CN110484488B - 人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用 - Google Patents

人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110484488B
CN110484488B CN201910808332.5A CN201910808332A CN110484488B CN 110484488 B CN110484488 B CN 110484488B CN 201910808332 A CN201910808332 A CN 201910808332A CN 110484488 B CN110484488 B CN 110484488B
Authority
CN
China
Prior art keywords
white spot
cell
cells
epithelial cells
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910808332.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110484488A (zh
Inventor
周水洪
敖胤杰
鲍洋洋
钟江涛
陈哲
沈丽芳
喻而
余祺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine filed Critical First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Priority to CN201910808332.5A priority Critical patent/CN110484488B/zh
Publication of CN110484488A publication Critical patent/CN110484488A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110484488B publication Critical patent/CN110484488B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用。技术要点主要包括：白斑细胞原代培养；不定期检测细胞增殖；取培养至第三代或第四代的白斑细胞，制成细胞悬液；冰上操作，Matrigel基质胶中加入DMEM培养基制成稀释液，按照稀释液：细胞悬液为2：1的比例混合，得到新的细胞悬液，将新的细胞悬液按照每孔0.6ml加入至24孔板中；将24孔板转移至37℃细胞培养箱中培养12h后，各孔加入DMEM 1ml后继续培养1天即可。本发明在体外成功构建人白斑上皮细胞三维培养模型，构建方法简单，可操作性强，模型状态稳定。三维模型构建，成为二维细胞实验和在体细胞实验的桥梁。

Description

人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用。
背景技术
声带白斑是一种常见的喉癌前病变，研究表明声带白斑在不同阶段都可能发生癌变，目前喉癌前病变多以声带白斑作为研究对象。
国外学者Lewin首次报道胃食管反流导致喉正常上皮组织向白斑转化可能与喉异型增生及喉癌的发生相关。国内也有研究发现咽喉反流与早期喉癌及声带白斑相关。但胃食管反流引起声带白斑的真正机制尚不清楚，以声带白斑为代表的喉癌前病变的发生、进展机制及寻找早期癌变特异性标志物，是亟待解决的临床问题。这对预防喉癌前病变发生癌变具有重要意义。
常规细胞培养以细胞二维贴壁培养为主，二维状态下所培养细胞与正常在体细胞无论从形态学、功能学、细胞对外界刺激生理特性等方面都存在显著差异。细胞培养技术极大地限制了学者对声带白斑的研究的发展。
目前国内、国际学者尚无针对白斑细胞进行三维培养模型构建相关报道，白斑细胞培养均为二维培养模型，二维模型细胞均为贴壁生长，与细胞在体状态存在明显差异，因此二维状态下所培养细胞与正常在体细胞无论从功能学、细胞对外界刺激生理特性等方面均存在显著差异。
再者目前部分学者提出三维培养其他细胞所使用基质胶为自主配制，自主配制基质胶存在性能不稳定性，操作繁琐性，以及配制过程污染性较高等弊端，使得培养过程无法顺利进行。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用。
本发明是这样实现的，人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，包括以下步骤：
步骤1：白斑细胞原代培养，取组织块，分离上皮细胞，去除成纤维细胞；
步骤2：不定期检测细胞增殖；
步骤3：取培养至第三代或第四代的白斑细胞，消化后制成细胞悬液；
步骤4：冰上操作，Matrigel基质胶中加入DMEM培养基制成稀释液；
步骤5：冰上操作，按照稀释液：细胞悬液为2：1的比例混合，得到新的细胞悬液，将新的细胞悬液按照每孔0.6ml加入至24孔板中；
步骤6：将24孔板转移至37℃细胞培养箱中培养12h后，各孔加入DMEM 1ml后继续培养1天即可。
进一步，步骤1中，喉白斑组织块用无菌D-Hank’S液反复冲洗。
进一步，步骤1中，组织块用D-Hank’S液反复冲洗后，用2.4mg/ml DispaseII浸没组织块。
进一步，步骤1中，用酶消化法分离上皮细胞。
进一步，步骤1中，消化液为胰酶和EDTA的混合物，具体配制方法为，配制质量浓度为0.25％的胰酶和0.02％的EDTA，并按照体积比1：1配制无菌混合消化液。
进一步，步骤2中，用CCK-8检测细胞增殖。
进一步，步骤3中，消化细胞，计数后留取1×108个细胞制成细胞悬液。
进一步，步骤4中，按照1ml Matrigel基质胶中加入1ml DMEM培养基的比例制成稀释液。
如权利要求1-8任一所述的人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法在白斑细胞培养中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
相关学者报道利用Matrigel构建细胞三维模型一般为“二步法”：第一天将稀释后Matrigel放入温箱，第二天将细胞悬液滴于基质胶上，第三天模型方可构建完成。
而就白斑细胞而言，其增殖速度较快，细胞爬满10cm培养皿后，消化并取细胞悬液1/4进行传代，其完全再次爬满培养皿仅需2天，之后局部细胞由于过度增殖而失去典型铺路石外观，局部细胞漂浮于培养皿中。传代后第1天，细胞即可增殖至占培养皿70％左右，且形态较好。所以取传代后第1天白斑细胞进行三维培养为最理想实验模型。
另外，目前由于基质胶成本较高，三维模型建立均在24孔板中完成，相较于空间较大之培养皿而言，快速增殖的白斑细胞在相对狭小空间内，其传代时间将近一步缩短；加之基质胶的化学成分多对细胞增殖有促进作用。
所以为了能在白斑细胞出现过度增殖前完成三维模型建立，必须将模型建立时间缩短，步骤简化。
传统方法构建三维白斑模型，往往在模型还未构建完成时，白斑细胞已过度增殖，而失去典型外形状态或是局部以表现凋亡、衰老状态，从而影响模型建立的最终效果。
本发明针对白斑细胞生长周期特殊性，提出一次性三维白斑模型构建，传代次日模型即可构建完成，有助于后续实验顺利进行，且使得其实验结果对临床工作有最优化的指导意义。
本技术优点在于：在体外成功构建人白斑上皮细胞三维培养模型，构建方法简单，可操作性强，模型状态稳定。三维模型构建，成为二维细胞实验和在体细胞实验的桥梁。
就本专利而言，白斑细胞三维培养模型的构建，通过模拟细胞在体状态，在针对白斑细胞进行药物筛选，免疫应答，放射敏感性等研究方面，与白板细胞二维培养相比，能更好的对实际临床工作提供指导。
本实验使用BD公司Matrigel基质胶作为三维培养支架，该支架成胶性能稳定，操作简便，有利于模型构建的完成与推广。本实验首次提出一次性成胶三维模型构建方法，简化了实验操作步骤。
附图说明
图1是实施例1中细胞形态观察结果；
图2是实施例2中细胞增殖检测结果；
图3是实施例3中细胞培养结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用，具体如下各实施例所示。
实施例1白斑细胞原代培养组织处理：
1.将临床取材的适宜大小组织块放入DMEM/F12培养基中，待冰冻病理确认后(喉白斑组织大部分送快速冰冻)，冰袋运输至实验室，6-24h需进行细胞分离。
2.用D-Hank’S液反复冲洗3-4遍后，置于无菌小瓶中，滴加2.4mg/ml DispaseII以没过组织块为准。
3.将消化后的组织块取出，用眼科镊分别夹住标本的上皮侧和结缔组织侧，轻轻用力可将上皮和皮下组织分离，用D-Hank’S液冲洗上皮片2-3遍。
酶消化法分离上皮细胞：
1.配制质量浓度为0.25％的胰酶和0.02％的EDTA，并按照体积比1：1配制无菌混合消化液，放入培养箱进行预温。
2.将上皮组织剪成小片之后，将上述预热到37℃的无菌混合消化液倒入组织片中，放入37℃培养箱消化15-20min。
3.离心(1000rpm/min，5min)，弃去上清，然后用Hank’S洗2-3遍，重复离心弃上清。
4.用全培养基将细胞悬浮，100目筛网过滤细胞，然后计数，按照5*105个细胞接种到25cm2一次性培养瓶中，培养液体积大概5ml，瓶盖旋松，放入37℃，5％CO2培养箱进行培养。
5.成纤维细胞的去除，成纤维细胞较上皮细胞贴壁速度快，大概1h后会出现贴壁，通过差速贴壁法去除成纤维细胞。
6.每隔2天，培养基用移液枪吸出一半体积，然后放入同等体积的新鲜全培养基，并观察细胞贴壁情况以及细胞状态。
结果：
细胞形态学：挑选第三代白斑细胞进行观察，在培养第1、2天拍照，如图1所示，白斑细胞梭形，呈铺路石外观。3-5代增殖能力较强，7-8代增殖能力明显减弱，凋亡细胞数量逐渐增多。
实施例2 CCK-8检测细胞增殖
1.细胞培养所需时间后，每孔加入50μL CCK-8，37℃培养4h。
2.取100μL细胞悬液转移到96孔板中。
3.酶标仪测定各孔吸光值OD 450。elisa reader细胞免疫荧光检测波形蛋白、CEA表达：
1)培养时间到后，吸弃培养上清，加PBS清洗两次；
2)4％多聚甲醛固定各实验组细胞4℃过夜，PBS清洗3次，各5min；
3)0.5％TritonX-100(PBS配制)孵育1次10min，PBS清洗1次，各5min；
4. 1％BSA封闭30min，配制一抗稀释液(1:50)，4℃过夜；
5.PBS清洗3次各5min，配制二抗稀释液(1:400)，37℃孵育2h；
6.PBS清洗3次各5min，DAPI染核3分钟，PBS洗3次；
7. 50％甘油封片，激光共聚焦显微镜拍照。
拍照结果如图2所示，结果显示：细胞增殖能力好，并有一定迁移能力。
实施例3白斑细胞三维培养
1.取培养至第三代或第四代细胞，观察细胞形态良好，消化细胞，计数后留取1×108个细胞制成细胞悬液。
2.Matrigel常规-20℃保存，于实验前一天放置4℃冰箱解冻，取1ml Matrigel至于冰上备用。
3. 1ml Matrigel中加入1ml DMEM培养基稀释至2ml，按稀释液：细胞悬液为2:1将2ml稀释液与1ml细胞悬液制成新细胞悬液，之后按每孔0.6ml将新制成细胞悬液加入24孔板，上述过程全程在冰上进行，将24孔板转移至37℃细胞培养箱中培养12小时后，各孔加入DMEM 1ml后继续放入培养箱培养。以后每天更换上层液态培养基，并显微镜观察细胞生长状态。
结果：第一天观察细胞可见局部细胞成球形细胞团生长，细胞团占据70％左右视野，细胞分层分布，主要分布于基质胶与培养基交界平面。第二天观察可见细胞满视野，细胞球较前无明显变化，局部细胞由于过度增殖而形态较前有所改变。取培养第一天白斑细胞分别于10倍，20倍，40倍镜下图片，如图3所示。结果证实，白斑细胞三维培养模型成功建立。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：白斑细胞原代培养，取组织块，分离上皮细胞，去除成纤维细胞；用酶消化法分离上皮细胞；消化液为胰酶和EDTA的混合物，具体配制方法为，配制质量浓度为0.25％的胰酶和0.02％的EDTA，并按照体积比1：1配制无菌混合消化液；
步骤2：不定期检测细胞增殖；
步骤3：取培养至第三代或第四代的白斑细胞，消化细胞，计数后留取1×108个细胞制成细胞悬液；
步骤4：冰上操作，Matrigel基质胶中加入DMEM培养基制成稀释液，按照1ml Matrigel基质胶中加入1ml DMEM培养基的比例制成稀释液；
步骤5：冰上操作，按照稀释液：细胞悬液为2：1的比例混合，得到新的细胞悬液，将新的细胞悬液按照每孔0.6ml加入至24孔板中；
步骤6：将24孔板转移至37℃细胞培养箱中培养12h后，各孔加入DMEM1ml后继续培养1天即可。
2.根据权利要求1所述的人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，其特征在于：步骤1中，喉白斑组织块用无菌D-Hank’S液反复冲洗。
3.根据权利要求2所述的人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，其特征在于：步骤1中，组织块用D-Hank’S液反复冲洗后，用2.4mg/ml DispaseII浸没组织块。
4.根据权利要求1所述的人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，其特征在于：步骤2中，用CCK-8检测细胞增殖。
5.如权利要求1-4任一所述的人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法在白斑细胞培养中的应用。
CN201910808332.5A 2019-08-29 2019-08-29 人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用 Active CN110484488B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910808332.5A CN110484488B (zh) 2019-08-29 2019-08-29 人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910808332.5A CN110484488B (zh) 2019-08-29 2019-08-29 人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110484488A CN110484488A (zh) 2019-11-22
CN110484488B true CN110484488B (zh) 2022-04-01

Family

ID=68555031

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910808332.5A Active CN110484488B (zh) 2019-08-29 2019-08-29 人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110484488B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111084905A (zh) * 2019-12-10 2020-05-01 肖雁冰 利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6471958B2 (en) * 1998-03-24 2002-10-29 University Of North Texas Health Science Center Non-contracting tissue equivalent
CN102433296A (zh) * 2011-12-13 2012-05-02 广州医学院第一附属医院 一种人气道上皮细胞的培养方法
CN104694460A (zh) * 2015-02-13 2015-06-10 武汉大学深圳研究院 人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、培养方法、正常上皮细胞及其应用
CN106754753B (zh) * 2017-01-13 2020-01-31 中国科学院近代物理研究所 病毒培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110484488A (zh) 2019-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104263697B (zh) 一种诱导培养基及诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法
CN104450611B (zh) 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法
CN108070561A (zh) 一种人原代结肠癌细胞的分离及培养方法
CN104480062A (zh) 一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法
CN105505860B (zh) 一种食管上皮干细胞的分离培养方法
CN107475179A (zh) 一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法
CN108018258A (zh) 一种原代人食管上皮细胞的分离及培养方法
CN108795850A (zh) 一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法
CN110484488B (zh) 人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用
CN113667645B (zh) 一种犬乳腺癌细胞系、其建立方法及应用
CN110079501A (zh) 小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法
CN108070560A (zh) 一种人原代胃癌细胞的分离及培养方法
CN108823154A (zh) 一种脂肪干细胞的无血清培养基及其制备方法
CN107320785A (zh) 一种在猪小肠粘膜下层胶原蛋白膜上培养软骨细胞的方法
CN117025505A (zh) 胃粘膜上皮前体样细胞及其制备方法和应用
CN105861426A (zh) 一种口腔黏膜上皮干细胞的分离培养方法
CN105755098A (zh) 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法
CN105664258A (zh) 基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法
CN109402175A (zh) 表达趋化因子受体ccr2b的脂肪干细胞及制备方法与应用
CN113265441B (zh) 三明治夹层培养体系用于检测类器官对大分子药物敏感性的方法
CN109342153A (zh) 一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法
CN110387351A (zh) 一种人视网膜Muller细胞的分离及培养方法
CN109762787A (zh) 一种原代人肾癌细胞的分离及培养方法
CN109423475A (zh) 一种小鼠骨骼肌卫星细胞的分离及培养方法
CN111593016A (zh) 一种人肾上皮细胞分离与培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant