CN109971709A - 一种iPS细胞分化制备巨噬细胞的方法 - Google Patents

一种iPS细胞分化制备巨噬细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种通过iPS细胞体外培养有效分化诱导制备成熟巨噬细胞的方法。本发明提供一种将iPS悬浮培养成类胚体EB，再通过EB诱导的途径分化成巨噬细胞，从而从iPS获得大量、具有免疫功能的巨噬细胞的方法体系。另外，提供该EB的诱导分化方法在适于血细胞分化诱导的条件下进一步培养，能够产生各种血细胞的方法。

Description

一种iPS细胞分化制备巨噬细胞的方法
【技术领域】
本发明涉及一种由iPS(诱导性多潜能干细胞)分化制备巨噬细胞的方法。
【背景技术】
人类巨噬细胞(macrophage,)研究的最大障碍是人类巨噬细胞来源的有限性和异质性，目前，实验研究用人类巨噬细胞多来源于肿瘤细胞系和外周血单核细胞。前者能够无限增殖，但肿瘤来源可能导致遗传结构改变，从而造成功能缺失；后者不能自我更新，且每次试验需要大量外周血，获取困难且数量较少，来源和批次不同也会造成结果的不可重复性。如何获取大量有功能活性的巨噬细胞是研究的关键，诱导性多能干细胞(Inducedpluripotentstem cells，iPS)技术的出现为体外获得大量巨噬细胞提供了新思路。
iPS是通过体外导入特定的转录因子基因将终末分化的体细胞重编程为具有胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ES)特性的多能细胞，即能够自我更新并可分化为3个胚层来源所有细胞的能力。同时，iPS避免伦理道德和免疫排斥反应等局限而备受青睐。
研究表明，iPS在适当的诱导条件下能够分化为免疫细胞。类胚体(EmbryonicBody,EB)是iPS通过悬浮细胞培养在高密度环境中形成的细胞团集合，是一种常用的ES和iPS自发分化的研究手段。在培养过程中，随着EB成熟，EB会包含三个胚层的细胞，加之方法简便易行，所以EB常用作体外定向诱导分化为如巨噬细胞等的其他谱系细胞的方法。
此外，巨噬细胞几乎涉及每一种人类疾病，其的功能可以被加强或抑制，固可改变疾病的转归；且运用iPS产生的巨噬细胞建立相关疾病模型可进一步解析巨噬细胞与疾病的关系。同时，巨噬细胞具有强大的吞噬功能，很难将外源基因导入到细胞中进行修饰，iPS的出现为解决上述问题提供了一个新方法。
【发明内容】
本发明的目的在于克服目前技术中的瓶颈，提供一种由hiPS细胞获得大量、具有免疫功能的巨噬细胞的方法。具体地说，发明提供了一种将hiPS悬浮培养成类胚体EB，再通过EB诱导的途径分化成巨噬细胞的方法体系，提高了诱导分化的效率，降低了由肿瘤细胞系分化成巨噬细胞的基因结构变异风险。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种hiPS的稳定培养方法，该方法通过提供了一种无饲养层完全培养液的培养方式，能够稳定为生成巨噬细胞提供基础细胞来源。
进一步地，hiPS培养在1％Matrigel胶包被的细胞培养皿中。
进一步地，hiPS(DYR0100，中国科学院干细胞库)培养于10μM Y27632(ROCK激酶抑制剂，Selleck公司)的hiPS无饲养层完全培养液(Pluripotent Stem Cell SFM XF/FF,中国科学院干细胞库)中。
更进一步地，hiPS在5％CO2 37℃细胞培养箱中培养，每天换液，3～4d传代一次，传代比例为1:4～1:6。
本发明的第二个目的是提供一种hiPS的鉴定方法，通过hiPS的细胞形态，AKP染色，RT-PCR和免疫荧光分别检测hiPS多能性基因和蛋白表达，hiPS分化能力检测方法鉴定hiPS的可靠性，从而能够为分化为提供确定hiPS。
进一步地，用倒置显微镜每天观察培养细胞的形态和形态，并拍照记录。
进一步地，对处于对数生长期和生长到汇合度达100％的hiPS进行AKP染色。
进一步地，通过Trizol法提取hiPS细胞的RNA，通过PrimeScripte Rtreagent Kit试剂盒说明书进行反转录，随后通过PCR扩增检测了多能干细胞标记基因Nanog，OCT4的表达。
进一步地，从蛋白水平检测hiPS的多能性表达，通过免疫英光化学的方法检测了Nanog，Oct4的表达情况。
更进一步地，采用体外分化的方法，将hiPS悬浮培养成EB。在培养11d后，提取总RNA，用RT-PCR的方法，检测了内胚层基因甲胎蛋白AFP、中胚层基因球蛋白转录调节因子Gata-1和外胚层基因巢蛋白Nestin的表达情况。
本发明的第三个目的是提供一种hiPS悬浮培养成EB的方法。
进一步地，培养皿中的hiPS细胞用hiPS无饲养层消化液消化，离心获得细胞，用含Y27632的EB培养基重悬细胞，细胞培养1天后再用正常EB培养基培养。
优选地，消化时间为10～15min。
优选地，Y27632的浓度为8～12MM。
进一步地，EB培养基培养EB换液为每2d更换新鲜的EB培养基。
更进一步地，EB培养基的成分为KO-DMEM 500ml，NEAA 5ml，L-谷氨酰胺73mg，PSA5ml，β-巯基乙醇3.9μL，KSR 60ml。
本发明第四个目的是提供一种hiPS形成EB后诱导分化为巨噬细胞的方法。
进一步地，按照每孔6～8个的比例，将培养11d的EB铺到0.1％明胶包被的24孔板中。进一步地，用EB培养基1(DMEM+10％FBS+1ml L-谷氨酰胺+50ng/ml M-CSF+25ng/ml IL3+50μMβ-巯基乙醇+PSA)培养EB，每3d更换1次培养基，培养15～20d左右，陆续有悬浮细胞产生，收集悬浮细胞。
进一步地，悬浮细胞换用EB培养基2(1640+10％FBS+100ng/ml M-CSF+50ng/mlIL3+50μMβ-巯基乙醇+PSA)培养。悬浮细胞在培养10d后进行巨噬细胞鉴定。
本发明的最后一个目的是hiPS来源巨噬细胞的鉴定，通过形态学、吉姆萨染色、吞噬功能、非特异性酯酶染色和流式细胞术检测来鉴定
进一步地，用倒置显微镜每天观察培养细胞的形态和形态，并拍照记录。
进一步地，培养的细胞用4％多聚甲醛固定20min；PBS洗涤2次，每次3-5min；加入500μL吉姆萨染色液，室温孵育10-15min；吸取染色液，洁净水洗涤1次，晾干后用倒置显微镜观察细胞染色情况。
进一步地，弃掉培养皿中的培养基，用PBS清洗1次，将印度墨水以1:1000的比例稀释于新鲜的培养基中，在37℃5％CO2培养箱中静置1h，显微镜下观察计数细胞吞噬的情况。
进一步地，吸取培养皿中培养基，加入α-NAE固定液固定10～15min，水洗5min晾干，加入配置好的α-NAE孵育液，放入湿盒中37℃避光孵育1h，水洗，加入甲基绿染色液复染5～15min，水洗后镜检。
更进一步地，将细胞上清吸到15mL离心管中，胰酶消化后收集细胞，离心弃上清后每管加入100μL流式染色缓冲液，每管加入5μL CD11b、CD14、CD40、CD68和MHC-II流式抗体，避光孵育15min，每管加入1mL流式染色缓冲液，5min 1000rpm离心弃上清，每管加入500μL流式染色缓冲液重悬，经滤纱过滤后，上流式细胞仪检测。
本发明通过对hiPS细胞使用细胞因子体外诱导分化改造，生成具有吞噬功能的巨噬细胞，保持了巨噬细胞的形态特征和特定生物标记，为基础研究和潜在的临床免疫治疗提供了大量、具有免疫功能的巨噬细胞的方法体系。
【附图说明】
图1 hiPS细胞的生长形态。1A图为传代后第1天，1B图为传代后第3天。图中比例尺长度为100μm。
图2 hiPS的AKP染色鉴定，1A图为传代后第1天染色结果，1B图为传代后第3天染色结果。
图3 hiPS多能性基因的表达鉴定，hiPS的Oct-4和Nanog基因均有表达阳性。
图4免疫荧光法检测hiPS多能性蛋白的表达。图4A为Oct-4的免疫荧光表达，图4B为DAPI的免疫荧光核染色，图4C为图4A和图4B的图像重叠结果；图4D为Nanog的免疫荧光表达，图4E为DAPI的免疫荧光核染色，图4F为图4D和图4E的图像重叠结果。hiPS的Oct-4和Nanog蛋白均有表达阳性。
图5 EB和hiPS三胚层特定基因RT-PCR的琼脂糖凝胶电泳结果图。三胚层分化基因AFP、Gata-1和Nestin在hiPS和EB中的表达。
图6 EB培养的显微镜观察结果。形成的EB呈球形，细胞间紧密结合，图6A为培养1天后的EB；图6B为培养5天后的EB，EB逐渐向三胚层发育；图6C为培养11天的EB，EB成熟度增加。
图7 hiPS通过EB途径形成巨噬细胞的过程图。图7A为培养11天的EB；图7B为EB分化第1天，细胞开始逐渐贴壁；图7C为EB分化第4天，EB大部分都贴壁生长；图7D为EB分化第8天，EB整个都贴壁生长；图7E和7F为EB分化培养第12～20天，细胞向单核细胞分化，并逐渐由悬浮细胞产生，每4-5天收集悬浮细胞，并更换新鲜培养基；图7G为收集的悬浮细胞，并添加高浓度的M-CSF和IL3刺激单核细胞向巨噬细胞分化；图7H为收集的具有典型巨噬细胞形态特征的细胞(圆形、椭圆形、梭形及不规则形等，部分细胞可见伪足和凸起)。
图8 hiPS来源巨噬细胞的吉姆萨染色结果。图8A和图8B为TPH-1来源染色结果，标尺分别为50和100μm；图8C和图8D为hiPS来源染色结果，标尺分别为50和100μm。染色后的细胞，胞浆丰富，细胞核较大，偏居细胞一端，着色较深，形态为马蹄形。
图9 hiPS来源巨噬细胞的非特异性酯酶染色(α-NAE)结果。图9A为THP-1来源染色结果，图9B为hiPS来养染色结果。经α-NAE染色后，胞浆内有黑色或棕黑色弥散性颗粒，表明细胞中含有α-乙酸萘酚酯酶。图中比例尺长度为50μm。
图10 hiPS来源巨噬细胞的印度墨水吞噬结果。图10A为THP-1来源吞噬结果，图10B为hiPS来养吞噬结果。经吞噬后，细胞质中有着不同程度的墨汁颗粒，表明具有吞噬功能。图中比例尺长度为50μm。
图11 hiPS来源巨噬细胞的流式细胞检测结果。的CD11b、CD14、CD40、MHC-II和CD68的流式细胞检测结果如图11A、图11B、图11C、图11D和图11E所示，THP-1的CD11b、CD14、CD40、MHC-II和CD68的流式细胞检测结果如图11F、图11G、图11H、图11H、图11I和图11J所示。表达CD11b、CD14、CD40、CD68和MHC-II表面抗原的细胞占总细胞数的86.5％，78.6％，74.3％，27.9％和23.8％，和THP-1诱导的抗原表达相似，说明诱导分化的细胞为巨噬细胞。
【具体实施方式】
本发明提供一种由iPS细胞获得大量、具有免疫功能的巨噬细胞的方法。具体地说，发明提供了一种将iPS悬浮培养成类胚体EB，再通过EB诱导的途径分化成巨噬细胞的方法体系，其具体包括hiPS的细胞培养、hiPS的鉴定，hiPS形成EB的方法、培养与鉴定、hiPS形成EB的诱导分化为巨噬细胞以及hiPS来源的巨噬细胞的鉴定。
hiPS细胞培养
100μL Matrigel基质胶溶于10mL DMEM基础培养基中，每个35mm细胞培养皿中加入2mL，室温放置2h，4℃保存。hiPS(DYR0100，中国科学院干细胞库)培养于10μMY27632(ROCK激酶抑制剂，Selleck公司)的hiPS无饲养层完全培养液(Pluripotent Stem CellSFM XF/FF,中国科学院干细胞库)中，细胞培养于基质胶包被的培养皿内，5％CO2 37℃细胞培养箱中培养，每天换液，3～4d传代一次，传代比例为1:4～1:6。
hiPS的鉴定
(1)形态：细胞生长迅速，能稳定传代。为了促进细胞贴壁、减少凋亡，在传代过程中添加了ROCK激酶抑制剂Y27632，细胞呈梭形，形态如图1所示。
(2)AKP染色：对处于对数生长期和生长到汇合度达100％的hiPS进行AKP染色，染色结果如图2所示，细胞克隆大部分都染成深紫黑色，AKP染色呈阳性，表明细胞保持未分化状态。
(3)RT-PCR检测hiPS多能性基因表达：通过TRizol法提取hiPS细胞的RNA，通过PrimeScripte Rtreagent Kit试剂盒说明书进行反转录，随后通过PCR扩增检测了多能干细胞标记基因Nanog，OCT4的表达。结果如图3所示，hiPS的Nanog和OCT4均有表达呈阳性。
(4)免疫化学检测hiPS多能性基因表达：为了进一步从蛋白水平检测hiPS的多能性表达，通过免疫英光化学的方法检测了Nanog，Oct4的表达情况。结果如图4所示，hiPS表达Nanog和Oct4。
(5)hiPS分化能力的检测：为了检测hiPS分化能力，采用体外分化的方法，将hiPS悬浮培养成EB。在培养11d后，提取总RNA，用RT-PCR的方法，检测了内胚层基因甲胎蛋白AFP、中胚层基因球蛋白转录调节因子Gata-1和外胚层基因巢蛋白Nestin的表达情况。结果如图5显示，EB表达三胚层分化相关基因。通过检测hiPS的形态，AKP染色，Nanog和Oct4基因和蛋白的表达水平，分化能力等指标，确定hiPS具有多能性、生长状态良好、增殖速度快，且处于未分化状态能向三胚层分化，为巨噬细胞的定向分化提供了可靠的细胞来源。
hiPS形成EB的方法、培养与EB的鉴定
将培养皿中的hiPS细胞用1ml iPS无饲养层消化液消化10～15min，期间注意每个克隆都向中心卷起；将消化液弃掉，加入1ml无饲养层完全培养基并晃动培养基，用细胞刮刀使细胞脱落，避免吹打过度，将细胞转移至15ml离心管，5min 1000rpm，收集离心获得额细胞。用2mL添加10μM Y27632的EB培养基轻轻重悬细胞，将细胞转移至培养皿内培养，隔天换液为正常的EB培养基，之后每2d更换新鲜的EB培养基。
EB培养基的成分为：KO-DMEM 500ml，NEAA 5ml，L-谷氨酰胺73mg，PSA 5ml，β-巯基乙醇3.9μL，KSR 60ml。
EB的鉴定：培养的EB如图6所示，呈球形，细胞间结合紧密；培养5～8d左右，EB逐渐向三胚层发育；11d左右，随着时间的延长，EB成熟度增加。
hiPS形成EB的诱导分化为巨噬细胞
24孔板中加入2ml 0.1％的明胶溶液，5％CO2 37℃细胞培养箱中培养过夜。按照每孔6～8个的比例，将培养11d的EB铺到明胶包被的24孔板中。用EB培养基1(DMEM+10％FBS+1ml L-谷氨酰胺+50ng/ml M-CSF+25ng/ml IL3+50μMβ-巯基乙醇+PSA)培养，每3d更换1次培养基；培养15～20d左右，陆续有悬浮细胞产生，收集悬浮细胞进行下一步培养，同时24孔板中，EB培养基1继续每3d更换1次培养基；悬浮细胞换用EB培养基2(1640+10％FBS+100ng/ml M-CSF+50ng/ml IL3+50μMβ-巯基乙醇+PSA)培养。悬浮细胞在培养10d后进行巨噬细胞鉴定。
hiPS来源巨噬细胞的鉴定
(1)形态学观察：用倒置显微镜每天观察培养细胞的形态和形态，并拍照记录。EB形成无饲养层法诱导hiPS分化为巨噬细胞的方法，结果如图7所示，EB贴壁培养第4d，细胞生长迅速，培养8～11d，更换添加有M-CSF和IL-3的培养液，细胞呈现不不规则的分化，细胞于18d左右，向单核细胞分化，培养体系中呈现圆形、椭圆形细胞，随着培养液中的M-CSF和IL13浓度增加，大约20d左右，培养体系中的圆形、椭圆形细胞逐渐增多，第25d左右细胞具有圆形、椭圆形、梭形及不规则形等，部分细胞可见伪足和凸起等典型巨噬细胞的形态特征。
(2)吉姆萨染色：培养的细胞用4％多聚甲醛固定20min；PBS洗涤2次，每次3-5min；加入500μL吉姆萨染色液，室温孵育10-15min；吸取染色液，洁净水洗涤1次，晾干后用倒置显微镜观察细胞染色情况。结果如图8所示，染色后的细胞，具有清晰的圆形或不规则形，有伪足和突起，胞浆丰富，细胞核较大，偏居于细胞的一端，着色较深，其形态为马蹄形，圆形或者不规则形。
(3)吞噬功能检测：弃掉培养皿中的培养基，用PBS清洗1次，将印度墨水以1:1000的比例稀释于新鲜的培养基中，在37℃5％CO2培养箱中静置1h，显微镜下观察计数细胞吞噬的情况。结果如图9所示，细胞质中有不同程度的墨汁颗粒，表明具有吞噬功能。
(4)非特异性酯酶染色(α-NAE法)：吸取培养皿中培养基，加入α-NAE固定液固定10～15min，水洗5min晾干，加入配置好的α-NAE孵育液，放入湿盒中37℃避光孵育1h，水洗，加入甲基绿染色液复染5～15min，水洗后镜检。结果如图10所示，经过非特异性酯酶染色后，胞浆内有黑色或棕黑色弥散性颗粒，表明细胞含有α-乙酸萘酚酯酶。
(5)流式细胞仪检测细胞表面抗原表达：将细胞上清吸到15mL离心管中，胰酶消化后收集细胞，5min 1000rpm离心，弃上清后每管加入100μL流式染色缓冲液，每管加入5μL流式抗体，避光孵育15min，每管加入1mL流式染色缓冲液，5min 1000rpm离心弃上清，每管加入500μL流式染色缓冲液重悬，经滤纱过滤后，上流式细胞仪检测。结果如图11所示，表达CD11b、CD14、CD40、CD68和MHC-II表面抗原的细胞占总细胞数的86.5％，78.6％，74.3％，27.9％和23.8％，和THP-1诱导的抗原表达相似，说明诱导分化的细胞为巨噬细胞。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种将iPS悬浮培养成类胚体EB，再通过EB诱导的途径分化成巨噬细胞，从而从iPS获得大量、具有免疫功能的巨噬细胞的方法体系。
2.根据权利要求1所述的类胚体EB，其中，所述EB培养体系的分化诱导成巨噬细胞的条件是在M-CSF和IL3存在下培养25～30天。
3.根据权利要求1或成所述的类胚体EB，其特征在于，其培养在0.1％明胶包被的细胞培养皿中。
4.根据权利要求1～3所述的类胚体EB，其特征在于，其由iPS细胞经ROCK激酶抑制剂处理和EB培养基培养而成。
5.根据权利要求4所述，iPS细胞经含10μM ROCK激酶抑制剂的EB培养基培养1天。
6.根据权利要求4或5所述，EB培养基的成分为KO-DMEM 500ml，NEAA 5ml，L-谷氨酰胺73mg，PSA 5ml，β-巯基乙醇3.9μL，KSR 60ml。
7.根据权利要求2～3所述，类胚体EB经过EB培养基1培养15～20天，再经过EB培养基2培养10天，从而形成巨噬细胞。
8.根据权利要求7所述，EB培养基1的成分为DMEM+10％FBS+1mM L-谷氨酰胺+50ng/mlM-CSF+25ng/ml IL3+50μM β-巯基乙醇+PSA。
9.根据权利要求7所述，EB培养基2的成分为1640+10％FBS+100ng/ml M-CSF+50ng/mlIL3+50μM β-巯基乙醇+PSA。
10.一种免疫细胞制剂，其以采用权利要求6～9中任一项所述的方法产生的巨噬细胞或其衍生产物。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021107855A1 (en) * 2019-11-28 2021-06-03 Amniotics Ab Metabolism guides definitive lineage specification during endothelial to hematopoietic transition
CN113832104A (zh) * 2021-09-14 2021-12-24 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种从hiPS分化巨噬细胞的方法
US11446334B2 (en) 2019-10-18 2022-09-20 Amniotics Ab Use of term amniotic fluid cells for the treatment of acute and chronic respiratory diseases
US11542473B2 (en) 2016-10-21 2023-01-03 Amniotics Ab Methods and compositions for generating hematopoietic cells
WO2024037011A1 (zh) * 2022-08-15 2024-02-22 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基、方法及其应用

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11542473B2 (en) 2016-10-21 2023-01-03 Amniotics Ab Methods and compositions for generating hematopoietic cells
US11446334B2 (en) 2019-10-18 2022-09-20 Amniotics Ab Use of term amniotic fluid cells for the treatment of acute and chronic respiratory diseases
WO2021107855A1 (en) * 2019-11-28 2021-06-03 Amniotics Ab Metabolism guides definitive lineage specification during endothelial to hematopoietic transition
CN113832104A (zh) * 2021-09-14 2021-12-24 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种从hiPS分化巨噬细胞的方法
WO2024037011A1 (zh) * 2022-08-15 2024-02-22 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基、方法及其应用

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