CN103194424A - 一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法 - Google Patents

Abstract

一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法，包括采用悬滴培养法使胚胎干细胞分化为三个胚层细胞，并使用免疫磁珠细胞分选法纯化出定型内胚层细胞；利用定型内胚层细胞，进一步诱导使其分化为胰腺前体细胞；使胰腺前体细胞在体外进一步分化，形成较高淀粉酶分泌能力的胰腺组织样细胞。本发明的技术方案采用多种诱导因子分阶段诱导分化方式，表明了胚胎干细胞具有分化为胰腺外分泌细胞的潜能，并找出了诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的有效途径，使胰腺前体细胞修复胰腺损伤成为可能，为胰腺损伤提供更多细胞来源。

Description

一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程领域，具体涉及一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法。

背景技术

胰腺是人体重要的内、外分泌器官，位于腹上区和左季肋区的腹膜后面，分为内分泌部和外分泌部两部分。外分泌部由导管（导管细胞的标志分子CK19）和腺泡构成，可合成并分泌淀粉酶（amylase）、脂肪酶等。内分泌部分散在外分泌部之间，主要由A细胞、B细胞、D细胞和PP细胞组成，分别分泌胰高血糖素、胰岛素、生长抑素和胰多肽。目前急性重症胰腺炎、慢性胰腺炎和胰腺癌的治疗十分棘手。而研究胰腺外分泌细胞在体外的分化及发育过程，可能为研究胰腺疾病的发生机制提供新思路，为研究胰腺损伤提供新的治疗方法。

干细胞具有强大的自我更新及多向分化潜能，为多种疾病的治疗提供了一种新的手段。干细胞根据发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是指着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞。ESC具有增殖、自我更新和强大的多向分化能力，在体内、外可以诱导分化为几乎所有的组织细胞。1981年Evans等分离小鼠胚胎干细胞，建立小鼠的胚胎干细胞系。研究表明小鼠ESC在去除LIF的培养基中可以形成胚体(embryonic bodies,EBs),分化为外、中、内胚层，内胚层包括定型内胚层和脏内胚层。定型内胚层起源于前原肠胚，随着胚胎的发育形成原始消化道及与消化道相关的脏器组织，比如胰腺、肝脏等。因此定型内胚层可以作为胰腺细胞、肝细胞及肠道上皮细胞的前体细胞群，进行体外定向诱导分化的研究。近年来，研究胚胎干细胞在体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及胰岛样细胞较多，研究分化为胰腺外分泌细胞的报道甚少。在Gouon-Evans V等人的研究中，以ESC来源的定型内胚层为前体细胞，通过BMP-4的诱导，成功在体外获得可以产生甲胎蛋白（AFP）及白蛋白的肝脏样细胞，这一研究成果为以定型内胚层作为诱导分化的前体阶段，实施胰腺前体细胞及胰腺内外分泌细胞的定向诱导分化提供了实验基础。

信号通路在干细胞增殖分化中扮演了重要的调控角色。多个研究报道显示，在ESC体外形成EB的自然分化过程中可以形成一定比例的定型内胚层。研究表明，在胚胎发育过程中，激活Nodal通路及抑制Shh通路可以诱导及促进胰腺细胞、组织的分化和发育。因此调控Nodal通路和Shh通路，为ESC体外诱导分化定型内胚层细胞，进一步诱导分化为胰腺组织样细胞提供了有效途径；为ESC体外诱导分化为胰腺组织样细胞修复胰腺损伤提供实验基础。

发明内容

本发明的所解决的技术问题在于提供一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法，通过诱导胚胎干细胞分化为内胚层细胞，然后通过进一步诱导使其分化为胰腺前体细胞，随后进一步分化为可以分泌淀粉酶的胰腺组织样细胞。

为此，本发明提供一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法，包括如下步骤：步骤一、采用悬滴培养法使胚胎干细胞分化为三个胚层细胞，并使用免疫磁珠细胞分选法（Magnetic active cell sorting,MACS），纯化出定型内胚层细胞；

步骤二、利用定型内胚层细胞，进一步诱导使其分化为胰腺前体细胞；

步骤三、使胰腺前体细胞在体外进一步分化，形成较高淀粉酶分泌能力的胰腺组织样细胞。

其中，所述步骤一是采用悬滴培养法使小鼠胚胎干细胞分化为三个胚层细胞，并使用定型内胚层的特异性标志物标记的磁珠分选纯化出定型内胚层细胞；步骤三中胰腺组织样细胞为胰腺外分泌细胞。

步骤二、利用定型内胚层细胞，进一步使其分化胰腺前体细胞；

步骤三、使胰腺前体细胞，在体外进一步分化，形成较高淀粉酶分泌能力的胰腺外分泌细胞。

优选地，所述小鼠胚胎干细胞为E14TG2a系小鼠胚胎干细胞。

优选地，所述定型内胚层的特异性标志物为CXCR-4-分子。

优选地，所述步骤二中是通过使用环杷明（Cyclopamine）及Exendin-4联合诱导，使定型内胚层细胞分化为胰腺前体细胞。

优选地，所述步骤二中环杷明和Exendin-4在培养基的浓度为1.0uM和10nM。

优选地，所述步骤一的悬滴培养过程中包括：

使小鼠胚胎干细胞在去除白血病抑制因子的培养基中可以形成胚体；

而后在无血清培养基中培养分化成三个胚层细胞，所述无血清培养基中添加有对定型内胚层分化起促进作用的诱导剂Activin A。

优选地，所述步骤一中，使用定型内胚层的特异性标志物标记的磁珠分选纯化出定型内胚层细胞包括如下步骤：

取经Activin A诱导的胚体细胞，经消化处理后加入藻红蛋白标记的大鼠抗小鼠CXCR-4单克隆抗体标记；

制成重悬细胞液后加入抗藻红蛋白免疫磁珠摇匀、孵育苗，再分选纯化出定型内胚层细胞。

本发明的方法选择免疫磁珠分选细胞，保证后续实验的细胞活性，使细胞在分选后仍可保持较好增殖和好的状态。在步骤一中，在无血清培养基中添加有对定型内胚层分化起促进作用的诱导剂Activin A悬滴培养的EB，定型内胚层细胞比例明显增加，并使EB中CXCR4+细胞比例显著高于对照组。从而说明Activin A诱导的EB，能够分化得到更多的定型内胚层细胞。并以定型内胚层特异性标志CXCR-4作为分选标记，免疫磁珠分选出CXCR-4阳性细胞和CXCR-4阴性细胞，结合本发明实施中结论说明免疫磁珠分选可降低分化体系中胚胎干细胞的比例。因此，利用MACS可得到较高纯度的分化细胞，且细胞存活率不受影响，为下一步诱导胰腺组织样细胞提供更多的细胞来源。

另外，在步骤二中通过使用环杷明（Cyclopamine）及Exendin-4联合诱导，使定型内胚层细胞分化为胰腺前体细胞。本发明实施例中MACS分选CXCR4阳性细胞及阴性细胞分别添加和不添加1.0uM Cyclopamine和10nM Exendin-4诱导分化实验结果表明：CXCR4阴性细胞添加Cyclopamine和Exendin-4组，Shh表达量显著低于不添加Cyclopamine和Exendin-4组，（所有P＜0.05），Pdx1表达量在两组间无差异（P>0.05）；CXCR4阳性细胞在第1、5、7、9天添加与不添加Cyclopamine和Exendin-4组，Shh和Pdx1表达量差异性不显著（P＞0.05）；CXCR4阳性细胞在第3天加Cyclopamine和Exendin-4组，Shh表达量显著低于无添加组（P均＜0.05），而Pdx1表达量显著高于无添加组（P均＜0.05）。

胰腺外分泌部由导管（导管细胞的标志分子CK19）和腺泡构成，可合成并分泌淀粉酶、脂肪酶等，因此CK19和淀粉酶可作为评价及鉴定胰腺外分泌细胞的依据。在CXCR4⁺定型内胚层细胞添加Cyclopamine和Exendin-4诱导3天所得Pdx1^highShh^low胰腺前体细胞，该细胞继续在体外分化后第3、6、9、12天的CK19和淀粉酶mRNA表达量均显著高于同时间点CXCR4⁺定型内胚层细胞未添加（Cyclopamine和Exendin-4）诱导组及CXCR-4阴性细胞组（所有P＜0.05）；结果证明，经Cyclopamine和Exendin-4诱导后的CXCR4阳性细胞具备更高的分化为胰腺外分泌细胞，即胰腺组织样细胞的能力。

总而言之，本发明的诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法采用多种诱导因子分阶段诱导分化方式，表明了胚胎干细胞具有分化为胰腺外分泌细胞的潜能，并找出了诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的有效途径，使胰腺前体细胞修复胰腺损伤成为可能，为胰腺损伤提供更多细胞来源。

附图说明

图1为实施例2中细胞表面CXCR4表达的流式细胞仪测定结果图；

图2为实施例2中CXCR4阳性细胞比例的测定实验结果图；

图3为实施例2中SF-A、SF培养基培养的EB5细胞表面显微图（微镜标尺在A、B中为50μm）；

图4为为实施例3中MACS分选后CXCR4阳性细胞的形态图；

图5为为实施例3中MACS分选后CXCR4阳性细胞+1.0umol/L的Cyclopamine培养的细胞形态图；

图6为为实施例3中MACS分选后CXCR4阴性细胞的形态图；

图7为为实施例3中MACS分选后CXCR4阴性细胞+1.0umol/L的Cyclopamine培养的细胞形态图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1E14TG2a系小鼠ESC的扩增及EB的培养

1、鼠E14TG2a系ESC的培养：

（1）ESC的复苏：常规消毒超净工作台，在无菌15ml离心管中加入10ml小鼠ESC培养基，从液氮罐中取出冻存的小鼠E14TG2a系ESC一管，立即放置37℃的水浴箱中，并振荡，观察细胞悬液的解冻情况，待至约2/3解冻后把冻存管经75％酒精喷洒消毒后放入超净台，用吸管把细胞悬液转移至含有10ml培养基的离心管中，并吹打匀，进行1000rpm室温离心5min，弃去上清液，加入5mlESC培养基，吹打均匀后转移至25cm²培养瓶中，放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱中。

⑵细胞换液及传代：依据培养瓶中旧液的情况决定是否换液，通常每日全量换液1次。当ESC扩增到70％～80％覆盖瓶底时进行传代。首先弃去瓶中旧液，用0.1M PBS清洗1遍，弃去PBS，加入2ml0.25％胰蛋白酶/0.04%EDTA消化液，消化45sec，加入2ml胰蛋白酶中和液，用吸管吹打至所有细胞脱壁，把细胞悬液转移至15ml离心管中，进行1000rpm室温离心5min，弃去上清液，加入6ml ESC培养基，吹打均匀后等分至6个25cm²培养瓶中（即1：6传代），每瓶培养基补充至5ml，然后培养瓶放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱中。

⑶ESC的冻存：当ESC扩增到70％～80％覆盖瓶底时进行冻存。首先弃去瓶中旧液，用0.1M PBS清洗1遍，弃去PBS，加入2ml0.25％胰蛋白酶/0.04%EDTA消化液，消化45sec，加入2ml胰蛋白酶中和液，用吸管吹打至所有细胞脱壁，把细胞悬液转移至15ml离心管中，进行1000rpm室温离心5min，弃去上清液，加入细胞冻存液重悬细胞，调整细胞浓度为1.0～1.2×10⁷/ml。把细胞悬液转移至冻存管中，先放置于4℃30min，转至-30℃30min，再转至-80℃过夜，第二天转移至液氮罐中保存。

小鼠ESC在传代后6～8h逐渐在培养瓶中贴壁生长，细胞呈小圆形，细胞核大，有一个或几个核仁，胞质胞浆少。形成边缘清楚的细胞克隆，克隆呈“巢状”或“岛状”，其中细胞排列紧密，与周围存在明显边界。小鼠ESC的直径约7μm～18μm。ESC细胞增殖能力强，每2～3天即可1：6传代一次。

2.EB的悬滴培养法：

当小鼠ESC扩增到70％～80％覆盖瓶底时可进行EB的培养。首先弃去瓶中旧液，用0.1M PBS清洗1遍，弃去PBS，加入2ml0.25％胰蛋白酶/0.04%EDTA消化液，消化45sec，加入2ml胰蛋白酶中和液，用吸管吹打至所有细胞脱壁，把细胞悬液转移至15ml离心管中，进行细胞计数，计算ESC总量，随后进行1000rpm室温离心5min，弃去上清液，加入EB培养基，吹打均匀，调整细胞浓度为1.0×10⁶/ml左右。取出无菌90mm培养皿，在皿盖上使用定量移液器接种细胞悬液液滴，每滴32μl，在皿中加EB培养基3～5ml，翻转皿盖并盖合至皿上，用胶带固定，注明时间。放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱中。每日进行换液，皿盖倾斜约45°，使用定量移液器，每次每个液滴更换EB培养基25μl。

采用悬滴培养法，ESC以1.0×10⁶/ml的细胞浓度接种后24h即可观察到液滴中的细胞聚集成一个肉眼可见的EB，EB周围的培养基清亮。每个90mm皿盖可以接种EB约40个。显微镜下观察，所形成的EB为边界清楚的细胞团，周围培养基中散在分布的单个细胞极少。EB的直径大小约1.0～1.5mm。当培养至5～7天时，部分EB（大约10％）可以观察到节律性搏动。

实施例1中，小鼠ES-E14TG2a系ESC，购于American Type Culture Collection(ATCC)。

ESC培养基配方为：

以高糖DMEM为基础培养基，添加碳酸氢钠（NaHCO₃）、HEPES、非必需氨基酸、胎牛血清、β-巯基乙醇、青霉素/链霉素、LIF，各添加物的终浓度为：10%胎牛血清，10mM HEPES,0.12%NaHCO₃,0.1mM非必需氨基酸,0.1mMβ-巯基乙醇，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素,1000U/ml LIF。

过0.22μm滤器除菌，4℃保存。

EB培养基配方为：

以高糖DMEM为基础培养基，添加碳酸氢钠（NaHCO₃）、HEPES、非必需氨基酸、胎牛血清、β-巯基乙醇、青霉素/链霉素，各添加物的终浓度为：10%胎牛血清，10mM HEPES,0.12%NaHCO₃,0.1mM非必需氨基酸,0.1mMβ-巯基乙醇，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。

胰蛋白酶中和液，以高糖DMEM为基础培养基，添加10%胎牛血清过0.22μm滤器除菌，4℃保存。细胞冻存液由无菌高糖DMEM7ml，胎牛血清2ml，DMSO1ml组成，使用前现配。

实施例2定型内胚层在EB形成过程中的分化及Activin A对其分化的促进作用

1、本实施例中用到的培养基：

（1）Activin A无血清培养基（SF-Activin A）：

以高糖DMEM为基础培养基，添加碳酸氢钠（NaHCO₃）、HEPES、非必需氨基酸、KSR、β-巯基乙醇、青霉素/链霉素、重组Activin A，各添加物的终浓度为：10%KSR，10mM HEPES,0.12%NaHCO₃,0.1mM非必需氨基酸,0.1mMβ-巯基乙醇，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素,50ng/ml Activin A。

过0.22μm滤器除菌，4℃保存。

（2）血清对照培养基（SF）：

以高糖DMEM为基础培养基，添加碳酸氢钠（NaHCO₃）、HEPES、非必需氨基酸、KSR、β-巯基乙醇、青霉素/链霉素，各添加物的终浓度为：10%KSR，10mM HEPES,0.12%NaHCO₃,0.1mM非必需氨基酸,0.1mMβ-巯基乙醇，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。

过0.22μm滤器除菌，4℃保存。

（3）EB培养基（FCS）：

以高糖DMEM为基础培养基，各添加物的终浓度为：100ml/L胎牛血清，10mmol/LHEPES,0.12%NaHCO₃,0.1mmol/L非必需氨基酸,0.1mmol/Lβ-巯基乙醇。

2、细胞表面CXCR4表达的流式细胞仪（FACS）测定：

（1）EB的消化及细胞悬液的制备：

将实施例1中获取的EB分别在Activin A无血清培养基（SF-Activin A）、血清对照培养基（SF）、EB培养基（FCS）中进行培养，并按如下步骤进行测定实验：

各阶段待测的EB用吸管转至15ml的离心管中，700rpm离心3min，去上清，用0.1M PBS洗一遍，离心去除PBS后，加入0.25％胰蛋白酶/0.04%EDTA消化液，边消化边用吸管吹打，共消化1min，加入等量的胰蛋白酶中和液，继续吹打均匀，过300目/cm²细胞筛，进行细胞计数，然后予1000rpm离心5min，去上清后，PBS洗一遍，用流式细胞仪抗体稀释液重悬细胞，调整细胞密度为1.0×10⁶/ml，在避光情况下根据细胞数量，按10μl/1.0×10⁵个细胞的剂量加入PE标记的抗小鼠CXCR4单克隆抗体，4℃下孵育45min，随后PBS洗两遍，再用PBS重悬为1.0×10⁶/ml密度的细胞悬液上机测定。同时制备不加抗体的标本用于流式细胞仪调节补偿，以未分化的ESC作为阴性对照组。

如图1所示，SF-A组中CXCR4^＋细胞在第1、3、5、7天EB中的比例分别为10.4%±2.63％、29.1%±2.41％、41.9%±4.21％、26.7%±2.36％；SF组中分别为4.5%±1.37％、7.3%±1.84％、17.5%±2.90％、12.8%±3.88％；FCS组中分别为8.8%±3.68％、24.5%±3.76％、33.4%±2.87％、16.5%±3.36％。根据上述结果，SF-A组第5天的EB中定型内胚层比例显著高于其他组及其它分化阶段（n＝3，SF-A组VS SF组：t=8.273，P=0.001；SF-A组VS FCS组：t=2.884，P=0.045）。

（2）CXCR4阳性细胞比例的测定：

由于本次研究使用的CXCR4抗体为PE（Phycoerythrin）标记，选择488nm的激光进行测定。重点观察不同培养条件下CXCR4^＋细胞在ESC及第1、3、5、7天EB中的表达情况。细胞表面分子的表达分析采用Beckman Coulter EPICSALTRA流式细胞仪，各象限细胞比例等数据记录采用EXPO32MultiCOMP v1.1C软件，数据分析采用EXPO32analysis v1.2B软件。

如图2所示，流式细胞仪测定各组中不同阶段CXCR4阳性细胞的比例。A：流式细胞仪测定结果。B：CXCR4阳性细胞的比例（SF-A组VS SF组：P=0.001；SF-A组VS FCS组：P=0.045）。

5、SF-A、SF和FCS组EB5细胞表面CXCR4表达的细胞免疫化学测定：

（1）标本的制备：

细胞爬片的制备：取无菌的细胞爬片专用盖玻片放入6孔板中，取SF-A、SF和FCS培养基悬滴培养第4天的EB消化吹打均匀，调整细胞密度为5×10⁴/ml细胞，每孔加入2ml细胞悬液。待细胞贴壁生长1天后，吸去培养基，加入0.1MPBS洗1遍，弃去PBS，每孔加入4％多聚甲醛1ml，室温固定45min，吸去多聚甲醛后，PBS洗2遍，弃去PBS，4℃保存。

（2）CXCR-4的免疫化学染色后通过电子显微镜观察，如图3所示，CXCR-4阳性显示为棕黄色或者棕褐色。从实验结果来看，利用细胞免疫化学方法观察添加（SF-A组）和不添加（SF组）50ng/ml Activin A诱导分化的EB5中定型内胚层细胞比例，结果显示，SF-A组中CXCR-4的表达显著高于对照组SF组。

本实施例中检测结果表明，在维持悬浮培养的状态下，Activin A可以提高EB中定型内胚层的分化比例。为了保持EB更好的自然分化状态，在加入Activin A后EB继续采用悬滴法进行悬浮培养，同时用KSR替代培养基中的胎牛血清，以减少血清中促分化成分对Activin A诱导的干扰。结果显示，以CXCR4作为定型内胚层的标志分子，Activin A诱导组中CXCR4^＋细胞的比例明显增加。在Activin A诱导分化后的第5天，EB中CXCR4^＋细胞的比例达41.9%±3.21％，显著高于对照组。

实施例3，环杷明诱导免疫磁珠分选胰腺前体细胞

1、免疫磁珠分选SF-A组的EB5：

（1）EB的消化及细胞悬液的制备：

取经50ng/ml的Activin A诱导的EB5，用吸管转至15ml的离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，用0.1M PBS洗一遍，离心后弃PBS，加入0.25％胰蛋白酶/0.04%EDTA消化液，边消化边用吸管吹打，总共消化1min，加入等量的胰蛋白酶中和液，继续吹打均匀，细胞悬液过200目/cm²细胞筛后，细胞计数。将细胞悬液于4℃，300×g，10min离心，弃上清，根据细胞计数，按照10ul/1.0×10⁵个细胞的剂量（最大不超过200ul）加入PE标记的大鼠抗小鼠CXCR-4单克隆抗体（R&D公司购买），4℃下孵育20min。加入running buffer洗2遍，300×g，10min离心，弃上清液。按照80ul/1×10⁷个细胞的量加入running buffer重悬细胞。按照20ul/1×10⁷个细胞的量加入抗PE免疫磁珠（美天旎公司购买），摇匀后4℃孵育15min。加入running buffer洗2遍，300×g，10min离心，弃上清。加入runningbuffer重悬细胞，调整密度为1×10⁸/ml，每次取500ul上机分选。

实验结果如图4-7所示，在MACS分选完后，CXCR4阳性细胞活性比CXCR4阴性差，同样接种密度和体积，存活的细胞数比CXCR-4阴性明显减少。CXCR4阴性细胞分化主要为上皮样细胞和纤维样细胞，在CXCR4阳性细胞尤其是添加1.0uMCyclopamine和10nM Exendin4，随着诱导时间延长，可见胰岛样细胞团，细胞团逐渐增大，数量增多，周围可见大量纤维样细胞及上皮样细胞。

2、细胞培养：

取2支15ml无菌离心管中分别加入2mL进口胎牛血清，接MACS分选出CXCR-4阳性和阴性细胞。离心1000r/min，5min，SF培养基清洗2遍。离心1000r/min，5min，加入或者不加入1.0uM Cyclopamine和10nM Exendin-4培养基，不加入Cyclopamine和Exendin-4用SF培养基培养细胞，总共分为四组，A组:CXCR4+/Cycl+&Ex4+；B组：CXCR4+/Cycl-&Ex4-；C组：CXCR4-/Cycl+&Ex4+；D组：CXCR4-/Cycl-&Ex4-。使四组调整成一样的细胞密度接种于六孔板，细胞密度大约为4×10⁴/ml。

3、总RNA提取：

（1）细胞标本移入DEPC处理过的1.5ml离心管，去上清后加入1ml TRIzol试剂，吹打均匀后，冰上静置5min；

（2）上述溶液中加入0.2ml氯仿（三氯甲烷），振荡15sec，冰上静置3min，进行4℃，15min，12000rpm离心；

（3）取离心后上层无色水相到另一1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，冰上静置10min，进行4℃，10min，12000rpm离心；

（4）离心后去上清，吸干管口，加入用dH₂O现配的75％乙醇1ml，进行4℃，5min，7500rpm离心；

（5）离心后去上清，吸干管口，气干沉淀8～10min，加入dH₂O20～30μl，振摇；标本-20℃保存。

4.RNA标本质量及浓度测定：

（1）琼脂糖凝胶电泳法：

用dH₂O配1％琼脂糖溶液，微波加热至沸腾后室温静置待凉，待温度降至约40～50℃，倒入制胶槽，并立即放入孔梳，等待凝固后即可使用。每孔按如下上样：RNA标本4μl、胶体金0.5μl、10×Loading Buffer0.5μl，混匀后上样。电泳条件为：100v（恒压），10min。结束后进行凝胶图像记录及分析。图像中主要出现18S及28SrRNA条带，且灰度28S/灰

度18S约2：1为RNA质量良好。

5.培养细胞总RNA的逆转录

（1）cDNA第一链的合成（RT）：

①采用TaKaRa的PrimeScript^TM RT-PCR kit进行RT反应。

在冰上按下列剂量及顺序在200μl去RNA酶的离心管中加样：

在PCR仪上进行如下反应：65℃，5min→4℃，保持。

②样本回收至冰上，瞬时离心一次，在上述10μl体系中按下列顺序、剂量加样：

PCR仪上进行如下反应：30℃，10min→42℃，30min→95℃，5min→4℃，保持。结束反应后，样本-30℃保存。

6.培养细胞的mRNA的荧光定量PCR检测：

采用TaKaRa的

Premix Ex Taq^TMII进行荧光定量PCR反应。

（1）在冰上按下列剂量及顺序在96孔荧光定量PCR板加样：

（2）加样后以封板膜封板，离心3000rpm，4℃，2分钟；

（3）离心后将加好样的96孔荧光定量PCR板放入LightCycler480荧光定量PCR仪中；

（4）扩增反应条件：95℃，30sec→【95℃，5sec→60℃，20sec】×40循环；

（5）溶解曲线条件：95℃，1sec→65℃，15sec→95℃，1sec→42℃；

（6）标准扩增曲线的制作：

①取培养12天的细胞cDNA样品，按照1：10：100：1000四个浓度倍比稀释；

②以上4组样品做荧光定量PCR，每组做3个复孔，重复3次。

（7）荧光定量PCR引物：（Shh、Pdx1、CK19、amylase、18sRNA引物序列）

（8）本次研究中荧光定量PCR以18s-RNA作为内参，每个标本以3个孔的平均Ct值作为结果，根据所制作的每对引物的标准曲线，采用LightCycler480荧光定量PCR仪自带软件中的Advanced Analysis进行分析，采用E-Method方法根据引物扩增效率，自动采用Second Derivative Maximum method或者FitPoints method进行计算（根据引物扩增效率，扩增效率=2时采用Fit Pointsmethod），最终得到样品之间目的基因的表达比率，利用相对比值进行统计分析。

7.统计方法：

计量资料以均数±标准差表示（Mean±SD），计数资料以百分率表示，均数的比较采用t检验，率的比较采用χ²检验，P＜0.05为差别有统计学意义。所有资料统计均采用SAS8.1统计软件。

表达实验测试结果：

MACS后CXCR-4阳性和CXCR-4阴性细胞添加及不添加环杷明和Exendin4诱导的不同天数Shh、Pdx1、CK19和amylase的mRNA表达情况（A:CXCR4+/Cycl+&Ex4+；B：CXCR4+/Cycl-&Ex4-；C：CXCR4-/Cycl+&Ex4+；D：CXCR4-/Cycl-&Ex4-）：Shh、Pdx1、CK19和amylase均以正常小鼠胰腺为阳性对照，Real-Time PCR的mRNA表达均为1。

（1）Real-Time PCR分析结果显示，以18sRNA作为内参，C组Shh、Pdx1表达量显著低于D组（所有P＜0.05）；CXCR4阳性细胞在第3天加与不加Cyclopamine组，Shh表达量差异性不显著（P＞0.05）；CXCR4阳性细胞在第6、9、12天加Cyclopamine组，Shh表达量显著低于不加Cyclopamine组（P均＜0.05）。CXCR4阳性细胞+Cyclopamine组:第3天Shh表达量显著高于其他时间点（所有P＜0.05）；CXCR4阳性细胞和CXCR4阴性细胞组：各个时间点Shh表达量均无显著差异（所有P＞0.05）；CXCR4阴性细胞+Cyclopamine组：第3、6天Shh表达量均显著高于第9、12天（所有P＜0.05）；但第3天和6天Shh表达量差异性不显著（P＞0.05）。Shh、Pdx1在不同实验组和不同时间点mRNA的表达情况如表一、表二所示：

表一、Shh在不同实验组和不同时间点mRNA的表达

表二、Pdx1在不同实验组和不同时间点mRNA的表达

（2）Real-Time PCR分析结果显示，以18sRNA作为内参，在加Cyclopamine组，第3、6、9、12天的CXCR4阳性细胞CK19表达量显著高于同时间点CXCR-4阴性细胞（所有P＜0.05）；在不加Cyclopamine组，第3、9、12天的CXCR4阳性细胞CK19表达量显著高于同时间点CXCR-4阴性细胞（所有P＜0.05），在第6天CXCR-4阳性和阴性细胞CK19表达量差异性不明显（P＞0.05）。CXCR4阳性细胞+Cyclopamine组:第6、9天Shh表达量显著高于其他时间点（所有P＜0.05），但第6天和第9天无显著性差异（P＞0.05）；CXCR4阴性细胞组加或不加Cyclopamine组：各个时间点CK19表达量均无显著差异（所有P＞0.05）；CXCR4阳性细胞：第9、12天CK19表达量均显著高于第3天（所有P＜0.05）；但其他时间点CK19表达量差异性不显著（P＞0.05）。

表二、CK19在不同实验组和不同时间点mRNA的表达

（2）Real-Time PCR分析结果显示，以18sRNA作为内参，在添加Cyclopamine组，第3、6、9、12天的CXCR4阳性细胞AMY表达量显著高于同时间点CXCR-4阴性细胞（所有P＜0.05）；在不添加Cyclopamine组，第3、6、9、12天的CXCR4阳性细胞AMY表达量显著高于同时间点CXCR-4阴性细胞（所有P＜0.05）。

表三、AMY在不同实验组和不同时间点mRNA的表达

本实施中实验结果过表明，一方面，利用MACS可得到较高纯度的分化细胞，且细胞存活率不受影响，为下一步诱导胰腺组织样细胞提供更多的细胞来源。另一方面，利用各种细胞因子的作用，诱导定型内胚层细胞向Pdx1高表达、Shh低表达的胰腺细胞分化，进而表现出胰腺外分泌细胞的功能，提高胚胎干细胞定向分化为胰腺外分泌细胞的质和量。由于胰腺外分泌部由导管（导管细胞的标志分子CK19）和腺泡构成，可合成并分泌淀粉酶、脂肪酶等，因此CK19和淀粉酶可作为评价及鉴定胰腺外分泌细胞的依据。在添加Cyclopamine和Exendin-4组，第3、6、9、12天的CXCR4阳性细胞CK19和淀粉酶mRNA表达量均显著高于同时间点CXCR-4阴性细胞（所有P＜0.05）；结果证明，Cyclopamine和Exendin-4诱导后的CXCR4阳性定型内胚层细胞具备更高的分化为胰腺外分泌细胞的能力。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法，包括如下步骤：

步骤一、采用悬滴培养法使胚胎干细胞分化为三个胚层细胞，并使用免疫磁珠细胞分选法，纯化出定型内胚层细胞；

步骤二、利用定型内胚层细胞，进一步诱导使其分化为胰腺前体细胞；

步骤三、使胰腺前体细胞在体外进一步分化，形成较高淀粉酶分泌能力的胰腺组织样细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤一是采用悬滴培养法使小鼠胚胎干细胞分化为三个胚层细胞，并使用定型内胚层的特异性标志物标记的磁珠分选纯化出定型内胚层细胞；步骤三中胰腺组织样细胞为胰腺外分泌细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小鼠胚胎干细胞为E14TG2a系小鼠胚胎干细胞。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述定型内胚层的特异性标志物为CXCR-4-分子。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤二中是通过使用环杷明及Exendin-4联合诱导，使定型内胚层细胞分化为胰腺前体细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤二中环杷明和Exendin-4在培养基的浓度分别为1.0uM和10nM。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤一的悬滴培养过程中包括：

使小鼠胚胎干细胞在去除白血病抑制因子的培养基中可以形成胚体；

而后在无血清培养基中培养分化成三个胚层细胞，所述无血清培养基中添加有对定型内胚层分化起促进作用的诱导剂Activin A。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，使用定型内胚层的特异性标志物标记的磁珠分选纯化出定型内胚层细胞包括如下步骤：

取经Activin A诱导的胚体细胞，经消化处理后加入藻红蛋白标记的大鼠抗小鼠CXCR-4单克隆抗体标记；

制成重悬细胞液后加入抗藻红蛋白免疫磁珠摇匀、孵育苗，再分选纯化出CXCR4⁺定型内胚层细胞。

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