CN102250835A - 一种利用脐带来源间充质干细胞培养人胚胎干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了脐带来源间充质干细胞的应用和人胚胎干细胞的培养方法。本发明所提供的增殖培养人胚胎干细胞的方法，包括如下步骤：用离体的人脐带间充质干细胞作为饲养层，对离体的人胚胎干细胞进行增殖培养，得到增殖的人胚胎干细胞。本发明证实了人脐带间充质干细胞是维持人胚胎干细胞未分化生长状态的理想人源性饲养层来源细胞，对解决人胚胎干细胞应用于临床时所面临的问题提供了新的思路。

Description

一种利用脐带来源间充质干细胞培养人胚胎干细胞的方法

技术领域

本发明涉及脐带来源间充质干细胞的应用和人胚胎干细胞的培养方法。

背景技术

人来源干细胞是指人个体生长发育中具有自我更新、增殖和多向分化潜能的细胞群体，分为胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)、成体干细胞，以及近几年逐渐发展起来的通过转基因技术使成体皮肤成纤维细胞转成具有多分化潜能的诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS)。

hESCs首先从人囊胚的内细胞团(inner cell mass，ICM)中分离得到，其最主要的特性是：(1)高度的自我复制能力，在体外具有接近无限的增殖能力；(2)发育的全能性，ES细胞能够分化为完整个体的所有组织细胞，为细胞治疗和其他应用提供充足的细胞来源；(3)遗传的可操作性，可以对hESCs进行相关的基因改造，使其可以用于治疗因特定基因改变引起的相关疾病或者用于研究疾病的发病机制。这些特性使得人胚胎干细胞成为近年来的研究热点，为再生医学和细胞移植治疗的发展带来无限的发展契机。

但对于hESCs而言，最初的hESCs系是以小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblast cell，MEF)为饲养层进行建立起来的，由于培养体系必需的饲养层问题以及培养体系的动物源性成分问题，都使得细胞的临床研究以及以后的应用面对很多困难。现在的诸多努力就是要剔除hESCs培养中鼠源性因素，以满足临床的需要

人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)是间充质干细胞的一种，从脐带华通氏胶中分离获得，它具有一般间充质干细胞的特性，比如自我更新、增殖和多向分化潜能等。间充质干细胞一般会随着年龄的增长而发生增殖能力和分化能力的降低，而HUCMSCs属于干细胞效价早期的间充质干细胞，增殖能力和分化能力比较强、免疫原性极低，是一种很有应用前景的干细胞。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种增殖培养人胚胎干细胞的方法。

本发明所提供的增殖培养人胚胎干细胞的方法，包括如下步骤：用离体的人脐带间充质干细胞作为饲养层，对离体的人胚胎干细胞进行增殖培养，得到增殖的人胚胎干细胞。

上述方法中，所述离体的人脐带间充质干细胞是经过增殖抑制处理的。

上述任一所述方法中，所述增殖抑制处理的方法如下：将所述离体的人脐带间充质干细胞接种于含有丝裂霉素C的人脐带间充质干细胞培养基中，培养2h45min～3h15min；所述含有丝裂霉素C的人脐带间充质干细胞培养基中丝裂霉素C的浓度为10～12μg/ml。

上述任一所述方法中，所述离体的人脐带间充质干细胞为处于对数生长期的细胞。

上述任一所述方法中，所述饲养层按照如下方法制备：按每100mm皿7×10⁵～8×10⁵个细胞的接种量将所述人脐带间充质干细胞接种于明胶包被过的细胞培养皿中，培养，得到饲养层细胞。

上述任一所述方法中，所述增殖培养中包括传代培养的步骤。

上述任一所述方法中，所述传代培养的代数至少为30代。

人脐带间充质干细胞在增殖培养人胚胎干细胞中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明以从脐带中分离培养获得的HUCMSCs作为人胚胎干细胞的饲养层细胞，成功实现了人胚胎干细胞的未分化生长。经定性鉴定，人胚胎干细胞的各项多能性指标与以小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层的人胚胎干细胞相似。人脐带间充质干细胞经丝裂霉素C处理后，可以作为人胚胎干细胞培养的饲养层，能够维持人胚胎干细胞的未分化生长，并且保持核型的稳定性。

我们将HUCMSCs用丝裂霉素C处理，抑制其有丝分裂的活性，作为本实验中的人源性饲养层。实验结果表明，hESCs在这种人源性饲养层上培养30代后，仍然保持了与在MEF上培养时的典型克隆形态，细胞之间界限清楚，折光性好，细胞核大，核质比高；免疫荧光染色显示人胚胎干细胞多能性相关基因OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81表达阳性、而分化时表达的基因SSEA1为阴性；碱性磷酸酶染色为阳性；hESCs在这种人源性饲养层上保持了核型的稳定性；hESCs体外悬浮培养可以形成拟胚体，将拟胚体贴壁培养后可以向三胚层分化。这些都证实了本发明所采用的HUCMSCs可以维持hESCs的未分化生长状态。

与以往的人源性饲养层相比，本发明所采用HUCMSCs作为饲养层具有如下优势：

(1)材料来源方面。经孕妇本人及家属知情同意后，我们可以在无菌条件下获取新生儿的脐带，由于每年出生人口数量庞大，脐带的获取相对其他人源性材料的获得，具有量上的巨大优势。

(2)安全性方面。胎儿娩出后，将脐带从母体与胎儿之间分离是常规的临床无菌操作，操作过程的并发症和风险很小。

(3)医学伦理方面。脐带的获得不需要破坏母体和新生儿的正常结构和功能，因而也医学伦理方面的争议很少。就目前的文献方面的报道来看，现在普遍认为经过孕妇及家属知情同意后，获取脐带进行科学研究不存在伦理问题。

(4)扩增能力和生存周期方面。从脐带中分离获得的间充质干细胞具有较强的体外扩增能力和较长的生存周期。HUCMSCs在体外培养过程中约4d便可传代一次，可体外扩增20多代不发生明显的衰老。我们使用不同代数(P3～P15)的HUCMSCs作为饲养层细胞，经过对人胚胎干细胞的形态学观察和多能性基因鉴定，我们未发现这一差异对培养的人胚胎干细胞的生长有明显影响。

(5)免疫原性方面。本发明所采用的HUCMSCs具有很低的免疫原性，动物在体实验表明机体未产生对HUCMSCs的排斥反应，更加有意义的是我们可以建立大样本的人脐带间充质干细胞库，从而可以选择与宿主HLA表型最接近的人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞，从而最大程度的减少由于饲养层细胞导致的免疫排斥。这对于将人胚胎干细胞应用于临床具有非常重要的意义。

总而言之，本发明证实了人脐带间充质干细胞是维持人胚胎干细胞未分化生长状态的理想人源性饲养层来源细胞，对解决人胚胎干细胞应用于临床时所面临的问题提供了新的思路。

附图说明

图1为小鼠胚胎成纤维细胞(倒置显微镜下)形态特征Bar＝50μm。

A：小鼠胚胎成纤维细胞原代培养第2天；B：小鼠胚胎成纤维细胞第3代。

图2为人脐带间充质干细胞(倒置显微镜下)形态特征Bar＝50μm。

图3为人脐带间充质干细胞成骨诱导和成脂诱导染色Bar＝50μm。

A：碱性磷酸酶染色显示阳性B：油红O法染色显示阳性。

图4为流式细胞仪检测人脐带间充质干细胞的表面标志。

图5为倒置显微镜下鼠源性和人源性饲养层的形态和密度观察，Bar＝50μm。

A：MEF饲养层B：HUCMSCs饲养层。

图6为生长在人源性和鼠源性饲养层上的人胚胎干细胞(倒置显微镜下)的形态特征Bar＝50μm。

A：生长在MEF饲养层上的hESC_sB生长在HUMSC_s饲养层上的hESC_s。

图7为MEF饲养层和HUCMSCs饲养层上的hESCs碱性磷酸酶染色Bar＝50μm。

A：HUMSCs饲养层上的hESCs碱性磷酸酶染色

B：MEF饲养层上的hESCs碱性磷酸酶染色。

图8为以HUCMSCs为饲养层的多能性相关基因的表达Bar＝50μm。A：以HUCMSCs为饲养层；B：以MEF为饲养层。

图9为hESCs核型鉴定结果。A：以MEF为饲养层的hESCs核型鉴定；B：以HUCMSCs为饲养层的hESCs核型鉴定。

图10为人胚胎干细胞体外分化形成拟胚体能力检测Bar＝50μm。

A、B：早期拟胚体形态C、D：成熟的拟胚体形态。

图11为人胚胎干细胞形成的拟胚体在体外分化形成三胚层的能力检测Bar＝50μm。

A：以HUCMSCs为饲养层；B：以MEF为饲养层。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中使用的材料如下：

1.细胞株

人脐带间充质干细胞(HUCMSCs细胞)：按照现有方法制备得到。

MEF细胞：按照现有方法制备得到。

人胚胎干细胞系(即hESCs)：NIH人胚胎干细胞登记署登记号为WA01，简称H1人胚胎干细胞系，核型为46XY。购自WiCell Research Institute，产品目录号为WA01。

2.实验动物

本实验所采用的实验动物是清洁级孕12.5～13.5d的ICR小鼠(MEF的来源)【SYXK(京)2006-0025】，购自北京大学医学部实验动物部。

3.主要药品及试剂

4.主要实验用仪器设备

5、MEF细胞全培养基的配制

每次配制100ml，充分混匀，4℃冰箱中保存备用。

6、HUCMSCs细胞培养基的配制

配制100ml，充分混匀，4℃冰箱中保存备用。

7、hESCs细胞全培养基的配制

每次配制100ml，充分混匀，4℃冰箱中保存备用。

8、拟胚体(EBs)培养基的配制

每次配制100ml，充分混匀，4℃冰箱中保存备用。

9、细胞冻存液的配制

MEF细胞冻存液：MEF全培养基与DMSO按9∶1的比例配制而成。

hESCs细胞冻存液：SR与DMSO按9∶1的比例配制而成。

HUCMSCs细胞冻存液：HUCMSCs细胞全培养基与DMSO按9∶1的比例配制而成。

10、其他实验用液体配制

0.1％的明胶的配制：将0.1g明胶溶于100mlPBS中，高压灭菌后，置于4℃冰箱中保存。

bFGF的配制及分装：将50μg bFGF带包装离心后溶解于1ml Knockout DMEM中，浓度为50μg/ml。40μl/支分装，-20℃冰箱中保存。使用时取1支与培养液混合，工作浓度为10ng/mL。

丝裂霉素液配置：丝裂霉素10mg加入10mlDMEM中，按100μl或者200μl分装，避光保存于-20℃冰箱中。使用时取1支与培养液混合，工作浓度为10μg/mL。

实施例1、实验细胞的制备

一、人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)的原代培养、传代、冻存与复苏

1、HUCMSCs的原代培养

(1)无菌取健康(无传染病，血清学检查HBV，HCV，HIV和梅毒为阴性)剖腹产胎儿的离体脐带10cm，置于50ml离心管内，离心管预先放入无菌PBS；脐带的获取均经孕妇本人及家属知情同意。

(2)超净台内，用含有1×青霉素-链霉素的PBS充分冲洗脐带外表面，将血液充分洗掉，然后将脐带放入玻璃皿中进行操作；

(3)用组织剪将两根脐静脉及一根脐动脉小心剔除，并将剩余的脐带间质组织华尔通氏胶剪成1mm³大小的小组织块；

(4)将组织块收入离心管内加入PBS以1200rpm 10min离心2-3次进行清洗，使表面粘性物质尽可能洗净。

(5)将组织块放入离心管内，加入0.25％胶原酶IV，37℃条件下消化作用4小时；

(6)加入PBS至离心管内，1200rpm离心5min，吸弃上清，加入PBS再次以1200rpm离心数次，收集沉淀；

(7)培养基重悬细胞沉淀，根据细胞量接种至不同皿进行培养。将培养皿置于培养箱中培养。

2、HUCMSCs的传代培养

(1)倒置相差显微镜下观察，当HUCMSCs皿底达到70％融合时，将培养基倒掉，用PBS清洗2遍。

(2)加入1mL0.25％胰蛋白酶消化液，镜下观察，细胞间出现裂隙变圆，轻轻晃动培养皿细胞脱离皿底(时间一般少于一分钟)，立即加入等量的HUCMSCs细胞培养基终止消化，并用吸管反复轻柔吹打成单细胞悬液。

(3)将单细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm离心5分钟；

(4)弃上清，加入HUCMSCs细胞培养基重新悬浮细胞，按1∶4传代。置37℃，5.0％CO₂饱和培养箱中培养。

结果：采用胶原酶消化法分离得到的单个核细胞多于24h内开始贴壁，3d内大部分细胞贴壁，细胞呈梭形、多角形(图2A)，原代细胞约1周近80％融合，细胞呈梭形(图2B)。传代后的细胞生长速度明显加快，约4d可传代1次，传代次数可达到20代以上。传代后细胞纯度提高，形态较原代均一，以平行排列生长为主，或呈漩涡状生长(图2C)。图2中，A.原代培养第3天；B.原代培养第7天；C.第8代细胞。

3、HUCMSCs的冻存

(1)冻存液配方：90％培养基+10％DMSO。取汇合约80％-90％左右的细胞，按传代的方法，得到细胞悬液，1000rpm×5分钟离心，弃上清，重悬于40％培养基中；

(2)配液：将50％培养基+10％DMSO混匀放于15ml离心管中；

(3)将以上配好液体与细胞悬液混匀，分别加入到冻存管中一般100mm培养皿可冻存2管-3管，每管1ml，将冻存管放入程序性冻存盒内，置于-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮中保存。

4、HUCMSCs的复苏

(1)从液氮罐中用镊子夹出冻存管，核对标签。在38℃水浴中快速摇动，待残留小冰核时，快速用酒精棉球擦拭，放入超净台；

(2)离心管加入培养液，将冻存管内细胞轻吹并移至离心管中，混匀，1000rpm X5min离心；

(3)弃上清，添加适量新鲜培养基重悬细胞，转移至1个100mm细胞培养皿中，放入二氧化碳培养箱；

(4)24小时后，倒置显微镜下检查细胞生长状况、是否发生污染等，根据情况换液。

5、HUCMSCs的相关鉴定

5.1、HUCMSCs分化潜能的鉴定

采用成骨和成脂诱导作为鉴定HUCMSCs分化潜能的指标

5.1.1HUCMSCs的成骨诱导

(1)配制成骨诱导液：高糖DMEM-F12、10％FBS、地塞米松(10^-8mol/L)、β-磷酸甘油(10mmol/L)、抗坏血酸(50μg/mL)；

(2)P3代生长至60％融合时将基础培养液更换为成骨诱导液；

(3)每3d换液一次。诱导3周后，碱性磷酸酶染色鉴定，显微镜下观察拍照。

经成骨诱导后的HUCMSCs，由梭形逐渐变成立方形，且出现聚集倾向。诱导3周后，进行碱性磷酸酶染色，可见胞质被染成棕褐色，呈碱性磷酸酶染色阳性(图3A)。说明HUCMSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜能。

5.1.2HUCMSCs的成脂诱导

(1)配制成脂诱导液：DMEM/F12、10％FBS、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、100mmol/L吲哚美辛、10mg/L胰岛素。

(2)P3代生长至80％融合时将基础培养基更换为成脂诱导培养基；

(3)每3d换液一次。成脂诱导第14天，吸弃诱导培养液，PBS冲洗，4％多聚甲醛室温固定1h，70％异丙醇清洗，油红O工作液室温染色10min，70％异丙醇洗去多余染料，显微镜下观察拍照。

HUCMSCs成脂诱导分化的形态变化及油红O染色：经成脂诱导后的HUCMSCs，其形态由典型的长梭形逐变短、变宽，呈短宽梭形、椭圆形或圆形。诱导7d后，在光镜下可看见折光性很强的空泡，提示脂滴开始形成。随着诱导时间延长，胞质内的脂滴增多。诱导后的细胞经油红O染色，可见胞质中有大量被染成红色的脂滴(图3B)，说明HUCMSCs在体外具有向脂肪细胞分化的潜能。

5.2HUCMSCs的表面标志的鉴定

采用流式细胞术检测HUCMSCs的表面标志。

(1)取第3代细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，PBS洗涤3次，调整细胞至1×10⁶/mL，分为每管0.1mL。

(2)阴性对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE；其他管分别加入鼠抗人抗体CD38-PE、CD14-PE、CD133-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD90-PE、CD86-PE、CD34-FITC、CD45-FITC、HLA-DR-FITC、CD147-FITC、CD44-FITC、CD117-FITC、CD29-FITC；

(3)避光4℃孵育30min，PBS洗涤3次，流式固定液固定，流式细胞仪检测细胞表型分子阳性率。

经流式细胞术检测，HUCMSCs高表达黏附分子和基质细胞标记CD44、CD29，也高表达CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117。不表达造血干细胞标志CD14、CD34和CD45，也不表达HLA-DR、CD38、CD133(图4)。

我们用胶原酶消化法从脐带中获取HUCMSCs，经过相关鉴定，证实其具有间充质干细胞的各种特性。我们所获得的HUCMSCs贴壁培养呈梭形，增殖能力强，约4d可传代一次；流式细胞术检测，HUCMSCs高表达黏附分子和基质细胞标记CD44、CD29，也高表达CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117，不表达造血干细胞标志CD14、CD34和CD45，也不表达HLA-DR、CD38、CD133；在成骨和成脂诱导液的作用下可以向成骨细胞和脂肪细胞分化。这些结果与文献中报道的结果相一致。稳定和高效的获得人脐带间充质干细胞为我们后期培养人胚胎干细胞打下了基础。

二、hESCs的复苏与冻存

1、hESCs的复苏

(1)从液氮罐中取出装有hESCs的冻存麦管，快速置于37℃温水中晃动，使其融化；

(2)75％的酒精清洁冻存管口，将冻存细胞吸至预先加有10mLhESCs全培养基的离心管中，吹打混匀；

(3)1000rpm离心5分钟。弃上清，加入适量hESCs全培养基重悬细胞后，将其移至新鲜制备的饲养层(MEF或HUCMSCs)上，补足hESCs全培养基，置于37℃，5.0％CO₂饱和湿度温箱中培养。

(4)hESCs接种24小时完全贴壁后换液，每天换液一次。

2、hESCs的冻存(程序降温法)

(1)采用胶原酶IV将hESCs消化，吸管吹成小细胞团块，移入离心管中，1000rpm离心5min；

(2)用冻存液重悬细胞沉淀，装入麦管中。具体方法如下：一端安装1ml微量注射器先吸入约1.5cm的空白液，再吸入约2mm空气柱，然后吸入hESC悬液至麦管上方留约2cm高度，接着再吸入2mm空气柱，最后吸入空白液至吸不动为止，盖上麦管塞，于塞上做好标记。

(3)将麦管置于麦管架中，放入程序冷冻箱内，按照预设的程序进行冷冻。程序完毕后，迅速将麦管放入液氮中。

(4)启动冷冻程序：打开程序降温仪，设置降温程序，将装有细胞的麦管投入降温室，按下列程序进行降温：起始温度为21℃，由21℃到-6℃，每分钟降2.5℃，降至-6℃时植冰→停5min→-6℃到-30℃，每分钟降低0.3℃→-30℃到-150℃，每分钟降10℃→降至-150℃时取出麦管，投入液氮罐，做好登记。

三、MEF细胞的制备

3.1、MEF的原代培养

(1)取12.5-13.5d ICR孕鼠，断颈处死；

(2)将鼠腹面向上放置，75％酒精润湿、消毒腹部(防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫)，剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中；

(3)把平皿转入超净台；

(4)在解剖显微镜下，打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等)；

(5)将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次；

(6)弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色(1-4次)；

(7)加入适量Trypsin-EDTA，浓度为0.25％，体积约等于组织块体积；

(8)于37℃的水浴锅内消化10min×3次，每次消化后，将上清液用吸管吸出至离心管内，离心管内加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀；

(9)将细胞悬液管离心1000rpm×5min；

(10)弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10cm细胞培养皿，补加适量培养基，作好标记，转入培养箱培养；

(11)视细胞生长情况换液(一般3天换液一次)。

3.2、MEF的传代培养

(1)倒置相差显微镜下观察，当MEF在皿底达到80-90％融合时，将培养基倒掉，用PBS清洗2遍。

(2)加入1mL0.25％胰蛋白酶消化液，镜下观察，细胞间出现裂隙变圆，轻轻晃动培养皿细胞脱离皿底(时间一般少于一分钟)，立即加入等量的MEF培养基终止消化，并用吸管反复轻柔吹打成单细胞悬液。

(3)将单细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm离心5分钟

(4)弃上清，加入MEF全培养液重新悬浮细胞，按1∶2～3传代。置37℃，5.0％CO₂饱和培养箱中培养。

MEF细胞为贴壁生长型细胞，细胞呈长梭形或条带状，细胞质中央为卵圆形核，周边向外伸出纤维状伪足，细胞生长迅速，逐渐连成片层，3d左右需行传代。原代MEF细胞形态多样，有其他细胞混杂(图IA)，传代过程中杂细胞逐渐去除，呈典型的梭形或条带状(图1B)。6代以前细胞纯度较好，生长旺盛。第6代以后细胞生长缓慢，形态变异，出现明显粗颗粒区，呈衰老征象。

3.3、MEF的冻存

(1)冻存液配方：90％培养基+10％DMSO。取汇合约80％-90％左右的细胞，按传代的方法，得到细胞悬液，1000rpm X 5分钟离心，弃上清，重悬于40％培养基中

(2)配液：将50％培养基+10％DMSO混匀放于15ml离心管中

(3)将以上配好液体与细胞悬液混匀，分别加入到冻存管中一般100mm培养皿可冻存2管-3管，每管1ml，将冻存管放入程序性冻存盒内，置于-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮中保存。

3.4、MEF的复苏

(1)从液氮罐中用镊子夹出冻存管，核对标签。在38℃水浴中快速摇动，待残留小冰核时，快速用酒精棉球擦拭，放入超净台；

(2)离心管加入培养液，将冻存管内细胞轻吹并移至离心管中，混匀，1000rpm×5min离心；

(3)弃上清，添加适量新鲜培养基重悬细胞，转移至1个100mm细胞培养皿中，放入二氧化碳培养箱；

(4)24小时后，倒置显微镜下检查细胞生长状况、是否发生污染等，根据情况换液。

实施例2、增殖培养人胚胎干细胞

一、本发明方法增殖培养人胚胎干细胞

(一)HUCMSCs饲养层的制备

(1)取P3～P13的HUCMSCs，待其至对数生长期，倒掉培养基，加入含10μg/ml丝裂霉素C的培养基(即丝裂霉素C在培养基中的浓度为10μg/ml)，放入培养箱培养3小时；

(2)用0.1％明胶处理培养皿(将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后置于37℃半小时即可)，吸弃明胶，室温放置至皿底明胶干燥为止。

(3)弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2-3mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次(必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素C，丝裂霉素C是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性)；

(4)加入胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打成单细胞悬液。

(5)将单细胞悬液收于离心管内1000rpm 5min离心，收集细胞沉淀；

(6)间充质干细胞培养基重悬细胞沉淀，细胞计数，按每100mm皿7×10⁵个细胞的接种量接种于明胶包被过的细胞培养皿中，置于细胞培养箱中培养，得到Feeder细胞皿。接种hESCs以前，倒掉原来培养基，PBS轻洗两次，加入hESCs全培养基。

(二)hESCs的传代

将hESCs细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS洗一遍，加入1mg/ml胶原酶IV，37℃培养箱中孵育5min，当hESCs克隆明显变松散时，用吸管轻轻吹打细胞成几十个细胞的小细胞团，平均分到Feeder培养皿中，一般按1∶6～1∶8传代，补足hESCs全培养基，作好标记；前后左右水平晃动培养皿，使hESCs细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。每天换液一次。如此传代培养30代以上。

二、对照组

(一)MEF饲养层的制备

(1)选取1～3代的MEF，待其至对数生长期，倒掉培养基，加入含10μg/ml丝裂霉素C的培养基，放入培养箱培养3小时；

(2)用0.1％明胶处理培养皿(将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后置于37℃半小时即可)，吸弃明胶，室温放置至皿底明胶干燥为止。

(3)弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2-3mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次(必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素C，丝裂霉素C是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性)；

(4)加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打成单细胞悬液。

(5)将单细胞悬液收于离心管内1000rpm×5min离心；

(6)培养基重悬细胞沉淀，细胞计数，按每100mm皿1×10⁶细胞数接种于明胶包被过的皿内。置于细胞培养箱中培养。次日接种hESCs。

(二)hESCs的传代

将hESCs细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS洗一遍，加入1mg/ml胶原酶IV，37℃培养箱中孵育5min，当hESCs克隆明显变松散时，用吸管轻轻吹打细胞成几十个细胞的小细胞团，平均分到Feeder培养皿中，一般按1∶6～1∶8传代，补足培养基，作好标记；前后左右水平晃动培养皿，使hESCs/HiPS细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。每天换液一次。如此传代培养30代以上。

MEF和HUCMSCs经丝裂霉素C处理后，按照适宜的密度进行接种，第二天观察到的细胞的形态和细胞的疏密程度如图5。

hESCs在HUCMSCs饲养层上培养30代后，其形态(图6B)与以MEF为饲养层的hESCs(图6A)相似，依然呈圆形或椭圆形克隆性生长，并且保持未分化状态。细胞之间界限清楚，折光性好，细胞核大，核质比高。

实施例3、以HUCMSCs、MEF作为饲养层细胞的hESCs的相关鉴定

一、碱性磷酸酶(AKP)染色

碱性磷酸酶染色阳性是hESCs多能性的指标之一。使用Millipore碱性磷酸酶检测试剂盒对第30代的hESCs进行染色观察。具体步骤参照说明书进行。显微镜下观察照相。

经碱性磷酸酶染色鉴定，在HUCMSCs饲养层上的hESCs碱性磷酸酶染色(图7A)与以MEF为饲养层的hESCs碱性磷酸酶染色都为阳性(图7B)。

二、免疫荧光检测特异性抗原的表达

(1)将hESCs在HUCMSCs饲养层和MEF饲养层上培养30代后，消化取适量细胞接种于铺有饲养层细胞的24孔板内。

(2)3d后，4％多聚甲醛室温固定30min，PBS洗3次，每次5min；

(3)0.1％Triton-X 100室温处理3次，每次5min；

(4)PBS洗3次，每次5min；

(5)10％BSA37℃封闭抗原1h；

(6)分别加入按说明书比例稀释(1∶100)的小鼠抗人一抗OCT4、SSEA4、SSEA1、Tra-1-60、Tra-1-81、Nanog 4℃过夜；

(7)PBS洗3次，每次5min，分别加入荧光标记的羊抗鼠二抗(1∶200稀释)，37℃孵育45min；

(8)PBS洗3次，每次5min。加入细胞核染料DAPI，室温作用10min，PBS洗涤后荧光显微镜下观察照相。

经免疫荧光染色法分析，在HUCMSCs饲养层上生长30代的hESCs多能性相关基因Nanog、OCT4、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81呈阳性表达，hESCs分化时表达的基因SSEA1呈阴性表达(图8A)，与MEF饲养层上的hESCs染色结果相同(图8B)。这说明HUCMSCs饲养层具有维持hESCs多能性相关基因表达的作用。

三、hESCs/HiPS染色体核型鉴定

采用常规G带法：

(1)分别取处于对数增长期的，在两种饲养层上培养的第30代hESCs一皿，更换新鲜培养液10ml，加入5μg/ml的秋水仙素200μl(终浓度0.1μg/ml)培养2h，使细胞分裂终止于有丝分裂中期；

(2)弃含秋水仙素的培养液，0.05％胰酶室温下消化3-5min，加入含血清的培养液终止消化，用加样枪反复吹打制成细胞悬液，1000r/min离心5min；

(3)向细胞沉淀中加入4ml KCI(0.075mol/L)低渗液，吸管吹打均匀，37℃恒温水浴低渗处理5min；

(4)加入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)1ml，轻轻混匀，1500r/min离心I0min，弃上清，沉淀加入4ml固定液，轻轻吹打混匀，室温固定20min，1000r/min离心5min，固定重复一次，弃上清，沉淀加入1ml固定液悬浮；

(5)将细胞悬液滴至在0℃蒸馏水中浸泡过的干净载玻片上，吹散，空气晾干；65℃烤片2-4h，载玻片入0.02％胰酶消化液中消化8-10秒钟，37℃生理盐水终止消化，蒸馏水冲洗；Giemsa染色2-4min；自来水冲洗终止染色，晾干；显微镜下观察，Cytoktype5.0软件进行核型分析。

经多次传代后，第30代hESCs保持了正常的核型，为正常男性染色体核型(46，XY)，与H1细胞系的核型一致(图9)。即HUCMSCs饲养层培养体系与MEF饲养层培养体系一样可以维持了细胞核型的稳定性。

四、hESCs拟胚体(Embryonic Bodies，EBs)形成能力鉴定(即hESCs体外分化能力检测)

(1)取第30代对数生长期的hESCs一皿，1mg/mL的IV型胶原酶37℃下消化5min；

(2)吸弃胶原酶，PBS洗3次，除去残留的胶原酶，加入2～3mL的EBs培养基，用吸管轻轻吹打，使细胞从皿底脱离并分散成含几十个细胞的小团片。

(3)将细胞转移到低黏附性的六孔板中，每孔添加培养基补足至2mL，置于37℃5％CO₂环境的细胞培养箱中培养。

(4)隔日低速离心或自然沉降法更换培养液，每日观察细胞团大小、形态变化并拍照。

IV型胶原酶消化后的小片状hESCS种植到低黏附性的培养皿中悬浮培养，细胞很快自动聚集形成边缘不整、大小不等的球形或类球形细胞团，随着培养时间延长，细胞团逐渐增大，边缘整齐，细胞排列越发紧密，开始为实性(图10A、B)，5d时逐渐出现囊性变，7d后大部分为囊实相间的成熟的EBs(图10C、D)。

经多次传代后，第30代hESCs保持了正常的拟胚体形成能力，证实该培养体系没有影响hESCs的体外分化能力。即HUCMSCs饲养层培养体系与MEF饲养层培养体系一样可以维持hESCs的体外分化能力。

五、拟胚体三胚层分化能力鉴定

将成熟拟胚体接种于覆盖有0.1％明胶的24孔板上，在含体积分数为10％FBS的DMEM/F12中贴壁培养，1w后免疫荧光法检测AFP的表达，2w后免疫荧光法检测VIMENTIN、CK-PAN、A-SMA的表达。具体操作步骤如下：

(1)4％多聚甲醛室温固定30min，PBS洗3次，每次5min；

(2)0.1％Triton-X 100室温处理3次，每次5min；

(3)PBS洗3次，每次5min；

(4)10％BSA37℃封闭抗原1h；

(5)分别加入按说明书比例稀释(1∶100)的小鼠抗人一抗AFP、VIMENTIN、NESTIN过夜；

(6)PBS洗3次，每次5min，分别加入荧光标记的羊抗鼠二抗(1∶200稀释)，37℃孵育45min；

(7)PBS洗3次，每次5min。加入细胞核染料DAPI，室温作用10min，PBS洗涤后荧光显微镜下观察照相。

结果如图11。经多次传代后，第30代hESCs在保持正常的拟胚体形成能力的基础上，形成的拟胚体在体外完全可以向三个胚层的细胞分化，表达相应胚层的标志蛋白，证实该培养体系没有影响hESCs的体外分化能力。即HUCMSCs饲养层培养体系与MEF饲养层培养体系一样可以维持hESCs的体外分化能力。

试验一碱性磷酸酶(AKP)染色是检测多能性的一个方面。试验二多能性相关基因也是检测多能性的一个方面。试验三核型是体外培养保证细胞未突变的一个鉴定。试验四拟胚体形成能力是为了证明得到的胚胎干细胞具有多能性。试验五，三层分化是为了证明得到的胚胎干细胞具有多能性。

重复实施例1-3所述实验8次，均得到相同的结果。即从不同的个体中分离脐带进而分离得到人脐带间充质干细胞，再分别进行细胞增殖培养实验，再按照实施例3所述方法检测各个指标，结果均与实施例3中所述一致。

将实施例2中丝裂霉素C处理人脐带间充质干细胞步骤中，培养时间改为2h45min，培养基中浓度改为12μg/ml，得到的人脐带间充质干细胞用于培养人胚胎干细胞，得到的增殖的人胚胎干细胞的效果，与实施例3一致。

将实施例2中丝裂霉素C处理人脐带间充质干细胞步骤中，培养时间改为3h15min，培养基中浓度改为11μg/ml，得到的人脐带间充质干细胞用于培养人胚胎干细胞，得到的增殖的人胚胎干细胞的效果，与实施例3一致。

Claims (8)

1.一种增殖培养人胚胎干细胞的方法，包括如下步骤：用离体的人脐带间充质干细胞作为饲养层，对离体的人胚胎干细胞进行增殖培养，得到增殖的人胚胎干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述离体的人脐带间充质干细胞是经过增殖抑制处理的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述增殖抑制处理的方法如下：将所述离体的人脐带间充质干细胞接种于含有丝裂霉素C的人脐带间充质干细胞培养基中，培养2h45min～3h15min；所述含有丝裂霉素C的人脐带间充质干细胞培养基中丝裂霉素C的浓度为10～12μg/ml。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述离体的人脐带间充质干细胞为处于对数生长期的细胞。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述饲养层按照如下方法制备：按每100mm皿7×10⁵～8×10⁵个细胞的接种量将所述人脐带间充质干细胞接种于明胶包被过的细胞培养皿中，培养，得到饲养层细胞。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述增殖培养中包括传代培养的步骤。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述传代培养的代数至少为30代。

8.人脐带间充质干细胞在增殖培养人胚胎干细胞中的应用。

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