CN101613674A - 猪静脉血管内皮细胞系及其建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪静脉血管内皮细胞系(ZYM－SVEC01)，该细胞系于2008年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.C200841。该细胞系是从猪的原代静脉血管中分离培养，采用脂质体转染法将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI－neo－hTERT导入原代培养的猪静脉血管内皮细胞，再应用G418筛选获得抗G418阳性细胞并继续继续扩大培养，最后用荧光标记的抗体进行筛选得到阳性细胞，分选后的细胞即为永生化的细胞系。该细胞系能够在营养条件要求低、细胞生长速度快，易于培养，便于推广应用。

Description

猪静脉血管内皮细胞系及其建立方法

技术领域

本发明属于动植物细胞工程技术领域，涉及建立一种新的细胞系，特别涉及猪静脉血管内皮细胞系及其建立方法。

背景技术

血管内皮细胞衬贴于心血管内腔表面，除具有屏障作用外，还可合成、分泌多种因子，在凝血、抗凝、抗纤溶、调节细胞生长、改变脂质代谢、维持血管壁完整性和管壁张力等方面具有重要作用，同时免疫调节、移植排斥、肿瘤转移、炎症消除等许多过程中发挥作用。

西北农林科技大学动科学院张彦明导师等人先后在对猪脐静脉血管内皮细胞分离与培养^[1]方法、应用端粒酶逆转录酶基因使猪血管内皮细胞永生化的初步研究^[2]、猪脐静脉血管内皮细胞永生化的初步研究^[3]中先后公开了猪脐静脉血管内皮细胞分离与培养方法、采用脂质体转染法将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪静脉血管内皮细胞进行转染后应用G418筛选获得抗G418阳性细胞继续扩大培养，用荧光抗体进行细胞流式筛选得到表达的阳性细胞在体外连续培养箱内培养，分选后得永生化的细胞系。但是该方法中由于一次将500μg/mL G418筛选至14天，用滤纸片加入胰酶消化单克隆细胞，在转入96孔中扩大培养，这样单克隆阳性细胞较少，细胞生长的数量非常少，生长缓慢，而且在生产过程中要加入20％的胎牛血清，生产成本高，不便于推广应用。

引用文献

[1]洪海霞、张彦明、孙裴等，对猪脐静脉血管内皮细胞分离与培养[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)2004年5月第32卷第5期。

[2]苏正元、张彦明、洪海霞等，应用端粒酶逆转录酶基因使猪血管内皮细胞永生化的初步研究[J].畜牧兽医学报2007.38(4)：407～411。

[3]马泉荔、洪海霞、张彦明等，猪脐静脉血管内皮细胞永生化的初步研究[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)2007年7月第35卷第7期。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种易于培养，生长速度较快，操作方法简便的猪静脉血管内皮细胞系。

实现上述发明目的技术方案是一种猪静脉血管内皮细胞系，命名为ZYM-SVEC01，该细胞系于2008年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏登记入册编号为CCTCC No.C200841，保藏单位地址：中国 武汉 武汉大学。

本发明还有一个目的是提供猪静脉血管内皮细胞系的建立方法，具体包括下列步骤：

(1)无菌采取分离猪静脉，用1g/L胶原酶消化分离内皮细胞，于37℃、5％的CO₂培养箱内培养3～7天；

(2)采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪静脉血管内皮细胞进行转染；

(3)待细胞转染pCI-neo-hTERT真核表达质粒后48小时加G418筛选，第3天细胞开始死亡，7天后用ATV于原皿消化细胞，弃去消化液并补加完全高糖DMEM培养基，待细胞完全贴壁后加入500μg/mL G418继续筛选，第14天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞，且已有G418抗性细胞开始生长，筛选一个月，G418浓度降至250μg/mL维持筛选，待细胞铺满单层开始传代，并于37℃、5％的CO₂培养箱内扩大培养，得到抗G418阳性细胞继续扩大培养，用标记CD₃₁荧光抗体进行细胞流式筛选，得到表达CD₃₁的阳性细胞；

(4)将阳性细胞在体外连续于37℃、5％的CO₂培养箱内培养，分选后细胞呈现长梭形单层贴壁生长，细胞间存在接触抑制，培养超过50代次即得永生化的细胞系。

本发明所述的完全DMEM培养液：购买自invitrogen公司GIBCO的highglucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium培养基，加入10％牛血清。

本发明的ZYM-SVEC01与现有技术相比，具有以下优点：

(1)本发明的ZYM-SVEC01的营养条件要求低，现有细胞营养条件要求低，原先需要20％的胎牛血清，羊的下丘脑提取物、肝素、谷氨酰胺等各种营养物质，而现在的细胞只要求10％的血清，大大降低了培养的成本。

(2)本发明的ZYM-SVEC01通过应用先扩大培养后筛选的方法，获得的细胞的生长状态非常好，原来传代1∶1需要3～5天现在的细胞传代1∶1传代需要1～2天，且细胞的生命力较以前非常强，便于规模化的应用。

3)本发明的ZYM-SVEC01在体外传染50代以上仍然能够保持分裂增殖，不发生衰老和死亡，是一种永生化的细胞系，现已传至93代，为研究和预防猪病提供了基本的实验材料。

附图说明

图1转染后的第30代细胞(×100)电镜图。

图2转染后的第65代细胞(×100)电镜图。

图3转染前第7代和转染后第30代、第50代细胞hTERT mRNA RT-PCR检测结果图。

图4转染后第45代细胞的hTERT荧光染色鉴定(×200)电镜图。

图5第7代细胞的hTERT荧光染色阴性对照(×200)电镜图。

图6vWF荧光染色鉴定(×100)电镜图。

图7CD34荧光染色鉴定(×100)电镜图。

图8CD31荧光染色鉴定(×200电镜)电镜图。

图9原代第7代细胞生长周期分布图。

图10转染后45代细胞生长周期分布图。

图11转染后第10、20、30、50代细胞生长曲线图。

图12原代和ZYM-SVEC01中ET-1的分泌量矩形图。

图13原代和ZYM-SVEC01中PGI2的分泌量矩形图。

图14原代和ZYM-SVEC01中NO的分泌量矩形图。

图15未接毒的对照96h时细胞保持细胞多角形形状(×100)电镜。

图16接种CSFV石门株48h的细胞(×100)电镜图。

图17接种CSFV石门株72h的细胞(×100)电镜图。

图18接毒96h时细胞(×100)电镜图。

图19接毒120h时细胞(×100)电镜图。

具体实施方式

以下结合发明人给出的猪静脉血管内皮细胞系的原代培养所用的组织材料来源、取样过程、原代培养的培养基和培养条件、传代过程和次数、传代培养组成和传代培养的条件、新细胞系的分离和鉴定特征的实施例和新细胞系的功能、使用效果试验例来进一步说明本发明的有益效果。

实施例1  ZYM-SVEC01的建立方法

(1)无菌采取分离猪静脉，用1g/L胶原酶消化分离内皮细胞，于37℃、5％的CO₂培养箱内培养3～7天；

(2)采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪静脉血管内皮细胞进行转染；

(3)待细胞转染pCI-neo-hTERT真核表达质粒后48小时加G418筛选，第3天细胞开始死亡，7天后用ATV于原皿消化细胞，弃去消化液并补加完全高糖DMEM培养基，待细胞完全贴壁后加入500μg/mL G418继续筛选，第14天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞，且已有G418抗性细胞开始生长，筛选一个月，G418浓度降至250μg/mL维持筛选，待细胞铺满单层开始传代，并于37℃、5％的CO₂培养箱内扩大培养，得到抗G418阳性细胞继续扩大培养，用标记CD₃₁荧光抗体进行细胞流式筛选，得到表达CD₃₁的阳性细胞；

(4)将阳性细胞在体外连续于37℃、5％的CO₂培养箱内培养，分选后细胞呈现长梭形单层贴壁生长，细胞间存在接触抑制，培养超过50代次即得永生化的细胞系。

所述的pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪静脉血管内皮细胞进行转染，具体包括下列步骤：

(1)转染前48小时，ATV消化传至第7代的猪静脉血管内皮细胞并计数，以1×10⁴个细胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80％～90％的汇合度；

(2)转染前24小时，更换新鲜的无血清高糖DMEM培养液；

(3)用无血清高糖DMEM培养液分别稀释2μL、4μL、6μL、8μLpCI-neo-hTERT质粒至体积为50μL，质粒浓度达到0.01μg/μL～0.04μg/μL，轻轻混匀，室温作用5分钟；

(4)用无血清高糖DMEM培养液稀释Lipofectamine 2000 Reagent(invitrogen公司购买，中文名称为脂质体2000，Cat.no.11668-027)4μL至体积为50μL，轻轻混匀，室温作用5分钟；

(5)混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此时总体积为100μL，轻轻混匀，室温作用20分钟；

(6)将12孔板中的旧培养液吸出，加入400μL无血清高糖DMEM培养液；

(7)逐滴将步骤(5)所得混合物加入到不同孔中，边加边摇动培养板，轻轻混匀；同时设立2孔未转染空白对照；

(8)于37℃、5％的CO₂培养箱中孵育4～6小时，弃去培养液，加入完全高糖DMEM培养液。

所述的细胞流式筛选，具体包括下列步骤：

(1)用ATV消化扩大培养的G418筛选阳性的血管内皮细胞群，800转/分钟离心10分钟，弃上清；

(2)沉淀中加入PBS轻轻吹打垂悬细胞，以800转/分钟离心10分钟，重复洗两次，弃上清；

(3)用无血清高糖DMEM培养液制成细胞悬液，300目滤网过滤收集单细胞悬液，台盼兰染色，计数；

(4)用无血清高糖DMEM培养液将细胞稀释成10⁷个/mL的悬液，取900μL悬液至EP管，加入FITC标记的小鼠抗猪CD₃₁抗体，37℃细胞培养箱中孵育1小时，另取100μL悬液于37℃细胞培养箱中培养，不加抗体作为阴性对照；

(5)流式细胞仪进行无菌分选，并收集CD₃₁阳性细胞5.64×10⁵，接种到10％高糖DMEM培养基中，于37℃、5％的CO₂培养箱内培养。

本发明所述的高糖DMEM培养基是在购买自invitrogen公司GIBCO的highglucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium培养基中加入10％胎牛血清。

本发明所述的无血清高糖DMEM培养液是不加10％胎牛血清的高糖DMEM培养液。

试验例1

1.细胞形态学特征

细胞经转染后于相差显微镜下观察形态变化，并与原代静脉血管内皮细胞进行比较。

ZYM-SVEC01与原代细胞形态相似，为成纤维细胞样，细胞中央核明显，清晰可见2个或2个以上核仁。大多数细胞形态呈多角形或短梭状，细胞呈典型的鹅卵石铺路石状排列，细胞间存在接触抑制。

2.RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT的表达

(1)引物设计与合成

根据GenBank中已发表的人端粒酶反转录酶基因参考序列(登录号为NM-198253)设计1对特异性检测引物，上下游引物分别为P1：5′-GCC GAAGAA GCC ACC TC-3′；P2：5′-GCC GCA TTT GCC AGT AG-3′，扩增片段大小为399bp，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

(2)细胞总RNA的提取

①转染细胞与原代细胞分别用ATV消化后接种到35毫米培养皿中，待细胞铺满单层后取出，用灭菌PBS洗两遍，弃去液体。

②加入750μL Trizol试剂，上下颠倒混匀，待细胞裂解完全后，将细胞裂解液吸到DEPC水处理过的1.5mL灭菌EP管中，4℃静置5分钟。

③加200μL氯仿，充分震荡至乳化均匀，4℃静置15分钟。

④在4℃以12000转/分钟离心15分钟。

⑤轻轻吸取上清450μL转移入另一新的DEPC水处理过的1.5mL灭菌EP管，加入500μL冰冷异丙醇(-20℃贮存)，轻轻颠倒混匀，置-20℃过夜。

⑥在4℃以12000转/分钟离心10分钟。

⑦弃上清，加入1mL冰冷的750mL/L乙醇，轻轻颠倒几次，在4℃以12000转/分钟离心10分钟。

⑧弃上清，倒置EP管，室温干燥核酸。

⑨加入20μL DEPC水溶解RNA。

(3)第一链cDNA合成

在0.5mL PCR反应管中加入如下溶液和试剂进行反转录：

5×AMV buffer                   4.0μL

                                                    

dNTP(10mmol/L)                  4.0μL

                                                    

随机引物(50pmol/μL)            1μL

                                                    

RNA模板                         9.5μL

                                                    

RNase Inhibitor                 0.5μL

                                                    

吹打混匀，稍离心，加入AMV反转录酶1.0μL，于42℃水浴作用1.5小时。

(4)PCR扩增双链cDNA

在PCR反应管中配制如下反应体系：

反转录产物(cDNA)            10μL

10×PCR buffer(Mg2+free)    5μL

dNTP                        4μL

上游引物P1                  0.5μL

下游引物P2                  0.5μL

MgCl₂                       3μL

灭菌去离子水                26.5μL

Taq DNA聚合酶               0.5μL

混匀后置于PCR扩增仪中，95℃预变性5分钟；94℃，30秒，58℃，30秒，72℃，30秒，进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。扩增完成后，PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果(见图3，图中M.Maker；1.F7；2.F30；3.F50)。

3.间接免疫荧光法检测细胞中外源性hTERT的表达

(1)在24孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5cm×0.6cm，SUVECs用ATV消化成单细胞，计数后调整细胞浓度至2×105个/mL，每孔中接种0.5mL细胞悬液。

(2)待细胞生长至近融合状态(低密度单层)时，用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)洗3遍，加入0.4g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，细胞面朝上，室温固定10分钟，用PBS冲洗3次，每次3分钟。

(3)加入2g/L Triton室温作用20分钟，用PBS冲洗3次，每次3分钟。

(4)加入1∶100倍稀释的小鼠抗人hTERT抗体50μL于盖玻片上，放入湿盒内4℃过夜。同时不加一抗做阴性对照，用PBS冲洗3次，每次3分钟。(5)加入Cy3标记的二抗山羊抗小鼠IgG，于37℃孵育1小时后，用PBS洗涤3次，然后立即在荧光显微镜下观察，照相。图4中的细胞呈红色荧光，图5阴性细胞没有荧光，说明培养的细胞表达hTERT基因。

4.内皮细胞相关抗原的鉴定

(1)vWF抗原间接免疫荧光检测除加入的一抗为兔抗人vWF抗原抗血清外，其余操作步骤同hTERT鉴定。

(2)CD₃₄免疫荧光检测除加入的一抗为兔抗人CD₃₄因子相关抗原抗血清外，其余操作步骤同hTERT鉴定。

(3)CD₃₁直接免疫荧光检测

①在24孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5cm×0.6cm，SUVECs用ATV消化成单细胞，计数后调整细胞浓度至2×105个/mL，每孔中接种0.5mL细胞悬液。

②待细胞生长至近融合状态(低密度单层)时，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗3遍，加入0.4g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，细胞面朝上，室温固定10分钟，用PBS冲洗3次，每次3分钟。

③加入2mL/L Triton室温作用20分钟，用PBS冲洗3次，每次3分钟。④加入FITC标记的小鼠抗猪CD₃₁单克隆抗体50μL于盖玻片上，置湿盒37℃孵育1小时。同时不加一抗做阴性对照，用PBS冲洗3次，然后立即在荧光显微镜下观察，照相。图6检测vWF抗原，细胞发红色荧光，图7检测CD₃₄细胞发红色荧光，图8检测CD₃₁细胞发红色荧光。

5.流式细胞仪(FCM)检测猪静脉血管内皮细胞系(ZYM-SVEC01)周期

(1)待测ZYM-SVEC01样本制成单细胞悬液，然后1000转/分钟离心5分钟，弃上清。

(2)用4℃预冷的700mL/L冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。

(3)调整细胞浓度为106个/mL，取1mL细胞悬液，用PBS洗3次，细胞重悬于1mL PI染液(终浓度为50μg/mL)中，37℃孵育30分钟，进行流式细胞仪分析(见图9至10)。

6.生长曲线的测定

将第转染后第10、20、30、50代hTERT-SUVECs按1×104个/孔接种于24孔板，3～4天换液1次，每天用2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，血细胞计数板计数。每个时间点设3个平行孔，每个孔计数3次，取其平均值绘制细胞的生长曲线。图11说明细胞在第3天数量开始增长，到了第5、6天时细胞数量达到最大，约为5×10⁵个。

试验例2本发明猪血管内皮细胞系(ZYM-SVEC01)的功能学特征

内皮细胞能通过膜受体途径感知血流动力学变化和血液传递的信号，并在接受物理和化学刺激后合成和分泌多种血管活性物质，这些物质按其化学组成可分为4大类，即：小分子物质[一氧化氮(NO)、自由基、组织胺等]、蛋白质[内皮素-1(ET-1)、缓激肽(BK)、黏附分子、组织纤溶酶原激活物(tPA)、肝细胞生长因子(HGF)等]、酶类[血管紧张素转换酶(ACE等)]和脂类[前列环素(PGI₂)、白三烯等]。它们的功能可概括为：调节血管张力，调节凝血和纤溶系统的平衡，调节血管壁的炎症反应和调节血管平滑肌增殖等4个方面。

为了检测转染前后血管内皮细胞的分泌功能有无异常或丧失，我们对转染前后的内皮细胞培养上清的ET、NO和前列环素的含量进行了测定。

方法与步骤

1.ET-1含量的测定

(1)将传至第3代静脉血管内皮细胞和传至第35代ZYM-SVEC01细胞分别接种于12孔板，分别于培养第2天，第4天和第6天收集细胞上清，每次3孔，放-20℃保存待测。

(2)取待测细胞上清2mL，加入10％EDTA二钠30μL和抑肽酶40μL，混匀，4℃，3000转/分钟离心10分钟，去上清，置-20℃保存备用。

(3)将待测样品与抗血清100μL混合，摇匀，4℃放置24小时。

(4)加入¹²⁵I-ET 100μL，摇匀，4℃放置24小时。

(5)加入PR分离剂500μL，混匀，室温放置20分钟，3500转/分钟离心25分钟，吸弃上清，在γ计数器上测定沉淀每分钟计数。

(6)结果计算，以自动γ计数器预先编制程序，直接给出有关曲线，标准曲线及样品浓度。ET含量以pg/mL表示。

2.PGI2含量的测定

(1)将传至第3代静脉血管内皮细胞和传至第35代ZYM-SVEC01细胞分别接种于12孔板，分别于培养第2天，第4天和第6天收集细胞上清，每次3孔，放-20℃保存待测。

(2)取待测细胞液2mL，于4℃、3500转/分钟离心15分钟，取上清备用。

(3)用试剂盒中缓冲液A将标准品依次倍比稀释，浓度分别为25、50、100、200、400、800、1600pg/mL。

(4)分别取各浓度标准品和待测样品200μL，与抗血清100μL混匀，37℃放置5～6小时。

(5)各管中加入125I-6-Keto-PGF1a 100μL，混匀，4℃放置24小时。

(6)加入PR分离剂500μL，混匀，室温放置15分钟，3500转/分钟离心20分钟，吸弃上清，在γ计数器上测各管沉淀每分钟计数。

(7)结果计算，以自动γ计数器预先编制程序，直接给出有关曲线，标准曲线及样品浓度。6-Keto-PGF1a含量以pg/mL表示。

3.NO含量的测定

(1)将传至第3代血管内皮细胞和传至第35代ZYM-SVEC01细胞分别接种于12孔板，分别于培养第1天、第2天、第4天和第6天收集细胞上清，每次3孔。

(2)双蒸水，100μmol/L标准品用液，和待测细胞液各取0.1mL，与试剂盒中试剂1和试剂2各0.2mL混匀，37℃准确水浴60分钟。

(3)各管中分别加入0.2mL试剂(3)，0.1mL试剂(4)，充分漩涡混匀30秒，室温静置10分钟，3500转/分钟离心10分钟n，取上清。

(4)各管上清各取0.5mL，加入显色剂0.6mL，混匀，室温静置10分钟。

(5)蒸馏水调零，550nm，0.5cm光径，测各管吸光度值。

(6)结果计算，按以下公式计算NO含量，单位以μmol/L表示。

NO含量(μmol/L)＝(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度(100μmol/L)×样品测试前稀释倍数

4.统计学处理

数据以均数±s表示，用SPSS13.0统计学软件包进行单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05视为有统计学意义。

5.结果

(1)ET-1分泌量

分别检测了35代ZYM-SVEC01和第3代静脉血管内皮细胞在培养2天、4天、6天的ET-1的细胞培养液中的含量，如图12所示，在一个生长周期内，ZYM-SVEC01和原代细胞的ET分泌量随时间而增加，培养6天的ET分泌量显著高于培养4天和2天(P＜0.05)。两者在不同时间段内细胞培养上清中ET-1含量接近，无显著性差异(P＞0.05)。

(2)PGI2分泌量

如图13所示，ZYM-SVEC01和原代细胞的PGI₂分泌量在培养第4天时达到最高，然后开始下降，第6天时其培养液中含量明显低于培养第4天和第2天。在一个生长周期内，ZYM-SVEC01和原代细胞的PGI₂分泌量变化一致，两者在不同时间段内的细胞培养上清中PGI₂含量也较为接近。

(3)NO分泌量

如图14所示，SUVECs在一个生长周期内，其NO分泌量变化起伏较大，而ZYM-SVEC01的NO分泌量变化相对平缓。总体上，除第1天外，原代细胞培养上清中NO的含量均高于ZYM-SVEC01培养上清中的含量，差异显著(P＜0.05)。

试验例3猪瘟病毒对本发明ZYM-SVEC01转染后的病变作用

取转染后的第60代细胞，待长成80％单层时吸弃培养液并以D-Hanks液洗涤2次后接CSFV石门株，37℃吸附1小时，吸弃多余的病毒液后加DMEM维持液(含2％无牛病毒性腹泻病毒抗体的胎牛血清)培养。同时设空白(不接毒)对照。分别于48、72、96、120小时观察细胞形态。从图15至19可以看出随着时间的增加，猪瘟病毒对转染后细胞致病变作用更加剧烈，细胞开始变圆，细胞内部出现空泡，死细胞增多，细胞脱落死亡。

Claims (2)

1.猪静脉血管内皮细胞系(ZYM-SVEC01)，该细胞系于2008年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏登记入册编号为CCTCC No.C200841。

2.建立权利要求1所述的猪静脉血管内皮细胞系的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

(1)无菌采取分离猪静脉，用1g/L胶原酶消化分离内皮细胞，于37℃、5％的CO₂培养箱内培养3～7天；

(2)采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪静脉血管内皮细胞进行转染；

(3)待细胞转染pCI-neo-hTERT真核表达质粒后48小时加G418筛选，第3天细胞开始死亡，7天后用ATV于原皿消化细胞，弃去消化液并补加完全高糖DMEM培养基，待细胞完全贴壁后加入500μg/mL G418继续筛选，第14天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞，且已有G418抗性细胞开始生长，筛选一个月，G418浓度降至250μg/mL维持筛选，待细胞铺满单层开始传代，并于37℃、5％的CO₂培养箱内扩大培养，得到抗G418阳性细胞继续扩大培养，用标记CD₃₁荧光抗体进行细胞流式筛选，得到表达CD₃₁的阳性细胞；

(4)将阳性细胞在体外连续于37℃、5％的CO₂培养箱内培养，分选后细胞呈现长梭形单层贴壁生长，细胞间存在接触抑制，培养超过50代次即得永生化的细胞系。

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