CN107254432A - 一种同时分离尿源性干细胞两种亚群的培养基、分离方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种同时分离人尿源性干细胞不同亚群的培养基，它是由K‑SFM培养基和祖细胞培养基等体积混合而成。本发明还提供了所述培养基的用途，及一种人尿源性干细胞的分离培养方法。本发明培养基及分离培养方法，可用于有效分离培养人尿源性干细胞不同亚群，应用前景良好。

Description

一种同时分离尿源性干细胞两种亚群的培养基、分离方法及 应用

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种同时分离尿源性干细胞两种亚群的培养基、分离方法及应用。

背景技术

近十年来，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)作为组织工程和再生医学的种子细胞得到了蓬勃发展，但主要集中于骨髓来源间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。2008年，Zhang等人首次从尿液中分离出具有祖细胞特性的一类细胞，随后证实这类有祖细胞特性的细胞正是干细胞，命名为尿源性干细胞(Urine-derived stem cells，USCs)。相比于其他MSCs，USCs具有取材无创、来源丰富、增殖能力强等优点，是理想的自体干细胞来源，在再生医药领域中应用前景广阔。

已有研究发现，各种MSC例如骨髓来源间充质干细胞(BM-MSCs)、脐带血来源干细胞(UCBSCs)和羊水来源干细胞(AFPCs)都存在细胞亚群，不同干细胞亚群的形态不同，增殖能力、迁移能力和多向分化能力等生物学特性也不尽相同。更重要的是，不同干细胞亚群间的组织修复能力不同。例如，在视力衰退的治疗研究中，长梭形BM-MSCs亚群比表皮样BM-MSCs亚群的治疗效果更好。因此，了解清楚USCs细胞亚群的生物学特征是其用于细胞治疗的必要前提。

目前，对USCs的研究尚在初级阶段，虽已有少量文献报道了USCs的生物学特性，但不同文献报道的USCs形态并不一致。Shantaram Bharadwaj等【S Bharadwaj,G Liu,Y Shi,et al.Characterization of Urine-Derived Stem CellsObtained from Upper UrinaryTract for Usein Cell-Based Urological Tissue Engineering.Tissue Engineering:Part A.2011.17(15-16):2123】研究了来自上尿道的尿液中干细胞的生物学特性，从形态上看，细胞呈现出谷粒状的形态，折光度较高，在他们公布的后续研究中依然是谷粒状的形态。然而在Junjie Guan等【JJ Guan,X Niu,FX Gong,et al.BiologicalCharacteristicsof Human-Urine-Derived Stem Cells:Potential for Cell-BasedTherapy in Neurology.Tissue Engineering:Part A.2014.6(13):1794-1806】的研究中公布USCs的形态呈现长梭形的成纤维样。了解清楚各细胞亚群的生物学特性，是USCs进一步应用于细胞治疗和再生修复的必要前提。

但由于现在不同的USCs亚群均是从不同文献中独立报道的，对不同USCs亚群的生物学研究可比性较差，不利于USCs的临床应用。为了保证对USCs不同亚群研究的准确性，尽可能减少不同实验室、不同检测体系的误差，迫切需要研发一种能够同时分离USCs不同亚群的分离方法，以满足实际应用的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时分离尿源性干细胞两种亚群的培养基、细胞分离方法及应用。

本发明提供了一种同时分离人尿源性干细胞不同亚群的培养基，它是由K-SFM培养基和祖细胞培养基等体积混合而成，

其中，祖细胞培养基由基础培养基和添加因子组成，基础培养基由60～78％的DMEM高糖培养基、14～30％的Ham’s F12培养基、8～15％FBS组成，添加因子及在祖细胞培养基中的终浓度分别为EGF 4～6ng/mL、牛垂体提取物4～6ng/mL、氢化可的松0.3～0.5μg/mL、转铁蛋白4～6μg/mL、牛胰岛素4～6ng/mL、腺嘌呤1.4～2.2×10^-4M和3,3,5-Triiodo-L-thyromine 1.6～2.4×10^-9M。

其中，它是由K-SFM培养基和祖细胞培养基等体积混合而成，其中，祖细胞培养基由基础培养基和添加因子组成，基础培养基由67.5％的DMEM高糖培养基、22.5％的Ham’sF12培养基、10％FBS组成，添加因子及在祖细胞培养基中的终浓度分别为EGF 5ng/mL、牛垂体提取物5ng/mL、氢化可的松0.4μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、牛胰岛素5ng/mL、腺嘌呤1.8×10^-4M和3,3,5-Triiodo-L-thyromine 2×10^-9M。

其中，所述牛垂体提取物购自Sciencell公司。

本发明还提供了上述培养基在分离培养人尿源性干细胞中的用途。

其中，所述人尿源性干细胞为长梭形和/或谷粒状尿源性干细胞亚群。

本发明还提供了一种人尿源性干细胞的分离培养方法，它包括如下步骤：

a、取人尿液，离心，弃上清，用PBS洗涤；

b、加入上述培养基，重悬，贴壁培养；

c、换液，待细胞单克隆生长至直径0.5-2cm时，采用单克隆消化法分离单个细胞，培养；

d、对细胞进行鉴定，即可。

其中，步骤a中，所述离心为400g离心10min；

其中，步骤a中，所述PBS洗涤的方法为：加入PBS溶液混匀，400g，离心5min；重复洗涤2次。

其中，步骤c后，还包括消化传代步骤：取细胞进行胰酶消化传代，培养至第三代细胞，即可。

其中，所述培养是在温度为37℃、体积分数为5％的CO₂的培养箱中进行。

本发明通过多年的组织工程研究，研发了一种具有特定组成的尿源性干细胞培养基及分离培养方法，可用于同时有效分离培养两种形态稳定、增殖能力、迁移能力和多向分化能力不同的尿源性干细胞亚群，而且来源方便、分离培养效率高，适用于大规模细胞制备，不仅为组织工程和细胞治疗提供了良好的种子细胞来源，也为尿源性干细胞的临床应用提供了科学依据和理论基础。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1人尿液来源细胞的单克隆培养示意图。

图2从人尿液中分离USCs亚群，细胞贴壁形成克隆过程。(A-C)SS-USCs从单个细胞贴壁第4天到第10天，形成可传代克隆的过程；(B-D)RS-USCs从单个细胞贴壁第4天到第10天，形成可传代克隆的过程。黑色箭头指向原代培养过程中不贴壁的细胞碎片(bar＝500μm)。

图3USCs亚型的形态特征。(A)(C)SS-USCs传代培养第1代和第3代形态特征图，细胞呈长梭形，旋涡状汇集；(C)(D)RS-USCs传代培养第1代和第3代形态特征图，细胞呈高折光度，两端偏圆润的形态，均匀铺开的排列形式(bar＝100μm)；(E)SS-USCs和RS-USCs采用单细胞克隆培养后，在同一视野下观察对比其形态特征(bar＝500μm)。

图4SS-USCs与RS-USCs单个细胞最长轴和最短轴的比较。

图5第5代的SS-USCs形态

图6第5代的RS-USCs形态

图7(A)流式细胞术检测SS-USCs表面抗原表达结果；(B)流式细胞术检测RS-USCs表面抗原表达结果；(C)不同人来源的SS-USCs与RS-USCs表面标记物表达量统计学分析；(*，表示两组间有显著性差异P<0.05，n＝3)。

图8(A)SS-USCs和RS-USCs成骨诱导30天后茜素红S染色以及成脂诱导30天后油红-O染色；(B)IPP软件分析SS-USCs与RS-USCs油红-O和茜素红的染色面积。

图9尿液来源上皮样细胞的鉴定。(A)尿液中上皮样细胞形态以及CCK-8检测其增殖活性；(B)上皮样细胞成脂肪诱导，成骨诱导后油红O，茜素红染色结果；(C)流式细胞术检测上皮样细胞表面抗原表达情况；(D)免疫荧光检测上皮样细胞CK18的表达情况；(bar＝50μm)。

图10使用CCK-8法检测SS-USCs与RS-USCs的增殖活性。

图11SS-USCs与RS-USCs克隆形成能力比较。(A)观察SS-USCs的克隆形成情况；(B)观察RS-USCs的克隆形成情况；(C)结晶紫染色后倒置相差显微镜观察SS-USCs集落形态；(D)结晶紫染色后倒置相差显微镜观察RS-USCs集落形态；(E)两种亚群细胞的克隆集落计数统计分析；(bar＝500μm)。

图12SS-USCs与RS-USCs迁移能力的比较。(A)SS-USCs与RS-USCs划痕0h和40h后倒置相差显微镜观察各组划痕的情况(bar＝500μm)；(B)两种亚群的细胞迁移距离的统计学分析。

图13(A)(B)real time-PCR检测不同个体间细胞Oct-4，c-Myc的表达水平以及(C)(D)同一个体中不同代次的细胞干性基因表达水平的改变；(*，表示与对照组有显著性差异P<0.05，n＝3)。内参基因：GAPDH。

图14Real time PCR检测SS-USCs与RS-USCs中CITED1、FOXD1和Six2表达水平。内参基因：GAPDH。(*，表示与对照组有显著性差异P<0.05；NS，表示与对照组无显著性差异P>0.05，n＝3)。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验试剂与仪器如下：

1、主要试剂

DMEM高糖培养基(Dulbecco’s modified Eagles’medium-high glucose，HD，Gibco，USA)；Ham’sF12(Hyclone，USA)；无血清培养基(Defined Keratinocyre-SFM，K-SFM，Gibco，USA)；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS，Gibco，USA)；Human TGF-beta 1-produced in CHO(Perotech，USA)；EGF重组人表皮生长因子(REC HU EGF，Gibco，Life，USA)；BPE牛垂体提取物(Bovine pituitary extract，Sciencell，USA)；氢化可的松(Hydrocortisone，Sigma，USA)；牛胰岛素(Bovine insμLin，Sigma，USA)；人转铁蛋白(Transferrin，Sigma，USA)；腺嘌呤(Adenine，Sigma，USA)；3,3,5-Triiodo-L-thyromine(Sigma，USA)；胰蛋白酶(Trypsin，TN，Gibco，USA)；牛血清白蛋白(Albumin Bovine V，USA)；二乙胺四乙酸二钠(EDTA，Gibco，USA)；成软骨诱导液(ChondrogenesisDifferentiation Kit，Gibco，USA)；茜素红(Alizarin red，Sigma，USA)；FITC标记的小鼠抗人CD44(BD，USA)；FITC标记的小鼠抗人CD90(BD，USA)；PE标记的小鼠抗人CD73(BD，USA)；PE标记的小鼠抗人CD133(Miltenyi Biotec，German)；PE标记的小鼠抗人CD29(BD，USA)；APC标记的小鼠抗人CD34(BD，USA)；Cytokeratin 18抗体(Santa Cruz Biotechnology，USA)；山羊抗小鼠二抗(北京中山金桥生物技术有限公公司)；二抗稀释液(北京中山金桥生物技术有限公公司)；Trizol Reagent(Invitrogen，USA)；TritonX-100(Applichem，German)；反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara，大连)；SYBR Premix Ex Taq II(Takara，大连)；DL 1000DNA marker(Takara，大连)；琼脂糖(Sigma，USA)；油红O(Oil red O，Sigma，USA)；阿利新蓝染色液试剂盒(Solarbio，USA)；地塞米松(Dexamethasone，DXM，Sigma,USA)；抗坏血酸(Ascorbic acid，Sigma，USA)；β-磷酸甘油钠(β-Glycerophosphate disodium salt hydrate，β-GP，Sigma，USA)；吲哚美辛(Indomethacin，Sigma，USA)；1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX，Sigma，USA)；L-脯氨酸(L-Proline，Solarbio，北京)；丙酮酸钠(Pyruvic acidsodium，北京)；CCK-8(Cell Counting Kit-8，Dojindo Molecular Technologies，Japan)；无水乙醇、CuSO4、二甲亚砜(DMSO)、乙二胺四己酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)、浓硝酸，异丙醇，氯仿(成都市科龙化工试剂厂)；磷酸盐缓冲液(PBS)(Hyclone，USA)；4％多聚甲醛(博士德，武汉)；

盘尼西林-链霉素(Penicillin-streptomycin，Gibco，USA)；焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate，DEPC，Sigma,USA)；绿如蓝核酸染料(天恩泽，中国)；

2、主要仪器

37℃恒温CO2培养箱(Thermo，Forma SeriesⅡ)；超净工作台(Thermo ElectionCorporation，USA)；离心机(Eppendorf，Germany)；超纯水系统(ELGA，USA)；6孔板、96孔板、3.5mm培养皿(Corning，USA)；25mm2培养瓶(Excell，China)；37℃恒温CO2培养箱(SANYO，Japan)；低温高速离心机(Heraeus D-37520，Germany)；离心机Centrifuge 5702(Eppendorf Rasearch，Germany)；连续光谱微孔板光密度测读仪SPECTRA MAX 190(Molecular Devices，USA)；FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，USA)；小型水平电泳系统(Bio-Rad，USA)；96实时荧光定量PCR仪(Roche，Switzerland)；凝胶成像系统(Bio-Rad，USA)；PCR扩增仪(Bio-rad PTC-1148EDU，USA)；倒置相差显微镜(OlympusIX50，Japan)；倒置荧光相差显微镜(Olympus，Japan)；血球计数器(求精玻璃仪器厂，上海)。

3、试剂的配置

TNE的配置：0.25％的胰蛋白酶和1mM EDTA按照1:1体积比混匀，滤器过滤后备用。

成脂诱导液的配制：HG-DMEM中加入10％FBS，1.0μM地塞米松，50μM吲哚美辛，500μM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤，10μg/mL牛胰岛素，混匀后4℃避光保存。

成骨诱导液的配制：HG-DMEM中加入10％FBS，50μg/mL的维生素C，0.2μM的地塞米松，0.01M的β-磷酸甘油钠，混匀后4℃避光保存。

茜素红染液的配制(100mL)：取1.2114g Tris-base，加入100mL的去离子水，用0.2N的HCl调节pH值至8.3，加入100mg茜素红，溶解后过滤使用。

油红O染液的配制(100mL)：取100mL的异丙醇，加入1g的油红O，7O℃水浴搅拌溶解2h，用时取油红O溶液与去离子水按照1：1的比例稀释，过滤后使用。

实施例1本发明培养基的配制

本发明USCs培养基由K-SFM培养基和祖细胞培养基等体积混合而成；

其中，祖细胞培养基由基础培养基和添加因子组成，基础培养基由67.5％的DMEM高糖培养基、22.5％的Ham’s F12培养基、10％FBS组成，添加因子在祖细胞培养基中的浓度分别为EGF 5ng/mL、牛垂体提取物5ng/mL、氢化可的松0.4μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、牛胰岛素5ng/mL、腺嘌呤1.8×10^-4M和3,3,5-Triiodo-L-thyromine 2×10^-9M。

制备方法如下：

1、先配置未加因子的基础培养基备用：

包括HD(Gibco)67.5mL、F12(Hyclone)22.5mL、FBS(Hyclone)10mL。

2、K-SFM(Gibco)100mL。

3、7个因子，分别是：

①EGF：GIBCO-PHG0315，冻干无菌，2-8度保存0.1-1.0mg/mL，PBS Buffer浓缩液，更低稀释度下应保存在低内毒素培养基中或者含保护蛋白的Buffer中，保护蛋白为灭活FCS或者BSA；

配制：25ug干粉，12000rpm离心2分钟，溶于500μL含0.1％BSA的PBS中，浓度为50ug/μL，分装10μL/管。

培养基终浓度：5ng/mL；100mL培养基含EGF:500ng。

②BPE:Sciencell，浓度25mg/1.8mL 100mL培养基含5000ng，即5ug。

配制：取18μL原液，含BPE250ug，加入482μLDPBS至浓度0.5ug/μL，分装10μL/管，-20度保存。

100mL培养基中加量：10μL

③氢化可的松：(Sigma)，货号H0888。不容于水，溶于酒精或者DMSO。

配制：称取80mg溶于2mL无水乙醇(40mg/mL)0.22um滤器过滤除菌，取20μL加入180μL无水乙醇，至4mg/mL，分装10μL/管。

培养基终浓度：0.4ug/mL，100mL培养基含40ug。

④胰岛素(牛)：粉剂。

配制：a.16.8mL纯盐酸+100mddH₂O，成2N HCl

b.Isulin粉剂按5mg/mL溶于2N HCl中

c.取b中母液5μL至45μL 2N HCl至0.5mg/mL

d.取C中母液30μL至270μL 2N HCl中，至0.05mg/mL，即0.05ug/μL(50ng/μL)，即为应用液。分装-20度保存。

培养基中终浓度：5ng/mL，100mL培养基加10μL应用液(d)。

⑤人转铁蛋白：Sigma 货号：T8158 CAS:11096-37-0 PCode:1400132442；

配制：100mg溶于4mL无菌ddH₂O，浓度25mg/mL。(25ug/μL)。

培养基中终浓度：5ug/mL 100mL 培养基含500ug，100mL培养基加入20μL。

⑥腺嘌呤：Sigma A2786 5g 135.13g/mol

溶解度：0.5M HCl 20mg/mL

配制：称取48.6468mg溶于3mL0.5M HCl，浓度：16.2156ug/μL，155μL/管分装于-20度保存。

100mL培养基加入150μL即可。

培养基终浓度：1.8×10^-4M(24.3234ug/mL)，100mL培养基：2432.34ug(2.43234mg)0.5M HCl：取纯HCl76.68μL溶至5mL，即取ddH₂O 4923.32μL，加入HCl 76.68μL

⑦3，3，5-Triiodo-L-thyromine Sigma，货号：T2877 性状：白色结晶 熔点:237度650.97g/mol 溶解性：溶于稀碱液形成棕色的水溶性钠盐，不溶于水，乙醇，丙二醇

4M NH₄OH in MeOH,5mg/mL 培养基终浓度：2×10^-9M，1.30194×10^-6mg/mL

100mL培养基：1.20194×10^-4mg

配制：称取13.0194mg溶于10mL 4M NH₄OH，为A液；取1mLA液溶于9mL 4M NH₄OH为B液；取500μLB液溶于4.5mL 4M NH₄OH为C液；C液浓度：1.30194×10^-2mg/mL；100mL培养基加入10μL C液即可

配置：4M NH₄OH(10mL)，称5.68g浓氨水定容至10mL。

4、配制时：先按照各因子在祖细胞培养基中的浓度添加到基础培养基中，使得祖细胞培养基体积为100mL；然后，加入K-SFM100mL，即可。

5、也可在USCs培养基中，加入抗生素盘尼西林；用量为1％，即将2mL盘尼西林加入到198mLUSCs培养基中。

实施例2本发明尿源性干细胞的分离培养及鉴定

一、人尿源性干细胞(USCs)亚群的分离培养

取3-35周岁健康人新鲜中末段尿液50mL-250mL，于50mL离心管中，400g离心10min，于生物安全柜中弃去上层尿液上，加入40mL含1％双抗(Gibco)的PBS，与底部尿液混匀，400g，离心5min。重复PBS洗涤尿液的步骤两遍。吸弃上清，加入5mL USCs培养基(本发明实施例1方法制备的含有盘尼西林的USCs培养基)将离心管底部细胞重悬，再将细胞悬液吸入T25培养瓶中，放入37℃含5％CO₂孵箱中培养，前两天适时观察是否有污染；约5-7d出现克隆后更换培养基，待细胞单克隆生长至直径0.5～2cm后，用2-10mL胰酶对单个克隆分别进行消化，并分别传代至新的T25培养瓶中。

二、USCs亚群的鉴定

取生长良好的第3代USCs，用显微镜鉴定所获细胞的形态，用流式细胞仪鉴定培养细胞的表面抗原表达；并且进行成脂、成骨诱导分化鉴定。

(一)鉴定方法

1、流式细胞术检测细胞表面抗原表达

取生长良好的第3代USCs，TNE消化后，完全培养基终止消化。1200rpm，3min离心，弃培养基。PBS洗涤细胞3次，1200rpm离心3min，PBS重悬细胞，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL，每个流式细胞管中加0.1mL的细胞悬液。阴性对照管中不加抗体；其他管分别加入小鼠抗人CD24、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133和CD34各2μL，室温避光孵育30min，PBS洗涤离心，吸弃上清液，加入200μL PBS轻弹混匀底部细胞沉淀，流式细胞仪检测相关表型的表达情况。

取上皮样细胞，TNE消化后，完全培养基终止消化。以6.0×10⁴个细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板爬片上，培养48h后，用4％多聚甲醛固定细胞15min后，PBS洗3次；0.5％Triton室温破膜10min，PBS洗3次，每次5min；1％的BSA室温封闭40分钟，加入一抗：CK18以1：50稀释后加至血盖片上，4℃过夜；37℃回温1h，PBS洗3次，每次10min，加入山羊抗小鼠二抗(1：500)，37℃孵育2h，孵育完成后PBS洗涤3次，每次10min。免疫荧光检测CK18的表达情况。

2、成骨诱导及鉴定

取生长良好的第3代USCs，以6.0×10⁴个细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板爬片上，培养24h后，换成骨诱导培养基进行诱导，每3天换液一次，连续诱导30天后，清洗并固定，采用茜素红染色进行鉴定。

取出细胞爬片，PBS洗涤3次；75％酒精固定20min；双蒸水清洗，37℃条件下茜素红染液染色1h；清水冲洗2-3次，采图。采用IPP(Image-pro-plus)软件随机计算SS-USCs与RS-USCs各3个视野下茜素红着色面积。

3、成脂诱导及鉴定

取生长良好的第3代USCs，以1.0×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板爬片上，培养24h后，更换成脂诱导液进行诱导，每3天换液一次。连续诱导30天。清洗固定，采用油红O染色进行鉴定。

取出细胞爬片，PBS洗涤3次；75％酒精固定20min；双蒸水清洗，37℃条件下油红O染液染45min；清水冲洗3次，采图。采用IPP软件随机计算SS-USCs与RS-USCs各3个视野下油红O着色面积。

4、成软骨诱导及鉴定

取生长良好的第3代USCs，以1.0×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板爬片上，培养24h后，更换成软骨诱导液进行诱导，每3天换液一次。连续诱导30天。清洗固定，采用阿利新蓝染色进行鉴定。

(二)鉴定结果

原代细胞的形态不一，主要呈现梭形、多角形以及穹顶状，采用单克隆消化培养法培养各个细胞克隆，并分别传代至T25细胞培养瓶中进行扩增培养。可观察到细胞形态以长梭形和谷粒状为主，少数传代后的克隆呈现典型的上皮样细胞形态。

1、形态学鉴定

传代后每个培养瓶中细胞均为较纯的细胞(图1)，接种3-14天后可陆续观察到单个细胞贴壁，通常每份样品中1-3个细胞贴壁，不贴壁的细胞碎片悬浮在培养基中。贴壁细胞生长约10天，形成紧实的细胞集落(图2)。长梭形(Spindle shaped，SS)细胞看上去较为扁平，折光度低，我们将其命名为SS-USCs(Spindle shaped USCs，SS-USCs)；谷粒状(Rice-like shaped，RS)细胞整体圆润，折光度高，我们将其命名为RS-USCs(Rice-like shapedUSCs，RS-USCs)。符合干细胞形态。

待细胞融合至80％，用TNE将细胞按1:4传代，3天后则再次达到融合状态，可继续传代培养。将第1代SS-USCs与RS-USCs以1:1(约200个)比例混合接种至培养瓶，待细胞融合后，于镜下观察可见细胞间边沿界限分明，形态上有明显差异(图3)。

使用photoshop随机测量单个细胞最长轴和最短轴，作散点图比较细胞大小，结果显示SS-USCs的长轴比RS-USCs更长，短轴长度趋于一致(图4)。

分别将两种USC亚群，用USCs培养基传代培养，第5代细胞图片分别见图5-6，可见，本发明的两种USC亚群保持原形态，可稳定传代。

2、表面抗原的表达鉴定

分别取3个不同人来源的第3代SS-USCs与RS-USCs，经流式细胞术检测，SS-USCs与RS-USCs均高表达CD24、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，不表达CD34，表明所获得的SS-USCs与RS-USCs表达间充质干细胞的表面标志物，为间充质干细胞。

将不同人来源细胞所测结果进行统计学分析，结果显示SS-USCs比RS-USCs表达更高的CD133，差异具有统计学意义(P<0.05)(图7)。

3、成脂、成骨和成软骨分化鉴定

SS-USCs与RS-USCs成骨诱导30天，茜素红染色都为阳性，形成典型的钙结节结构；经IPP软件分析显示SS-USCs比RS-USCs有更多的茜素红着色，差异具有统计学意义(P<0.05)(图8)。

成脂诱导30天，油红-O染色后，SS-USCs与RS-USCs均可观察到串珠状的脂滴位于胞质内；经IPP分析显示SS-USCs的脂滴多于RS-USCs，差异具有统计学意义(P<0.05)(图8)。

成软骨诱导30天，阿利新蓝染色后，SS-USCs与RS-USCs均可观察到染成蓝色的软骨基质位于胞质内；经IPP分析显示RS-USCs的脂滴多于SS-USCs，差异具有统计学意义(P<0.05)(图8)。

4、上皮样细胞的鉴定

一类细胞排列紧实，形态呈铺路石样，对其增殖、分化、表型、CK18表达情况进行检测。使用CCK-8检测尿液中上皮样细胞的增殖活性，结果显示细胞具有一定的增殖能力，生长曲线较为平滑，生长速度缓慢，且连续传代次数少(图9-A)，最多增殖至约400万个时，细胞出现凋亡，停止分裂增殖。

成脂诱导后油红-O染色结果显示，上皮样细胞无成脂肪分化能力；成骨诱导后茜素红染色结果显示，其无成骨分化能力(图9-B)。

流式细胞术鉴定细胞表型，上皮样细胞CD24、CD29、CD44、CD73呈阳性，CD105呈弱阳性，CD133呈阴性(图9-C)。

免疫荧光检测CK18的表达情况，Hela作阳性对照，结果显示上皮样细胞CK18的表达呈阳性(图9-D)。因此，这类铺路石样的细胞为可能为来源于尿液中的上皮细胞。

可见，本发明得到了长梭形和谷粒状两种形态的尿源性干细胞亚群(SS-USCs和RS-USCs)。

以下用试验例的方式说明本发明的有益效果：

试验例1本发明两种尿源性干细胞亚群的比较

一、实验方法

1、CCK-8法检测USCs亚群的增殖速率

取生长良好的第3代USCs，TNE消化后，吸取培养基轻轻吹打细胞使其脱落，轻吹打混匀，吸10μL细胞悬液至血细胞计数板计数。将细胞悬液的细胞密度调至3.0×10⁴/mL，向96孔板每孔加100μL细胞悬液，即每孔接种3000个细胞。24小时后，将其中六孔的培养基换为110μL含10μL CCK-8溶液的完全培养基，晃匀。在细胞培养箱中孵育3h，吸出100μL孵育后液体至全新96孔板中(注意不要在孔中生成气泡影响O.D值的读数)。用酶标仪测定孵育液在450nm处的吸光度。连续测定9天，每天测试6孔。

2、USCs亚群克隆形成能力的比较

克隆形成分析实验用于表征USCs亚群的自我更新潜能。取生长良好的第3代USCs按照800cells/cm²接种至25cm²细胞培养瓶中，设置4个平行组。培养过程中，每3d换液一次，培养15天，待细胞克隆形成后，甲醇固定5min，0.5％结晶紫37℃染色30min。导致显微镜下观察克隆集落形态，并对克隆进行技术，直径小于2mm的克隆集落忽略不计。

3、细胞划痕实验检测USCs亚群的迁移能力

所有能灭菌的器械均需灭菌，记号笔和直尺在操作前在紫外下照射30min(超净台内)。先用记号笔在6孔板背后，用直尺均匀地划横线，大约每隔1～2cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。取生长良好的第3代SS-USCs与RS-USCs，以2.0×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔培养板，待细胞融合到90％以上时，用1mL枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，按左中右依次每孔划三道痕。用PBS洗细胞3次，除去划下的细胞，加入含1％FBS的培养基。

4、实时荧光定量PCR检测基因表达情况

取生长良好的第3代SS-USCs与RS-USCs，以1.0×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板上，培养48h后，提取细胞RNA。根据Takara试剂盒提取RNA，再反转成cDNA，

4.1提取总RNA

(1)将无水乙醇存放于200℃处理过无RNA酶玻璃瓶中，用DEPC处理过的水稀释成75％酒精备用；将氯仿和异丙醇装入200℃处理过无RNA酶的玻璃瓶中。

(2)细胞处理完毕后吸弃培养基，每孔加1mL Trizol Reagent，室温裂解细胞5min。

(3)将每孔含裂解物的Trizol移入RNAase Free的EP管中，加入200μL氯仿，用力颠倒混匀，室温条件下静置5min。

(4)4℃，12000g离心15min。

(5)离心后混合物分为三层，小心吸取200μL上层水样液体到另一个干净的EP管中，加入200μL异丙醇。颠倒混匀5-8次，室温下静置10min。

(6)静置后4℃，12000g离心10min。离心后可见EP管底有白色胶状沉淀。

(7)小心吸走上清液，勿触及沉淀。

(8)加入1mL 75％乙醇，颠倒数次清洗沉淀。

(9)4℃，7500g离心10min。白色胶状RNA沉淀在EP管底部。

(10)倒掉上清液，尽量吸掉剩余的上清液，空气干燥10min，待白色胶状沉淀透明。

(11)加20μLDEPC水，溶解RNA沉淀。

4.2 RNA的质量鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性：

(1)制备1％琼脂糖凝胶：0.2g琼脂糖加入20mL TAE缓冲液中，混匀，微波加热至沸腾，使琼脂糖完全溶解。当凝胶温度降至50℃左右时加入溴化乙锭替代物核酸染料2μL，混匀，倒入模具中。

(2)等凝胶自然冷却后，6×buffer稀释RNA，加入电泳道，110V电压，电泳15min。

(3)BIO-RAD凝胶成像系统成像。

5.3 RNA逆转录成cDNA

如提取的总RNA没有降解，电泳观察能看到3条带，分别从上到下是28S、18S和5S，并且3条带各自的亮度应符合要求，那么提取的总RNA才能进行反转录。

(1)按下表所示组分配制DNA去除反应体系(10μL)：

(2)按下表所示组分配制逆转录反应体系(10μL)：

(3)将(1)，(2)体系混匀后，在PCR仪中进行反转录，反应体系体积20μL，按以下条件进行逆转录：37℃，15min；85℃，5秒。

(4)逆转录所得产物保存在-20℃冰箱备用。

4.4实时荧光定量PCR

1.引物设计与合成：根据待测基因的序列设计引物，为了避免基因组DNA的污染，上下游引物均设计为跨过内含子。本实验所用的引物均由上海生工公司合成。开盖前10000g离心50S，加入DEPC水，将引物稀释至10μM，分装至200μL EP管中，-20℃保存备用。引物序列见下：

1.PCR反应体系如下(加样在冰上操作，20μL体系)

将反应体系于实时荧光定量PCR仪分析。

2.PCR扩增条件如下：

3.PCR结果分析

PCR结果在96SW 1.1上进行分析目的基因相对于内参基因的表达值，再在统计软件分析。

4.5统计分析

数据均以x±S表示，使用统计软件GraphPad Prism 5进行数据分析。组间比较采用独立样本量的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

二、实验结果

1、USCs亚群的增殖能力比较

使用CCK-8试剂盒检测SS-USCs与RS-USCs的增殖活性，测1到6天细胞的CCK-8孵育液OD值，绘制生长曲线，比较其增殖能力，结果见图10。

可见，两种细胞生长曲线均呈“S”形，且SS-USCs比RS-USCs有更快的增殖速率。

2、USCs亚群细胞克隆形成能力的比较

分别接种SS-USCs与RS-USCs于细胞培养瓶，培养14天后结晶紫染色，肉眼清晰可见克隆集落。对细胞克隆集落进行统计分析，结果见图11。

可见，约2.6％的SS-USCs能形成克隆，约3.65％的RS-USCs能形成克隆，RS-USCs的克隆形成能力强于SS-USCs。

3、USCs亚群的迁移能力比较

使用第3代USCs亚群细胞进行细胞划痕实验，划痕0h及40h使用倒置相差显微镜采图，结果见图12。

可见，SS-USCs迁移184.2±9.8μm，RS-USCs迁移98.5±16.0μm，表明SS-USCs比RS-USCs有更强的迁移能力。

4、USCs亚群干性基因的表达情况

取4个不同人来源的SS-USCs与5个不同人来源的RS-USCs的3代细胞，以尿液中上皮细胞为对照组，结果见图13。

可见，与对照组相比，两种USCs的多能性基因OCT-4，c-Myc表达水平均有显著的高水平表达。短期传代培养过程中，SS-USCs与RS-USCs均能维持多能性基因的高水平表达，甚至在传代后有所提高。

5、USCs亚群的肾祖细胞相关基因的表达情况

USCs亚群的存在可能与其组织来源不同有关。为了追踪SS-USCs与RS-USCs的来源，我们采用实时荧光定量PCR检测肾干细胞特异性基因CITED1，FOXD1和Six2。取不同人来源的SS-USCs与RS-USCs 3代细胞各4组，检测肾干细胞基因CITED1。结果见图14。

可见，CITED1在两种细胞中均有高水平表达，且在SS-USCs中明显高于RS-USCs，差异具有统计学意义，提示两种细胞均可能是来源于肾脏的干细胞。在两种细胞中FOXD1和Six2均处于低水平表达。

因此，两种形态的USCs亚群，增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和多向分化能力等生物学特性均存在差异，为其应用于细胞治疗奠定基础。

综上，本发明培养基及分离培养方法，可用于同时有效分离培养两种形态稳定，功能不同的尿源性干细胞亚群，不仅为组织工程和细胞治疗提供了良好的种子细胞来源，也为尿源性干细胞的临床应用提供了科学依据和理论基础，应用前景良好。

Claims (10)

1.一种同时分离人尿源性干细胞不同亚群的培养基，其特征在于，它是由K-SFM培养基和祖细胞培养基等体积混合而成，

其中，祖细胞培养基由基础培养基和添加因子组成，基础培养基由60～78％的DMEM高糖培养基、14～30％的Ham’s F12培养基、8～15％FBS组成，添加因子及在祖细胞培养基中的终浓度分别为EGF 4～6ng/mL、牛垂体提取物4～6ng/mL、氢化可的松0.3～0.5μg/mL、转铁蛋白4～6μg/mL、牛胰岛素4～6ng/mL、腺嘌呤1.4～2.2×10^-4M和3,3,5-Triiodo-L-thyromine 1.6～2.4×10^-9M。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：它是由K-SFM培养基和祖细胞培养基等体积混合而成，

其中，祖细胞培养基由基础培养基和添加因子组成，基础培养基由67.5％的DMEM高糖培养基、22.5％的Ham’s F12培养基、10％FBS组成，添加因子及在祖细胞培养基中的终浓度分别为EGF 5ng/mL、牛垂体提取物5ng/mL、氢化可的松0.4μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、牛胰岛素5ng/mL、腺嘌呤1.8×10^-4M和3,3,5-Triiodo-L-thyromine 2×10^-9M。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述牛垂体提取物购自Sciencell公司。

4.权利要求1-3任意一项所述的培养基在分离培养人尿源性干细胞中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述人尿源性干细胞为长梭形和/或谷粒状尿源性干细胞亚群。

6.一种人尿源性干细胞的分离培养方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a、取人尿液，离心，弃上清，用PBS洗涤；

b、加入权利要求1-3任意一项所述的培养基，重悬，贴壁培养；

c、换液，待细胞单克隆生长至直径0.5-2cm时，采用单克隆消化法分离单个细胞，培养；

d、对细胞进行鉴定，即可。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于：步骤a中，所述离心为400g离心10min。

8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于：步骤a中，所述PBS洗涤的方法为：加入PBS溶液混匀，400g，离心5min；重复洗涤2次。

9.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于：步骤c后，还包括消化传代步骤：取细胞进行胰酶消化传代，培养至第三代细胞，即可。

10.根据权利要求6-9任意一项所述的培养方法，其特征在于：所述培 养是在温度为37℃、体积分数为5％的CO₂的培养箱中进行。