CN105087470A - 人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，包括以下步骤：胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织；组织消化，得到细胞悬液；不连续Percoll梯度密度分离，得到滋养细胞和胎盘间充质干细胞；滋养细胞的纯化；胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养。本发明采用HyQTase和DNAse？I共同消化组织，经密度梯度分离获得大量的细胞纯度和活力都比较理想的滋养细胞和的胎盘间充质干细胞；且去除消化碎片、成纤维细胞和红细胞，并把滋养细胞和胎盘间充质干细胞区分开来，获得的细胞滋养细胞纯度可达90％，胎盘间充质干细胞用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，纯度也很高。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体是涉及人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法。
背景技术
常规分离方法通常难以获得大量纯度较高的滋养细胞和胎盘间充质干细胞；应用流式细胞仪分选法或磁珠分选法获得的细胞虽然纯度好，但成本很高。
滋养细胞在体外培养和传代比较困难，很多研究者都采用分离细胞后直接处理或干预的方案，因此一次性获得大量的滋养细胞对实验进行是非常有利的。胎盘间充质干细胞在胎盘组织的丰度低，想获得一定数量的原代细胞也需要很多的胎盘组织。
现有技术中，胎盘的细胞成分较复杂，其中所包含的滋养细胞在母胎免疫耐受过程中起重要作用，胎盘间充质干细胞具有多向分化潜能以及抑制淋巴细胞增殖的特性，常规离方法通常难以获得大量且纯度较高的上述两种细胞。
发明内容
本发明解决的技术问题是针对现有技术存在的缺陷，提供一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，可以分离出较高纯度的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：
人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，包括以下步骤：
(1)胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织，将胎盘组织进行组织消化，得细胞悬液；
(2)不连续Percoll梯度密度分离：在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液，每个密度5mL，再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心20min，小心弃除离心管20mL刻度以上的液体，收集12.5～20.0mL刻度的细胞层和12.5～7.5mL刻度的液体，在离心管15～20mL刻度处可见明显的白色云雾状细胞层，此处对应的Percoll相对密度为1.046～1.059，是滋养细胞存在的区域；离心管10mL刻度附近可见不明显的细胞层，此处密度为1.072，是淋巴细胞和胎盘间充质干细胞存在的区域，分别放入不同离心管里，用D-Hank’s液稀释5倍后，室温下1000g离心15min；离心管底可见白色细胞团；
(3)滋养细胞的纯化：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮液，将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数，获得的滋养细胞量可达(5.48±1.98)×108个；
(4)胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF、增殖促进剂配制成悬浮液，将密度梯度离心后获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，可以获得具有更小的平均气泡尺寸的间充质干细；计数并接种于75mm的培养瓶，在培养基中补充4mg/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10ng/mlN-乙酰基-L-半胱氨酸、100ng/ml氯化钙，放入37℃、二氧化碳浓度为0.5％的CO2培养箱中培养，2d换液1次，细胞生长至90％融合后，消化并计数细胞，按1∶4比例传代，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均一，变化形态明显的第2天用100ng/ml的BMP4处理，第3天或4用10ng/ml的BMP4处理，第5天用1ng/ml的BMP4处理，到第6天时，用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，传至第8代时细胞开始出现老化现象，细胞增殖缓慢，细胞体积增大，胞浆中出现很多黑色颗粒，此时需要注入一种抗氧化剂，所述抗氧化剂为聚乙二醇-缀合过氧化氢酶(PEG-过氧化氢酶)或N-乙酰半胱氨酸，或使用抗氧化物，所述抗氧化物为1-500μM丙酮酸乙酯(EP)，抑制间充质干细胞的衰老，用于增加干细胞产量，直到传至第九或十代。
进一步地，在上述方案中，所述的胎盘标本处理步骤包括：无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜，剪除胎盘母体面2.0～3.0mm组织后，剪下胎盘小叶，称取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是将10～100微克/毫升多聚赖氨酸加入到10～100微克/毫升没食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡预定时间后，将剪下的胎盘小叶用手术剪剪碎，用生理盐水反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色。
进一步地，在上述方案中，所述组织消化步骤包括：用15mmol/L三羟甲基氨基甲烷，加入哈特曼-D溶液，调节pH至8.0，作为消化缓冲液，加入终浓度为2.4g/LHyQTase(购于HyClone公司)和300U/mLDNaseI组成的消化液，取消化液320mL，将冲洗后的胎盘组织分多次进行消化，每次在37±0.2℃、180r/min恒温气浴摇床消化2min，消化完毕后，无菌去除HyQTase溶液，用新生牛血清终止消化反应，得到细胞悬液。
进一步地，在上述方案中，所述增殖促进剂为凝结的脐带血液的液体成分，以促进细胞生长。
进一步地，在上述方案中，所述微重力环境是通过多轴旋转所形成的模拟微重力环境，可以获得具有更小的平均气泡尺寸的间充质干细胞。
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用HyQTase和DNAseI共同消化组织，经梯度密度分离后，可同时一次性获得大量的滋养细胞和较多的胎盘间充质干细胞，对细胞损伤小，所获得细胞纯度和活力都比较理想；
(2)使用不连续梯度的Percoll细胞分离液可以去除消化碎片、成纤维细胞和红细胞，并把滋养细胞和胎盘间充质干细胞区分开来；获得的细胞滋养细胞在经差速贴壁法贴除成纤维细胞后，纯度可达90％，而且成本较低。
(3)密度梯度分离后获得的胎盘间充质干细胞用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，纯度也很高。
附图说明
图1为本发明实施例中各个浓度Percoll分布位置、相对密度和对应的细胞种类图；
图2为本发明实施例中梯度密度分离后接种培养的胎盘间充质干细胞生长形态(×100)图，A：第四代，B：第八代，C：第九代，D：第十代；
图3为本发明实施例中胎盘间充质干细胞的成骨分化潜能(×100)图，A：诱导实验组，B：对照组。
具体实施方式
下面结合实验室进行的具体试验对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明不限于以下列举的特定例子。
人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，包括以下步骤：
(1)胎盘标本处理：无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜，剪除胎盘母体面2.5mm组织后，剪下胎盘小叶，称取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是将55微克/毫升多聚赖氨酸加入到55微克/毫升没食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡预定时间后，将剪下的胎盘小叶用手术剪剪碎，用生理盐水反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色，得处理后的胎盘组织；将胎盘组织进行组织消化：用15mmol/L三羟甲基氨基甲烷，加入哈特曼-D溶液，调节pH至8.0，作为消化缓冲液，加入终浓度为2.4g/LHyQTase(购于HyClone公司)和300U/mLDNaseI组成的消化液，取消化液320mL，将冲洗后的胎盘组织分多次进行消化，每次在37℃、180r/min恒温气浴摇床消化2min，消化完毕后，无菌去除HyQTase溶液，用新生牛血清终止消化反应，得到细胞悬液；
(2)不连续Percoll梯度密度分离：在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液，每个密度5mL，如表1所示；再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心20min，小心弃除离心管20mL刻度以上的液体，收集12.5～20.0mL刻度的细胞层和12.5～7.5mL刻度的液体，在离心管15～20mL刻度处可见明显的白色云雾状细胞层，此处对应的Percoll相对密度为1.046～1.059，是滋养细胞存在的区域；离心管10mL刻度附近可见不明显的细胞层，此处密度为1.072，是淋巴细胞和胎盘间充质干细胞存在的区域，见图1，分别放入不同离心管里，用D-Hank’s液稀释5倍后，室温下1000g离心15min；离心管底可见白色细胞团；
表1梯度密度分离液的配制和密度梯度
Table1DilutionschemeforpreparationofPercollgradients
| 90％Percoll(ml) | D-Hank’s(ml) | Density | Final concentration(％) |
| 14.4 | 5.6 | 1.0.85 | 65 |
| 12.2 | 7.8 | 1.072 | 55 |
| 10.0 | 10.0 | 1.059 | 45 |
| 7.8 | 12.2 | 1.046 | 35 |
| 5.6 | 14.4 | 1.033 | 25 |
| 3.3 | 16.7 | 1.020 | 15 |
| 1.1 | 18.9 | 1.007 | 5 |
(3)滋养细胞的纯化：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮液，将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数，获得的滋养细胞量可达(6.12)×108个；
滋养细胞的鉴定：所获滋养细胞取部分细胞，用PBS洗涤2次，调整细胞密度至1×109/L。0.5mlEP管中加入0.1mL细胞悬液，按顺序加入小鼠抗人细胞角蛋白7单克隆抗体和FITC标记的羊抗鼠二抗孵育，设置一抗和FITC对照，流式细胞仪计数10000个细胞。经流式细胞仪检测，细胞角蛋白7阳性率为(90.00±4.36)％。
(4)胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF、增殖促进剂配制成悬浮液，所述增殖促进剂为凝结的脐带血液的液体成分，以促进细胞生长，将密度梯度离心后获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在通过多轴旋转所形成的模拟微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，可以获得具有更小的平均气泡尺寸的间充质干细；计数并接种于75mm的培养瓶，在培养基中补充4mg/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10ng/mlN-乙酰基-L-半胱氨酸、100ng/ml氯化钙，放入37℃、二氧化碳浓度为0.5％的CO2培养箱中培养，2d换液1次，细胞生长至90％融合后，消化并计数细胞，按1∶4比例传代，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均一，变化形态明显的第2天用100ng/ml的BMP4处理，第3天或4用10ng/ml的BMP4处理，第5天用1ng/ml的BMP4处理，到第6天时，用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，传至第8代时细胞开始出现老化现象，细胞增殖缓慢，细胞体积增大，胞浆中出现很多黑色颗粒，此时需要注入一种抗氧化剂，所述抗氧化剂为聚乙二醇-缀合过氧化氢酶(PEG-过氧化氢酶)或N-乙酰半胱氨酸，或使用抗氧化物，所述抗氧化物为1-500μM丙酮酸乙酯(EP)，抑制间充质干细胞的衰老，用于增加干细胞产量，直到传至第九或十代，见图2。
胎盘间充质干细胞的鉴定：
细胞表型检测：取第3代细胞，调整密度至1×109L-1，每管加入0.1mL细胞悬液。阴性对照管加入鼠IgG-FITC，IgG-PE；其他管分别加入鼠抗人抗体CD14-PE，CD45-PE，CD34-PE，CD29-FITC，CD44-FITC，HLA-DR-FITC，室温孵育30min，流式细胞仪计数10000个细胞。流式细胞仪检测结果显示，第3代胎盘间充质干细胞表面标志物比较均一，强表达透明质酸受体CD44和整合素家族成员CD29，阳性率分别为(99.86±0.05)％，(98.50±1.26)％；不表达造血干细胞标志物CD34，CD45和CD14，阳性率分别为(1.62±0.87)％(2.26±1.95)％，(2.08±0.97)％；强表达HLA-ABC，阳性率为(99.00±1.58)％，不表达HLA-DR，阳性率为(1.66±0.84)％。
成骨潜能检测：取第3代细胞接种于12孔板上，每个标本3孔，2孔进行诱导，1孔作为阴性对照。每孔加1mL完全培养基，含1×104个细胞。放入培养箱中培养，每2d换液1次，直到细胞生长至70％-80％融合后开始诱导。成骨细胞诱导分化培养基为含体积分数为10％胎牛血清的L-DMEM培养基，5mmol/Lβ-磷酸甘油，50mg/L维生素C，1nmol/L地塞米松。每2d更换1次诱导分化培养基，诱导20d，直至细胞出现聚集现象。将分化的胎盘间充质干细胞用1mLPBS洗2遍；每孔加入1mL体积分数为10％的中性甲醛，室温固定细胞10min。使用10g/L的茜素红(pH4.1)染色，室温30min。再用去离子水洗除茜素红，直到阴性对照孔背景染色基本消除。诱导4周后茜素红染色，胎盘间充质干细胞可被染成鲜艳的橙红色，但阴性对照孔基本不上色，见图3。
以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织，将胎盘组织进行组织消化，得细胞悬液；
(2)不连续Percoll梯度密度分离：在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液，每个密度5mL，再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心20min，小心弃除离心管20mL刻度以上的液体，收集12.5～20.0mL刻度的细胞层和12.5～7.5mL刻度的液体，分别放入不同离心管里，用D-Hank’s液稀释5倍后，室温下1000g离心15min；
(3)滋养细胞的纯化：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮液，将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数；
(4)胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF、增殖促进剂配制成悬浮液，将密度梯度离心后获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，计数并接种于75mm的培养瓶，放入37℃、二氧化碳浓度为0.5％的CO2培养箱中培养，2d换液1次，细胞生长至90％融合后，消化并计数细胞，按1∶4比例传代，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均一，变化形态明显的第2天用100ng/ml的BMP4处理，第3天或4用10ng/ml的BMP4处理，第5天用1ng/ml的BMP4处理，到第6天时，用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，直到传至第九或十代。
2.如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于所述的胎盘标本处理步骤包括：无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜，剪除胎盘母体面2.0～3.0mm组织后，剪下胎盘小叶，称取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是将10～100微克/毫升多聚赖氨酸加入到10～100微克/毫升没食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡预定时间后，将剪下的胎盘小叶用手术剪剪碎，用生理盐水反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色。
3.如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于所述组织消化步骤包括：用15mmol/L三羟甲基氨基甲烷，加入哈特曼-D溶液，调节pH至8.0，作为消化缓冲液，加入终浓度为2.4g/LHyQTase(购于HyClone公司)和300U/mLDNaseI组成的消化液，取消化液320mL，将冲洗后的胎盘组织分多次进行消化，每次在37±0.2℃、180r/min恒温气浴摇床消化2min，消化完毕后，无菌去除HyQTase溶液，用新生牛血清终止消化反应，得到细胞悬液。
4.如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于所述增殖促进剂为凝结的脐带血液的液体成分。
5.如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于所述微重力环境是通过多轴旋转所形成的模拟微重力环境。
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