CN101962628B - 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法 - Google Patents
肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101962628B CN101962628B CN 200910089693 CN200910089693A CN101962628B CN 101962628 B CN101962628 B CN 101962628B CN 200910089693 CN200910089693 CN 200910089693 CN 200910089693 A CN200910089693 A CN 200910089693A CN 101962628 B CN101962628 B CN 101962628B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- entoderm
- liver
- inducing culture
- stem cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims abstract description 94
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 40
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 279
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 57
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 35
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 25
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 claims description 23
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 19
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims description 14
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 14
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 13
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 11
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 9
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 claims description 6
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 2
- 101100454433 Biomphalaria glabrata BG01 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100454434 Biomphalaria glabrata BG04 gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 90
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 abstract description 52
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 abstract description 52
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 abstract description 48
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 abstract description 44
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 3
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 abstract 2
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 abstract 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 124
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 45
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 42
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 30
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 27
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 27
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical class [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 101000975502 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 7 Proteins 0.000 description 17
- 102100023974 Keratin, type II cytoskeletal 7 Human genes 0.000 description 17
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 14
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 10
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 10
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 10
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 10
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 9
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 108010020076 Cytochrome P-450 CYP2B1 Proteins 0.000 description 7
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 description 7
- 101001062347 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 3-beta Proteins 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 6
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 6
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 208000020673 hypertrichosis-acromegaloid facial appearance syndrome Diseases 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 5
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 5
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C(C=CC(N)=C2)C2=[O+]C2=C1C=CC(N)=C2 TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 4
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 description 4
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 4
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 3
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 3
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 3
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000050510 Cunninghamia lanceolata Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- -1 HNF4A Proteins 0.000 description 2
- 102000006752 Hepatocyte Nuclear Factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 108091008634 hepatocyte nuclear factors 4 Proteins 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229960001722 verapamil Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 101710149366 Afamin Proteins 0.000 description 1
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 description 1
- 101710085003 Alpha-tubulin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710085461 Alpha-tubulin N-acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002734 Collagen Type VI Human genes 0.000 description 1
- 108010043741 Collagen Type VI Proteins 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 1
- 102100036194 Cytochrome P450 2A6 Human genes 0.000 description 1
- 102100039203 Cytochrome P450 3A7 Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000875170 Homo sapiens Cytochrome P450 2A6 Proteins 0.000 description 1
- 101000745715 Homo sapiens Cytochrome P450 3A7 Proteins 0.000 description 1
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000998020 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 18 Proteins 0.000 description 1
- 101000975496 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 8 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100033421 Keratin, type I cytoskeletal 18 Human genes 0.000 description 1
- 102100023972 Keratin, type II cytoskeletal 8 Human genes 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 1
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 1
- 102100021869 Tyrosine aminotransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710175714 Tyrosine aminotransferase Proteins 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010036226 antigen CYFRA21.1 Proteins 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057308 human HGF Human genes 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
本发明公开了一种肝脏内胚层细胞及其制备方法与应用。本发明的肝脏内胚层细胞，是由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化获得的至少表达甲胎蛋白、肝细胞核因子4A和神经性钙黏附蛋白这三种标志性蛋白的肝脏内胚层细胞。本发明还提供了肝脏内胚层细胞的制备方法，包括以下步骤1)将人胚胎干细胞或诱导形成的多潜能干细胞在内胚层诱导培养基I上培养；2)步骤1)获得的细胞在内胚层诱导培养基II上培养；3)步骤2)获得的细胞肝脏内胚层诱导培养基上培养。本发明的肝脏内胚层继续培养可获得肝脏前体细胞。这些肝脏前体细胞具有在体外分化成肝实质和胆管的潜能。
Description
技术领域
本发明涉及肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法。
背景技术
人胚胎干细胞具有无限增殖的能力和分化的全能性，在合适的条件下可以分化为人体的各种细胞类型(Thomson et al.，1998)。因此，人胚胎干细胞有为各种细胞提供来源的潜力，具有巨大的应用潜能，如应用于发育过程中细胞谱系决定的机制的研究，或者是应用于各种退行性疾病进行的细胞移植。在人胚胎干细胞可分化产生的各种谱系中，肝脏细胞受到了人们格外的关注。这是因为肝脏在人体内代谢过程中起到重要的作用，具有许多重要功能，包括糖原合成，分解红细胞，合成血浆蛋白，以及解毒等等。最近，有许多研究小组都成功的将人或者小鼠胚胎干细胞分化到肝脏谱系(Basma et al.，2009；Drobinskaya et al.，2008；Gouon-Evans etal.，2006；Hay et al.，2008b；Soto-Gutierrez et al.，2006)。
在早期肝脏组织生成的过程中，肝脏前体细胞是肝脏实质的主要组成部分(Zaret，2008)。通过小鼠和人的发育学研究发现，这些肝脏前体细胞是成熟肝实质细胞以及肝内胆管上皮细胞的共同前体。肝脏前体细胞向肝胆两个谱系的分化大约是在怀孕中期才逐渐确定的(Walkup and Gerber，2006)。人们通过从人和小鼠胎肝中分离肝脏前体细胞并进行体外培养的方法，已经对肝脏前体细胞的特性作了初步的研究(Dan et al.，2006；Oertel et al.，2008；Schmelzer et al.，2007；Strick-Marchand and Weiss，2002；Suzuki et al.，2002；Tsuchiya et al.，2005)。在体外培养中，人肝脏前体细胞表现出强大的增殖能力，同时表现出稳定的表型(Danet al.，2006)。当置于合适的条件下，肝脏前体细胞可以分化为表达ALB，储存糖原的类肝实质细胞；以及分化为表达KRT19的胆管细胞(Schmelzer et al.，2007)。
尽管肝脏前体细胞的增殖能力和肝胆双向分化潜能都已经被人们证实，但是这些肝脏前体细胞的起源和功能目前还是一个存有争议的领域。这可能主要是因为目前人们只能从肝脏中直接分离获得肝脏前体细胞，而早期人胚胎的缺乏极大的限制了该领域的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法。
本发明所提供的肝脏内胚层细胞是由人胚胎干细胞(人ES细胞)或人诱导的多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，人iPS细胞)分化获得的至少表达甲胎蛋白(AFP)、肝细胞核因子4A(HNF4A)和神经性钙黏附蛋白这三种标志性蛋白的肝脏内胚层细胞。
所述肝脏内胚层细胞还可表达白蛋白(ALB)和肝细胞核因子3B(FOXA2)。
所述人胚胎干细胞具体可为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系，如表1。
表1.可从商业途径获得的人胚胎干细胞系
本发明的另一个目的是提供一种肝脏内胚层细胞的制备和纯化方法。
本发明所提供的肝脏内胚层细胞的制备和纯化方法，包括如下步骤
1)将人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞在内胚层诱导培养基I上培养；
2)步骤1)获得的细胞在内胚层诱导培养基II上培养；
3)步骤2)获得的细胞在内胚层诱导培养基III上培养；
4)步骤3)获得的细胞肝脏内胚层诱导培养基上培养；
所述内胚层诱导培养基I为含有质量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白组分V和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；其中，牛血清白蛋白组分V的含量优选为0.02％-0.1％，尤其优选为0.05％；人活化素-A的含量优选为80-150ng/ml，尤其优选为100ng/ml；
所述内胚层诱导培养基II为含有质量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白组分V，体积百分含量0.05％-0.5％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；其中，牛血清白蛋白组分V的含量优选为0.02％-0.1％，尤其优选为0.05％；人活化素-A的含量优选为80-150ng/ml，尤其优选为100ng/ml；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的含量优选为0.05％-0.15％，尤其优选为0.1％；
所述内胚层诱导培养基III为含有质量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白组分V，体积百分含量0.5％-2％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；其中，牛血清白蛋白组分V的含量优选为0.02％-0.1％，尤其优选为0.05％；人活化素-A的含量优选为80-150ng/ml，尤其优选为100ng/ml；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的含量优选为0.8％-1.5％，尤其优选为1％；
所述肝脏内胚层诱导培养基为含有20-60ng/ml人成纤维细胞生长因子-4和10-30ng/ml人骨成型蛋白-2的肝细胞培养基；其中，人成纤维细胞生长因子-4的含量优选为30ng/ml，人骨成型蛋白-2的含量优选为20ng/ml。
上述内胚层诱导培养基I、内胚层诱导培养基II、内胚层诱导培养基III和肝脏内胚层诱导培养基的pH均可为培养哺乳动物细胞的常规pH，如pH7.2-7.6.
其中，所述方法还包括用流式细胞仪分选表达神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)表面蛋白的细胞。
将获得的肝脏内胚层细胞用不含有EDTA、加入2mM钙离子的胰酶进行消化处理，随后用流式细胞仪分选表达神经性钙黏附蛋白表面蛋白的细胞。
所述人胚胎干细胞为如表1所示。所述基础细胞培养基可为MEM、DMEM、BME、DMEM/F12、RPMI1640或Fischers。
所述方法中，人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞在内胚层诱导培养基I上培养24h。所述方法中，步骤1)获得的细胞在内胚层诱导培养基II上培养24h。所述方法中，步骤2)获得的细胞在内胚层诱导培养基III上培养24h。所述方法中，步骤3)获得的细胞肝脏内胚层诱导培养基上培养5天。
由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞制备肝脏内胚层细胞的培养基，也属于本发明的保护范围。该由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞制备肝脏内胚层细胞的培养基，由上述内胚层诱导培养基I、上述内胚层诱导培养基II、上述内胚层诱导培养基III和上述肝脏内胚层诱导培养基组成。
在发明中，检测了人胚胎干细胞向肝脏谱系分化的过程，并鉴定出在这个分化过程中肝脏内胚层细胞的产生。找到了一个表面标志蛋白N-cadherin，可以有效的代表在分化过程中最早产生的AFP+的肝脏内胚层细胞。因此，可以通过流式细胞分选的方法将肝脏内胚层细胞从混杂的人胚胎干细胞分化产物中分离和纯化出来。
附图说明
图1为肝脏内胚层相关基因的表达的时间动态。
图2为免疫荧光显示N-cadherin与AFP、ALB、HNF4A、GATA4和FOXA2共表达。
1：AFP与N-cadherin共表达(AFP绿色，N-cadherin红色)；2：AFP与N-cadherin共表达(AFP红色，N-cadherin绿色)；3：ALB与N-cadherin共表达；4：HNF4A与N-cadherin共表达；5：GATA4与N-cadherin共表达；6：FOXA2与N-cadherin共表达。
图3为胞内流式细胞分析表明N-cadherin和AFP在同一细胞中表达。
A：同型抗体对照B：肝脏内胚层细胞中神经性钙黏附蛋白和甲胎蛋白的表达情况
图4为分化第8天的细胞通过N-cadherin进行分选的结果。
A：经过胰酶进行消化；B：经过胰酶和EDTA进行消化；C：胰酶和钙离子进行消化。
图5为分选后N-cadherin+的细胞群和N-cadherin-细胞群的AFP表达。
A：N-cadherin+的细胞群；B：N-cadherin-细胞群。
图6为定量RT-PCR显示分选后N-cadherin+的细胞群富集了肝脏特异蛋白。
图7为N-cadherin+细胞的细胞在具有继续向ALB、AAT、阳性的类肝实质细胞分化的能力，也具有向KRT7阳性细胞分化的能力。
图8为肝脏内胚层细胞只具有较弱的增殖能力。
上排，只有少量肝脏内胚层细胞表达Ki67。下排，只有少量肝脏内胚层细胞与BrdU共染。注意大多数AFP+的细胞均为BrdU阴性。细胞核由DAPI进行复染(蓝色)。标尺，50μm。
图9为肝脏前体细胞的相应的形态变化。
A人胚胎干细胞；B定形内胚层细胞；C肝脏内胚层细胞；D肝脏前体细胞。
图10为针对人细胞核的特异性染色。
说明STO饲养层上的克隆(上排)是人细胞来源的。下排，STO饲养层不表达人细胞核抗原。细胞核由DAPI进行复染(蓝色)。标尺，50μm。
图11为肝脏前体细胞的克隆中大部分细胞表达Ki67。
细胞核由DAPI进行复染(蓝色)。标尺，50μm。
图12为肝脏前体细胞的增殖能力。
图13为肝脏前体细胞的基因表达特性。
图14为流式细胞分析肝脏前体细胞EpCAM以及CD133的表达。
A同型对照；B STO细胞对照；C肝脏前体细胞。
图15为肝脏前体细胞能自发的向肝实质细胞分化。
图16为定向诱导肝脏前体细胞向肝实质细胞分化。
图17为肝脏前体细胞分化得到的肝实质细胞的mRNA表达情况。
图18为ELISA检测人白蛋白分泌情况。
图18中，1：培养基；2：人胚胎干细胞分化得到的肝脏前体细胞；3：经由肝脏前体细胞分化得到的肝实质细胞；4：直接由人胚胎干细胞分化得到的肝实质细胞
图19为肝脏前体细胞分化得到的类肝实质细胞的功能分析。
图20为肝脏前体细胞分化为KRT7阳性和KRT19阳性的细胞。
图21为肝脏前体细胞在三维培养体系中向类胆管细胞分化。
图22为参与胆管运输和分泌的关键蛋白MDR的功能。
(左)转运rhodamine 123至中间空腔。(右)MDR的抑制剂Verapamil可以抑制rhodamine 123的转运。标尺，50μm。
图23为诱导的多潜能干细胞分化得到的肝脏内胚层细胞。
左图，AFP与N-cadherin共表达(AFP红色，N-CAD绿色)；右图，HNF4A与N-cadherin共表达(HNF4A红色，N-CAD绿色)。
图24为诱导的多潜能干细胞分化形成的肝脏前体细胞。
AFP绿色，KRT19红色。
图25为诱导的多潜能干细胞进一步分化为肝实质细胞。H1：人胚胎肝细胞系；3U1和3U2：诱导多潜能干细胞系hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3。
具体实施方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。其中，牛血清白蛋白组分V(美国Calbiochem公司，126579)，人活化素-A(Activin A，美国Peprotech公司，120-14E)，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液(美国Invitrogen公司，51300-044)，HCM培养基(美国Lonza公司，CC-3198)，人成纤维细胞生长因子-4(FGF4，美国Peprotech公司，100-31)，人骨成型蛋白-2(BMP2，美国Peprotech公司，120-02)，HEPES(美国Calbiochem公司，391338)，尼克酰胺(美国Sigma-aldrich公司，N0636-100G)、抗坏血酸(Asc-2P，美国Sigma-aldrich公司，49752-10G)和EGF(美国R&D公司，236-EG-200)。
实施例中的图21-22为由人胚胎干细胞系H1(NIH的编号为WA01)获得的相应细胞，分别由人胚胎干细胞系H7(NIH的编号为WA07)和人胚胎干细胞系H9(NIH的编号为WA09)获得的相应细胞与图21-22基本相同，没有实质差别。
实施例1、肝脏内胚层细胞的制备及鉴定
一、肝脏内胚层细胞的获得
第1天：
1)人胚胎干细胞H1、H7或者H9传代后2-3天开始诱导，选择生长状态好的细胞进行分化实验；
2)弃去人胚胎干细胞培养基(为基础细胞培养基DMEM/F12中添加20％血清替代物(Knock-out Serum Replacement，KSR，美国Invitrogen公司，10828028)，1mM谷氨酰胺(美国Invitroge公司，25030-081)，0.1mM β-巯基乙醇(美国Invitrogen公司，21985-023)，1％非必需氨基酸(Non-essential AminoAcids)(美国Invitrogen公司，11140-076)，4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，美国Peprotech公司，100-18B))，用PBS洗2遍；
3)换上内胚层诱导培养基I。内胚层诱导培养基I是在1640培养基中加入牛血清白蛋白组分V(美国Calbiochem公司，126579)和人活化素-A(Activin A，美国Peprotech公司，120-14E)得到的培养基。该培养基的pH7.2-7.6。内胚层诱导培养基I中，牛血清白蛋白组分V的终浓度为0.05％(质量百分含量)、人活化素-A(Activin A)的终浓度为100ng/ml。
第2天：
4)弃去昨天的培养基，换上内胚层诱导培养基II。内胚层诱导培养基II为在1640培养基中加入牛血清白蛋白组分V(美国Calbiochem公司，126579)、人活化素-A(Activin A)和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液(美国Invitrogen公司，51300-044)得到的培养基。该培养基的pH7.2-7.6。内胚层诱导培养基II中，牛血清白蛋白组分V的终浓度为0.05％(质量百分含量)、人活化素-A(Activin A)的终浓度为100ng/ml、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为0.1％(体积百分含量)。
第3天：
5)弃去昨天的培养基，换上内胚层诱导培养基III。内胚层诱导培养基III为在1640培养基中加入牛血清白蛋白组分V、人活化素-A(Activin A)和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液(美国Invitrogen公司，51300-044)得到的培养基。该培养基的pH7.2-7.6。内胚层诱导培养基III中，牛血清白蛋白组分V的终浓度为0.05％(质量百分含量)、人活化素-A(Activin A)的终浓度为100ng/ml、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为1％(体积百分含量)。
第4-8天每天重复如下步骤：
1)弃昨日的培养基，PBS洗一遍；
2)换上肝脏内胚层诱导培养基，进行培养。
第8天获得肝脏内胚层细胞；肝脏内胚层诱导培养基为在HCM培养基(美国Lonza公司，CC-3198)中添加人成纤维细胞生长因子-4(FGF4，美国Peprotech公司，100-31)和人骨成型蛋白-2(BMP2，美国Peprotech公司，120-02)得到的培养基。该培养基的pH7.2-7.6。肝脏内胚层诱导培养基中，人成纤维细胞生长因子-4(FGF4)的终浓度为30ng/ml、人骨成型蛋白-2(_BMP2)的终浓度为20ng/ml。RT-PCR的方法检测AFP，ALB，HNF4A，CEBPA等早期肝脏相关基因的表达时间动态。
引物：
AFP：上游CCCGAACTTTCCAAGCCATA(序列1)，下游TACATGGGCCACATCCAGG(序列2)；ALB：上游GCACAGAATCCTTGGTGAACAG，下游ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA；HNF4A：上游ACTACATCAACGACCGCCAGT，下游ATCTGCTCGATCATCTGCCAG；CEBPA：上游ACAAGAACAGCAACGAGTACCG，下游CATTGTCACTGGTCAGCTCCA。
AFP，ALB，HNF4A，CEBPA这些基因在分化的过程中都显示出类似的表达模式，即在第5天左右开始表达，并在第8天达到最大值(图1)，表明肝脏内胚层细胞已经产生。
在人胚胎干细胞的分化产物中，N-cadherin特异性地表达在所有AFP表达的细胞中，并且只在AFP表达的细胞中表达。重复实验以及通过激光共聚焦显微镜的观察，确认了N-cadherin和AFP共表达的特异性(图2)。图2中图片1通过荧光显微镜进行拍摄，其余的图片为激光共聚焦显微镜拍摄。标尺，50μm。细胞核由DAPI(美国Roche公司，10236276001)进行复染(蓝色)。
胞内流式细胞分析也显示出类似的结果，即N-cadheirn和AFP在同一个细胞中表达(图2)。进一步的免疫荧光实验确认了N-cadherin同时还和其他肝脏内胚层标志蛋白如ALB，HNF4A，FOXA2，GATA4等共表达，表明N-cadherin是肝脏内胚层特异的表面标志蛋白。
N-cadherin是一个钙依赖型细胞-细胞黏附蛋白，对胰酶的处理具有高度的敏感性，但是钙离子可以保护胰酶对它的消化作用(Yoshida and Takeichi，Cell.1982Feb；28(2)：217-24.)。当分化第8天的肝脏内胚层细胞用通常的胰酶-EDTA消化液(美国Invitrogen公司，25200114)进行消化时，大量地N-cadherin的胞外段都会被胰酶裂解，因此流式分选所用的N-cadherin的抗体(克隆号GC4，购自美国Sigma-Aldrich公司)便无法识别N-cadherin蛋白(图4B)。如果肝脏内胚层用无EDTA的胰酶(美国Invitrogen公司，27250018)进行处理，同时加入2mM钙离子，则可以有效地保护N-caherin蛋白的完整(Reiss等，EMBO J.2005Feb 23；24，742-752)。
流式细胞仪分离N-cadherin+细胞群，同时收集N-cadherin-的细胞群作为对照。
流式分选从分化第8天的产物中分选出一群N-cadheirn阳性的细胞群(60.9％±9.1％，图4C)。
对分选后的N-cadherin的细胞进行免疫细胞化学显示，N-cadheirn+的细胞群中超过90％的细胞都是AFP表达的，而N-cadherin-的细胞群中则几乎没有AFP阳性的细胞(图5)。N-cadherin+的细胞群表达AFP(绿色)。
进一步，对分选得到的细胞进行定量RT-PCR分析发现，N-cadheirn+的细胞群富集了肝脏特异表达的基因甲胎蛋白(AFP)，白蛋白(ALB)，肝细胞核因子4A(HNF4A)和肝细胞核因子3B(FOXA2)(引物：AFP：上游CCCGAACTTTCCAAGCCATA，下游TACATGGGCCACATCCAGG；ALB：上游GCACAGAATCCTTGGTGAACAG，下游ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA；HNF4A：上游ACTACATCAACGACCGCCAGT，下游ATCTGCTCGATCATCTGCCAG；FOXA2：上游CTGAGCGAGATCTACCAGTGGA，下游CAGTCGTTGAAGGAGAGCGAGT。)(图6)。每个定量PCR结果均为3次重复，每组基因中N-cad+和N-cad-之间表达量差异的显著性均小于0.01。
二、肝脏内胚层细胞诱导分化为成熟的肝实质细胞
1)步骤一获得的N-cadheirn+的细胞或N-cadherin-的细胞用PBS洗一遍；换上肝实质细胞培养基I；肝实质细胞培养基I为含有20ng/ml人肝细胞生长因子(HGF，美国Peprotech公司，100-39)的HCM培养基(美国Lonza公司，CC-3198)。每天重复上述步骤一次，共培养5天；
2)弃去肝实质细胞培养基I，PBS洗一遍；换上肝实质细胞培养基II，肝实质细胞培养基II为含有10ng/ml肿瘤抑制素M(OSM，美国R&D公司，295-OM-050)，0.1μM地塞米松(美国Sigma-aldrich公司，D8893)的HCM培养基。
N-cadheirn+的细胞可以继续分化为表达ALB和AAT的类肝实质细胞，以及表达KRT7的类胆管细胞(图7)。图7中N-cadherin+细胞的细胞在具有继续向ALB(图7A)，AAT(图7B)阳性的类肝实质细胞分化的能力，也具有向KRT7(图7C)阳性细胞分化的能力。
相反的，N-cadherin-的细胞则不能向肝胆谱系分化。以上实验说明，N-cadheirn+的细胞为人胚胎干细胞分化得到的肝脏内胚层细胞。
利用诱导的多潜能干细胞(ips)细胞系hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3(赵扬，Two supporting factors greatly improve the efficiency of human iPSCgeneration.Cell Stem Cell，2008；3：475-479.)(北京大学)用相同的方法进行分化，同样可以得到肝脏内胚层细胞。该肝脏内胚层细胞共表达AFP和N-cadherin，以及共表达HNF4A和N-cadherin(图23)。该肝脏内胚层细胞同时还表达ALB、FOXA2、GATA4等基因。按上文所示方法进一步还可以诱导分化为成熟的肝实质细胞，表达ALB和AAT等蛋白(图25)，也可以分化为KRT7阳性的类胆管细胞。
实施例2、由人胚胎干细胞来源的肝脏内胚层细胞制备肝脏前体细胞
一、从肝脏内胚层细胞产生肝脏前体细胞
A)肝脏前体细胞的获得
1)实施例1获得的肝脏内胚层细胞用PBS洗一遍；
2)如果不进行N-cadherin分选，则可以用胰酶-EDTA溶液消化，室温约1分钟；如果需要用N-cadherin进行分选，则用无EDTA的胰酶(胰酶溶液，加入2mMCaCl2)在37℃消化约半小时；
3)加入含有体积百分含量10％胎牛血清的DMEM培养基进行终止，将细胞悬起并转移到15ml离心管中；
4)1000转/分钟离心5分钟；用肝脏前体细胞培养基重悬。肝脏前体细胞培养基为在DMEM/F-12基础培养基中添加HEPES(美国Calbiochem公司，391338)、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液(美国Invitrogen公司，51300-044)、牛血清白蛋白组分V、尼克酰胺(美国Sigma-aldrich公司，N0636-100G)、抗坏血酸(Asc-2P，美国Sigma-aldrich公司，49752-10G)、地塞米松和EGF(美国R&D公司，236-EG-200)得到的培养基。该培养基的pH7.2-7.6。肝脏前体细胞培养基中，HEPES的终浓度为10mM、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为1％(体积百分含量)、牛血清白蛋白组分V的终浓度为0.05％(质量百分含量)，尼克酰胺的终浓度为11mM、抗坏血酸(Asc-2P)的终浓度为1mM、地塞米松的终浓度为0.1μM和EGF的终浓度为10ng/ml。
5)用N-cadherin对肝脏内胚层细胞进行分选纯化，方法同实施例1，获得N-cadheirn+的细胞；
6)制备STO饲养层细胞。用生长状态良好，汇合度约有90％的鼠胚成纤维细胞系(STO)细胞，用10ug/ml的丝裂霉素C(美国Roche公司，10107409001)处理4-6个小时。用0.1％的明胶(美国Sigma-Aldrich公司，G1890-100G)处理培养皿，37度30分钟或者室温放置2小时。用PBS溶液洗涤丝裂霉素C处理过的细胞5遍，以彻底洗掉残存的丝裂霉素C。胰酶消化后按照1∶3的密度接种至明胶处理过的培养皿，过夜培养后即可使用；
7)将已经制备好的STO饲养层细胞用PBS洗两遍；
8)将N-cadheirn+的细胞接种至STO饲养层细胞上，补足肝脏前体细胞培养基，放入CO2培养箱进行培养；
9)每天换液；大约7-10天可以见到明显的克隆产生。
B)肝脏前体细胞的传代
1)弃去A)中获得的细胞中的肝脏前体细胞培养基，加入PBS洗一次；
2)加入胰酶-EDTA消化液(美国Invitrogen公司，25200114)，室温消化3-5分钟。镜下观察细胞收缩变圆，彼此分离即可；
3)加入含有体积百分含量10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；
4)将细胞悬起并转移到15ml离心管中，1000转/分钟离心5分钟；
5)用肝脏前体细胞培养基重悬细胞；
6)将已经制备好的STO饲养层细胞用PBS洗两遍；
7)然后接种至STO饲养层细胞上，补足肝脏前体细胞培养基；
8)放入CO2培养箱进行培养，每天换液。
C)肝脏前体细胞的维持培养
步骤B)的细胞在STO饲养层上用肝脏前体细胞培养基进行培养，每天更换一次培养基，通常7～10天传代一次。饲养层的放置时间达到两周或转态变差，或者肝脏前体细胞克隆过于致密或面积过大，及时进行传代。
在胚胎肝脏发育的过程中，一旦肝脏命运特化完成，肝芽产生，肝脏前体细胞就开始大量扩增，直到最终达到相应肝脏组织的体积大小。然而，对人胚胎干细胞来源的肝脏内胚层细胞进行检测，发现这些肝脏内胚层细胞的增殖能力很低。对肝脏内胚层细胞进行免疫荧光检测AFP和Ki67发现(AFP和Ki67的抗体购自中杉金桥公司)，几乎没有AFP阳性的细胞和Ki67共染(图8)。当在肝脏内胚层产生阶段里整个5天里都在培养基中添加BrdU，检测发现只有小于5％的AFP阳性细胞表达BrdU(图8)。这些研究发现，人胚胎干细胞来源的肝脏内胚层细胞迅速的走向了分化，丧失了增殖的能力。
肝脏的前体细胞产生过程如下：
人胚胎干细胞来源的肝脏内胚层细胞采用上述方法培养的时候，能产生一些实质的细胞克隆(图9)。图9中人胚胎干细胞克隆呈扁平状圆形，具有严整的细胞边缘。内胚层细胞呈鱼鳞状，为扁平的单层细胞。肝脏内胚层细胞呈单层或者多层。肝脏前体细胞形成紧密的克隆，边缘光滑严整。标尺，50μm。这些克隆具有完整的、光滑的边缘。与不能传代的肝脏内胚层细胞不同，这些克隆可以持续的扩增。针对人细胞核的特异性免疫荧光(抗体购自美国Chemicon公司)显示这些细胞是人细胞来源的，而不是STO细胞来源(图10)。因此，这些克隆为人胚胎干细胞来源的肝脏前体细胞。克隆里主要的细胞都表达Ki67(图11)。为了进一步证明其增殖能力，调查了这些克隆随着生长其大小变化情况。当克隆传到STO饲养层细胞7天时，这些肝脏前体细胞形成的克隆直径为62.0±15.4μm，当培养到第20天时，这些克隆可以达到225.4±92.0μm，从而显示出缓慢但是切实的细胞增殖。这些肝脏前体细胞按1∶2或者1∶3进行传代已经在体外培养了超过12代，并且可以被反复的冻存和复苏(图12)。作为对照，单独培养的经丝裂霉素处理的饲养层细胞在同样的培养条件下不能产生克隆。
图12中，左：肝脏前体细胞的克隆随培养天数增加，其大小也逐渐增加，n＝3。中：肝脏前体细胞的生长曲线图。右：N-cadherin+群产生克隆的能力大于N-cadherin-群产生克隆的能力。该实验经过三次重复表现出类似的结果，这里展示的是一次典型结果。
为了进一步鉴定肝脏前体细胞，用免疫荧光方法检测了甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、细胞角蛋白19(KRT19)和细胞角蛋白7(KRT7)的表达(AFP、KRT19和KRT7的抗体购自中杉金桥公司，ALB的抗体购自美国DAKO公司)。这些肝脏前体细胞表达早期肝脏标志基因AFP，但是微弱或者是不表达成熟肝脏细胞标志ALB。这些克隆同时也表达胆管的标志基因KRT19和KRT7(图13)。图13A为肝脏前体细胞共表达AFP和KRT7，图13B为KRT19，图13C为表达ALB。图13D为阴性对照，细胞核由DAPI进行复染(蓝色)，标尺，50μm。此外，它们还表达假定的肝脏前体细胞标志EpCAM和CD133(图14)(Schmelzer等，J Exp Med.2007 Aug6；204(8)：1973-87)。
为了比较在肝脏命运决定之后N-cadherin+的肝脏内胚层细胞和N-cadherin-的细胞群产生肝脏前体细胞的能力，按照相同的方法对N-cadherin-的细胞群进行培养，结果发现来自N-cadherin-细胞群所能产生的克隆数量比N-cadherin+群的要低至少6倍(图12)。而且这些克隆在传代后也迅速的丢失，显示其增殖能力低下，并不是之前的肝脏前体细胞。这样的结果也说明N-cadherin可以作为一种特异的表面标志蛋白用于在人胚胎干细胞分化体系中对肝脏内胚层细胞进行分离纯化，用来分化产生肝脏前体细胞。
二、肝脏前体细胞向肝胆两个谱系分化
A)人胚胎干细胞来源的肝脏前体细胞向类肝实质细胞分化
第1天：
1)(一)的肝脏前体细胞，弃去培养基；
2)PBS洗一遍；
3)加入肝实质细胞培养基I，肝实质细胞培养基I为含有20ng/ml肝细胞生长因子(HGF)的HCM培养基。
第2-5天每天重复如下步骤：
4)弃去昨日的培养基；加入新鲜的肝实质细胞培养基I。
第6-10天每天重复如下步骤：
5)弃去昨日的培养基；
6)换上肝实质细胞培养基II，肝实质细胞培养基II为含有10ng/ml OSM，0.1μM地塞米松的HCM培养基。
人胚胎干细胞来源的肝脏前体细胞在进行扩增培养的时候，我们发现有一些细胞会从严整的克隆边缘迁移出来。与AFP+KRT7+的前体细胞不同，这些克隆边缘的细胞成为AFP+KRT7-的细胞，这可能意味着它们已经自发的向肝实质细胞分化(图15)。箭头所指的细胞为AFP+KRT7-。细胞核由DAPI进行复染(蓝色)。标尺，50μm。
为了进一步确认肝脏前体细胞向肝实质细胞分化的潜能，用HGF和OSM促进前体细胞向肝实质细胞定向分化。肝脏前体细胞首先在含有20ng/ml HGF的肝实质细胞培养基(HCM)中培养5天，随后再在含有10ng/ml OSM和0.1μM的地塞米松的肝实质细胞培养基(HCM)中继续培养5天。对分化后的细胞通过免疫荧光技术检测肝实质细胞的标志蛋白。分化了的细胞集落丧失了KRT7的表达，转而开始表达ALB，而ALB在肝脏前体细胞中只有很微弱的表达。此外，这些ALB表达的细胞还表达AAT(图16)肝脏前体细胞被诱导为KRT7阴性(上排)，ALB(中排和下排)和AAT(下排)阳性的类肝实质细胞。细胞核由DAPI进行复染(蓝色)。标尺，50μm。
RT-PCR分析发现许多成熟肝实质细胞的特异基因，如ALB，AAT，TAT，KRT8，KRT18，以及细胞色素P450家族的CYP3A7和CYP2A6在诱导细胞中也都有表达(图17)。同时，分化的细胞丧失了多能性标志基因OCT4和Nanog的表达，说明分化的细胞群中不再含有未分化的人胚胎干细胞，在今后有可以用于细胞移植实验的可能(图17)。(引物参见表2)
图17中，1：人胚胎干细胞；2：人胚胎干细胞分化得到的肝脏前体细胞；3：经由肝脏前体细胞分化得到的肝实质细胞；4：直接由人胚胎干细胞分化得到的肝实质细胞；5：人胎肝细胞；6：未反转录的cDNA。
表2：RT-PCR检测肝实质细胞基因表达的引物序列
为了进一步确认这些类肝实质细胞是否具有肝脏的功能，对分化得到的细胞进行了一系列的功能检测。
通过ELISA检测(ELISA检测试剂盒购自美国BETHYL公司)显示，经由前体细胞分化得到的类肝实质细胞白蛋白分泌量可达到439ng/天/百万细胞，接近于由胚胎干细胞直接分化得到的类肝实质细胞的白蛋白分泌量(439ng/天/百万细胞)(图18)。
通过Periodic acid Schiff染色分析细胞储存的糖原的情况。结果发现分化的集落可以被特异的染成红色，说明这些类肝实质细胞具有储存糖原的功能(图19A)。
进一步，检测分化得到的类肝实质细胞对吲哚氰绿的吸收与释放情况，能够吸收并释放ICG是肝实质细胞的特异性功能，已经被广泛用于胚胎干细胞分化过程中肝实质细胞的鉴定。
检测方法：细胞用含1mg/ml的吲哚氰绿(购自美国Sigma-Aldrich公司，I2633-25MG)的培养基37度孵育15分钟，之后弃去含吲哚氰绿的培养基，用PBS洗三遍，更换新鲜培养基进行观察吲哚氰绿的吸收状况。之后细胞继续培养6小时，更换新鲜培养基，镜下观察吲哚氰绿的释放情况。
经由前体细胞分化得到的类肝实质细胞可以吸收培养基中的吲哚氰绿并呈现绿色，并且在6个小时之后可以排掉吸收入细胞的吲哚氰绿。作为对照，未分化的前体细胞则不能吸收吲哚氰绿(图19B)。
进一步检测经前体细胞分化得到的类肝实质细胞可以吸收低密度脂蛋白(LDL)(图19C)。
检测方法：在培养的细胞中加入10μg/ml的Dil-Ac-LDL(购自美国Biomedicaltechnologies公司，BT-902)，37度培养4小时。之后弃去含Dil-Ac-LDL的培养基，用PBS洗三遍，更换新鲜培养基并在荧光显微镜下观察。
通过PROD检测分析分化细胞的细胞色素p450的活性情况。在没有苯巴比妥诱导的情况下，分化得到的细胞只具有轻微的PROD活性。苯巴比妥的诱导可以提高分化细胞的PROD的活性，这证明分化的细胞的确具有细胞色素p450的活性。作为对照，未分化的前体细胞的PROD活性则很低(图19D)。
综合以上功能性实验，说明前体细胞可以分化得到有一定功能的类肝实质细胞。
图19A为PAS染色分析发现分化得到的类肝实质细胞胞浆着红色，说明其储存有糖原。图19B为分化细胞可以吸收ICG(左)，并在6小时之后释放(中)，前体细胞不能吸收ICG(右)。图19C为分化得到的类肝实质细胞可以吸收dil标记的LDL。图19D为缺少苯巴比妥的情况下，分化细胞只表现微弱的PROD活性(中)。通过苯巴比妥的诱导，PROD活性增加(左)。前体细胞只表现微弱的PROD活性(右)。(中)，苯巴比妥。标尺，50μm。
B)肝脏前体细胞向类胆管细胞分化
1)取160μl Matrigel(美国BD公司，354230)，加入4.64ml DMEM/F-12基础培养基，混匀，将混合液加入到培养皿中，摇动使混合液覆盖全部皿底，37℃放置1小时，使用前弃去Matrigel溶液；
2)取步骤A)中生长状态较好的肝脏前体细胞，弃去培养基，加入PBS洗一次；
3)加入胰酶-EDTA消化液，室温消化3-5分钟，镜下观察细胞收缩变圆，彼此分离即可；
4)加入含有体积百分含量10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；
5)将细胞悬起并转移到15ml离心管中，1000转/分钟离心5分钟；
6)用适量William E培养基(美国Sigma-Aldrich公司，W4128)重悬；
7)将肝脏前体细胞接种至步骤1)中Matrigel包被的培养皿上；
8)补足胆管分化培养基，胆管分化培养基为含有20mM HEPES，17mM NaHCO3，5mM丙酮酸钠，0.2mM Asc-2P，14mM葡萄糖，体积百分含量1％的GlutaMAX-I二肽(美国Invitrogen公司，35050-061)，0.1μM地塞米松，体积百分含量1％的胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠混合物，质量百分含量0.05％的牛血清白蛋白组分V，5.35ug/ml亚麻油酸(美国BD公司，354227)，20ng/ml EGF。
9)放入CO2培养箱进行培养，每天换液。
已经有报道证明Matrigel具有诱导从胎肝直接分离得到的肝脏前体细胞向胆管细胞分化的作用(Tanimizu and Miyajima，J Cell Sci.2004 Jul 1；117，3165-3174)。免疫荧光显示经过诱导之后有KRT19、KRT7表达，AFP不表达的细胞出现(图20)图20A中红色为KRT7阳性细胞，图20B中红色为KRT19阳性；标尺，50μm。这说明肝脏前体细胞具有向胆管细胞分化的潜能。
C)三维培养条件下肝脏前体细胞向类胆管细胞分化
1)取生长状态较好的肝脏前体细胞，弃去培养基，加入PBS洗一次；
2)加入胰酶-EDTA消化液，室温消化3-5分钟，镜下观察细胞收缩变圆，彼此分离即可；
3)加入含有体积百分含量10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，将细胞悬起并转移到15ml离心管中；1000转/分钟离心5分钟；
4)用适量胆管分化培养基重悬；
5)准备混合凝胶：每1ml凝胶含有400μl Matrigel，240μl一型胶原(美国R&D公司，3442-100-01)，360μl胆管分化培养基；
6)混匀混合凝胶，用手掌型离心机轻轻离心一下，避免气泡产生；
7)将混合凝胶按100μl/cm2小心加入到细胞培养皿中；
8)放入37℃培养箱进行培养1-2个小时，等待凝胶凝固；
9)在已经凝固的凝胶上补等体积的胆管分化培养基，放入37℃培养箱；每天更换凝胶上的胆管分化培养基。
肝脏前体细胞按照上述方法分化培养7天之后，分化的细胞形成中央为空腔，外层由单层细胞构成的囊泡结构。通过免疫荧光检测发现，两个传统的胆管细胞标志蛋白KRT7和KRT19在囊泡的单层细胞中表达，而肝脏谱系特异的蛋白AFP则不表达。
进一步，我们通过免疫荧光的方法检测β-catenin、E-cadherin、integrinα6和F-actin等蛋白的亚细胞定位，从而判断分化的细胞是否如胆管细胞一样具有顶侧-基底侧的极性。
检测发现β-catenin只位于细胞的基底侧，而F-actin则富集在囊泡的内层，即顶端。因此，组成该囊泡结构的分化细胞是具有顶侧-基底侧的上皮极性的。此外，E-cadherin和integrinα6也在基底侧特异表达(图21)。图21A为类胆管状细胞形成胆管状结构；图21B为免疫荧光显示类胆管细胞表达KRT19(红色)；图21C为免疫荧光显示类胆管细胞表达KRT7(红色)，但不表达AFP(绿色)；图21D上皮极性的标志性蛋白β-catenin的定位；图21G上皮极性的标志性蛋白E-cadherin的定位；图21J为Integrin α6的定位，β-catenin(D)，E-cadherin(G)和Integrinα6(J)定位于细胞的基底侧；F-actin(图21E和图21H)位于细胞的顶侧。胆管细胞标志KRT19同时位于顶侧和基底侧(图21K)。图21F，I，L显示的为合并图。蓝色为DAPI标记的细胞核。标尺，50μm。
检测分化得到的类胆管细胞是否如正常的胆管细胞一样具有运输和分泌的功能，分析参与胆管运输和分泌的关键蛋白MDR的功能情况。MDR是一种ATP依赖的跨膜运输泵，有文献报道其可能参与了胆汁中阳离子物质的分泌(Gigliozzi等，Gastroenterology.2000 Oct；119，1113-1122)。将分化得到的囊泡与荧光染料rhodamine 123(美国Sigma-Aldrich公司，83702-10MG)共同孵育。囊泡内空腔部分的荧光强路要远高于周围细胞内的荧光强度。用10mM的MDR蛋白的抑制剂Verapamil(美国Sigma-Aldrich公司，V106-5MG)进行处理，rhodamine 123被限制在囊泡外周的细胞中，而丧失了转运至囊泡内空腔的能力(图22)。这说明rhodamine 123的转运的确是依赖于位于细胞顶侧的功能性的MDR蛋白的。以上的结果共同说明，这些从肝脏前体细胞分化得到的细胞与胆管细胞具有很强的相似性的。
利用诱导的多潜能干细胞(ips)细胞系hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3(赵扬，Two supporting factors greatly improve the efficiency of human iPSCgeneration.Cell Stem Cell，2008；3：475-479.)(北京大学)用相同的方法进行分化，同样可以得到肝脏前体细胞。该肝脏前体细胞同样具有克隆形态，具有长期增殖能力，并表达AFP、KRT19(图24)和KRT7，以及假定的肝脏前体细胞标志EpCAM和CD133。
序列表
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
cccgaacttt ccaagccata 20
<210>2
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
tacatgggcc acatccagg 19
Claims (5)
1.一种制备肝脏内胚层细胞的方法，包括如下步骤：
1）将人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞在内胚层诱导培养基I上培养；
2）步骤1）获得的细胞在内胚层诱导培养基II上培养；
3)步骤2）获得的细胞在内胚层诱导培养基III上培养；
4）步骤3）获得的细胞肝脏内胚层诱导培养基上培养；
5）用流式细胞仪分选表达神经性钙黏附蛋白表面蛋白的细胞，得到肝脏内胚层细胞；
所述内胚层诱导培养基I为含有质量百分含量0.02%-1%的牛血清白蛋白组分V和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；所述内胚层诱导培养基II为含有质量百分含量0.02%-1%的牛血清白蛋白组分V，体积百分含量0.05%-0.5%的胰岛素—转铁蛋白—亚硒酸钠混合补充液和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；所述内胚层诱导培养基III为含有质量百分含量0.02%-1%的牛血清白蛋白组分V，体积百分含量0.5%-2%的胰岛素—转铁蛋白—亚硒酸钠混合补充液和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；所述肝脏内胚层诱导培养基为含有20-60ng/ml人成纤维细胞生长因子-4和10-30ng/ml人骨成型蛋白-2的肝细胞培养基；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基础细胞培养基为MEM、DMEM、BME、DMEM／F12、RPMI1640或Fischers。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞在内胚层诱导培养基I上培养24h；所述方法中，步骤1）获得的细胞在内胚层诱导培养基II上培养24h；所述方法中，步骤2）获得的细胞在内胚层诱导培养基III上培养24h；所述方法中，步骤3）获得的细胞肝脏内胚层诱导培养基上培养5天。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述人胚胎干细胞为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述可从商业途径获得的人胚胎干细胞系为下述任一种细胞系：BG01,BG02,BG03,BG04，SA01,SA02,SA03，ES01,ES02,ES03,ES04,ES05,ES06，TE03,TE32,TE33,TE04,TE06,TE62,TE07,TE72，UC01,UC06，WA01,WA07,WA09,WA13和WA14；所述编号为NIH的编号。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200910089693 CN101962628B (zh) | 2009-07-24 | 2009-07-24 | 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法 |
| EP10801854.0A EP2457998A4 (en) | 2009-07-23 | 2010-07-23 | METHODS FOR OBTAINING HEPATIC CELLS, HEPATIC ENDODERM CELLS, AND HEPATIC PRECURSOR CELLS BY INDUCING THE DIFFERENTIATION |
| PCT/CN2010/001118 WO2011009294A1 (zh) | 2009-07-23 | 2010-07-23 | 通过诱导分化获得肝脏细胞、肝脏内胚层细胞和肝脏前体细胞的方法 |
| JP2012520888A JP2012533310A (ja) | 2009-07-23 | 2010-07-23 | 分化誘導による肝細胞、肝内胚葉細胞及び肝前駆細胞を得る方法 |
| US13/386,373 US20120190059A1 (en) | 2009-07-23 | 2010-07-23 | Methods for obtaining hepatocytes, hepatic endoderm cells and hepatic progenitor cells by induced differentiation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200910089693 CN101962628B (zh) | 2009-07-24 | 2009-07-24 | 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101962628A CN101962628A (zh) | 2011-02-02 |
| CN101962628B true CN101962628B (zh) | 2013-03-20 |
Family
ID=43515683
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200910089693 Expired - Fee Related CN101962628B (zh) | 2009-07-23 | 2009-07-24 | 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101962628B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103374546B (zh) * | 2012-04-12 | 2018-05-18 | 北京大学 | 肝实质细胞及其制备、鉴定与应用方法 |
| CN105797154B (zh) * | 2014-12-31 | 2020-03-10 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 软骨干细胞的分离及其应用 |
| CN106754636B (zh) * | 2015-11-19 | 2019-08-30 | 中国人民解放军第二军医大学 | 体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用 |
| CN108865969B (zh) * | 2017-05-11 | 2022-04-01 | 北京大学 | Mapk/pkc信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟 |
| CN110923191B (zh) * | 2018-11-23 | 2022-09-16 | 中国科学院动物研究所 | 将干细胞诱导为肝细胞的方法和试剂盒 |
| CN111235094B (zh) * | 2020-03-11 | 2023-06-30 | 上海东方星际干细胞科技有限公司 | 一种人多能干细胞向内胚层分化的方法 |
| CN112553143A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-03-26 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种肝脏模型及其制备方法和用途 |
| CN114686418B (zh) * | 2022-02-21 | 2024-04-02 | 江苏鼎泰药物研究(集团)股份有限公司 | 一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101573441A (zh) * | 2005-12-08 | 2009-11-04 | 路易斯维尔大学研究基金会有限公司 | 非常小的胚胎样（vsel）干细胞及分离和利用其的方法 |
-
2009
- 2009-07-24 CN CN 200910089693 patent/CN101962628B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Rebecca N. Moore，et al.Enhanced differentiation of embryonic stem cells using co-cultivation with hepatocytes.《Biotechnology and Bioengineering》.2008, * |
| Takashi Hamazaki,et al.Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cells in vitro.《FEBS Letters》.2001, * |
| 金晔，等.骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中肝细胞相关转录因子的表达.《中国医学科学院学报》.2009, * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101962628A (zh) | 2011-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101962629B (zh) | 肝脏前体细胞及其制备方法与应用 | |
| CN101962628B (zh) | 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法 | |
| Kang et al. | Differentiating characterization of human umbilical cord blood‐derived mesenchymal stem cells in vitro | |
| Luo et al. | Three-dimensional hydrogel culture conditions promote the differentiation of human induced pluripotent stem cells into hepatocytes | |
| Li et al. | Hepatoblast-like progenitor cells derived from embryonic stem cells can repopulate livers of mice | |
| Hookway et al. | Aggregate formation and suspension culture of human pluripotent stem cells and differentiated progeny | |
| JP2012533310A (ja) | 分化誘導による肝細胞、肝内胚葉細胞及び肝前駆細胞を得る方法 | |
| Haque et al. | The effect of recombinant E-cadherin substratum on the differentiation of endoderm-derived hepatocyte-like cells from embryonic stem cells | |
| JP6013196B2 (ja) | 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法 | |
| JP5843775B2 (ja) | 幹細胞を分化させるための重量オスモル濃度の操作法 | |
| KR102151588B1 (ko) | hUTC 성장을 위한 영양 강화 배지 | |
| CN103374546B (zh) | 肝实质细胞及其制备、鉴定与应用方法 | |
| US20180305669A1 (en) | Microtissue formation using stem cell-derived human hepatocytes | |
| Costa et al. | Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization | |
| CN100465268C (zh) | 人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基 | |
| Meng et al. | The differentiation and isolation of mouse embryonic stem cells toward hepatocytes using galactose-carrying substrata | |
| CN103834613A (zh) | 制备多能心血管前体细胞及维持其心血管分化能力的方法 | |
| CN107916248A (zh) | 来源于人类干细胞的肝细胞分化方法及肝细胞 | |
| Saito et al. | Promoted differentiation of cynomolgus monkey ES cells into hepatocyte-like cells by co-culture with mouse fetal liver-derived cells | |
| CN108884438B (zh) | 肝细胞的生产方法 | |
| EP2134836A2 (en) | A combined scalable in vitro differentiation system for human blastocyst-derived stem (hbs) cells or cells derived from hbs cells for direct assay application in multiwell plates | |
| Guenther et al. | The treasury of Wharton's Jelly | |
| KR102218549B1 (ko) | 인간 타액선 세포의 배양 방법 | |
| Shi et al. | Generation of hepatocytes and nonparenchymal cell codifferentiation system from human-induced pluripotent stem cells | |
| EP2104731A1 (en) | Novel mesenchymal progenitor cells derived from human blastocyst-derived stem cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130320 Termination date: 20150724 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |