固定好的精原干细胞样细胞以5μl/滴的量滴在洁净的载玻片上并涂抹开，置于烘箱中烘干，组织固定液为4％多聚甲醛溶液组织固定液固定的时间为10min，烘箱的烘干温度为37℃。
(4)孵育：在步骤(3)中做好的载玻片中用免疫组化笔将样本圈住，使用0.2％的Triton X-100-PBS透膜对细胞质或细胞核中的基因进行定位通透，5min后使用6％马血清封闭0.5h后，先用一抗孵育，使用PBS++洗3次，每次清洗3min，再进行二抗孵育，使用PBS++洗3次，每次清洗3min，得到孵育完成的样本；
(5)染色：在免疫组化圈内滴加含有抗荧光淬灭剂的DAPI，盖上盖玻片并用指甲油封片保存，封片保存的时间为2个月，保存条件为常温避光。
实施例2
一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，包括以下步骤：
(1)悬液制备：取水牛睾丸剪成碎块，加入质量比3％的胶原酶和质量比0.005％的DNase I酶消化15min，消化完成后重悬滤去上层清液，再加入0.4％的trypsin-EDTA和0.007％的DNase I酶进行消化15min，再次重悬滤去上层清液，得到底层重悬液的精细小管内部精原干细胞释放出来，使用移液器吹成单个细胞，使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管离心后，再使用培养液进行重悬后使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液；血清为和血清替代物KSR中任意一种或两种的混合物，所述血清的添加量为IMDM的10％。
培养液包括以下体积份数的原料：88份IMDM基础培养液、13份血清替代物KSR、0.3份胎球蛋白Fetuin、0.03份非必需氨基酸NEAA、0.03份脂质混合物Lipid mixture 1,Chemically Defined、0.06份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.05ng/ml GDNF、0.2ug/ml GFRα1、0.07ng/ml bFGF、0.07U/ml Lif和10-3nM/Lβ-ME。
(2)细胞纯化：将步骤(1)中获得的水牛睾丸单细胞悬液接种在铺有明胶的培养皿中，使用培养液过夜培养24h，收集悬浮及贴壁不牢的细胞，将其转移至铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中，放置37℃培养箱中培养6h收集上清细胞，转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，二次培养为放置37℃培养箱中培养50min后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的水牛精原干细胞样细胞；
(3)细胞固定：将步骤(2)中的到的水牛精原干细胞样细胞使用组织固定液固定，将固定好的精原干细胞样细胞以5μl/滴的量滴在洁净的载玻片上并涂抹开，置于烘箱中烘干，组织固定液为Bouin氏固定液，组织固定液固定的时间为20min，所述烘箱的烘干温度为37℃。
(4)孵育：在步骤(3)中做好的载玻片中用免疫组化笔将样本圈住，使用0.2％的TritonX-100-PBS透膜对细胞质或细胞核中的基因进行定位通透，10min后使用6％马血清封闭2h后，先用一抗孵育，使用PBS++洗5次，每次清洗10min，再进行二抗孵育，使用PBS++洗5次，每次清洗10min，得到孵育完成的样本；
(5)染色：在免疫组化圈内滴加含有抗荧光淬灭剂的DAPI，盖上盖玻片并用指甲油封片保存，封片保存的时间为5个月，保存条件为常温避光。
实施例3
一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，包括以下步骤：
(1)悬液制备：取水牛睾丸剪成碎块，加入质量比2％的胶原酶和质量比0.003％的DNase I酶消化10min，消化完成后重悬滤去上层清液，再加入0.2％的trypsin-EDTA和0.005％的DNase I酶进行消化10min，再次重悬滤去上层清液，得到底层重悬液的精细小管内部精原干细胞释放出来，使用移液器吹成单个细胞，使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管离心后，再使用培养液进行重悬后使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液；血清为胎牛血清FBS和血清替代物KSR中任意一种或两种的混合物，所述血清的添加量为IMDM的10％。
培养液包括以下体积份数的原料：84份IMDM基础培养液、10份血清替代物KSR、0.2份胎球蛋白Fetuin、0.02份非必需氨基酸NEAA、0.02份脂质混合物Lipid mixture 1,Chemically Defined、0.03份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.03ng/ml GDNF、0.15ug/ml GFRα1、0.04ng/ml bFGF、0.04U/ml Lif和10-5nM/Lβ-ME。
(2)细胞纯化：将步骤(1)中获得的水牛睾丸单细胞悬液接种在铺有明胶的培养皿中，使用培养液过夜培养20h，收集悬浮及贴壁不牢的细胞，将其转移至铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中，放置37℃培养箱中培养5h收集上清细胞，转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，二次培养为放置37℃培养箱中培养40min后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的水牛精原干细胞样细胞；
(3)细胞固定：将步骤(2)中的到的水牛精原干细胞样细胞使用组织固定液固定，将固定好的精原干细胞样细胞以5μl/滴的量滴在洁净的载玻片上并涂抹开，置于烘箱中烘干，组织固定液为10％福尔马林固定液，组织固定液固定的时间为15min，所述烘箱的烘干温度为37℃。
(4)孵育：在步骤(3)中做好的载玻片中用免疫组化笔将样本圈住，使用0.2％的TritonX-100-PBS透膜对细胞质或细胞核中的基因进行定位通透，8min后使用6％马血清封闭1.5h后，先用一抗孵育，使用PBS++洗4次，每次清洗6min，再进行二抗孵育，使用PBS++洗4次，每次清洗6min，得到孵育完成的样本；
(5)染色：在免疫组化圈内滴加含有抗荧光淬灭剂的DAPI，盖上盖玻片并用指甲油封片保存，封片保存的时间为3个月，保存条件为常温避光。
实施例1～实施例3中使用的一抗为DDX4(Abcam,ab13840,1:200)。
实施例4
在步骤(4)使用一抗为PGP9.5(Abd Serotec,7863-1004,1:200),其余实施与实施例1一致。
实施例5
在步骤(4)使用一抗为PGP9.5(Abd Serotec,7863-1004,1:200),其余实施与实施例2一致。
实施例6
在步骤(4)使用一抗为PGP9.5(Abd Serotec,7863-1004,1:200),其余实施与实施例3一致。
实施例1～实施例3中使用的是DDX4抗体对精原细胞中的DDX4抗原进行染色，这三个实施例中染色情况基本一致，如图1-a、图1-b和图1-c所示为实施例1的免疫荧光染色图。而实施例4～实施例6则是使用的是PGP9.5抗体对精原细胞中的PGP9.5抗原进行染色，这三个实施例中染色情况基本一致，如图2-a、图2-b和图2-c所示为实施例4的免疫荧光染色图。
如图1-a、图1-b和图1-c所示的DDX4抗体的免疫荧光染色图，其中图1-a是DAPI染的细胞核，可以看出样品中确实有细胞存在，且细胞核各个独立分离，显色清晰，能够清洗数出视野中的细胞个数，图1-b是使用DDX4的特异性抗体Goat anti Rabbit对DDX4阳性细胞的染色图，图中染色的均为DDX4阳性细胞，图1-c是图1-a和图1-b的合成图，做成合成图后可以更好的定位抗体以及阳性细胞的位置，其中图1-a中的染色为蓝光，图1-b中的染色为绿光。
如图2-a、图2-b和图2-c所示的PGP9.5抗体的免疫荧光染色图，其中图2-a是PGP9.5染的细胞核，可以看出样品中确实有细胞存在，且细胞核各个独立分离，显色清晰，能够清洗数出视野中的细胞个数，图2-b是使用PGP9.5的特异性抗体488Goat anti Rabbit对PGP9.5阳性细胞的染色图，图中染色的均为PGP9.5阳性细胞，图2-c是图2-a和图2-b的合成图，做成合成图后可以更好的定位抗体以及阳性细胞的位置，其中图2-a中的染色为蓝光，图2-b中的染色为绿光。
由以上实验可知，按照本发明的免疫荧光染色法对细胞的染色效果好，能够根据细胞核数量清晰地数出细胞数量，且容易确定抗体及阳性细胞的位置，对于干细胞与组织技术领域中的研究具有重大意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)悬液制备：取水牛睾丸剪成碎块，加入依次一步消化液进行一步消化，消化完成后重悬滤去上层清液，再加入二步消化液进行消化，再次重悬滤去上层清液，得到底层重悬液的精细小管内部精原干细胞释放出来，使用移液器吹成单个细胞，使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管离心后，再使用培养液进行重悬后使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液；
(2)细胞纯化：将步骤(1)中获得的水牛睾丸单细胞悬液接种在铺有明胶的培养皿中，使用培养液过夜培养，收集悬浮及贴壁不牢的细胞，将其转移至铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中，进行一次培养收集上清细胞，转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中进行二次培养后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的水牛精原干细胞样细胞；
(3)细胞固定：将步骤(2)中的到的水牛精原干细胞样细胞使用组织固定液固定，将固定好的精原干细胞样细胞以5μl/滴的量滴在洁净的载玻片上并涂抹开，置于烘箱中烘干；
(4)孵育：在步骤(3)中做好的载玻片中用免疫组化笔将样本圈住，使用TritonX-100-PBS透膜对细胞质或细胞核中的基因进行定位通透，使用马血清封闭0.5～2h后，先用一抗孵育，清洗，在进行二抗孵育和清洗，得到孵育完成的样本；
(5)染色：在免疫组化圈内滴加含有抗荧光淬灭剂的染色剂，盖上盖玻片并用指甲油封片保存。
2.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：所述一步消化液为质量比1～3％的胶原酶和质量比0.001～0.005％的DNase I酶，所述消化时间为5～15min，所述二步消化液为0.1～0.4％的trypsin-EDTA和0.003～0.007％的DNase I酶，所述血清为胎牛血清FBS和血清替代物KSR中任意一种或两种的混合物，所述血清的添加量为IMDM的10％。
3.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：所述培养液包括以下体积份数的原料：78～88份IMDM基础培养液、6～13份血清替代物KSR、0.1～0.3份胎球蛋白Fetuin、0.01～0.03份非必需氨基酸NEAA、0.01～0.03份脂质混合物Lipidmixture 1,Chemically Defined、0.01～0.06份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.01～0.05ng/ml GDNF、0.05～0.2ug/ml GFRα1、0.01～0.07ng/ml bFGF、0.01～0.07U/ml Lif和10-5～10-3nM/Lβ-ME。
4.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述培养箱的温度为37℃，所述过夜培养的时间为16～24h，所述一次培养为放置37℃培养箱中培养4～6h，所述二次培养为放置37℃培养箱中培养30～50min。
5.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述组织固定液为4％多聚甲醛溶液、Bouin氏固定液或10％福尔马林固定液中的任意一种，所述组织固定液固定的时间为10～20min，所述烘箱的烘干温度为37℃。
6.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述TritonX-100-PBS透膜的含量为0.2％，所述定位通透的时间为5～10min，所述马血清的含量为6％，所述清洗是使用PBS++洗3～5次，每次清洗3～10min。
7.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：所述染色剂为DAPI或PI。
8.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：所述封片保存的时间为2～5个月，保存条件为常温避光。
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