KR102151588B1 - hUTC 성장을 위한 영양 강화 배지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아미노산, 비타민, 염, 뉴클레오시드, 인슐린, 트랜스페린, 에탄올아민 및 나트륨 셀레늄을 포함하는 배양 배지에서 부착의존성 세포(예를 들어, hUTC)를 성장시키는 방법을 제공하며, 배양 배지에는 혈청이 보충된다. 본 방법은 아미노산, 비타민, 염, 뉴클레오시드, 인슐린, 트랜스페린, 에탄올아민 및 나트륨 셀레늄을 포함하는 무혈청 영양액의 첨가를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 부착의존성 세포 성장용 배양 배지 및 무혈청 영양액을 제공한다.

Description

hUTC 성장을 위한 영양 강화 배지{NUTRIENT ENRICHED MEDIA FOR hUTC GROWTH}

본 출원은 예를 들어, 제대 조직 유래 세포와 같은 부착의존성 세포(anchorage-dependent cell)의 성장을 위한 영양 강화 배양 배지에 관한 것이다.

동종이계 세포 치료제의 경우, 세포 또는 조직을 공여자로부터 수득하여, 환자에게 투여되기 전에 추가로 조작한다. 일반적으로, 비상동성 세포 치료제의 제조 공정은 하기 단계를 포함한다: 세포 은행 바이알을 해동하여 세포를 증식시켜, 생산 용기를 접종시키는 단계; 생산 용기에서 세포를 생산하는 단계; 세포의 생산 동안 사용된 바람직하지 않은 불순물, 예컨대, 혈청 및 트립신을 제거하는 단계; 세포를 농축시키는 단계; 최종 제형 완충제로 세포를 제형화하는 단계; 및 세포를 동결시키는 단계. 이러한 제조 공정은 상당히 복잡하고 비용이 많이 들 수 있다. 예를 들어, 세포 요법 적용을 위한 세포는 일반적으로 혈청이 보충된 성장 배지에서 배양되고 증식된다. 세포 요법의 생산 비용은 공정에 사용되는 혈청, 배지 및 기타 소모품의 높은 비용으로 인해 매우 높아질 수 있다. 영양 제한, 배양 중 세포 부산물의 축적, 물리적 환경 등을 비롯한 다수의 인자들이 세포가 고세포 밀도로 성장하는 것을 제한할 수 있다. 따라서, 세포를 고세포 밀도로 성장시켜 생산 용기로부터 생산되는 부피 당 세포(volumetric cell)를 증가시키는 것이 바람직하다.

진행(run) 3일째에, 예를 들어, 인간 제대 조직 유래 세포(hUTC)와 같은 부착의존성 세포를 15% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 세포 성장 배지로 교환하여, 고세포 밀도로 성장시킬 수 있다는 것이 이미 밝혀졌다. 그러나, 이러한 배지 교환은 높은 혈청 비용, 생산을 위한 높은 혈청 사용량 및 추가의 운행 조작으로 인해 덜 바람직하다. 따라서, 배지 교환을 사용한 공정은 상업적으로 실현가능하지 않다.

상업적으로 실현가능한, 세포 성장 배지를 교환할 필요 없이 세포를 성장시키는 새로운 방법이 필요하다.

본 발명의 일 실시 형태는 (1) 아미노산: L-아르기닌; L-시스틴; L-시스테인; L-글루타민; 글리신; L-히스티딘; L-이소류신; L-류신; L-라이신; L-메티오닌; L-페닐알라닌; L-세린; L-트레오닌; L-트립토판; L-티로신; L-발린; L-알라닌; L-아스파라긴; L-아스파르트산; L-글루탐산; L-프롤린; 및 L-타우린; (2) 비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민); (3) 염: 염화칼슘, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨 및 하나 이상의 인산나트륨 염; (4) 뉴클레오시드: 티미딘, 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신; (5) 인슐린; (6) 트랜스페린; (7) 리포산/티옥트산; (8) 에탄올아민; (9) 아셀렌산나트륨; 및 (10) 하나 이상의 에너지 공급원을 포함하는, 부착의존성 세포 성장용 배양 배지이다.

일 실시 형태에서, 배양 배지는,

L-아르기닌 약 0.05 g/L 이상; L-시스틴 약 0.02 g/L 이상; L-글루타민 약 0.2 g/L 이상; 글리신 약 0.01 g/L 이상; L-히스티딘 약 0.02 g/L 이상; L-이소류신 약 0.09 g/L 이상; L-류신 약 0.09 g/L 이상; L-라이신 약 0.09 g/L 이상; L-메티오닌 약 0.02 g/L 이상; L-페닐알라닌 약 0.05 g/L 이상; L-세린 약 0.03 g/L 이상; L-트레오닌 약 0.08 g/L 이상; L-트립토판 약 0.009 g/L 이상; L-티로신 약 0.08 g/L 이상; L-발린 약 0.08 g/L 이상; L-시스테인 약 0.005 g/L 이상; L-알라닌 약 0.0004 g/L 이상; L-아스파라긴 약 0.01 g/L 이상; L-아스파르트산 약 0.006 g/L 이상; L-글루탐산 0.03 g/L 이상; L-프롤린 약 0.005 g/L 이상; 및 L-타우린 약 0.0003 g/L 이상;

각각의 비타민 약 5 × 10^-6 g/L 내지 약 0.015 g/L;

무수 염화칼슘 약 0.05 g/L 이상, 염화칼륨 약 0.1 g/L 이상, 황산마그네슘 약 0.2 g/L 이상, 인산이수소나트륨 일수화물(sodium phosphate, monobasic, H₂O) 약 0.08 g/L 이상 및 인산일수소나트륨 칠수화물(sodium phosphate, dibasic heptahydrate; Na₂HPO₄.7H₂O) 약 0.0005 g/L 이상;

티미딘 약 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 약 0.005 g/L 이상; 및

인슐린 0.003 g/L 이상, 트랜스페린 0.05 g/L 이상, 리포산/티옥트산 약 5 × 10^-6 g/L 이상, 에탄올아민 0.05 g/L 이상 및 아셀렌산나트륨 약 0.00004 g/L 이상을 포함한다.

본 발명의 다른 실시 형태는,

아미노산: L-아르기닌, L-시스틴, L-시스테인, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-타우린;

비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민);

염: 인산이수소나트륨 및 인산일수소나트륨 칠수화물;

뉴클레오시드: 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신;

인슐린; 트랜스페린; 리포산/티옥트산; 에탄올아민; 및 아셀렌산나트륨을 포함하는, 부착의존성 세포 성장용 무혈청 영양액(serum-free nutrient solution)이다.

본 발명은 또한 부착의존성 세포 성장용 키트(kit)를 제공한다. 키트는 배양 배지 및/또는 무혈청 영양액을 포함한다. 배양 배지, 무혈청 영양액 및 키트는 부착의존성 세포(예를 들어, 제대 조직 유래 세포)를 성장시키는 방법에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 실시 형태는,

아미노산, 비타민, 염, 뉴클레오시드, 리포산/티옥트산, 에탄올아민, 인슐린, 트랜스페린, 나트륨 셀레늄(sodium selenium)을 포함하는, 혈청이 보충된 배양 배지에서 마이크로캐리어 상에 접종시킨 제대 조직 유래 세포를, 상기 세포가 원하는 초기 집단 밀도를 달성하기에 충분한 시간 동안 성장시키는 단계;

상기 세포가 원하는 초기 집단 밀도를 달성한 후에, 아미노산, 비타민, 염, 인슐린, 트랜스페린, 에탄올아민, 리포산/티옥트산, 나트륨 셀레늄을 포함하는 무혈청 영양액을 첨가하는 단계; 및

상기 세포를, 상기 세포가 원하는 최종 집단 밀도를 달성하기에 충분한 시간 동안 성장시키는 단계를 포함하는, 단리된 제대 조직 유래 세포를 배양하는 방법이다.

본 방법은 추가의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 세포를 마이크로캐리어 상에 접종시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 방법은 배양 후 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 원하는 초기 집단 밀도는 3 내지 4일 후에 달성된다. 본 방법은 배지 교환을 필요로 하지 않는다. 본 방법은 회전병 배양 시스템(roller bottle culture system)에서 수행될 수 있으며, 마이크로캐리어는 아민 처리된 표면을 가질 수 있다.

본 방법에 사용되는 제대 조직 유래 세포는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, 분화하는 잠재력을 갖고, CD13, CD90, HLA-ABC를 발현하며, CD34, CD117 및 HLA-DR을 발현하지 않는다. 일 실시 형태에서, 세포는 hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 세포의 특성은 배양 전후에 실질적으로 동일하다. 일 실시 형태에서, 세포의 특성은 배양 전후에 동일하다.

일 실시 형태에서, 본 방법에 사용되는 배양 배지는,

아미노산: L-아르기닌; L-시스틴; L-시스테인; L-글루타민; 글리신; L-히스티딘; L-이소류신; L-류신; L-라이신; L-메티오닌; L-페닐알라닌; L-세린; L-트레오닌; L-트립토판; L-티로신; L-발린; L-알라닌; L-아스파라긴; L-아스파르트산; L-글루탐산; L-프롤린; 및 L-타우린;

비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민);

염: 염화칼슘, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨 및 하나 이상의 인산나트륨 염;

뉴클레오시드: 티미딘, 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신;

인슐린; 트랜스페린; 리포산/티옥트산; 에탄올아민; 아셀렌산나트륨; 및 하나 이상의 에너지 공급원(예를 들어, D-글루코스 및 피루브산나트륨)을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 본 방법에 사용되는 배양 배지는,

L-아르기닌 약 0.05 g/L 이상; L-시스틴 약 0.02 g/L 이상; L-글루타민 약 0.2 g/L 이상; 글리신 약 0.01 g/L 이상; L-히스티딘 약 0.02 g/L 이상; L-이소류신 약 0.09 g/L 이상; L-류신 약 0.09 g/L 이상; L-라이신 약 0.09 g/L 이상; L-메티오닌 약 0.02 g/L 이상; L-페닐알라닌 약 0.05 g/L 이상; L-세린 약 0.03 g/L 이상; L-트레오닌 약 0.08 g/L 이상; L-트립토판 약 0.009 g/L 이상; L-티로신 약 0.08 g/L 이상; L-발린 약 0.08 g/L 이상; L-시스테인 약 0.005 g/L 이상; L-알라닌 약 0.0004 g/L 이상; L-아스파라긴 약 0.01 g/L 이상; L-아스파르트산 약 0.006 g/L 이상; L-글루탐산 0.03 g/L 이상; L-프롤린 약 0.005 g/L 이상; 및 L-타우린 약 0.0003 g/L 이상;

각각의 비타민 약 5 × 10^-6 g/L 내지 약 0.015 g/L;

무수 염화칼슘 약 0.05 g/L 이상, 염화칼륨 약 0.1 g/L 이상, 황산마그네슘 약 0.2 g/L 이상, 인산이수소나트륨 일수화물 약 0.08 g/L 이상, 및 인산일수소나트륨 칠수화물(Na₂HPO₄.7H₂O) 약 0.0005 g/L 이상;

티미딘 약 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 약 0.005 g/L 이상; 및

인슐린 0.003 g/L 이상, 트랜스페린 0.05 g/L 이상, 리포산/티옥트산 약 5 × 10^-6 g/L 이상, 에탄올아민 0.05 g/L 이상 및 아셀렌산나트륨 약 0.00004 g/L 이상을 포함한다.

본 방법에 사용되는 배양 배지에는 2 내지 20%의 FBS가 보충된다. 일 실시 형태에서, 배양 배지에는 약 7.5%, 약 10% 또는 약 15%의 FBS가 보충된다.

일 실시 형태에서, 본 방법에 사용되는 무혈청 영양액은,

아미노산: L-아르기닌, L-시스틴, L-시스테인, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-타우린;

비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 비타민 B₁₂(시아노코발라민);

염: 인산이수소나트륨 및 인산일수소나트륨 칠수화물;

미량 미네랄: 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O), 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O);

뉴클레오시드: 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신;

인슐린; 트랜스페린; 에탄올아민; 리포산/티옥트산; 및 아셀렌산나트륨을 포함한다.

배양 배지와 무혈청 영양액은 또한 추가의 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 및/또는 무혈청 영양액은 푸트레신, 안정제 및/또는 소포제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 명백해질 것이다.

하기 예시적인 실시 형태의 상세한 설명에서, 이의 부분을 형성하는 첨부 도면에 관하여 언급하고자 한다. 이들 실시 형태는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 충분히 상세하게 기술되어 있으며, 다른 실시 형태가 이용될 수 있고, 타당한 구조적, 기계적, 전기적 및 화학적 변화가 본 발명의 사상 또는 범주에 벗어남이 없이 일어날 수 있음을 이해한다. 당업자가 본 명세서에 기재된 실시 형태를 실시가능하게 하는데 필요가 없는 세부 사항을 피하기 위해, 당업자에게 알려진 특정 정보에 대한 설명을 생략할 수 있다. 따라서, 하기 상세한 설명은 한정적인 의미로 이해되어서는 안된다.

한 측면에서, 본 발명은 혈청을 함유한 배지에서 마이크로캐리어에 부착된, 예를 들어, 인간 제대 조직 유래 세포("hUTC")와 같은 부착의존성 세포를 배지 교환 없이, 진행 중간에 배양물에 무혈청 영양액을 공급함으로써 고세포 밀도로 성장시키는 공정을 제공한다. 상기 공정은 세포의 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 세포를 고세포 밀도로 성장 가능하게 한다. 본 발명은 생산 생물반응기의 수율을 증가시켜 경제적 이익과 상업적 이익을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 스피너 플라스크(spinner flask)에서, 바람직하게는 배지를 교환할 필요가 없는 부착의존성 세포를 성장시키기 적합한 배양 배지 및 영양액을 제공한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 배지 교환 없이 스피너 플라스크에서 hUTC를 고밀도로 성장시키기 위한 강화 배지와 농축된 무혈청 영양액의 조성물을 개시한다. 이 방법은 혈청 사용량을 줄이고 부피 생산성을 증가시켜, 제조 비용을 줄인다. 특히, 본 발명은 배지 교환을 이용하여 향상된 배가를 가능하게 한다.

다른 실시 형태에서, 본 발명은 아미노산(배양 중 소모된 아미노산을 보충하기 위해); 비타민; 염(배양 중 삼투성 평형을 유지하기 위해); 뉴클레오시드; 인슐린; 트랜스페린; 및 임의로 그러나 바람직하게는 에탄올아민; 및 나트륨 셀레늄을 포함하는 무혈청 영양액을 제공한다. 본 발명은 공정을 대규모 생물반응기로 확장가능하게 한다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 아미노산, 비타민, 염, 뉴클레오시드, 인슐린, 트랜스페린, 및 임의로 그러나 바람직하게는 에탄올아민 및 나트륨 셀레늄을 포함하는 배양 배지를 제공한다. 사용 전에, 이런 배양 배지에는 혈청이 보충될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 혈청을 함유한 성장 배지에 영양소를 보강하고 배양물에 무혈청 영양소를 공급함으로써, 스피너 플라스크의 현탁 배양물 중에서 마이크로캐리어에 부착된 hUTC를 고세포 밀도로 성장시키는 방법이 또한 개시되어 있다. 이런 방법은 hUTC를 고밀도로 성장시키기 위한 배지 교환을 제거한다.

본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 다양한 용어가 사용된다. 이러한 용어는 달리 지시되지 않으면 본 기술 분야에서의 그의 통상적인 의미로 주어져야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다.

일 실시 형태에서, 본 발명에 사용되는 세포는 일반적으로 산후 세포 또는 산후 유래 세포(PPDC)로 지칭된다. 이들 세포는 더욱 구체적으로는 "제대 유래 세포는 "제대 유래 세포(UDC)" 또는 "제대 조직 유래 세포(UTC)"이다. 또한, 세포는 줄기 또는 전구 세포인 것으로 설명될 수 있으며, 후자의 용어는 넓은 의미로 사용된다. 용어 "유래"는 세포를 이들의 생물학적 공급원으로부터 수득하고 성장시키거나, 아니면 시험관 내에서 조작한(예를 들어, 성장 배지에서 배양하여, 집단을 증식시키고/증식시키거나 세포주를 생성한) 것을 나타내기 위하여 사용된다. 제대 줄기 세포의 시험관 내 조작 및 본 발명의 제대 유래 세포의 독특한 특징은 하기에 상세히 기술된다.

줄기 세포는 자가 재생할 뿐 아니라, 분화하여, 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 단일 세포의 능력에 의해 정의되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그들의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주사 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.

줄기 세포는 그들의 발생능(developmental potential)에 따라, (1) 전능성(totipotent); (2) 만능성; (3) 다능성; (4) 소기능성(oligopotent); 및 (5) 단일기능성(unipotent)으로 분류된다. 전능성 세포는 모든 배아 및 배외 세포 유형을 발생시킬 수 있다. 만능성 세포는 모든 배아 세포 유형을 발생시킬 수 있다. 다능성 세포는 세포 계통의 아형(subset)을 발생시킬 수 있으나, 모두 특정 조직, 기관 또는 생리계 내에 있는 것들을 포함한다. 예를 들어, 조혈모세포(HSC)는 HSC(자가 재생), 혈액 세포 제한 소기능성 전구 세포 및 통상적인 혈액 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있다. 소기능성인 세포는 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 아형의 세포 계통을 발생시킬 수 있다. 단일기능성인 세포는 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)을 발생시킬 수 있다.

줄기 세포는 또한 그들이 수득되는 공급원에 기초하여 분류된다. 성체 줄기 세포는 일반적으로 다수의 분화된 세포 유형을 포함하는 조직에서 관찰되는 다능성 미분화 세포이다. 성체 줄기 세포는 스스로 재생할 수 있다. 정상 환경 하에서, 이는 또한 분화하여, 이것이 유래되는 조직의 특화된 세포(specialized cell) 유형, 및 아마도 다른 조직 유형을 제공할 수 있다. 배아 줄기 세포는 배반포기 배아의 내세포집단 유래의 만능성 세포이다. 태아 줄기 세포는 태아 조직 또는 막에서 유래되는 것이다. 산후 줄기 세포는 실질적으로 출산 후에 입수할 수 있는 배외 조직, 즉 제대에서 유래되는 다능성 또는 만능성 세포이다. 이들 세포는 급속 증식 및 많은 세포 계통으로의 분화 잠재력을 포함하는 만능성 줄기 세포에 특유한 특징을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 산후 줄기 세포는 혈액 유래(예를 들어, 제대혈로부터 수득되는 것들과 같음)이거나 비혈액(non-blood) 유래(예를 들어, 제대 및 태반의 비혈액 조직으로부터 수득되는 것들과 같음)일 수 있다.

다양한 용어를 사용하여 배양 중인 세포를 기술한다. "세포 배양물"은 일반적으로 살아있는 유기체로부터 취해지고, 조절된 조건 하에서 성장된 ("배양 중" 또는 "배양된") 세포를 말한다. "1차 세포 배양물"은 첫 번째 계대 배양(subculture) 전에 유기체(들)로부터 직접 취한 세포, 조직 또는 기관의 배양물이다. 세포를 세포 성장 및/또는 분열을 용이하게 하는 조건 하에 성장 배지 중에 둘 때, 세포는 배양 중 "증식"되어서 더욱 큰 세포 집단이 얻어진다. 세포가 배양 중 증식될 때, 세포 증식 속도는 때때로 세포수를 배가시키는데 필요한 시간의 양으로 측정된다. 이는 "배가 시간(doubling time)"으로 지칭된다.

일반적으로 용어 "세포주"는 1차 세포 배양물의 하나 이상의 계대 배양에 의해 형성되는 세포의 집단을 말한다. 계대 배양의 각각의 라운드(round)는 계대로 지칭된다. 세포가 계대 배양될 때, 세포는 "계대된" 것으로 칭해진다. 세포의 특정 집단, 또는 세포주는 때때로 그가 계대된 횟수를 말하거나 또는 상기 횟수에 의해 특징지어진다. 예를 들어, 10회 계대된 배양 세포 집단은 P10 배양물로서 지칭될 수 있다. 1차 배양물, 즉 조직으로부터 세포를 단리한 후 첫 번째 배양물을 P0으로 표기한다. 첫 번째 계대 배양 후에, 세포를 2차 배양물로 기재한다(P1 또는 계대 1). 두 번째 계대 배양 후, 세포는 3차 배양물(P2 또는 계대 2) 등이 된다. 당업자라면 계대 기간 동안 많은 집단의 배가가 있을 수 있으므로, 배양물의 집단 배가(population doubling) 수는 계대 수보다 크다는 것을 이해할 것이다. 계대 사이의 기간 동안 세포의 증식(즉, 집단 배가 수)은 접종 밀도, 기질, 배지, 성장 조건 및 계대간 시간을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인자에 좌우된다.

"분화"는 특화되지 않은("비수임된(uncommitted)") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. "분화된" 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된("수임된") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "수임된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 아형으로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경 하에서, 다른 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. "탈분화(de-differentiation)"는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 수임된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 "계통"은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다.

넓은 의미에서, "전구 세포"는 그 자체보다 더 분화되지만, 전구 세포의 풀(pool)을 보충하는 능력을 유지하는 자손을 생성하는 능력을 갖는 세포이다. 이 정의에 의하면, 최종 분화된 세포의 보다 직접적인 전구체가 그러하듯이, 줄기 세포 그 자체도 전구 세포이다. 본 발명의 세포를 지칭하는 경우, 하기에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 넓은 정의의 전구 세포가 사용될 수 있다. 좁은 의미에서, 전구 세포는 종종 분화 경로에서의 중간체인 세포로 정의되며, 다시 말하면, 이는 줄기 세포로부터 발생하고, 성숙 세포 유형 또는 세포 유형의 아형의 생성시 중간체이다. 이러한 유형의 전구 세포는 일반적으로 자가 재생할 수 없다. 따라서, 이러한 유형의 세포가 본 명세서에 지칭되는 경우, 이는 "비재생 전구 세포" 또는 "중간 전구 세포 또는 선구 세포(precursor cell)"로 지칭될 것이다.

일반적으로, "영양 인자"는 세포의 생존, 성장, 증식 및/또는 성숙을 촉진하거나 세포의 활성 증가를 자극하는 물질로 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표준 성장 조건"은 37℃에서, 5% CO₂ 및 약 100%로 유지된 상대 습도를 포함하는 표준 분위기하에서 세포를 배양하는 것을 말한다. 상술한 조건이 배양에 유용하지만, 이러한 조건이 세포를 배양하기 위한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 이용가능한 옵션을 인식할 숙련된 기술자에 의해 달라질 수 있음이 이해되어야 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리하다"는 세포가 이의 천연 환경으로부터 분리되었음을 말한다. 이 용어는 이의 천연 환경으로부터의 총체적인 물리적 분리, 예를 들어 공여 동물로부터의 제거를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 단리된 세포는 조직에 존재하지 않으며, 즉, 세포는 이것이 보통 접촉 상태로 있는 이웃 세포로부터 분리되거나 해리되어 있다. 바람직하게는, 세포는 세포 현탁액으로서 투여된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "세포 현탁액"은 배지와 접촉한 상태로 있고, 예를 들어 조직의 조각을 부드럽게 미분화함으로써 해리된 세포를 포함한다.

본 발명의 일 실시 형태는 본 발명의 배양 배지 및 무혈청 영양액을 이용한 단리된 부착의존성 세포를 배양하는 방법이다. 단리된 부착의존성 세포(예를 들어, 제대 조직 유래 세포)를 배양하는 방법은 적어도 하나의 캐리어 입자, 예를 들어, 마이크로캐리어 상에 세포를 배양하는 것을 제공한다. 마이크로캐리어는 천연 또는 합성적으로 유래된 물질로 구성될 수 있다. 이의 예에는 콜라겐 기반 마이크로캐리어, 덱스트란 기반 마이크로캐리어 또는 셀룰로오스 기반 마이크로캐리어 뿐만 아니라, 유리, 세라믹, 폴리머(예컨대, 폴리스티렌) 또는 금속도 포함된다. 마이크로캐리어는 무단백질이거나 단백질 코팅, 예를 들어, 콜라겐으로 코팅될 수 있다. 추가의 측면에서, 마이크로캐리어는 세포의 마이크로캐리어에 대한 결합을 향상시키고 세포의 마이크로캐리어로부터의 유리를 향상시키는, 히알루론산나트륨, 폴리(모노스테아로일글리세라이드 코-숙신산), 폴리-D,L-락티드-코-글리콜리드, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 라이신, n-아이소프로필 아크릴아미드, 비트로넥틴 및 콜라겐을 포함하지만 이에 한정되지 않은 화합물로 구성되거나 코팅될 수 있다. 이의 예에는 생물학적으로 유의미한 낮은 수준의 전기를 생성하는 미세전류를 보유한 마이크로캐리어, 예를 들어, 아연 및 구리의 갈바닉 쌍(galvanic couple) 미립자를 갖는 마이크로캐리어; 또는 상자성(paramagnetic)인 마이크로캐리어, 예를 들어, 상자성 칼슘-알기네이트 마이크로캐리어가 추가로 포함된다. 본 방법은 회전병 배양 시스템에서 수행될 수 있다.

본 발명은 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템에 한정되지 않으며, 이는 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 그 내용이 달리 명확하게 지시하지 않으면 복수형 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"의 언급은 둘 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.

"마이크로캐리어"는 배양 중 부착의존성 세포의 부착 및 성장에 유용한 입자, 비드 또는 펠릿을 지칭한다. 마이크로캐리어는 하기 특성을 갖는다: (a) 이들은 현탁 배양에 이용될 수 있을 만큼 충분히 작고(마이크로캐리어 또는 세포에 현저한 전단 손상(shear damage)을 유발하지 않는 교반 속도로); (b) 이들은 충실형(solid)이거나 표면 상에 다공성 코팅을 갖는 충실형 코어(core)를 가지며; (c) 이들의 표면(다공성 캐리어의 경우에 외부와 내부 표면)은 양이나 음으로 하전될 수 있는 특성. 한 측면에서, 마이크로캐리어는 약 150 내지 350 μm의 전체 입자 직경을 갖고, 약 0.8 내지 2.0 meq/g의 양전하 밀도를 갖는다. 예시적인 유용한 마이크로캐리어는 사이토덱스(Cytodex)® 1, 사이토덱스® 2 또는 사이토덱스® 3 (GE 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences))를 포함한다.

다른 측면에서, 마이크로캐리어는 충실형 캐리어이다. 충실형 캐리어는 부착 세포, 예를 들어, 부착의존성 세포에 특히 적합하다. 캐리어 입자는 또한 다공성 마이크로캐리어일 수 있다. 이의 예에는 미세전류를 보유한 마이크로캐리어, 예컨대, 생물학적으로 유의미한 낮은 수준의 전기를 생성하는 아연 및 구리의 갈바닉 쌍 미립자를 갖는 마이크로캐리어; 또는 상자성인 마이크로캐리어, 예컨대, 상자성 칼슘-알기네이트 마이크로캐리어가 추가로 포함된다.

"다공성 마이크로캐리어"는 배양 중 부착의존성 세포의 부착 및 성장에 유용한 입자를 말한다. 다공성 마이크로캐리어는 하기 특성을 갖는다: (a) 이들은 현탁 배양에 이용될 수 있을 만큼 충분히 작고(마이크로캐리어 또는 세포에 현저한 전단 손상을 유발하지 않는 교반 속도로); (b) 이들은 세포가 입자의 내부 공간으로 이동할 수 있을 만큼 충분한 크기의 구멍과 내부 공간을 가지며; (c) 이들의 표면(외부와 내부)은 양이나 음으로 하전될 수 있음. 일련의 실시 형태에서, 캐리어는 (a) 약 150 내지 350 μm의 전체 입자 직경을 갖고; (b) 약 15 내지 약 40 μm의 평균 기공 개구 직경(pore opening diameter)을 가지며; (c) 약 0.8 내지 2.0 meq/g의 양전하 밀도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, DEAE(N,N-다이에틸아미노에틸) 기는 양전하를 제공한다. 유용한 다공성 마이크로캐리어에는 제한 없이, 사이토포어(Cytopore) 1^® 및 사이토포어 2^®(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 GE 헬스케어 라이프 사이언시스)이 포함된다.

"부착의존성 세포"는 조직 배양물에서 복제하기 위해, 표면, 예를 들어, 조직 배양 플라스크 표면 또는 마이크로캐리어 입자 표면에 부착해야 하는, 포유류 세포를 비롯한 세포이다.

측정가능한 값, 예를 들어 양, 시간적 기간 등을 말할 때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 특정된 값으로부터 ± 20% 또는 ± 10%, 더욱 바람직하게는 ± 5%, 더욱더 바람직하게는 ± 1%, 그리고 더욱더 바람직하게는 ± 0.1%의 편차를 포함함을 의미하며, 이와 같이 편차는 개시된 방법을 수행하기에 적절하다.

I. 배양 배지 및 무혈청 영양 공급액(Nutrient Feed Solution)

본 발명은 강화 배지 및 무혈청인 농축 영양 공급액을 제공한다. 배지 및 무혈청 영양액은 세포를 고밀도로 성장시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 배지 및 무혈청 영양액은 스피너 플라스크에서 더 낮은 혈청 소모로, 예를 들어, hUTC와 같은 부착의존성 세포를 고밀도로 성장시키는데 사용될 수 있다.

일 실시 형태에서, 배양 배지 및 무혈청 영양액은 제대 조직 유래 세포의 성장에 사용된다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지 및 무혈청 영양액은 중간엽 줄기 세포, 골수 유래 줄기 세포, 태반 조직으로부터 유래된 세포, 예를 들어, 지방 조직, 근육 조직과 같은 비골수 조직으로부터 유래된 유착성 세포, 내유 동맥(internal mammary artery)을 비롯한 혈관으로부터 유래된 세포, 치아의 치수(dental pulp)로부터 유래된 세포, 양수로부터 유래된 세포 및 신생아 포피 섬유아세포를 비롯한 섬유아세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 전구 세포의 성장에 적합하다.

A. 배양 배지

본 발명의 한 측면은 아미노산; 비타민; 염; 뉴클레오시드; 인슐린; 트랜스페린; 에탄올아민; 아셀렌산나트륨; D-글루코스 및 피루브산나트륨을 포함하는 배양 배지이다.

일 실시 형태에서, 배양 배지는 통상적인 L-아미노산을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 하기 아미노산을 포함한다: L-아르기닌; L-시스틴; L-글루타민; 글리신; L-히스티딘; L-이소류신; L-류신; L-라이신; L-메티오닌; L-페닐알라닌; L-세린; L-트레오닌; L-트립토판; L-티로신; L-발린; 및 임의로 L-시스테인; L-알라닌; L-아스파라긴; L-아스파르트산; L-글루탐산; L-프롤린; 및 L-타우린. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 각각의 아미노산 약 0.0006 g/L 내지 약 0.1 g/L를 포함한다.

또 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 L-아르기닌 약 0.1 g/L 이상; L-시스틴 약 0.05 g/L 이상; L-글루타민 약 0.3 g/L 이상; 글리신 약 0.02 g/L 이상; L-히스티딘 약 0.03 g/L 이상; L-이소류신 약 0.08 g/L 이상; L-류신 약 0.08 g/L 이상; L-라이신 약 0.1 g/L 이상; L-메티오닌 약 0.1 g/L 이상; L-페닐알라닌 약 0.05 g/L 이상; L-세린 약 0.03 g/L 이상; L-트레오닌 약 0.08 g/L 이상; L-트립토판 약 0.01 g/L 이상; L-티로신 약 0.09 g/L 이상; L-발린 약 0.07 g/L 이상; 및 임의로 L-시스테인 약 0.007 g/L 이상; L-알라닌 약 0.0005 g/L 이상; L-아스파라긴 약 0.02 g/L 이상; L-아스파르트산 약 0.006 g/L 이상; L-글루탐산 0.03 g/L 이상; L-프롤린 약 0.01 g/L 이상; 및 L-타우린 약 0.0006 g/L 이상을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 배양 배지는 L-아르기닌 약 0.09705 g/L; L-시스틴 약 0.06779 g/L; L-시스테인 약 0.009224 g/L; L-글루타민 약 0.584 g/L; 글리신 약 0.031125 g/L; L-히스티딘 약 0.048288 g/L; L-이소류신 약 0.163713 g/L; L-류신 약 0.163713 g/L; L-라이신 약 0.16807 g/L; L-메티오닌 약 0.036748 g/L; L-페닐알라닌 약 0.073695 g/L; L-세린 약 0.05145 g/L; L-트레오닌 약 0.108609 g/L; L-트립토판 약 0.018457 g/L; L-티로신 약 0.121813 g/L; L-발린 약 0.111105 g/L; L-알라닌 약 0.000668 g/L; L-아스파라긴 약 0.031978 g/L; L-아스파르트산 약 0.0080 g/L; L-글루탐산 약 0.054728 g/L; L-프롤린 약 0.02403 g/L; 및 L-타우린 약 0.000844 g/L를 포함한다.

배양 배지는 하나 이상의 비타민을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 적어도 하기의 비타민을 포함한다: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; 및 임의로 d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민). 배지는 비타민 C 및 비타민 A를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 각각의 비타민 약 5 × 10^-6 g/L 내지 약 0.015 g/L를 포함한다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 D-판토텐산칼슘 약 0.004338 g/L; 염화콜린 약 0.006094 g/L; 엽산 약 0.004302 g/L; I-이노시톨 약 0.009568 g/L; 나이아신아미드 약 0.004302 g/L; 피리독살 약 0.004153 g/L; 리보플라빈 약 0.000431 g/L; 티아민 약 0.004304 g/L; d-비오틴 약 3.75E-05 g/L; 피리독신 약 1.85E-05 g/L 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민) 약 0.000102 g/L를 포함한다.

배양 배지는 하나 이상의 무기염을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 염화칼슘, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨 및 하나 이상의 인산나트륨 염을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 무수 염화칼슘, 염화칼륨, 무수 황산마그네슘, 인산이수소나트륨 일수화물 및 임의로 인산일수소나트륨 칠수화물(Na₂HPO₄·7H₂O)을 포함한다. 사용된 염에 따라, 배양 배지는 염 약 0.005 g/L 이상 내지 약 7 g/L 이상을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 무수 염화칼슘 약 0.01 g/L 이상, 염화칼륨 약 0.1 g/L 이상, 황산마그네슘 약 0.2 g/L 이상, 인산이수소나트륨 일수화물 약 0.08 g/L 이상, 및 임의로 인산일수소나트륨 칠수화물(Na₂HPO₄·7H₂O) 약 0.0005 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 무수 염화칼슘 약 0.2 g/L, 염화칼륨 약 0.4 g/L, 황산마그네슘 약 0.9767 g/L, 인산이수소나트륨 일수화물 약 0.13 g/L 이상, 염화나트륨 약 6.4 g/L 및 임의로 인산일수소나트륨 칠수화물(Na₂HPO₄·7H₂O) 약 0.002 g/L 이상을 포함한다.

배양 배지는 뉴클레오시드를 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 핵산 유도체(뉴클레오시드) 티미딘, 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배지는 각각의 뉴클레오시드 약 0.0001 g/L 이상 내지 약 0.02 g/L 이상을 포함한다. 일 실시 형태에서, 배지는 티미딘 약 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 약 0.005 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배지는 티미딘 약 0.00045 g/L, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 약 0.015 g/L를 포함한다.

일 실시 형태에서, 배양 배지는 인슐린, 트랜스페린, 에탄올아민 및 셀렌산나트륨을 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 인슐린 약 0.003 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 인슐린 약 0.01 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 트랜스페린 약 0.05 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 트랜스페린 약 0.055 g/L를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 에탄올아민 약 0.01 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 에탄올아민 약 0.02 g/L를 포함한다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 아셀렌산나트륨 약 0.00004 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 아셀렌산나트륨 약 0.000067 g/L를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 인슐린, 트랜스페린 및 에탄올아민을 추가로 포함하지 않는다.

본 발명의 일 실시 형태는 하기를 포함하는 배양 배지이다:

아미노산: L-아르기닌; L-시스틴; L-시스테인; L-글루타민; 글리신; L-히스티딘; L-이소류신; L-류신; L-라이신; L-메티오닌; L-페닐알라닌; L-세린; L-트레오닌; L-트립토판; L-티로신; L-발린; L-알라닌; L-아스파라긴; L-아스파르트산; L-글루탐산; L-프롤린; 및 L-타우린; 비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민); 염: 염화칼슘, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨 및 하나 이상의 인산나트륨 염; 뉴클레오시드(핵산 유도체): 티미딘, 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신; 인슐린; 트랜스페린; 에탄올아민; 아셀렌산나트륨; 및 하나 이상의 에너지 공급원. 일 실시 형태에서, 이러한 배양 배지는 각각의 아미노산 약 0.0006 g/L 내지 약 0.1 g/L를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 L-아르기닌 약 0.05 g/L 이상; L-시스틴 약 0.02 g/L 이상; L-글루타민 약 0.2 g/L 이상; 글리신 약 0.01 g/L 이상; L-히스티딘 약 0.02 g/L 이상; L-이소류신 약 0.09 g/L 이상; L-류신 약 0.09 g/L 이상; L-라이신 약 0.09 g/L 이상; L-메티오닌 약 0.02 g/L 이상; L-페닐알라닌 약 0.05 g/L 이상; L-세린 약 0.03 g/L 이상; L-트레오닌 약 0.08 g/L 이상; L-트립토판 약 0.009 g/L 이상; L-티로신 약 0.08 g/L 이상; L-발린 약 0.08 g/L 이상; L-시스테인 약 0.005 g/L 이상; L-알라닌 약 0.0004 g/L 이상; L-아스파라긴 약 0.01 g/L 이상; L-아스파르트산 약 0.006 g/L 이상; L-글루탐산 0.03 g/L 이상; L-프롤린 약 0.005 g/L 이상; 및 L-타우린 약 0.0003 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 각각의 비타민 약 5 ×10^-6 g/L 내지 약 0.015 g/L를 포함한다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 무수 염화칼슘 약 0.005 g/L 이상, 염화칼륨 약 0.1 g/L 이상, 황산마그네슘 약 02 g/L 이상, 인산이수소나트륨 일수화물 약 0.1 g/L 이상 및 인산일수소나트륨 칠수화물(Na₂HPO₄·7H₂O) 약 0.0005 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배지는 각각의 뉴클레오시드 약 0.0001 g/L 이상 내지 약 0.02 g/L 이상을 포함한다. 일 실시 형태에서, 배지는 티미딘 약 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 약 0.005 g/L 이상을 포함한다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 인슐린 0.005 g/L 이상, 및 트랜스페린 0.03 g/L 이상, 에탄올아민 0.01 g/L 이상 및 아셀렌산나트륨 약 0.00004 g/L 이상을 추가로 포함한다. 하나 이상의 에너지 공급원은 D-글루코스 및 피루브산나트륨일 수 있다.

다른 실시 형태에서, 배양 배지는 (1) 아미노산: L-아르기닌; L-시스틴; L-시스테인; L-글루타민; 글리신; L-히스티딘; L-이소류신; L-류신; L-라이신; L-메티오닌; L-페닐알라닌; L-세린; L-트레오닌; L-트립토판; L-티로신; L-발린; L-알라닌; L-아스파라긴; L-아스파르트산; L-글루탐산; L-프롤린; 및 L-타우린; (2) 비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민); (3) 염: 염화칼슘, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨 및 하나 이상의 인산나트륨 염; (4) 뉴클레오시드: 티미딘, 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신; (5) 인슐린; (6) 트랜스페린; (7) 리포산/티옥트산; (8) 에탄올아민; (9) 아셀렌산나트륨; 및 (10) 하나 이상의 에너지 공급원을 포함한다.

본 발명의 일 실시 형태는 하기를 포함하는 배양 배지이다: 아미노산: L-아르기닌; L-시스틴; L-시스테인; L-글루타민; 글리신; L-히스티딘; L-이소류신; L-류신; L-라이신; L-메티오닌; L-페닐알라닌; L-세린; L-트레오닌; L-트립토판; L-티로신; L-발린; L-알라닌; L-아스파라긴; L-아스파르트산; L-글루탐산; L-프롤린; 및 L-타우린; 비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민); 염: 염화칼슘, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨 및 하나 이상의 인산나트륨 염; 뉴클레오시드(핵산 유도체): 티미딘, 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신; 리포산/티옥트산; 미량 미네랄: 질산제2철, 황산구리, 황산아연; 및 하나 이상의 에너지 공급원. 일 실시 형태에서, 이러한 배양 배지는 각각의 아미노산의 약 0.0006 g/L 내지 약 0.1 g/L를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 L-아르기닌 약 0.05 g/L 이상; L-시스틴 약 0.02 g/L 이상; L-글루타민 약 0.2 g/L 이상; 글리신 약 0.01 g/L 이상; L-히스티딘 약 0.02 g/L 이상; L-이소류신 약 0.09 g/L 이상; L-류신 약 0.09 g/L 이상; L-라이신 약 0.09 g/L 이상; L-메티오닌 약 0.02 g/L 이상; L-페닐알라닌 약 0.05 g/L 이상; L-세린 약 0.03 g/L 이상; L-트레오닌 약 0.08 g/L 이상; L-트립토판 약 0.009 g/L 이상; L-티로신 약 0.08 g/L 이상; L-발린 약 0.08 g/L 이상; L-시스테인 약 0.005 g/L 이상; L-알라닌 약 0.0004 g/L 이상; L-아스파라긴 약 0.01 g/L 이상; L-아스파르트산 약 0.006 g/L 이상; L-글루탐산 0.03 g/L 이상; L-프롤린 약 0.005 g/L 이상; 및 L-타우린 약 0.0003 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지는 각각의 비타민 약 5 × 10^-6 g/L 내지 약 0.015 g/L를 포함한다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 무수 염화칼슘 약 0.01 g/L 이상, 염화칼륨 약 0.1 g/L 이상; 황산마그네슘(무수) 약 0.2 g/L 이상, 인산이수소나트륨 일수화물 약 0.1 g/L 이상 및 인산일수소나트륨 칠수화물(Na₂HPO₄·7H₂O) 약 0.005 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 배지는 각각의 뉴클레오시드 약 0.0001 g/L 이상 내지 약 0.02 g/L 이상을 포함한다. 일 실시 형태에서, 배지는 티미딘 약 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 약 0.005 g/L 이상을 포함한다. 하나 이상의 에너지 공급원은 D-글루코스 및 피루브산나트륨일 수 있다.

소정 실시 형태에서, 배양 배지는 미량 미네랄 아셀렌산나트륨에 더하여, 하나 이상의 추가의 미량 미네랄을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 배지는 질산제2철, 황산구리 및 황산아연을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 배지는 질산제2철(9H₂O), 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O) 및 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O)을 추가로 포함한다. 미량 미네랄은 각각의 미량 미네랄 약 5 × 10^-8 g/L 내지 약 3 × 10^-4 g/L의 범위의 양으로 존재할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 배지는 질산제2철(9H₂O) 약 0.001 g/L, 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O) 약 9.33 E-08 g/L 및 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O) 3.24 E-05 g/L를 추가로 포함한다.

게다가, 배지는 영양액의 약 5 × 10^-6 g/L 이상을 구성할 수 있는 리포산/티옥트산을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 배지는 리포산/티옥트산 약 0.000015 g/L를 추가로 포함한다.

임의로, 배지는 푸트레신, 알부민, 안정제 및/또는 소포제를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 알부민은 소 혈청 알부민이다. 일 실시 형태에서, 소 혈청 알부민은 지질이 풍부한 소 혈청 알부민인 시판되는 알부맥스(AlbuMAX)® I(깁코(Gibco)™ 셀 컬쳐(Cell Culture), 미국 캘리포니아주 칼스배드(Carlsbad) 소재의 인비트로겐(Invitrogen) 코포레이션)의 형태로 제공된다. 다른 실시 형태에서, 배지는 시판되는 안정제/소포제 플루로닉(Pluronic)® F68 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션)을 추가로 포함한다.

배양 배지의 예시적인 적절한 실시 형태를 하기 표에 나타낸다:

이들 배지는 소 혈청 알부민(BSA), 푸트레신 및 플루로닉® F68을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 실시 형태 A에 있어서, 배지는 푸트레신 3.02 E-05 g/L, BSA 2.5 g/L 및 플루로닉® F68 0.015 g/L를 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 실시 형태 B에 있어서, 무혈청 영양액은 푸트레신 약 1 E-05 g/L 이상, BSA 1 g/L 이상 및 플루로닉® F68 0.005 g/L 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 배지는 푸트레신 및 플루로닉® F68, 예를 들어, 푸트레신 3.02 E-05 g/L, BAS 2.5 g/L 및 플루로닉® F68 0.015 g/L를 추가로 포함한다.

본 발명의 배양 배지는 D-글루코스 0.8 g/L 이상 및 피루브산나트륨 0.1 g/L 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 배양 배지는 D-글루코스 약 1 g/L 및 피루브산나트륨 약 0.11 g/L를 추가로 포함한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 배양 배지에는 예를 들어, 소 태아 혈청(FBS) 또는 신생 송아지 혈청(NCS)과 같은 혈청이 보충된다. 혈청 함량은 배지의 총 부피의 0 (무혈청 배지) 내지 20%의 농도 범위일 수 있다. 일 실시 형태에서, 배지는 배지의 제조 동안 혈청(예를 들어, FBS)이 보충된다. 다른 실시 형태에서, 배지는 사용 직전에 (예를 들어, 혈청(예를 들어, FBS)을 포함하는 용액의 첨가를 통해서) 보충된다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 바람직하게는 약 2 내지 15%, 약 2 내지 약 10%, 약 3 내지 약 12%, 약 5 내지 약 15%, 또는 약 4% 내지 약 10%(v/v)의 FBS로 보충된다. 선택된 실시 형태에서, 배양 배지는 약 7.5%, 약 10% 또는 약 15%(v/v)의 FBS로 보충된다.

B. 무혈청 영양액

본 발명의 다른 측면은 아미노산; 비타민; 염; 뉴클레오시드; 인슐린; 트랜스페린; 에탄올아민; 및 아셀렌산나트륨을 포함하는 무혈청 영양액이다. 영양액과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "무혈청"은 영양액이 배양 배지에 첨가되기 전에 혈청을 포함하지 않는 것을 의미한다. 달리 지시되지 않으면, 무혈청 영양액의 성분에 대해 개시된 양은 무혈청 영양액이 배양물에 첨가된 후의 각각의 성분의 중량 증가의 측정치를 기준으로 한다.

일 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 통상적인 20가지의 L-아미노산을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 아미노산: L-아르기닌, L-시스틴, L-시스테인, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 및 임의로 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-타우린을 포함한다. 일 실시 형태에서, 영양액은 이들 각각의 아미노산 약 0.0001 g/L 이상 내지 약 0.03 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 L-아르기닌 약 0.005 g/L 이상, L-시스틴 약 0.002 g/L 이상, L-시스테인 약 0.0003 g/L 이상, 글리신 약 0.0005 g/L 이상, L-히스티딘 약 0.002 g/L 이상, L-이소류신 약 0.01 g/L 이상, L-류신 약 0.01 g/L 이상, L-라이신 약 0.008 g/L 이상, L-메티오닌 약 0.002 g/L 이상, L-페닐알라닌 약 0.002 g/L 이상, L-세린 약 0.002 g/L 이상, L-트레오닌 약 0.003 g/L 이상, L-트립토판 약 0.0008 g/L 이상, L-티로신 약 0.005 g/L 이상, L-발린 약 0.005 g/L 이상, L-알라닌 약 0.0001 g/L 이상, L-아스파라긴 약 0.005 g/L 이상, L-아스파르트산 약 0.002 g/L 이상, L-글루탐산 약 0.01 g/L 이상, L-프롤린 약 0.008 g/L 이상 및 L-타우린 약 0.008 g/L 이상을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 약 0.013 g/L의 L-아르기닌, HCl; 약 0.005 g/L의 L-시스틴, 2HCl; 약 0.009 g/L의 L-시스테인 HCl H₂O; 약 0.001 g/L의 글리신; 약 0.006 g/L의 L-히스티딘, HCl, H₂O; 약 0.059 g/L의 L-이소류신; 약 0.059 g/L의 L-류신; 약 0.022 g/L의 L-라이신, HCl; 약 0.007 g/L의 L-메티오닌; 약 0.008 g/L의 L-페닐알라닌; 약 0.009 g/L의 L-세린; 약 0.013 g/L의 L-트레오닌; 약 0.002 g/L의 L-트립토판; 약 0.018 g/L의 L-티로신, 2Na, 2H₂O; 약 0.018 g/L의 L-발린; 약 0.001 g/L의 L-알라닌; 약 0.032 g/L의 L-아스파라긴 H₂O; 약 0.008 g/L의 L-아스파르트산; 약 0.055 g/L의 L-글루탐산; 약 0.024 g/L의 L-프롤린; 및 약 0.0008의 L-타우린을 포함한다. 아미노산은 배양 중 소모된 아미노산의 보충을 돕는 것으로 여겨진다.

무혈청 영양액은 하나 이상의 비타민을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 적어도 하기 비타민을 포함한다: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민). 상기 영양액은 비타민 C 및 비타민 A를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 영양액은 하나 이상의 비타민 각각의 약 5 × 10^-6 g/L 내지 0.001 g/L를 포함한다. 일 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 D-판토텐산칼슘 약 0.0001 g/L 이상; 염화콜린 약 0.0008 g/L 이상; 엽산 약 0.0001 g/L 이상; I-이노시톨 약 0.0008 g/L 이상; 나이아신아미드 약 0.0001 g/L 이상; 피리독살 약 0.00005 g/L 이상; 리보플라빈 약 1× 10^-5 g/L 이상; 티아민 약 0.00001 g/L 이상; d-비오틴 약 1× 10^-5 g/L 이상; 피리독신 약 1× 10^-5 g/L 이상; 및 비타민 B12(시아노코발라민) 약 1× 10^-5 g/L 이상을 포함한다. 일 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 D-판토텐산칼슘 약 0.000338 g/L; 염화콜린 약 0.002094 g/L; 엽산 약 0.000302 g/L; I-이노시톨 약 0.002568 g/L; 나이아신아미드 약 0.000302 g/L; 피리독살, HCl 약 0.000153 g/L; 리보플라빈 약 3.11E-05 g/L; 티아민, HCl 약 0.000304 g/L; d-비오틴 약 3.75E-05 g/L; 피리독신 HCl 약 1.85E-05 g/L; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민) 약 0.000102 g/L를 포함한다.

추가로, 무혈청 영양액은 하나 이상의 염을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 약 0.0005 g/L 내지 약 0.001 g/L의 인산염을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 인산나트륨, 예를 들어, 인산이수소나트륨 및 인산일수소나트륨 칠수화물을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 인산이수소나트륨 약 0.005 g/L 이상 및 인산일수소나트륨 칠수화물 약 0.001 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 인산이수소나트륨 약 0.008 g/L 및 인산일수소나트륨 칠수화물 약 0.002 g/L를 포함한다.

무혈청 영양액은 뉴클레오시드를 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 핵산 유도체 티미딘, 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 각각의 뉴클레오시드 약 0.0001 g/L 이상 내지 약 0.005 g/L 이상을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 영양액은 티미딘 약 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 약 0.005 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 티미딘 약 0.0005 g/L, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 약 0.015 g/L를 포함한다.

무혈청 영양액은 인슐린, 트랜스페린, 에탄올아민 및 아셀렌산나트륨을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 영양액은 인슐린 0.002 g/L 이상 또는 약 0.01 g/L를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 트랜스페린 약 0.01 g/L 이상 또는 약 0.06 g/L를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 에탄올아민 약 0.005 g/L 이상 또는 약 0.02 g/L를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 아셀렌산나트륨 약 2 × 10^-5 g/L 이상 또는 약 7 × 10^-5 g/L를 포함한다.

소정의 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 미량 미네랄 아셀렌산나트륨에 더하여, 하나 이상의 추가의 미량 미네랄을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 영양액은 하나 이상의 추가의 미량 미네랄 각각의 약 3 × 10^-8 g/L 내지 약 2 × 10^-5 g/L를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 영양액은 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O) 및 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O)을 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O) 약 3 × 10^-8 g/L 이상 및 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O) 약 5 × 10^-6 g/L 이상을 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 영양액은 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O) 약 9 × 10^-8 g/L 및 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O) 약 3 × 10^-5 g/L를 추가로 포함한다.

게다가, 무혈청 영양액은 지질 에탄올아민에 더하여, 상기 영양액의 약 1 × 10^-5 g/L 이상을 구성할 수 있는 리포산/티옥트산을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 하기를 포함한다:

아미노산: L-아르기닌, L-시스틴, L-시스테인, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-타우린;

비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민);

염: 인산이수소나트륨 및 인산일수소나트륨 칠수화물;

뉴클레오시드: 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신;

인슐린; 트랜스페린; 에탄올아민; 및 아셀렌산나트륨.

이런 무혈청 영양액은 임의로 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O) 및 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O)을 추가로 포함할 수 있다. 게다가, 무혈청 영양액은 임의로 리포산/티옥트산을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 영양액은, (1) 각각의 아미노산 약 0.0001 g/L 내지 약 0.03 g/L; (2) 각각의 비타민 약 0.00001 g/L 내지 약 0.001 g/L; (3) 인산이수소나트륨 약 5 × 10^-6 g/L 이상 및 인산일수소나트륨 칠수화물 약 0.001 g/L 이상; (4) 티미딘 약 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 약 0.005 g/L 이상; (5) 인슐린 0.002 g/L 이상; (6) 트랜스페린 약 0.03 g/L 이상; (7) 에탄올아민 약 0.005 g/L 이상; 및 (8) 아셀렌산나트륨 약 5 × 10^-5 g/L 이상을 포함한다. 임의로, 이런 영양액은 (9) 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O) 약 7 × 10^-8 g/L 이상; (10) 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O) 약 5 × 10^-6 g/L 이상; 및 (11) 리포산/티옥트산 약 1 × 10^-6 g/L 이상을 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 아미노산, 비타민, 염, 뉴클레오시드, 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O), 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O) 및 리포산/티옥트산을 포함한다. 이런 실시 형태에서, 상기 영양액은,

아미노산: L-아르기닌, L-시스틴, L-시스테인, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-타우린;

비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂(시아노코발라민);

염: 인산이수소나트륨 및 인산일수소나트륨 칠수화물; 및

뉴클레오시드: 티미딘, 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신을 포함한다.

일 실시 형태에서, 이런 무혈청 영양액은 L-아르기닌 약 0.005 g/L 이상, L-시스틴 약 0.002 g/L 이상, L-시스테인 약 0.0003 g/L 이상, 글리신 약 0.0005 g/L 이상, L-히스티딘 약 0.002 g/L 이상, L-이소류신 약 0.01 g/L 이상, L-류신 약 0.01 g/L 이상, L-라이신 약 0.008 g/L 이상, L-메티오닌 약 0.002 g/L 이상, L-페닐알라닌 약 0.002 g/L 이상, L-세린 약 0.002 g/L 이상, L-트레오닌 약 0.003 g/L 이상, L-트립토판 약 0.0008 g/L 이상, L-티로신 약 0.005 g/L 이상, L-발린 약 0.005 g/L 이상, L-알라닌 약 0.0001 g/L 이상, L-아스파라긴 약 0.005 g/L 이상, L-아스파르트산 약 0.002 g/L 이상, L-글루탐산 약 0.01 g/L 이상, L-프롤린 약 0.008 g/L 이상 및 L-타우린 약 0.008 g/L 이상을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 이런 무혈청 영양액은 D-판토텐산칼슘 약 0.0001 g/L 이상; 염화콜린 약 0.0008 g/L 이상; 엽산 약 0.0001 g/L 이상; I-이노시톨 약 0.0008 g/L 이상; 나이아신아미드 약 0.0001 g/L 이상; 피리독살 약 0.00005 g/L 이상; 리보플라빈 약 1× 10^-5 g/L 이상; 티아민 약 0.00001 g/L 이상; d-비오틴 약 1× 10^-5 g/L 이상; 피리독신 약 1× 10^-5 g/L 이상; 및 비타민 B12(시아노코발라민) 약 1× 10^-5 g/L 이상을 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 이런 영양액은 티미딘 약 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 약 0.01 g/L 이상을 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 이런 영양액은 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O) 약 3 × 10^-8 g/L 이상, 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O) 약 5 × 10^-5 g/L 이상 및 리포산/티옥트산 약 2 × 10^-5 g/L 이상을 추가로 포함한다.

임의로, 무혈청 영양액은 푸트레신, 소 혈청 알부민, 안정제 및/또는 소포제를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 소 혈청 알부민은 지질이 풍부한 소 혈청 알부민인 시판되는 알부맥스®I(깁코™ 셀 컬쳐, 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션)의 형태로 제공된다. 다른 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 시판되는 안정제/소포제 플루로닉® F68(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션)을 포함한다.

무혈청 영양액의 예시적인 적절한 실시 형태를 하기 표에 나타낸다:

이들 무혈청 영양액은 소 혈청 알부민(BSA), 푸트레신 및 플루로닉® F68을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 실시 형태 A에 있어서, 무혈청 영양액은 푸트레신 3.02 E-05 g/L, BSA 2.5 g/L 및 플루로닉® F68 0.015 g/L를 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 실시 형태 B에 있어서, 무혈청 영양액은 푸트레신 약 1 E-05 g/L 이상, BSA 1 g/L 이상 및 플루로닉® F68 0.005 g/L 이상을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시 형태에서, 무혈청 영양액은 푸트레신 및 플루로닉® F68을 추가로 포함한다.

실시 형태에서, 무혈청 영양액은 셀렌산나트륨, 에탄올아민, 인슐린, 트랜스페린, 티미딘, 아데노신, 시티딘, 우리딘, 구아노신 및 혈청 알부민(예를 들어, 소 혈청 알부민)을 포함한다.

임의로, 무혈청 영양액은 하나 이상의 에너지 기질, 예를 들어, 글루코스 및/또는 피루브산 염을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 배양 배지 및/또는 무혈청 영양액은 미분화 세포의 성장을 촉진하는 외부로부터 첨가된 인자를 함유하지 않는다. 바람직한 일 실시 형태에서, 배양 배지 및/또는 무혈청 영양액은 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어, 염기성 FGF 또는 FGF-4를 포함하지 않는다.

II. 인간 제대 조직 유래 세포(hUTC)

본 발명의 특정 실시 형태에서 상술한 바와 같이, 배양 배지 및 무혈청 영양액은 단리된 인간 제대 조직 유래 세포("hUTC" 또는 "UTC")를 성장시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 배양 배지, 무혈청 영양액, 키트 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 UTC 및 UTC 집단이 하기의 본 발명의 상세한 설명과, 미국 특허 제7,510,873호; 미국 특허 제7,524,489호; 및 미국 특허 출원 공개 제2005/005863호에 상세하게 기재되어 있고, 이들이 hUTC의 설명, 단리 및 특성화에 관한 것이므로 전체적으로 참고로 포함된다.

A. 제대 조직 유래 세포의 단리 및 성장

본 명세서에 기술된 방법에 따르면, 포유류 제대는 만기 임신 또는 조산 임신의 임신 중절 수술 시에 또는 그 직후에, 예를 들어, 출산 후 만출(expulsion) 이후에 회수된다. 산후 조직은 출산 위치에서 멸균 용기(sterile container), 예를 들어, 플라스크, 비커, 배양 접시 또는 백(bag)으로 실험실로 수송될 수 있다. 용기는 염 용액, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM) (둘베코 최소 필수 배지(Dulbecco's Minimal Essential Medium)로도 알려져 있음) 또는 인산염 완충 식염수(PBS), 또는 이식을 위해 사용되는 기관의 수송에 사용되는 임의의 용액, 예를 들어, 위스콘신 대학 용액(University of Wisconsin solution) 또는 퍼플루오로 화합물 용액(perfluorochemical solution)을 포함하나 이에 한정되지 않는 용액 또는 배지를 가질 수 있다. 하나 이상의 항생제 및/또는 항진균제, 예를 들어, 비제한적으로, 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B, 젠타마이신 및 니스타틴이 배지 또는 완충제에 첨가될 수 있다. 산후 조직은 항응고(anticoagulant) 용액, 예를 들어, 헤파린 함유 용액으로 헹굴 수 있다. UTC의 추출 전에 약 4 내지 10℃에서 조직을 보관하는 것이 바람직하다. UTC의 추출 전에는 조직을 냉동시키지 않는 것이 더욱더 바람직하다.

UTC의 단리는 바람직하게는 무균 환경에서 일어난다. 제대는 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있는 수단에 의해 태반으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 제대 및 태반은 분리없이 사용된다. 혈액 및 잔사는 UTC의 단리 이전에 산후 조직으로부터 제거되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 산후 조직은 인산염 완충 식염수를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 완충액으로 세척될 수 있다. 세척 완충제는 또한 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B, 젠타마이신 및 니스타틴을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 항진균제 및/또는 항생제를 포함할 수 있다.

제대 또는 이의 단편 또는 절편을 포함하는 산후 조직은 기계력(다지는(mincing) 힘 또는 전단력)에 의해 분해된다. 현재 바람직한 실시 형태에서, 단리 절차는 또한 효소 분해 과정을 이용한다. 복합 조직 기질로부터의 개별 세포의 단리에 유용하여, 배양 중 성장을 용이하게 하는 많은 효소가 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있다. 분해 효소는 약한 분해성(예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제 및 중성 프로테아제, 디스파아제(dispase))부터 강한 분해성(예를 들어, 파파인 및 트립신)까지의 범위에 있으며, 시판되고 있다. 이것과 상용성인 효소의 불완전 목록은 점액용해(mucolytic) 효소 활성, 메탈로프로테아제(metalloprotease), 중성 프로테아제, 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신, 키모트립신 또는 엘라스타제) 및 데옥시리보뉴클레아제를 포함한다. 메탈로프로테아제, 중성 프로테아제 및 점액용해 활성으로부터 선택되는 효소 활성이 현재 바람직하다. 예를 들어, 콜라게나아제는 다양한 세포를 조직으로부터 단리하는데 유용한 것으로 알려져 있다. 데옥시리보뉴클레아제는 단일 가닥 DNA를 분해시킬 수 있으며, 단리 동안 세포 응집(clumping)을 최소화할 수 있다. 바람직한 방법은 예를 들어, 콜라게나아제 및 디스파아제 또는 콜라게나아제, 디스파아제 및 히알루로니다제를 사용한 효소 처리를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 콜라게나아제와 중성 프로테아제 디스파아제의 혼합물이 해리 단계에 사용된다. 더욱 구체적인 실시 형태는 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum) 유래의 적어도 하나의 콜라게나아제, 및 프로테아제 활성 중 어느 하나, 디스파아제 및 서모라이신(thermolysin)의 존재 하의 분해를 이용한다. 또 다른 실시 형태는 콜라게나아제 및 디스파아제 효소 활성 모두를 사용한 분해를 이용한다. 또한, 콜라게나아제 및 디스파아제 활성에 더하여, 히알루로니다제 활성을 사용한 분해를 포함하는 방법이 활용된다. 통상의 기술자라면, 많은 이러한 효소 처리가 다양한 조직 공급원으로부터의 세포 단리용으로 본 기술 분야에 알려져 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 상표명 "리베라제(LIBERASE)(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로슈(Roche))"하에 시판되는 조직 해리를 위한 효소 블렌드가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 효소의 다른 공급원이 알려져 있으며, 통상의 기술자라면 또한 이러한 효소를 그의 천연 공급원으로부터 직접적으로 수득할 수 있다. 또한 통상의 기술자라면, 새로운 또는 추가의 효소, 또는 효소 조합을 본 발명의 세포의 단리에 있어서의 그 유용성에 대하여 평가하는데 준비가 잘 되어 있다. 바람직한 효소 처리는 0.5, 1, 1.5 또는 2시간, 또는 이보다 더 길다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 해리 단계의 효소 처리 동안 조직을 37℃로 인큐베이션한다.

본 발명의 일부 실시 형태에서, 산후 조직은 조직의 다양한 양상, 예를 들어, 태반의 신생아, 신생아/모계 및 모계 양상을 포함하는 절편으로 분리된다. 이어서, 분리된 절편은 본 명세서에 기술된 방법에 따라 기계적 및/또는 효소적 해리에 의해 해리된다. 신생아 또는 모계 계통의 세포는 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있는 임의의 방법, 예를 들어, 핵형 분석 또는 Y 염색체에 대한 원위치(in situ) 혼성화에 의해 동정될 수 있다.

단리된 세포 또는 UTC가 유래되는 제대 조직은 세포 배양을 개시하거나 세포 배양물을 접종하기 위해 사용될 수 있다. 단리된 세포를 세포외 기질 또는 리간드, 예를 들어 라미닌, 콜라겐(천연, 변성 또는 가교결합), 젤라틴, 피브로넥틴, 및 다른 세포외 기질 단백질로 코팅되거나 코팅되지 않은 멸균 조직 배양 용기(vessel)로 옮긴다. 본 명세서에 개시된 배양 배지에 더하여, UTC는 예를 들어, DMEM(고농도 또는 저농도 글루코스), 고급(advanced) DMEM, DMEM/MCDB 201, 이글 기본배지(Eagle's basal medium), 햄 F10 배지(Ham's F10 medium; F10), 햄 F-12 배지(F12), 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium), 중간엽 줄기 세포 성장 배지(MSCGM), DMEM/F12, RPMI 1640 및 상표명 "셀-그로-프리(CELL-GRO-FREE)(버지니아주 헌든 소재의 메디아테크, 인코포레이티드(Mediatch, Inc.))"하에 시판되는 혈청/배지 미함유 배지이지만, 이에 한정되지 않는, 세포의 성장을 지속시킬 수 있는 임의의 배양 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지에는, 예를 들어, 소 태아 혈청(FBS), 바람직하게는 약 2 내지 15%(v/v); 말 혈청(ES); 인간 혈청(HS); 베타-메르캅토에탄올(BME 또는 2-ME), 바람직하게는 약 0.001%(v/v); 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 백혈구 저해 인자(LIF) 및 에리트로포이에틴(EPO); L-발린을 포함한 아미노산; 및 예를 들어, 페니실린 G, 스트렙토마이신 설페이트, 암포테리신 B, 젠타마이신 및 니스타틴과 같은 미생물 오염 제어를 위한 하나 이상의 항생제 및/또는 항진균제를 포함하는 하나 이상의 성분이 단독으로 또는 조합하여 보충될 수 있다. 배양 배지는 실시예에 정의된 바와 같은 성장 배지를 포함할 수 있다.

세포는 세포 성장을 허용하는 밀도로 배양 용기에 접종된다. 바람직한 실시 형태에서, 세포는 공기 중의 약 0 내지 약 5 부피%의 CO₂에서 배양된다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 세포는 공기 중의 약 2 내지 약 25%의 O₂, 바람직하게는 공기 중의 약 5 내지 약 20%의 O₂에서 배양된다. 세포는 바람직하게는 약 25 내지 약 40℃의 온도에서 배양되며, 더욱 바람직하게는 37℃에서 배양된다. 세포는 바람직하게는 인큐베이터에서 배양된다. 배양 용기의 배지는 정지 상태이거나, 예를 들어, 생물반응기를 이용하여 교반될 수 있다. UTC는 바람직하게는 (예를 들어, 글루타티온, 비타민 C, 카탈라아제, 비타민 E, N-아세틸시스테인의 첨가에 의한) 낮은 산화 스트레스 하에서 성장된다. "낮은 산화 스트레스"는 배양 세포에 대한 자유 라디칼 손상이 전혀 없거나 최소인 조건을 말한다.

가장 적절한 배양 배지, 배지 제조 및 세포 배양 기술의 선택 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려져 있으며, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Doyle et al., (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester]; 및 문헌[Ho and Wang (eds.), 1991, Animal Cell Bioreactors, Butterworth-Heinemann, Boston]을 비롯한 다양한 자료에 기재되어 있다.

UTC는 단리된 세포 또는 조직 단편을 충분한 기간 동안 배양한 후, 산후 조직으로부터의 이동이나 세포 분열, 또는 둘 모두로 인해 성장했을 것이다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, UTC는 처음에 사용된 것과 동일하거나 상이한 유형의 신선한 배지를 함유하는 별도의 배양 용기로 계대되거나 옮겨지며, 여기서, 세포 집단은 유사 분열로 증식될 수 있다. 본 발명의 세포는 계대 0부터 노화까지의 임의의 시점에서 사용될 수 있다. 세포는 바람직하게는 약 3 내지 약 25회 계대되며, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 12회 계대되며, 바람직하게는 10 또는 11회 계대된다. 클로닝 및/또는 서브클로닝을 수행하여, 세포의 클론 집단이 단리되었음을 확인할 수 있다.

소정 실시 형태에서, 산후 조직에 존재하는 상이한 세포 유형들을 하위집단(subpopulation)으로 분류하고, 이로부터 UTC를 단리할 수 있다. 분획 또는 선택은 산후 조직을 그의 성분 세포로 해리시키기 위한 효소 처리를 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포 분리를 위한 표준 기술에 이어서, 클로닝, 및 형태적 및/또는 생화학적 마커; 원하는 세포의 선택적 성장(양성 선택), 원하지 않는 세포의 선택적 파괴(음성 선택); 예를 들어, 대두 응집소를 사용하는 것과 같이 혼합된 집단에서 차별적 세포 응집성을 기반으로 한 분리; 동결-해동 절차; 혼합된 집단에서 세포의 차별적 유착 특성; 여과; 통상적인 띠 원심분리; 원심 세정(역류 원심분리(counter-streaming centrifugation)); 단위 중력 분리(unit gravity separation); 역류 분배; 전기영동; 및 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting; FACS)에 기초한 선택을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 세포 유형의 선택을 사용하여 달성될 수 있다. 클론 선택 및 세포 분리 기술의 개관에 대해서는, 본 명세서에서 참조로 포함되는 문헌[Freshney, 1994, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, 3rd Ed., Wiley-Liss, Inc., New York]을 참조한다.

배양 배지는 필요에 따라, 예를 들어, 피펫을 사용하여 접시로부터 배지를 조심스럽게 흡인시키고, 신선한 배지를 보충함으로써 교체된다. 인큐베이션은 충분한 개수 또는 밀도의 세포가 접시에 축적될 때까지 계속된다. 원래의 외식된 조직 절편이 제거될 수 있으며, 나머지 세포는 표준 기술을 이용하거나 셀 스크레이퍼(cell scraper)를 사용하여 트립신처리된다. 트립신 처리 후에, 세포를 수집하고, 신선한 배지로 옮겨, 상기와 같이 인큐베이션한다. 일부 실시 형태에서, 배지를 트립신처리 후 약 24시간 마다 1회 이상 교체하여, 임의의 부유 세포를 제거한다. 배양물에 남아있는 세포는 UTC인 것으로 간주한다.

UTC는 동결보존될 수 있다. 따라서, (어미 또는 아이 중 어느 하나의) 자가 전달을 위한 UTC를 아이의 출산 후에 적절한 산후 조직으로부터 얻은 다음에, 나중에 이식을 위해 필요한 경우에 이용할 수 있도록 동결보존할 수 있다.

B. 제대 조직 유래 세포의 특성

UTC는 예를 들어, 성장 특성(예를 들어, 집단 배가 능력, 배가 시간, 노화까지의 계대), 핵형 분석(예를 들어, 정상 핵형; 모계 또는 신생아 계통), 유세포 분석법(예를 들어, FACS 분석법), 면역조직화학법 및/또는 면역세포화학법(예를 들어, 에피토프 검출을 위한 것), 유전자 발현 프로파일링(예를 들어, 유전자 칩 어레이; 폴리머라아제 연쇄 반응(예를 들어, 역전사 효소 PCR, 실시간 PCR 및 통상적인 PCR)), 단백질 어레이, 단백질 분비(예를 들어, 혈장 응고 검정 또는 PDC-조절 배지, 예를 들어 효소 결합 면역 흡착 분석법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA)에 의해), 혼합 림프구 반응(예를 들어, PBMC의 자극의 척도로서), 및/또는 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 다른 방법에 의해 특성화될 수 있다.

제대 조직으로부터 유래되는 적절한 UTC의 예가 2004년 6월 10일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, 20110 버지니아주 머내서스 유니버시티 대로 10801 소재)에 기탁되었으며, 다음과 같이 ATCC 수탁 번호가 지정되었다: (1) 균주명(strain designation) UMB 022803 (P7)은 수탁 번호 PTA-6067이 지정되었으며; (2) 균주명 UMB 022803 (P17)은 수탁 번호 PTA-6068이 지정되었다.

다양한 실시 형태에서, UTC는 하기 성장 특징 중 하나 이상을 갖는다: (1) 이들은 배양 중 성장을 위하여 L-발린을 필요로 함; (2) 이들은 약 5% 내지 약 20% 이상의 산소를 함유하는 분위기에서 성장할 수 있음; (3) 이들은 노화에 도달하기 전 배양 중 약 40회 이상의 배가 능력을 가짐; 및 (4) 이들은 코팅되지 않거나, 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리오르니틴, 비트로넥틴 또는 피브로넥틴으로 코팅된 조직 배양 용기 상에 부착 및 증식됨.

소정 실시 형태에서, UTC는 정상 핵형을 가지며, 이는 세포가 계대됨에 따라 유지된다. 핵형 분석 방법이 이용가능하며, 당업자에게 알려져 있다.

다른 실시 형태에서, UTC는 (1) 조직 인자, 비멘틴 및 알파-평활근 액틴 중 적어도 하나의 생성; 및 (2) 유세포 분석법에 의해 검출시, CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, PD-L2 및 HLA-A, B, C 세포 표면 마커(surface marker) 중 적어도 하나의 생성을 포함하는 특정 단백질의 생성을 특징으로 할 수 있다. 다른 실시 형태에서, UTC는 유세포 분석법에 의해 검출시, CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G 및 HLA-DR, DP, DQ 세포 표면 마커 중 적어도 하나의 생성의 결여를 특징으로 할 수 있다. 조직 인자, 비멘틴 및 알파-평활근 액틴 중 적어도 2가지를 생성하는 세포가 특히 바람직하다. 조직 인자, 비멘틴 및 알파-평활근 액틴의 3가지 단백질 모두를 생성하는 세포가 더욱 바람직하다.

다른 실시 형태에서, UTC는 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 인터류킨 8; 레티쿨론 1; 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (흑색종 성장 자극 활성, 알파); 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 6 (과립구 주화성 단백질 2); 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 3; 및 종양 괴사 인자, 알파 유도 단백질 3 중 적어도 하나를 암호화하는 유전자에 대한 증가된 유전자 발현을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 실시 형태에서, UTC는 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 저신장 호메오박스(short stature homeobox) 2; 열충격 27 kDa 단백질 2; 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (간질 세포 유래 인자 1); 엘라스틴(판상부대동맥협착증, 윌리암스-보이렌 증후군(Williams-Beuren syndrome)); 호모 사피엔스(Homo sapiens) mRNA; cDNA DKFZp586M2022(클론 DKFZp586M2022 유래); 중간엽 호메오박스 2 (성장 정지 특이적 호메오박스); 사인 오쿨리스(sine oculis) 호메오박스 상동체 1 (초파리(Drosophila)); 크리스탈린(crystallin), 알파 B; 디쉐벨드 어소시에이티드 액티베이터 오브 모포게네시스(disheveled associated activator of morphogenesis) 2; DKFZP586B2420 단백질; 시밀러 투 뉴랄린(similar to neuralin) 1; 테트라넥틴(플라스미노겐 결합 단백질); src 호몰로지 3(src homology three; SH3) 및 시스테인 풍부 도메인; 콜레스테롤 25-하이드록실라아제; runt-관련 전사 인자 3; 인터류킨 11 수용체, 알파; 프로콜라겐 C-엔도펩티다아제 인핸서(enhancer); 프리즐드 상동체(frizzled homolog) 7 (초파리); 가상 유전자 BC008967; 콜라겐, 제VIII형, 알파 1; 테나신 C (헥사브라키온); 이로쿼이(iroquois) 호메오박스 단백질 5; 헤페스틴(Hephaestin); 인테그린, 베타 8; 시냅스 소포 당단백질 2; 신경아세포종, 종양 형성 억제 1; 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2, 36 kDa; 호모 사피엔스 cDNA FLJ12280 fis, 클론 MAMMA1001744; 사이토카인 수용체 유사 인자 1; 칼륨 중간체/작은 전도도의 칼슘 활성화 채널, 서브패밀리 N, 구성원 4; 인테그린, 베타 7; PDZ 결합 모티프를 갖는 전사 보조 활성화 인자(TAZ); 사인 오쿨리스 호메오박스 상동체 2 (초파리); KIAA1034 단백질; 소포 관련 막 단백질 5 (미오브레빈); EGF 함유 피불린 유사 세포외 기질 단백질 1; 초기 성장 반응 3; 디스탈-레스 호메오박스(distal-less homeo box) 5; 가상 단백질 FLJ20373; 알도-케토 리덕타아제 패밀리 1, 구성원 C3 (3-알파 하이드록시스테로이드 데하이드로게나아제, 제II형); 바이글리칸; PDZ 결합 모티프를 갖는 전사 보조 활성화 인자(TAZ); 피브로넥틴 1; 프로엔케팔린; 인테그린, 베타 유사 1 (EGF-유사 반복 도메인을 포함함); 호모 사피엔스 mRNA 전장 인서트 cDNA 클론 유로이미지(EUROIMAGE) 1968422; EphA3; KIAA0367 단백질; 나트륨이뇨 펩티드 수용체 C/구아닐레이트 사이클라아제 C (심방 나트륨이뇨 펩티드 수용체 C); 가상 단백질 FLJ14054; 호모 사피엔스 mRNA; cDNA DKFZp564B222 (클론 DKFZp564B222 유래); BCL2/아데노바이러스 E1B 19 kDa 상호작용 단백질 3 유사; AE 결합 단백질 1; 및 사이토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 VIIa 폴리펩티드 1 (근육) 중 적어도 하나를 암호화하는 유전자에 대한 감소된 유전자 발현을 특징으로 할 수 있다.

다른 실시 형태에서, UTC는 배양되는 경우에, MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1b, I309, MDC RANTES 및 TIMP1 중 적어도 하나의 분비를 특징으로 할 수 있다. 또한, UTC는 배양되는 경우, ELISA에 의해 검출되는 TGF-베타2, ANG2, PDGFbb, MIP1A 및 VEGF 중 적어도 하나의 분비 결여를 특징으로 할 수 있다.

일부 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 제대 조직으로부터 유래되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, 성장을 위하여 L-발린을 필요로 하고, 약 5% 이상의 산소에서 성장할 수 있으며, 하기 특성 중 적어도 하나를 포함한다: 배양 중 약 40회 이상의 배가 능력; 코팅되지 않은 조직 배양 용기, 또는 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리오르니틴, 비트로넥틴 또는 피브로넥틴으로 코팅된 조직 배양 용기 상의 부착 및 증식; 비멘틴 및 알파-평활근 액틴의 생성; CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90의 생성; 및 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 인터류킨 8 및 레티쿨론 1을 암호화하는 유전자에 대하여 증가된 유전자의 발현. 일부 실시 형태에서, 이러한 UTC는 CD45 및 CD117을 생성하지 않는다.

바람직한 실시 형태에서, 세포는 상기에 열거된 성장, 단백질/표면 마커 생성, 유전자 발현 또는 물질 분비 특성 중 2가지 이상을 포함한다. 상기 특성 중 3가지, 4가지, 5가지 또는 그 이상을 포함하는 세포가 더욱 바람직하다. 상기 특성 중 6가지, 7가지, 8가지 또는 그 이상을 포함하는 UTC가 더욱더 바람직하다. 상기 특성들 전부를 포함하는 세포가 현재 더 바람직하다.

본 발명의 몇몇 측면에서, 본 발명과 사용하기에 현재 바람직한 세포 중에는 상기에 기술된 특성을 갖는 산후 세포가 있으며, 더욱 특히, 정상 핵형을 가지며, 계대에 따라 정상 핵형을 유지하는 세포, 및 추가로 마커 CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, 및 HLA-A, B, C 각각을 발현하는 세포가 있으며, 여기서, 세포는 열거된 마커에 상응하는 면역학적으로 검출가능한 단백질을 생성한다. 또한 전술한 것에 더하여, 유세포 분석법에 의해 검출시, 마커 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, 또는 HLA-DR, DP, DQ 중 임의의 것에 상응하는 단백질을 생성하지 않는 세포가 더욱 바람직하다.

일 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, 분화하는 잠재력을 갖고, CD117 또는 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 이들 UTC는 임의로, 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티쿨론, 케모카인 수용체 리간드 3 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; CD31 또는 CD34를 발현하지 않고/않거나; 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티쿨론 1을 발현하고/하거나; CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현한다.

다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, 분화하는 잠재력을 갖고, CD13 및 CD90를 발현하며, CD34 및 CD117을 발현하지 않는다. 임의로, 이들 세포는 hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 또 다른 실시 형태에서, 세포는 CD10, CD44 및 CD43도 발현한다. 다른 실시 형태에서, 세포는 또한 CD45 및 CD31을 발현하지 않는다. 이들 UTC는 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티쿨론, 케모카인 수용체 리간드 3 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티쿨론 1을 발현한다.

다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, 분화하는 잠재력을 갖고, CD13, CD90 및 HLA-ABC를 발현하며, CD34, CD117 및 HLA-DR을 발현하지 않는다. 임의로, 이들 세포는 또한 hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 일 실시 형태에서, 세포는 CD10, CD44 및 CD43도 발현한다. 다른 실시 형태에서, 세포는 또한 CD45 및 CD31을 발현하지 않는다. 이들 UTC는 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티쿨론, 케모카인 수용체 리간드 3 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티쿨론 1을 발현한다.

다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, 분화하는 잠재력을 갖고, 하기 특성을 갖는다: (1) CD10, CD13, CD44, CD90 및 HLA-ABC를 발현함; (2) CD31, CD34, CD45, HLA-DR 및 CD117을 발현하지 않음; 및 (3) hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않음. 다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, 분화하는 잠재력을 갖고, 하기 특성을 갖는다: (1) CD10, CD13, CD44, CD90 및 HLA-ABC를 발현함; (2) CD31, CD34, CD45, HLA-DR 및 CD117을 발현하지 않음; (3) hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않음; (4) 산화된 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티쿨론, 케모카인 수용체 리간드 3 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현함; 및 (4) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티쿨론 1을 발현함.

일 실시 형태에서, hUTC는 세포 집단으로 제공되며, 이는 균질할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포 집단은 불균질할 수 있다. 본 발명의 불균질한 세포 집단은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 본 발명의 UTC를 포함할 수 있다. 본 발명의 불균질한 세포 집단은 줄기 세포 또는 다른 전구 세포, 예를 들어 근아세포 또는 다른 근육 전구 세포, 혈관아세포 또는 혈관 전구 세포를 추가로 포함할 수 있거나; 이것은 완전히 분화된 골격근 세포, 평활근 세포, 혈관주위세포 또는 혈관 내피 세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 집단은 실질적으로 균질하며, 즉, 실질적으로 오직 UTC(바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 UTC)만을 포함한다. 본 발명의 균질한 세포 집단은 제대 유래 세포로 구성된다. 제대 유래 세포의 균질한 집단에는 바람직하게는 모계 계통의 세포가 없다. 세포 집단의 균질성은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 세포 분류(예를 들어, 유세포 분석법) 또는 알려진 방법에 따른 클론 증식(clonal expansion)에 의해 달성될 수 있다. 균질한 UTC 집단은 산후 유래 세포의 클론 세포주를 포함할 수 있다.

일 실시 형태에서, 배양 후 hUTC는 배양 전 hUTC와 실질적으로 동일한 특성(예를 들어, 마커 프로파일(marker profile) 및/또는 유전자 발현 프로파일)을 갖는다. 다른 실시 형태에서, 배양 후 hUTC는 배양 전 hUTC와 동일한 특성(예를 들어, 마커 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일)을 갖는다. 일 실시 형태에서, 배양 후 hUTC는 적어도 CD13, CD34, CD90 및 CD117에 대하여, 배양 전 hUTC와 동일한 특성을 갖는다.

III. 다른 적절한 세포들

본 발명의 특정 실시 형태에서 상술한 바와 같이, 배양 배지 및 무혈청 영양액은 단리된 인간 제대 조직 유래 세포("hUTC" 또는 "UTC")를 성장시키는데 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지 및 무혈청 영양액은 다른 부착의존성 세포를 성장시키는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 배양 배지 및 무혈청 영양액은 다른 부착의존성 세포, 예컨대, 태반으로부터 유래된 세포를 성장시키는데 활용된다. 다른 부착의존성 세포의 예에는 골수 유래 중간엽 줄기 세포, 골수 유래 중간엽 줄기 세포의 전구 세포, 비골수 조직으로부터 유래된 세포, 예를 들어, 지방 조직, 근육 조직, 내유 동맥을 비롯한 혈관 유래 세포, 치아의 치수로부터 유래된 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가로, 양수는 매우 풍부한 부착의존성 줄기 세포의 공급원으로 밝혀졌다. 부착의존성 세포의 다른 예는 신생아 포피 섬유아세포를 포함하는 섬유아세포이다.

IV. 배양 방법

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 조절 배지 및 무혈청 영양액의 사용을 포함하는, 세포를 배양하는 방법이다. 상기 방법은 회전병, 스피너 플라스크 및/또는 마이크로캐리어를 이용할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은 예를 들어, hUTC 세포와 같은 부착의존성 세포를 배양하는데 사용되며, 마이크로캐리어를 필요로 한다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은 혈청을 교환할 필요 없이, 본 발명의 조절 배지 및 무혈청 영양액을 사용하여 hUTC를 배양하는 단계를 포함한다. 상술한 바와 같이, UTC를 여러 가지 배양 배지에서 성장시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 혈청 사용량을 최적으로 줄이고, 부피 생산성을 증가시켜, 부착의존성 세포, 예를 들어, hUTC를 포함하는 조성물을 제조하는 비용을 줄인다. 게다가, 상기 방법은 배지 교환 없이 세포(예를 들어, hUTC)의 성장을 가능하게 한다.

회전병 및 마이크로캐리어에서 세포를 성장시키는 예시적인 방법이 각각 미국 특허 출원 공개 제2007/0141700호 및 제2008/0166328호에 개시되어 있고, 이는 회전병, 마이크로캐리어, 및 회전병 및 마이크로캐리어 상의 배양의 설명에 대한 것으로, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 예시적인 적절한 회전병, 스피너 플라스크, 마이크로캐리어, 이들의 특성 및 적절한 배양 파라미터가 하기에 논의되어 있다.

A. 회전병

회전병 배양 시스템은 세포 배양의 기술 분야에 알려져 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 회전병 배양 시스템은 적어도 하나의 관심대상의 세포주, 성장 배지, 회전병, 상기 병을 회전시키기 위한 장치 및 세포를 수확하기 위한 수단을 포함한다.

회전병 배양 시스템은 전형적으로 인큐베이션 동안 온도를 조절하는 수단, 및 예를 들어, 병을 세포로 접종시키는 초기 동안 또는 뒤이은 이동 동안, 배양물을 무균적으로 취급하기 위한 수단을 추가로 포함한다. 세포의 수확은 예를 들어, 트립신, 트립신-EDTA, 디스파아제 및 콜라게나아제, 또는 다른 효소, 또는 다른 성분을 첨가하거나 첨가하지 않은 효소의 배합물을 사용한 효소 처리를 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, TrypLE™ 익스프레스(Express)(깁코, 인코포레이티드)이지만, 이에 한정되지 않는 다른 시판품들이 이용될 수 있다. 세포는 또한 예를 들어, 회분식 원심분리(batch centrifugation)를 비롯한 수동 조작에 의해 수확되거나, 수확은 자동화될 수 있다.

일 실시 형태에서, 상기 병을 약 100 내지 300 ml의 성장 배지로 충전하며, 다른 실시 형태에서, 약 100 내지 200 ml를 사용한다. 다른 실시 형태에서, 약 100 내지 120 ml, 또는 심지어는 105 내지 115 ml를 병에 넣는다. 다른 실시 형태에서, 상기 병을 약 112 ml의 성장 배지로 충전하여, 최대 집단 배가를 달성한다. 일 실시 형태에서, 상기 병을 약 2,500 내지 약 10,000개의 세포/㎠로 접종시킨다. 일 실시 형태에서, 이 범위의 하한(lower end), 예를 들어, 약 3000개의 세포/㎠ 미만을 사용하여 접종시킨다. 접종된 병을 부착 및 성장 동안 회전시킨다. 회전 속도를 약 0.5 내지 1 rpm으로 설정할 수 있다. 바람직하게는, 약 0.75 내지 1 rpm으로 회전시킨다. 더욱 바람직하게는, 상기 병을 약 0.8 내지 1 rpm으로 회전시킨다.

다른 실시 형태에서, 회전병을 약 100 내지 300 ml의 성장 배지로 충전하며, 바람직하게는 약 300 ml가 사용된다. 병을 약 2500 내지 약 10,000개의 세포/㎠로 접종시킨다. 일 실시 형태에서, 이 범위의 하한, 예를 들어 약 3000개의 세포/㎠ 미만을 사용하여 접종시킨다. 접종이 약 2500개의 세포/㎠인 실시 형태가 더욱더 바람직하다. 접종된 병을 부착 및 성장 동안 회전시킨다. 회전 속도를 약 0.5 내지 1 rpm으로 설정한다. 바람직하게는, 약 0.75 내지 1 rpm으로 회전시킨다. 더욱 바람직하게는, 병을 약 0.8 내지 1 rpm으로 회전시킨다. 거의 또는 약 0.9 내지 1.0 rpm으로 회전시키는 것이 현재 바람직하다.

충전되고 접종된 회전병을 회전시키고, 약 5 내지 7일 동안 인큐베이션하여, 최대 배가를 얻는다. 약 5.5 내지 약 6.5일간의 인큐베이션 시간이 현재 바람직하다.

회전병을 젤라틴, 세포외 기질 분자(예컨대, 젤라틴, 라미닌, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 콜라겐 제I형, IV형 및 VI형) 등과 같은 회전병 내면으로의 세포의 부착을 돕는 제제로 코팅할 수 있다. 그러한 시판되는 코팅된 병의 일례는 셀바인드(CellBind)(코닝(Corning)으로부터 카탈로그 번호 3907로서 이용가능한)로 코팅된 것들이다. 다양한 코팅제가 본 명세서에 제공된 방법에 따른 세포의 부착과 성장에 허용가능할 것으로 예상된다.

B. 스피너 플라스크

스피너 플라스크 배양 시스템이 또한 세포 배양의 기술 분야에 알려져 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 스피너 플라스크 배양 시스템은 적어도 하나의 관심 대상의 세포주, 성장 배지, 하나 이상의 스피너 플라스크, 하나 이상의 플라스크를 회전시키기 위한 수단 및 세포를 수확하기 위한 수단을 포함한다.

스피너 플라스크 배양 시스템은 전형적으로 인큐베이션 동안 온도를 조절하는 수단, 및 예를 들어, 세포를 플라스크에 접종시키는 초기 동안 또는 뒤이은 이동 동안, 배양물을 무균적으로 취급하기 위한 수단을 추가로 포함한다. 세포의 수확은 예를 들어, 트립신, 트립신-EDTA, 디스파아제 및 콜라게나아제, 또는 다른 효소, 또는 다른 성분을 첨가하거나 첨가하지 않은 효소의 배합물을 사용한 효소 처리를 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, TrypLE™ 익스프레스(깁코, 인코포레이티드)이지만, 이에 한정되지 않는 다른 시판품이 이용될 수 있다. 세포는 또한 예를 들어, 회분식 원심분리를 비롯한 수동 조작에 의해 수확되거나, 수확은 자동화될 수 있다.

일 실시 형태에서, 회전 속도는 약 35 내지 약 65 rpm, 약 35 내지 45 rpm, 약 40 내지 약 50 rpm, 약 45 rpm 내지 약 55 rpm, 약 55 내지 약 65 rpm, 또는 약 50 내지 약 60 rpm으로 설정된다. 바람직한 실시 형태에서, 약 40 rpm 또는 60 rpm의 회전 속도가 유지된다.

일 실시 형태에서, 약 3 L의 성장 배지, FBS, 무혈청 영양액, 마이크로캐리어 및 세포로 충전될 수 있는 3 L 스피너 플라스크가 사용된다. 이런 실시 형태에서, 회전 속도는 약 35 내지 45 rpm으로 설정될 수 있다. 바람직하게는, 약 40 rpm으로 회전된다.

다른 실시 형태에서, 125 ml 플라스크가 사용된다. 이들 플라스크는 성장 배지, FBS, 무혈청 영양액, 마이크로캐리어 및 세포를 포함하는 약 100 ml의 용액으로 충전될 수 있다. 일 실시 형태에서, 플라스크는 약 85 ml 내지 115 ml의 성장 배지, FBS, 무혈청 영양액, 마이크로캐리어 및 세포를 함유한다. 이런 실시 형태에서, 회전 속도는 약 55 내지 65 rpm으로 설정될 수 있다. 바람직하게는, 약 50 rpm으로 회전된다.

또 다른 실시 형태에서, 500 ml 스피너 플라스크가 사용된다. 이들 플라스크는 성장 배지, FBS, 무혈청 영양액, 마이크로캐리어 및 세포를 포함하는 약 500 ml의 용액으로 충전될 수 있다. 일 실시 형태에서, 플라스크는 약 450 ml 내지 500 ml의 성장 배지, FBS, 무혈청 영양액, 마이크로캐리어 및 세포를 함유한다. 이런 실시 형태에서, 회전 속도는 약 55 내지 65 rpm으로 설정될 수 있다. 바람직하게는, 약 50 rpm으로 회전된다.

다른 실시 형태에서, 500 ml 스피너 플라스크가 사용된다. 이들 플라스크는 성장 배지, FBS, 무혈청 영양액, 마이크로캐리어 및 세포를 포함하는 약 500 ml의 용액으로 충전될 수 있다. 일 실시 형태에서, 플라스크는 약 450 ml 내지 500 ml의 성장 배지, FBS, 무혈청 영양액, 마이크로캐리어 및 세포를 함유한다. 이런 실시 형태에서, 회전 속도는 약 35 내지 45 rpm으로 설정될 수 있다. 바람직하게는, 약 40 rpm으로 회전된다.

플라스크는 약 2,500 내지 약 10,000개의 세포/㎠로 접종될 수 있다. 세포는 플라스크내로 직접, 플라스크의 표면 상에 또는 플라스크 내부에 배치된 마이크로캐리어 상에 접종될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 접종은 약 3,000 내지 약 7,500, 약 3,000 내지 약 7,000, 약 4,000 내지 약 7,000, 약 3,000 내지 약 5,000, 약 5,000 내지 약 7,000, 약 3,500 내지 약 5,000, 약 4,500 내지 약 7,500, 또는 약 3,500 내지 약 5,500개의 세포/㎠로 수행된다. 플라스크는 부착 및 성장 동안 회전된다. 일 실시 형태에서, 집단 배가 속도(population doubling rate)를 극대화하기 위해, 상기 충전되고 접종된 플라스크를 회전시키고, 약 5 내지 7일 동안 인큐베이션하는데, 약 5 내지 약 6일간의 인큐베이션 시간이 바람직하다.

C. 마이크로캐리어

마이크로캐리어 배양은 부착의존성 세포, 예를 들어 부착의존성 산후 세포의 실질적인 고수율 배양을 가능하게 하는 기술이다. 수 밀리리터 내지 1000 리터 초과의 범위의 배양 부피의, 포유류 산후 세포와 같은 세포의 배양용으로 마이크로캐리어가 특별히 개발되어 있다. 마이크로캐리어는 생물학적으로 불활성이며, 교반되는 마이크로캐리어 배양물에 대하여 강하지만 비강성(non-rigid)인 기재를 제공한다. 마이크로캐리어는 투명하여, 부착된 세포의 현미경 검사를 가능하게 할 수 있다. 사이토덱스® 3(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 GE 헬스케어 라이프 사이언시스)는 가교결합된 덱스트란의 기질에 화학적으로 결합된 변성 콜라겐의 박층으로 구성된다. 사이토덱스® 3 상의 변성 콜라겐 층은 트립신 및 콜라게나아제를 비롯한 여러 가지 프로테아제에 의해 분해되기 쉬우며, 최대의 세포 생존율, 기능 및 완전성(integrity)을 유지하면서, 세포를 마이크로캐리어로부터 제거하는 능력을 제공한다.

무단백질 마이크로캐리어는 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상표명 "힐렉스(HILLEX)^®(미시간주 앤아버 소재의 솔로힐 엔지니어링 인코포레이티드(SoloHill Engineering, Inc.))"하에 시판되는, 제조용 및 실험 또는 연구용 마이크로캐리어 비드(bead)는 마이크로캐리어에 양으로 하전된 표면을 제공하기 위하여 양이온성 트라이메틸 암모늄이 표면에 부착된 변성 폴리스티렌 비드이다. 비드 직경은 약 90 내지 약 200 μm의 직경 범위일 수 있다.

마이크로캐리어 기반 세포 배양법은 많은 응용에서 하류 공정의 용이함을 비롯한 많은 이점을 제공한다. 마이크로캐리어는 전형적으로 대략 구형이며, 다공성 또는 충실형일 수 있다. 세포 부착을 위한 마이크로캐리어의 사용으로, 부착의존성 세포의 성장을 위한 교반 탱크 및 관련 반응기의 사용을 용이하게 한다. 세포는 용이하게 현탁화되는 마이크로입자에 부착한다. 현탁성(suspendability) 요건은 마이크로캐리어의 물리적 파라미터를 제한한다. 따라서, 마이크로캐리어는 통상적으로 평균 직경이 50 내지 2000 μm의 범위이다. 일부 응용에서, 충실형 마이크로캐리어는 약 100 내지 약 250 μm의 범위인 반면, 다공형(porous-type) 마이크로캐리어 비드는 약 250 내지 약 2500의 μm 범위이다. 이들 크기 범위는 교반 반응기에 사용하기에 적합한 특성을 갖는 현탁액을 형성하기에 충분히 작으면서 많은 부착의존성 세포를 수용할 수 있게 충분히 큰 마이크로캐리어의 선택을 가능하게 한다.

마이크로캐리어 비드의 사용에서 고려되는 요인 중에 하기와 같은 것들이 있다: 부착 효율, 면역원성(immunogenicity), 생체적합성, 생분해능, 컨플루언스(confluence)에 도달하는 시간, 단위 표면적당 도달 가능한 최대 밀도를 비롯한 부착 세포의 성장 파라미터, 필요한 경우 분리(detachment) 기술 및 분리의 효율, 배지 조건의 확장성과 확장 조건 하에서 배지의 균질성, 성공적으로 분리 절차 규모를 확대(scale-up)하는 능력 및 비드가 이식에 사용될 것인지의 여부. 이들 고려사항은 마이크로캐리어 비드의 표면 특성 뿐만 아니라, 마이크로캐리어의 공극률, 직경, 밀도 및 취급 특성에 의해 영향을 받을 수 있다.

예를 들어, 마이크로캐리어 입자 또는 비드의 밀도가 고려사항이다. 과도한 밀도는 마이크로캐리어 입자 또는 비드가 현탁액으로부터 침강시키거나, 배양 용기의 바닥에 완전히 머무르게 하는 경향이 있어, 반응기에서 세포, 배양 배지 및 기체 상의 양호하지 못한 벌크 혼합을 일으킬 수 있다. 반면, 지나치게 낮은 밀도는 마이크로캐리어의 과도한 부유를 야기할 수 있다. 1.02 내지 1.15 g/㎤의 밀도가 많은 마이크로캐리어 비드에 전형적이다.

마이크로캐리어 입자의 작은 직경과, 반응기에 첨가될 수 있는 입자의 용적에 의해, 회전병에서 또는 부착의존성 세포를 성장시키는 다른 방법에서, 예를 들어, 플레이트 상에서 관찰되는 실질적 표면적에 비해 마이크로캐리어 입자가 상당히 초과된 양의 실질적 표면적을 부여할 수 있게 된다. 다공성 마이크로캐리어는 훨씬 더 큰 단위 부피 또는 중량당 표면적을 제공한다. 이들 다공성 마이크로캐리어는 부착의존성 세포의 성장에 이용가능한 큰 공동(cavity)을 갖는다. 이들 공동은 표면적을 크게 증가시키고, 전단 응력과 같은 유해한 기계적 영향, 예를 들어 혼합 또는 기체 스파징(sparging)으로부터 세포를 보호할 수 있다.

마이크로캐리어 표면을 텍스쳐화(textured)하여, 세포 부착 및 증식을 향상시킬 수 있다. 마이크로캐리어 표면 텍스쳐는 몰딩(molding), 주조(casting), 리칭(leeching) 및 에칭(etching)을 포함하나 이에 한정되지 않는 기술에 의해 달성된다. 텍스쳐화된 표면의 특징부(feature)의 해상도는 나노스케일(nanoscale)일 수 있다. 텍스쳐화된 표면은 마이크로캐리어 표면 상의 특정 세포 정렬을 유도하는데 사용될 수 있다. 다공성 마이크로캐리어 내의 기공의 표면을 또한 텍스쳐화하여, 세포 부착 및 증식을 향상시킬 수 있다. 기공 표면 텍스쳐는 예를 들어, 몰딩, 주조, 리칭 및 에칭이지만, 이에 한정되지 않는 기술에 의해 달성된다.

마이크로캐리어 표면은 플라스마 코팅되어, 마이크로캐리어 표면에 특정 전하를 부여할 수 있다. 이들 전하는 세포 부착 및 증식을 향상시킬 수 있다.

다른 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 온도감응성(thermoresponsive) 폴리머, 예를 들어, 폴리-N-아이소프로필아크릴아미드로 구성되거나, 이로 코팅되거나, 전기기계적 특성을 갖는다. 마이크로캐리어는 또한 생물학적으로 유의미한 낮은 수준의 전기를 생성하는 아연 및 구리의 갈바닉 쌍 미립자를 갖는 마이크로캐리어와 같이 미세전류를 보유할 수 있다. 마이크로캐리어는 상자성 칼슘-알기네이트 마이크로캐리어와 같이 상자성일 수 있다.

다공형 및 충실형 마이크로미립자 캐리어가 시판되고 있다. 시판되는 충실형 마이크로캐리어의 예에는 GE 헬스케어 라이프 사이언시스의 덱스트란계 마이크로캐리어인 사이토덱스® 1 및 사이토덱스® 3가 포함된다. 시판되는 적절한 다공성 마이크로캐리어에는 GE 헬스케어 라이프 사이언시스의 사이토라인(Cytoline)™ 및 사이토포어(Cytopore)™, 바이오실론(Biosilon; NUNC) 및 컬티스퍼(Cultispher)® (퍼셀 바이올리티칼(Percell Biolytical))가 포함된다.

소정 실시 형태에서, 본 발명의 방법 및 키트는 25℃에서 근사 입자 크기가 약 60 내지 90 μm이고, 밀도가 약 1.03 g/㎤인 덱스트란 비드 마이크로캐리어를 이용한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법 및 키트는 25℃에서 근사 입자 크기가 약 114 내지 198 μm이고, 밀도가 약 1.04 g/㎤인 덱스트란 비드 마이크로캐리어를 이용한다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법 및 키트는 25℃에서 근사 입자 크기가 약 60 내지 87 μm이고, 밀도가 약 1.04 g/㎤인 덱스트란 비드 마이크로캐리어를 이용한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법 및 키트는 다공성 마이크로캐리어를 이용한다. 이들 다공성 마이크로캐리어는 약 200 내지 280 μm의 입자 직경, 약 1.1 m²/g의 유효표면적 (건조) 및 약 30 μm의 평균 기공 직경 개구를 가질 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법 및 키트는 아민 처리된 표면을 갖는 마이크로캐리어를 이용한다. 바람직한 실시 형태에서, 아민 처리된 표면을 갖는 마이크로캐리어는 약 160 내지 200 μm의 입자 크기, 약 1.090 내지 1.150의 범위의 상대 밀도, 약 515 ㎠/g의 표면적을 갖는다. 그러한 마이크로캐리어는 5.5 × 10⁵개의 마이크로캐리어/g을 함유한 용액에 제공될 수 있다.

캐리어 입자는 또한 생물활성제(bioactive agent)를 함유할 수 있다. 또한, 캐리어 입자는 세포 또는 조직 환경(milieu)의 성장 또는 기능을 조절할 수 있는 생물활성제 또는 인자를 함유할 수 있다. 적절한 인자는 섬유아세포 성장 인자, 에리트로포이에틴, 혈관 내피 세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 골 형성 단백질, 형질 전환 성장 인자, 종양 괴사 인자, 상피 세포 성장 인자 및 인슐린 유사 성장 인자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 완전한 인자, 이의 모방체(mimetic) 또는 활성 단편이 사용될 수 있다.

D. 방법

일반적으로, 본 발명의 방법은 혈청(예를 들어, FBS)이 보충된, 본 발명의 배양 배지에서 세포를 배양(예를 들어, 증식)하는 단계를 포함한다. 세포가 원하는 밀도로 성장한 후에(예를 들어, 약 3일 내지 4일 동안), 무혈청 영양액을 첨가한다. 세포는 마이크로캐리어 상에 접종될 수 있는 부착의존성 세포일 수 있다. 배양은 회전병 또는 스피너 플라스크 배양 시스템에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 부착의존성 세포를 마이크로캐리어 상에 접종시킬 때, 스피너 플라스크 배양 시스템을 사용한다. 원하는 시간은 예를 들어, 원하는 집단 밀도, 원하는 집단 배가(들) 또는 시간과 같은 파라미터에 의해 결정된다. 소정 실시 형태에서, 약 3일째에 무혈청 영양 배지를 첨가하면서, 세포를 4 내지 7일 동안 배양한다. 다른 실시 형태에서, 무혈청 영양액의 첨가 전에, 세포를 1 내지 2의 집단 배가수 동안 또는 원하는 초기 집단 밀도를 달성할 때까지 성장시킨다. 상술한 바와 같이, 본 방법은 배지 교환 없이 세포(예를 들어, hUTC)의 성장을 가능하게 한다.

1. 단리된 부착의존성 세포의 배양 방법

본 발명의 일 실시 형태는 부착의존성 세포를 배양(예를 들어, 증식)하는 방법이다. 본 방법은 혈청이 보충된 본 발명의 배양 배지의 조직 플라스크 표면 또는 바람직하게는 마이크로캐리어 상에 접종시킨, 단리된 부착의존성 세포를 배양하는 단계 및 세포를 원하는 초기 집단 밀도가 되기 충분한 시간 동안 성장시킨 후, 무혈청 영양액을 첨가하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 무혈청 영양액의 첨가 전에, 세포를 약 3 내지 약 7일, 약 3 내지 약 5일, 또는 약 4일 내지 약 5일 동안 성장시킨다. 일 실시 형태에서, 무혈청 영양액의 첨가하기 전에 약 3일 동안, 세포를 성장시킨다. 다른 실시 형태에서, 무혈청 영양액의 첨가 전에, 세포를 적어도 1 또는 2의 집단 배가수로 성장시킨다. 바람직한 실시 형태에서, 세포를 본 명세서에 개시된 임의의 마이크로캐리어 상에 접종시키고, 상술한 조건 하에서 스피너 플라스크에서 성장시킨다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 이들 세포를 포함하는 세포 은행 바이알을 해동하고 세포를 증식시켜 생산 용기에 접종시키는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태는 먼저 세포를 단리시킨 후, 단리된 세포를 접종시키는 단계를 포함한다.

논의된 바와 같이, 이들 방법에 사용되는 배지를 포함한 배지는 약 2% 내지 약 20%의 혈청(예를 들어, FBS)이 보충될 수 있다. 일 실시 형태에서, 배지는 배지의 제조 동안, 혈청(예를 들어, FBS)이 보충된다. 다른 실시 형태에서, 배지는 사용 바로 전에 (예컨대, 혈청(예를 들어, FBS)을 함유하는 용액의 첨가를 통해) 보충된다. 다른 실시 형태에서, 배지는 바람직하게는 약 2 내지 15%(v/v), 약 2 내지 약 10%, 약 3 내지 약 12%, 약 5 내지 약 15%, 또는 약 4% 내지 약 10%의 FBS로 보충된다. 선택된 실시 형태에서, 배양 배지는 약 7.5%, 약 10% 또는 약 15%(v/v)의 FBS로 보충된다.

다른 실시 형태에서, 본 방법은 또한 부착의존성 세포를 접종시키는 단계를 포함한다. 표적 접종 밀도는 달라질 수 있지만, 소정 실시 형태에서, 약 5,000 내지 약 8,000, 약 5,500 내지 약 7,500, 약 6,000 내지 약 8,000, 또는 약 6,500 내지 약 7,500개의 생존 세포/㎠가 약 12 내지 약 30, 약 12 내지 20, 약 18 내지 약 25, 또는 약 15 내지 약 23 g/L의 마이크로캐리어 농도로 접종된다.

2. 단리된 제대 조직 유래 세포의 배양 방법

본 발명의 일 실시 형태는 제대 조직 유래 세포를 배양하는 방법이다. 일반적으로 본 방법은 상술한 단리된 부착의존성 세포를 배양하는 방법의 단계를 포함하지만, 약간의 변화가 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시 형태는 성장 배지를 무혈청 영양액으로 보강함으로써, 스피너 플라스크의 현탁 배양물에서 마이크로캐리어 상에 부착된, 단리된 부착의존성 hUTC를 고세포 밀도로 배양하는 방법이다. 본 방법은 세포를 ＞20,000개의 세포/㎠로 지속적으로 성장시키기 위한 배지 교환(예를 들어, 3일째에)의 필요성을 최적으로 제거한다. 더욱이, 본 방법은 hUTC의 계대에 대한 안정성(robustness)을 향상시킨다. 본 방법은 본 발명의 배양 배지 및 무혈청 영양액을 이용한다.

본 방법은 혈청(예를 들어, FBS)이 보충된, 본 발명의 배양 배지 중에서 마이크로캐리어 상에 접종시킨 단리된 hUTC를 충분한 시간 동안 배양하여, 세포가 원하는 초기 집단 밀도를 달성하는 단계를 포함한다. 소정 실시 형태에서, 배양 배지 실시 형태 A, B 또는 C가 사용된다. 소정 실시 형태에서, 세포는 회전병에서 배양되고, 배양은 회전병 시스템 상에서 수행된다. 바람직한 실시 형태에서, 세포는 마이크로캐리어 상에 접종되고, 스피너 플라스크에서 배양되며, 배양은 스피너 플라스크 시스템 상에서 수행된다. 일 실시 형태에서, 세포는 10% CO₂ 분위기 하에 약 37℃로 인큐베이션된다.

다른 실시 형태에서, 플라스크를 약 55 내지 약 65 rpm, 약 55 rpm 내지 약 60 rpm, 또는 약 58 rpm 내지 약 61 rpm의 속도로 회전시킨다. 다른 실시 형태에서, 플라스크를 약 35 rpm 내지 약 45 rpm, 약 38 rpm 내지 약 42 rpm, 약 40 rpm 내지 약 43 rpm, 또는 약 36 rpm 내지 약 45 rpm의 속도로 회전시킨다. 다른 실시 형태에서, 배지 중의 마이크로캐리어 밀도는 약 11.0 내지 약 13.0 g/L이다.

일 실시 형태에서, hUTC는 약 55 rpm 내지 약 65 rpm (바람직하게는 약 60 rpm)의 rpm 범위로 회전하는 125 ml 플라스크에서 10% CO₂ 분위기 하에 약 37℃로 배양된다. 또 다른 실시 형태에서, hUTC는 약 55 rpm 내지 약 65 rpm (바람직하게는 약 60 rpm)의 rpm 범위로 회전하는 500 ml 플라스크에서 10% CO₂ 분위기 하에 약 37℃로 배양된다. 다른 실시 형태에서, hUTC는 약 35 rpm 내지 약 45 rpm (바람직하게는 약 40 rpm)의 rpm 범위로 회전하는 500 ml 플라스크에서 10% CO₂ 분위기 하에 약 37℃로 배양된다. 다른 실시 형태에서, hUTC는 약 35 rpm 내지 약 45 rpm (바람직하게는 약 40 rpm)의 rpm 범위로 회전하는 3 L 플라스크에서 10% CO₂ 분위기 하에 약 37℃로 배양된다. 이들 실시 형태에서, 플라스크는 배지에 약 11.0 내지 약 13.0 g/L의 마이크로캐리어 (바람직하게는 약 12 g/L)를 포함할 수 있다.

집단 밀도를 극대화하기 위해, hUTC를 포함하는, 충전되고 접종된 플라스크 또는 회전병을 회전시키고, 적어도 약 5 내지 7일 동안 인큐베이션하는데, 약 5 내지 약 6일간의 인큐베이션 시간이 바람직하다. 대략 인큐베이션의 중간 시점에서(즉, 약 2.5 내지 약 3.5일(바람직하게는 3일) 후), 또는 세포가 원하는 초기 세포 밀도로 획득된 때에, 본 발명의 무혈청 영양액을 hUTC 배양물에 첨가한다. 소정 실시 형태에서, 무혈청 영양액 실시 형태 A, B 또는 C가 사용된다.

바람직한 실시 형태에서, 무혈청 영양액의 첨가 전에, 세포를 원하는 초기 집단 밀도를 달성하기에 충분한 시간 동안 성장시킨다.

따라서, 일 실시 형태에서, 본 방법은 본 발명의 배양 배지에서 마이크로캐리어 상에 접종시킨 제대 조직 유래 세포를, 상기 세포가 원하는 초기 집단 밀도를 달성하기에 충분한 시간 동안 성장시키는 단계; 상기 세포가 상기 원하는 초기 집단 밀도를 달성한 후에, 본 발명의 무혈청 영양액을 첨가하는 단계; 및 세포를, 상기 세포가 원하는 최종 집단 밀도를 달성하기에 충분한 시간 동안 성장시키는 단계를 포함한다.

다른 실시 형태에서, 배양 배지 실시 형태 A와 무혈청 영양액 실시 형태 A가 사용된다. 다른 실시 형태에서, 배양 배지 실시 형태 B와 무혈청 영양액 실시 형태 B가 사용된다. 일 실시 형태에서, 배양 배지 실시 형태 C와 무혈청 영양액 실시 형태 C가 사용된다.

일 실시 형태에서, 본 방법은 배양 전에 마이크로캐리어를 hUTC로 접종시키는 단계를 포함한다. 마이크로캐리어는 상술한 마이크로캐리어 중 하나일 수 있다. 소정 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 아민 처리된 표면을 갖는다. 바람직한 실시 형태에서, 아민 처리된 표면을 갖는 마이크로캐리어는 약 160 내지 200 μm의 입자 크기, 약 1.090 내지 1.150의 범위의 상대 밀도, 약 515 ㎠/g의 표면적을 갖는다. 일 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 힐렉스®II 울트라(Ultra)이다.

표적 접종 밀도는 달라질 수 있지만, 소정 실시 형태에서, 약 5,000 내지 약 8,000, 약 5,500 내지 약 7,500, 약 6,000 내지 약 8,000, 또는 약 6,500 내지 약 7,500개의 생존 세포/㎠ 를 약 15 내지 약 30, 약 18 내지 약 25, 또는 약 15 내지 약 23 g/L의 마이크로캐리어 농도로 접종시킨다. 접종시킨 세포를 플라스크에 첨가한다. 대안적으로, 접종은 플라스크에서 수행된다. 일 실시 형태에서, 접종은 동결보존된 hTUC를 해동시키는 것을 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 마이크로캐리어를 접종시키기 전에, 동결보존된 hTUC를 해동시키고 세포를 증식시키는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 세포의 증식은 마이크로캐리어 상에서 수행된다.

일 실시 형태에서, hUTC를 성장시키기 위해 본 방법에 사용되는 배양 배지는 약 2% 내지 약 20%의 혈청(예를 들어, FBS)으로 보충된다. 일 실시 형태에서, 배지는 배지의 제조 동안 혈청(예를 들어, FBS)으로 보충된다. 다른 실시 형태에서, 배지는 사용 바로 전에 (예컨대, 혈청(예를 들어, FBS)을 함유하는 용액의 첨가를 통해) 보충된다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 바람직하게는 약 2 내지 15%(v/v), 약 2 내지 약 10%, 약 3 내지 약 12%, 약 5 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 10%, 약 8% 내지 약 15%, 또는 약 10% 내지 약 15%의 FBS로 보충된다. 선택된 실시 형태에서, 배양 배지는 약 7.5%, 약 10% 또는 약 15%(v/v)의 FBS로 보충된다.

3. 본 발명의 방법의 기타 특성

배지 교환의 필요 없이, 스피너 플라스크 또는 회전병 배양에서 획득 가능한 집단 배가의 수를 극대화하기 위해 사용될 수 있는 본 발명의 방법의 독립 변수는 회전 속도, 상기 병으로의 세포의 접종 밀도, 마이크로캐리어의 양, 인큐베이션 시간, 배양 배지 타입, 무혈청 영양액 타입 및 상기 병에 담긴 배지의 부피이다. 통상의 기술자라면, 시험한 범위를 벗어난 기타 수치가 통상 동일한 방법을 사용하여 시험될 수 있고, 이들 수치는 집단 배가 수의 향상된 이득을 제공한다는 것을 증명할 수 있음을 인지할 것이다. 종속 변수의 최대 반응은 획득된 집단 배가의 수는 이들 파라미터의 함수로서 측정되고, 본 명세서에서 구체적으로 예시되지 않은 실시 형태는 본 명세서의 일부로 간주된다.

제공된 방법에 따라 배양된 세포(예를 들어, hUTC)는 개시 세포(starting cell)와 실질적으로 동일한 세포 표면 마커 프로파일 또는 유전자 발현 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일 실시 형태에서, 제공된 방법에 따라 배양된 세포는 개시 세포와 실질적으로 동일한 세포 표면 마커 프로파일 또는 유전자 발현 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 세포 기반 요법의 많은 응용에 있어서, 양을 증가시키기 위해 배양 조건을 확대할 때, 세포의 특성이 변하지 않는다는 것이 중요하다. 예를 들어, 치료용 세포를 구별하거나 표지하는 것을 돕는 형태(morphology), 세포 표면 마커 및 특징적인(hallmark) 유전자의 발현은 동일하지 않다면, 실질적으로 변화없이 유지되어야 한다. 본 발명과 본 명세서에 교시된 방법에 따라 제공된 세포는 실험실 조건과 규모 하에서 성장한 동일 세포와 이러한 특성에 실질적으로 변화가 없거나, 바람직하게는 동일하다.

V. 배양 배지 및 무혈청 영양액을 포함하는 키트

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 배양 배지 및 무혈청 영양액을 포함하는, 세포를 성장시키는 키트이다. 일 실시 형태에서, 키트는 세포를 추가로 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 키트는 인간 제대 조직 유래 세포를 포함한다. 키트는 또한 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 키트는 마이크로캐리어 및 소 태아 혈청과 같은 혈청을 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 키트는 또한 회전병 시스템을 포함할 수 있다.

당업자라면, 추가의 설명 없이, 전술한 설명 및 하기의 예시적인 실시예를 이용하여 본 발명을 만들어 이용하고, 청구된 방법을 실시할 수 있다고 간주된다. 따라서, 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 구체적으로 언급한 것으로, 어떠한 방식으로든지 본 개시 내용의 나머지를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

실시예 1

강화 배지를 이용한 스피너 플라스크의 마이크로캐리어 상에서의 hUTC의 성장 및 수확

본 실시예에서, 다양한 강화 배지를 이용한 스피너 플라스크의 마이크로캐리어 상에서의 hUTC의 성장 및 수확을 조사하였다. 본 실시예에서, 연구를 위해, 제대 조직 유래 세포를 접종원으로부터 증식시킨 후, 하기에 약술한 바와 같이 각각 상이한 배양 배지를 사용한, 여러 가지 상이한 성장 조건(조건 1 내지 9) 하에서 성장시켰다.

본 연구에서 사용된 마이크로캐리어는 표면적이 515 ㎠/g인 힐렉스® 울트라 (미시간주 앤아버 소재의 솔로힐 엔지니어링)이다.

본 실시예에서 사용되는 바와 같은 용어 "계대"는 신선한 마이크로캐리어를 함유하는 용기에, 별도의 용기로부터의 컨플루언트(confluent) 마이크로캐리어를 접종시키는 것으로 정의된다. 게다가, 본 실시예에서 사용되는 바와 같은 용어 "집단 배가"는 주어진 시간에 세포 집단이 배가되는 횟수로 정의되며, 다음과 같이 계산된다.

세포 계수 절차

세포 계수를 다양한 조건에 의해 요구되는 대로 하기의 절차로 수행하였다. 샘플 10 ml를 배양물로부터 무균적으로 취하고, 15 ml 원뿔형 튜브로 옮겼다. 이어서, 샘플을 5분 동안 1600 RPM으로 원심분리하였다. 마이크로캐리어가 제거되지 않도록 확인하며, 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 이어서, 마이크로캐리어에 37℃로 예열된 TrypLE™ 셀렉트(select) (깁코®) 5 내지 10 ml를 첨가하고, 15 내지 30분 동안 회전기 상에서 교반시켰다. 그 다음에, 원심분리관의 내용물을 40-μm 필터를 통해 50 ml 원뿔형 튜브로 옮겨, 마이크로캐리어를 제거하고, 분리된 세포만 계대하였다. 1 × PBS를 사용한 2회 세척을 필터를 통해 수행하였다. 이어서, 50 ml 원뿔형 튜브를 5분 동안 1600 RPM으로 원심분리하였다. 세포 팰릿을 동요시키지 않고, 튜브 안에 상청액이 약 1 내지 2 mL 남을 때까지, 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 이런 남은 부피를 피펫을 사용하여 측정하고, 세포를 이 부피에서 재현탁시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 트리판 블루 배제법(Trypan Blue exclusion method)을 사용한 세덱스(CEDEX) (이노베이티스(Innovatis)) 세포 계수 장치를 사용하여 계수하였다. 배양 용기의 세포 농도를 세덱스 세포 계수에 기초하여 하기와 같이 계산하였다:

세포 배양 절차

동결 hUTC의 바이알을 해동시키고, 신선한 배지로 세척하였다. 세포 현탁액을 배지 및 마이크로캐리어를 포함하는 125 ml 유리 스피너 플라스크로 옮겼다. 이들 해동된 세포를 사용하여 접종원을 제조하였다.

접종원용 세포의 제조

상이한 크기(125 ml, 500 ml 및 3 L)의 유리 스피너 플라스크(뉴욕주 소재의 코닝)에서 12 g/L 농도의 마이크로캐리어를 사용하여, 접종원을 DMEM 및 15% v/v의 FBS로 구성된 대조 배지에서 다수의 계대에 걸쳐 증식시켰다. 접종원의 세포의 누적 집단 배가수는 35 미만이었다. 접종원의 증식 동안 계대 및 배양 조건의 기준이 아래 표에 나타나있다. 타겟 계대 일에, 세포 계수를 수행하고, 타겟 계대 밀도를 획득하면, 새 용기의 타겟 접종 밀도에 기초하여, 세포를 새 용기로 계대하였다. 타겟 계대 밀도를 획득하지 못하면, 80% 배지 교환을 수행하여, 다음날에 세포를 계수하였다. 배지 교환을 위하여, 용기를 스피너 플랫폼(platform)으로부터 꺼내고, 마이크로캐리어를 5분 동안 중력에 의해 침강시켜, 배지의 80%를 무균적으로 제거하고(마이크로캐리어를 제거하지 않고), 동일량의 신선한 배지를 첨가하여, 용기를 인큐베이터의 스피너 플랫폼 상에 다시 두었다.

접종원을 제조하기 위한 연속 계대 동안의 성장 조건 및 파라미터를 하기 표 1-1에 요약한다.

[표 1-1]

본 실시예에 사용된 다양한 성장 조건

조건 1 내지 9 각각에 있어서, 접종일은 0일로 간주한다. 또한, 각각의 조건에 있어서, 세포 계수는 접종원 상에서 수행하였다.

조건 1 (대조군): 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 18 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 6000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된(autoclaved) 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 9 g이 되었다. DMEM 및 15%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 60 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, DMEM + 15% FBS를 사용하여, 80% 배지 교환을 수행하였다. 상술된 절차를 사용하여 주기적 세포 계수를 수행하였다. 3일째에 그리고 5일째에, 글루코스 3 ml 및 2.5 ml를 각각, 플라스크에 첨가하였다. 200 mM L-글루타민 2.5 ml를 3일째 첨가하였다.

조건 2: 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 6000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M5 기본 배지 및 15%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 60 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드(feed) F5를 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 또한, 3일째에, 글루코스 2.5 ml를 첨가하였다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이, 주기적 세포 계수를 수행하였다. 5일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

조건 3: 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 7000 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M1 기본 배지 및15%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 45 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드 F1을 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이 주기적 세포 계수를 수행하였다. 글루코스 2.5 ml를 3일째에 첨가하였다. 4 일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

조건 4: 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 7000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M2 기본 배지 및 15%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 45 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드 F2를 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이 주기적 세포 계수를 수행하였다. 3일째에, 글루코스 2.5 ml(덱스트로스 일수화물 220 g/L의 수용액)를 첨가하였다. 4일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

조건 5: 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 7000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M3 기본 배지 및 15%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 45 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드 F3를 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이 주기적 세포 계수를 수행하였다. 3일째에, 글루코스 2.5 ml(덱스트로스 일수화물 220 g/L의 수용액)를 첨가하였다. 4일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

조건 6: 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 7000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M4 기본 배지 및 15%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 45 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드 F4를 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이 주기적 세포 계수를 수행하였다. 3일째에, 글루코스 2.5 ml(덱스트로스 일수화물 220 g/L의 수용액)를 첨가하였다. 4일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

조건 7: 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 7000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M5 기본 배지 및 15%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 45 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드 F5를 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이 주기적 세포 계수를 수행하였다. 3일째에, 글루코스 2.5 ml(덱스트로스 일수화물 220 g/L의 수용액)를 첨가하였다. 4일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

조건 8: 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 7000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M6 기본 배지 및 15%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 45 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드 F6를 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이 주기적 세포 계수를 수행하였다. 3일째에, 글루코스 2.5 ml(덱스트로스 일수화물 220 g/L의 수용액)를 첨가하였다. 4일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

조건 9: 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 7000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M7 기본 배지 및 15%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 45 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드 F7을 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이 주기적 세포 계수를 수행하였다. 3일째에, 글루코스 2.5 ml(덱스트로스 일수화물 220 g/L의 수용액)를 첨가하였다. 4일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

수확

6일째에, 모든 플라스크를 수확하였다. 수확을 위하여, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켜, 배지를 마이크로캐리어를 제거하지 않으면서, 가능한 많이 제거하였다. 37℃로 예열된 TrypLE™ 250 내지 300ml를 플라스크에 첨가하고, 37℃의 인큐베이터의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 30분 후, 교반을 중지하고, 플라스크에서 샘플 25 ml를 취하여, 40 μm 필터를 통해 여과하였다. 필터에 남아있는 마이크로캐리어를 버리고 샘플을 세덱스에서 직접 실행시켜 샘플에 대한 세포 계수를 수행하였다. 첨가된 TrypLE™ 부피 및 수득한 세포 계수에 기초하여, 용기 중의 총 세포수를 계산하여, 세포 밀도(세포/㎠)를 계산하였다.

세포 배양 배지의 조성

DMEM(글루코스 1 g/L, L-글루타민 4 mM 및 중탄산나트륨 3.7 g/L를 함유하고, 피루브산나트륨 및 페놀 레드를 함유하지 않음)을 조건 1(대조군)에 사용된 기본 배지이었다.

몇몇 다른 기본 배지도 시험하여, 배지 교환을 없애는 데 중요한 일부 성분을 동정함으로써, 혈청 소비를 줄였다. 제형에 사용된 성분의 하나는 지질이 풍부한 소혈청 알부민인, 시판되는 알부맥스® I(깁코™ 셀 컬쳐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션)의 형태로 제공되는 소 혈청 알부민이다. 표 1-2는 기본 배지(M1 내지 M7)의 제형을 제공한다. 기본 배지와 공급 배지(feed media)는 시판되는 세포막 안정제 및 소포제 플루로닉® F68을 함유하였다.

[표 1-2]

상기 약술한 바와 같이, 3일째에, 조건 1에서 80% 배지 교환을 수행하였다. 나머지 조건에 있어서, 피드를 첨가하여 배지 교환을 없앴다. 상이한 피드 제형을 표 1-3에 나타낸다. 표 1-3에 나타낸 양은 피드가 첨가될 때, 배양물 부피 리터(L)당 성분의 중량(g) 증가를 나타낸다.

[표 1-3]

조건 1 내지 9에 사용되는 모든 배지에 FBS가 첨가되었다. FBS의 성분은 하기에 나타낸다:

[표 1-4]

결과

상이한 조건으로부터의 세포 계수를 하기 표 1-5에 나타낸다. 결과를 두 부분으로 분석할 수 있다. 조건 1과 조건 2를 비교하면, M5 배지와 F5 피드의 조합이 3일째에 배지 교환을 제거하는 것이 명확해진다. 이는 혈청 농도를 44% 보다 더 크게 대폭 줄일 것이므로 중요하다. 조건 3 내지 9를 비교하면, 하기 3가지 조건은 다른 것과 비교하여 최저 성능을 갖는 것이 명확해진다: 조건 6, M4 기본 배지 + 15% FBS와 3일째에 F4 피드를 사용; 조건 8, M6 기본 배지 + 15% FBS와 3일째에 F6 피드를 사용; 및 조건 9, M7 기본 배지 + 15% FBS와 3일째에 F7 피드를 사용. 제형을 자세히 살펴보면, 이들 3가지 조건은 배지 또는 피드에 핵산 유도체를 가지지 않는다. 따라서, 핵산 유도체가 hUTC 성장에 매우 중요하다는 것도 유추할 수 있다. 본 실시예는 hUTC가 배양 배지를 보강하고, 3일째에 추가의 배지 성분을 보충함으로써, 6일 동안 배지 교환 없이 성장할 수 있고, 비견되는 세포 성장을 유지하기 위해 핵산 유도체가 중요함을 입증한다.

[표 1-5]

실시예 2

강화 배지를 사용한 스피너 플라스크의 마이크로캐리어 상에서의 HUTC의 성장 및 연속 계대

스피너 플라스크의 현탁 배양물 중의 마이크로캐리어 상에 부착된 인간 제대 조직 세포(hUTC)의 연속 계대는 3일째에 세포가 소정의 최적 세포 밀도 >20,000개의 세포/㎠에 도달하지 않으면, 배지 교환이 필요하다. 이러한 배지 교환은 공정에 추가의 조작을 더하여, 세포 계대 스케줄을 예상하기 어렵게 한다. 따라서, 세포를 계대하는 이러한 절차는 상업적으로 바람직하지 않다. hUTC를 15% 소 태아 혈청을 함유한 세포 성장 배지로 교환함으로써, 고세포 밀도로 성장시킬 수 있다. 본 실시예는 다른 상업적으로 더욱 바람직한 hUTC의 계대 방법을 조사하였다. 성장 배지를 무혈청 영양소로 보강함으로써, 마이크로캐리어 상에 부착된 hUTC를 스피너 플라스크의 현탁 배양물 중에서 고 세포 밀도로 성장시켰다. 이 방법은 3일째의 배지 교환을 제거하여, 세포를 >20,000개의 세포/㎠로 지속적으로 성장시킨다. 이 방법은 hUTC의 계대에 대한 공정 안정성을 향상시킨다.

본 연구에서 하기를 사용하였다: DMEM(글루코스 2 g/L, L-글루타민 4 mM 및 중탄산나트륨 3.7 g/L를 함유하고, 피루브산나트륨 및 페놀 레드를 함유하지 않음); 소 태아 혈청(15% v/v); M5 기본 배지 (상기 실시예 1 참조); F5 피드 (상기 실시예 1 참조); 및 힐렉스® 울트라(미시간주 앤아버 소재의 솔로힐 엔지니어링) 마이크로캐리어를 사용하였다.

표면 마커 분석 방법:

Ca 또는 Mg를 함유하지 않은 둘베코 인산염 완충 식염수(Dulbecco's Phosphate Buffer Saline; DPBS) 중의 3% FBS를 염색 완충액(staining buffer)으로 사용하였다. 6개의 항체를 사용하여 표면 마커를 동정하고, 2개의 항체를 대조군으로 사용하였다. 분석을 위한 항체 및 염색 완충액 중의 이들의 희석률 리스트를 하기 표 2-1에 나타낸다.

[표 2-1]

방법: 샘플에 대한 세포 계수를 수행하고, 2.5 × 10⁶개의 세포를 10 ml DMEM + 15% FBS 배지에서 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 원심분리하고, 상청액을 제거하며, 염색 완충액에서 재현탁하여, 1 × 10⁶개의 세포/ml의 세포 농도를 획득했다. 이어서, 이 세포 현탁액을 각각의 튜브가 20000개의 세포를 수용하도록 별도의 튜브로 분배하였다. 다음에, 희석된 항체와 염색 완충액의 적절한 양을 상기 표 2-1에 나타낸 바와 같이 첨가하였다. 그 후, 샘플을 2 내지 8℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 3 ml를 첨가하고, 샘플을 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 DPBS 500 μl에서 재현탁하였다. 이어서, 샘플을 미국 메릴랜드 주 소재의 밀리포어(Millipore) 구아바(Guava)® PCA™ 기기에서 진행시켰다. 6개의 표면 마커 중, 3개는 양성 마커(CD13, CD90, HLA-ABC)이고, 3개는 음성 마커(CD34, CD117, HLA-DR)이다.

배양 조건

hUTC의 배양 및 연속 계대의 방법을 실시예 1에서 설명하였다. 언급한 바와 같이, 이 연속 계대는 배양 배지로서 15% FBS를 함유한 DMEM을 사용하고, 계대 기준을 충족시키도록 종종 배지 교환을 필요로 하였다. 본 실시예에서, 연속 계대 동안 잦은 배지 교환의 필요성을 없애고자 시도했다. 이를 변형 M5 배지(글루코스 1 g/L 대신에 2 g/L 사용) 및 15% FBS(v/v)를 사용하여 달성하였다. 15% FBS를 함유한 이러한 변형 M5 배지의 사용으로 계대 일을 고정시키고, 6회의 계대 동안 배지 교환을 수행하지 않았다. 배양 조건 및 기준을 하기 표 2-2에 나타낸다.

[표 2-2]

하기 표 2-3에 나타낸 바와 같이, 세포는 6회의 계대 동안 안정한 성장을 가졌다. DMEM + 15% FBS만을 사용한 공정에서, 세포는 1.5 집단 배가수에 이르기 위하여 계대 전날에 종종 배지 교환을 필요로 하는데, 이로 인해, 계대 지속 시간을 하루씩 연장하였다. 강화 배지를 사용하여, 세포는 3일(바이알 해동으로부터 4일) 이내에 지속적으로 적어도 1.5가 넘는 집단 배가수를 가지고, 배지 교환을 필요로 하지 않았다. 이 배지에서 7회의 계대, 이어서 6일 배양 중 3일째에 F5 피드를 함유한 이 배지에서 이들 세포를 6일 동안 성장시킨 후, 세포는 이의 동일성(identity)를 유지하였다. 이들 세포의 표면 마커 분석을 하기 표 2-4에 나타낸다.

[표 2-3]

[표 2-4]

실시예 3

스피너 플라스크의 혈청 감소형 배지 중의 마이크로캐리어 상에서의 hUTC의 성장

진행 3일째에 15% FBS를 함유한 세포 성장 배지로 교환하여, 인간 제대 조직 세포(hUTC)를 고세포 밀도로 성장시킬 수 있다. 배지 중의 고혈청 농도 및 배지 교환은 높은 혈청 비용, 생산을 위한 높은 혈청 사용량 및 추가의 운용 조작으로 인해 상업적인 관점에서 바람직하지 않다. 본 실시예는 고세포 밀도를 획득하면서, 혈청 감소형 성장 배지 중에서 마이크로캐리어 상에 부착된 hUTC를 배지 교환 없이 성장시키는 방법을 개시한다.

본 실시예에서 사용된 배양 배지는 D-글루코스 1 g/L 대신에 D-글루코스 2 g/L를 사용한 M5 기본 배지(상기 참조)이며, 여기에 소 태아 혈청을 첨가하였다. F5 피드 배지를 사용하였다. 글루코스를 덱스트로스 일수화물 220 g/L의 수용액으로서 제공하였다. 글루타민을 200 mM 용액으로서 제공하였다. 본 실시예에서, 다양한 성장 조건을 연구하였다. 이들 조건을 하기에 약술한다. 이들 조건에 사용되는 바와 같이, 접종 일은 0일로 간주된다. 또한, 각각의 조건에서 힐렉스® 울트라 (미시간주 앤아버 소재의 솔로힐 엔지니어링) 마이크로캐리어를 사용하였다.

조건 1 (15% FBS): 세포 계수를 접종원 상에서 수행하였다. 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 6000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M5 기본 배지 및 15%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 60 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드 F5를 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이 주기적 세포 계수를 수행하였다. 글루코스 2.5 ml를 3일째 그리고 5일째에 첨가하였다. 4일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

조건 2 (10% FBS): 세포 계수를 접종원 상에서 수행하였다. 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 6000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M5 기본 배지 및 10%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 60 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드 F5를 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이 주기적 세포 계수를 수행하였다. 글루코스 2.5 ml를 3일째 그리고 5일째에 첨가하였다. 4일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

조건 3 (7.5% FBS): 세포 계수를 접종원 상에서 수행하였다. 본 조건의 타겟 접종 밀도는 약 20 g/L의 마이크로캐리어 농도에서 약 6000개의 생존 세포/㎠이었다. 접종원의 세포 계수에 기초하여, 원하는 접종원의 부피를 새로운 오토클레이빙된 500 ml 유리 스피너 플라스크에 첨가하였다. 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 접종원의 배지를 플라스크에 약 100 ml가 남을 때까지 제거하였다. 이어서, 신선한 마이크로캐리어를 첨가하여, 플라스크 내의 마이크로캐리어의 최종 중량이 약 10 g이 되었다. M5 기본 배지 및 7.5%(v/v)의 FBS로 구성된 신선한 배지를 첨가하여, 부피를 500 ml로 올렸다. 플라스크를 37℃ 및 10% CO₂ 인큐베이터에서, 60 RPM의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 3일째에, 피드 F5를 첨가하였다. 배지 교환을 수행하지 않았다. 세포 계수 섹션에서 설명한 것과 같이 주기적 세포 계수를 수행하였다. 글루코스 2.5 ml를 3일째 그리고 5일째에 첨가하였다. 4일째에, 200 mM L-글루타민 5 ml를 플라스크에 첨가하였다.

수확: 6일째에, 두개의 플라스크를 수확하였다. 수확을 위하여, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켜, 마이크로캐리어를 제거하지 않고, 배지를 가능한 많이 제거하였다. 37℃로 예열된 TrypLE™ 300ml를 플라스크에 첨가하고, 37℃의 인큐베이터의 스피너 플랫폼 상에 두었다. 30분 후, 교반을 중지하고, 플라스크에서 샘플 25 ml를 취하여, 40 μm 필터를 통해 여과하였다. 필터에 남아있는 마이크로캐리어를 버리고 샘플을 세덱스에서 직접 실행시켜 샘플에 대한 세포 계수를 수행하였다. 첨가된 TrypLE™ 부피 및 수득한 세포 계수 기초하여, 용기 중의 총 세포수를 계산하여, 세포 밀도(세포/㎠)를 계산하였다.

결과: 각각에서 상이한 농도의 FBS를 사용한 3가지 조건으로부터의 세포 계수를 하기 표에 나타낸다. 본 실시예의 결과에 더하여, 실시예 1, 조건 1(DMEM +15% FBS, 3일째에 배지 교환을 사용)의 결과를 비교를 위하여 포함시킨다. 따라서, 강화 배지는 배지 교환을 제거할 뿐만 아니라 배지의 혈청 농도를 줄일 수 있어서, 배양 중 사용되는 혈청의 양을 더욱 최소화하였다.

[표 3-1]

실시예 4

세포 단리

제대 세포 단리. 제대를 NDRI(미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재의 National Disease Research Interchange)로부터 획득하였다. 조직을 정상 분만 후 획득하였다. 세포 단리 프로토콜을 층류 후드에서 무균적으로 수행하였다. 혈액 및 잔사를 제거하기 위하여, 제대를 페니실린 100 U/ml, 스트렙토마이신 100 mg/ml 및 암포테리신 B 0.25 ㎍/mL(미국 캘리포니아 주 칼스배드 소재의 인비트로겐)의 존재 하에 인산염 완충 식염수(PBS; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠)로 세척하였다. 그 후, 조직이 미세 펄프로 다져(mince)질 때까지, 150 ㎠ 조직 배양 플레이트에서, 50 ml의 배지(DMEM-저농도 글루코스 또는 DMEM-고농도 글루코스; 인비트로겐)의 존재 하에 기계적으로 해리시켰다. 잘게 조각낸(chopped) 조직을 50 ml 원뿔형 튜브(튜브당 약 5 g의 조직)로 옮겼다.

이어서, 조직을 각각 페니실린 100 U/ml, 스트렙토마이신 100 mg/ml, 암포테리신 0.25 ㎍/ml 및 분해 효소들을 함유하는 DMEM-저농도 글루코스 배지 또는 DMEM-고농도 글루코스 배지에서 분해시켰다. 일부 실험에서, 콜라게나아제와 디스파아제의 효소 혼합물을 사용하였다("C:D"; DMEM-저농도 글루코스 배지 중의 콜라게나아제 (미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마) 500 U/ml; 및 디스파아제(인비트로겐) 50 U/ml). 다른 실험에서, 콜라게나아제, 디스파아제 및 히알루로니다아제의 혼합물("C:D:H")을 사용하였다(C:D:H = DMEM-저농도 글루코스 중의 콜라게나아제 500 U/ml; 디스파아제 50 U/ml; 및 히알루로니다아제(시그마) 5 U/ml). 조직, 배지 및 분해 효소를 함유하는 원뿔형 튜브를 회전식 진탕기(뉴욕주 브루클린 소재의 인바이런(Environ))에서, 225 rpm으로 2시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다.

분해 후, 조직을 5분 동안 150×g으로 원심분리하여, 상청액을 흡인하였다. 펠릿을 20 ml의 성장 배지(DMEM: 저농도 글루코스(인비트로겐), 15%(v/v)의 소 태아 혈청(FBS; 규정된 소 태아 혈청; 로트 번호 AND18475; 유타주 로건 소재의 하이클론(Hyclone)), 0.001%(v/v)의 2-메르캅토에탄올(시그마), 100 U/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 및 0.25 ㎍/ml의 암포테리신 B(각각 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐))에 재현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을 70 μm의 나일론 BD 팔콘(FALCON) 세포 스트레이너(Strainer)(캘리포니아주 새너제이 소재의 BD 바이오사이언시스)를 통해 여과하였다. 성장 배지를 포함하는 추가의 5 ml 린스(rinse)를 스트레이너에 통과시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 40-μm 나일론 세포 스트레이너(캘리포니아주 새너제이 소재의 BD 바이오사이언시스)에 통과시키고, 추가의 5 ml의 성장 배지의 린스로 추적하였다.

여과액을 성장 배지(총 부피: 50 ml)에 재현탁시키고, 150×g으로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 세포를 50 ml의 신선한 성장 배지에 재현탁시켰다. 이 과정을 2회 더 반복하였다.

최종 원심분리 후에 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 5 ml의 신선한 성장 배지에 재현탁시켰다. 생존 세포수를 트리판 블루 염색을 이용하여 측정하였다. 이어서, 세포를 표준 조건 하에 배양하였다.

제대 조직으로부터 단리된 세포를 성장 배지 중에, 젤라틴 코팅 T-75 플라스크(미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인코포레이티드) 상에 5,000개의 세포/㎠로 접종하였다. 2일 후에, 사용 후 배지(spent medium) 및 비유착 세포를 플라스크로부터 흡인하였다. 유착 세포를 PBS로 3회 세척하여, 잔사 및 혈액 유래 세포를 제거하였다. 그 후, 세포에 성장 배지를 보충하여, 성장시켜 컨플루언스가 되게하였다(계대 0으로부터 계대 1까지 약 10일). 후속적인 계대 시에(계대 1로부터 계대 2까지 등), 세포는 4 내지 5일 후에 서브컨플루언스(sub-confluence)(75 내지 85%의 컨플루언스)에 도달하였다. 이들 후속 계대에 있어서, 세포를 5,000개의 세포/㎠로 접종하였다. 세포를 5% 이산화탄소를 함유한 가습 인큐베이터에서 37℃로 성장시켰다.

일부 실험에서, 세포를 DMEM-저농도 글루코스 배지의 산후 조직으로부터, 리베라제(2.5 mg/ml, 블렌드자임(Blendzyme) 3; 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로슈 어플라이드 사이언시스(Roche Applied Sciences)) 및 히알루로니다아제(5 U/ml, 시그마)를 이용한 분해 후에 단리하였다. 조직의 분해 및 세포의 단리는 상기에서 다른 프로테아제 분해에 대하여 설명한 바와 같지만, C:D 또는 C:D:H 효소 혼합물 대신 리베라제/히알루로니다아제 혼합물을 사용하였다. 리베라제를 이용한 조직 분해는 쉽게 증식되는 산후 조직으로부터의 세포 집단의 단리를 일으켰다.

상이한 효소 조합들을 이용한 제대로부터의 세포의 단리를 위해 절차들을 비교하였다. 분해에 대하여 비교한 효소들은 하기를 포함하였다: i) 콜라게나아제; ii) 디스파아제; iii) 히알루로니다아제; iv) 콜라게나아제: 디스파아제 혼합물 (C:D); v) 콜라게나아제:히알루로니다아제 혼합물 (C:H); vi) 디스파아제:히알루로니다아제 혼합물 (D:H); 및 vii) 콜라게나아제:디스파아제:히알루로니다아제 혼합물 (C:D:H). 이들 상이한 효소 분해 조건들을 이용한 세포 단리의 차이를 관찰하였다(표 4-1 참조).

상이한 접근법에 의해 제대에서 세포의 풀(pool)을 단리하려는 다른 시도가 이루어졌다. 일례에서, 제대를 슬라이싱하고, 성장 배지로 세척하여, 혈전 및 젤라틴 물질을 제거하였다. 혈액, 젤라틴 물질 및 성장 배지의 혼합물을 수집하고, 150×g으로 원심분리하였다. 펠릿을 재현탁시켜, 성장 배지의 젤라틴 코팅 플라스크에 접종하였다. 이들 실험으로부터, 세포 집단을 단리하였으며, 이는 용이하게 증식되었다.

또한, 세포를 NDRI로부터 수득한 제대혈 샘플로부터 단리하였다. 사용한 단리 프로토콜은 호(Ho) 등의 국제특허 출원 제PCT/US2002/029971호의 것이었다. 제대혈 (펜실베이니아주 필라델피아 소재의 NDRI)의 샘플들(각각, 50 ml 및 10.5 ml)을 용해 완충제 (필터 살균된 염화암모늄 155 mM, 중탄산칼륨 10 밀리몰, pH 7.2로 완충된 EDTA 0.1 mM (모든 성분들은 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마로부터))와 혼합하였다. 세포를 1:20의 제대혈: 용해 완충제의 비로 용해시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 5초 동안 와동시키고, 주위 온도에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 상기 용해물을 원심분리하였다(200×g으로 10분). 세포 펠릿을 10% 소 태아 혈청(유타주 로간 소재의 하이클론), 4 mM 글루타민(버지니아주 헨던 소재의 메디아테크(Mediatech)), 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신(캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)을 함유하는 완전 최소 필수 배지(캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)에서 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 원심분리하여(200×g으로 10분), 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 완전 배지에서 세척하였다. 세포를 T75 플라스크 (뉴욕주 소재의 코닝), T75 라미닌 코팅 플라스크 또는 T175 피브로넥틴 코팅 플라스크(둘 모두 매사추세츠주 베드포드 소재의 벡톤 디킨슨) 중 어느 하나 내에 직접 접종하였다.

세포 집단을 상이한 조건들 하에서 단리하고, 단리 직후 다양한 조건들 하에서 증식시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, 상기에 제공된 절차에 따라, C:D:H의 효소 조합을 이용하여, 0.001%(v/v) 2-메르캅토에탄올(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)을 포함하거나 포함하지 않는 성장 배지에서 세포를 분해하였다. 모든 세포를 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신의 존재 하에서 성장시켰다. 모든 시험된 조건들 하에서, 세포는 계대 0과 계대 1 사이에서 잘 부착하여 증식하였다(표 4-2). 조건 5 내지 8 및 13 내지 16에서의 세포는 접종 후 4회의 계대까지는 충분히 증식하는 것으로 입증되었으며, 이 시점에서 상기 세포를 동결보존하였다.

C:D:H의 조합은 단리 후 최상의 세포 수율을 제공하며, 다른 조건보다 배양 중에 더욱 많은 세대로 증식하는 세포를 생성하였다(표 4-1). 증식성 세포 집단은 콜라게나아제 또는 히알루로니다아제를 단독으로 사용해서는 획득되지 않았다. 이러한 결과가 시험한 콜라게나아제에 대하여 특이적인 것인지를 결정하려는 시도는 하지 않았다.

[표 4-1]

세포는 효소 분해 및 성장에 대하여 시험한 모든 조건 하에서 계대 0과 계대 1 사이에서 잘 부착하여 증식하였다(표 4-2). 실험 조건 5 내지 8 및 13 내지 16에서의 세포는 접종 후 4회의 계대까지는 잘 증식하였며, 이 시점에서 상기 세포를 동결보존하였다. 모든 세포를 추가의 분석을 위하여 동결보존하였다.

[표 4-2]

유핵 세포는 부착하여 빠르게 성장하였다. 이들 세포를 유세포 분석법에 의해 분석하였으며, 상기 세포는 효소 분해에 의해 수득된 세포와 유사하였다.

상기 제제들은 적혈구 세포 및 혈소판을 함유하였다. 처음 3주 동안에는 유핵 세포가 부착하여 분열하지 않았다. 접종한지 3주 후, 배지를 교환하였으며, 어느 세포도 부착하여 성장하지 않는 것으로 관찰되었다.

세포 집단을 효소 조합, 콜라게나아제(메탈로프로테아제), 디스파아제(중성 프로테아제) 및 히알루로니다아제(히알루론산을 분해하는 점액 분해 효소)를 이용하여 제대 조직으로부터 효율적으로 단리할 수 있었다. 콜라게나아제와 중성 프로테아제의 조합인 리베라제가 또한 사용될 수 있다. 또한, 콜라게나아제(4 분쉬(Wunsch) U/g) 및 서모라이신(1714 카제인 U/g)인 블렌드자임 3을 히알루로니다아제와 함께 사용하여 세포를 단리하였다. 이들 세포는 젤라틴 코팅 플라스틱 상의 성장 증식 배지에서 배양될 때 많은 계대에 걸쳐 용이하게 증식되었다.

또한 세포를 제대혈이 아닌 제대 중 잔류 혈액으로부터 단리하였다. 사용한 조건 하에서 유착하여 성장하는, 상기 조직으로부터 세척한 혈전 중 세포의 존재는 절개 과정 동안 방출된 세포로 인한 것일 수 있다.

실시예 5

세포의 핵형 분석

세포 요법에서 사용되는 세포주는 균질하고 오염 세포 유형을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 세포 요법에서 사용되는 인간 세포는 정상 구조를 갖는 정상 개수(46개)의 염색체를 가져야 한다. 균질하고 비제대 조직 유래의 세포를 포함하지 않는 제대 유래 세포주를 동정하기 위하여, 세포 샘플들의 핵형을 분석하였다.

신생아 남아의 산후 조직으로부터의 UTC를 성장 배지에서 배양하였다. 신생아 남아 (X,Y)로부터의 산후 조직을 선택하여, 신생아 유래 세포와 모계 유래 세포 (X,X)를 구별하였다. 세포를 T25 플라스크(뉴욕주 코닝 소재의 코닝)에서 성장 배지 중에 제곱센티미터당 5,000개의 세포로 접종하고, 80% 컨플루언스로 증식시켰다. 세포를 포함하는 T25 플라스크를 성장 배지로 목(neck)까지 충전시켰다. 샘플들을 택배로 임상 세포유전학 실험실로 배달하였다(실험실에서 실험실까지의 예상 수송 시간은 1시간이다). 염색체 분석은 뉴저지주 뉴어크 소재의 뉴저지 메디컬 스쿨(New Jersey Medical School)의 인간 및 분자 유전학 센터(Center for Human & Molecular Genetics)가 실시하였다. 염색체가 가장 잘 가시화되는 중기 동안 세포를 분석하였다. 계수한 중기의 20개의 세포 중 5개를 정상 균질 핵형 수(2)에 대하여 분석하였다. 두 핵형이 관찰되면 세포 샘플을 균질한 것으로 특징지었다. 두 가지가 넘는 핵형이 관찰되면 세포 샘플을 불균질한 것으로 특징지었다. 불균질한 핵형 수(4)가 확인되는 때에 추가의 중기 세포를 계수하고 분석하였다.

염색체 분석을 위하여 보낸 모든 세포 샘플은 세포유전학 실험실 직원에 의해 정상 외관을 나타내는 것으로 해석되었다. 분석한 16가지의 세포주 중 세 가지는 이종성 표현형(XX 및 XY)을 나타냈으며, 이는 신생아 및 모계 기원으로부터 유래된 세포의 존재를 나타내는 것이었다(표 5-1). 각각의 세포 샘플을 균질한 것으로 특징지었다(표 5-1).

[표 5-1]

임상 세포유전학 실험실이 해석한 바와 같이 핵형이 정상으로 나타난 제대 유래 UTC를 염색체 분석에 의해 동정하였다. 균질한 핵형에 의해 결정되는 바와 같이, 핵형 분석에 의해 모계 세포를 포함하지 않는 세포주도 동정하였다.

실시예 6

유세포 분석법에 의한 세포 표면 마커의 평가

유세포 분석법에 의한 세포 표면 단백질 또는 "마커"의 특성화를 이용하여 세포주의 동일성을 결정할 수 있다. 발현의 일관성은 다수의 공여체로부터, 그리고 다양한 공정 및 배양 조건에 노출된 세포에서 측정될 수 있다. 제대로부터 단리한 산후 세포주를 유세포 분석법에 의해 특징지었으며, 이는 이들 세포주의 동정을 위한 프로파일을 제공하였다.

세포를 플라즈마 처리된 T75, T150, 및 T225 조직 배양 플라스크(뉴욕주 코닝 소재의 코닝)에서 컨플루언트될 때까지 성장 배지에서 배양하였다. 플라스크의 성장 표면을 실온에서 20분 동안 2%(w/v) 젤라틴(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)의 인큐베이션에 의해 젤라틴으로 코팅하였다.

플라스크 내의 유착성 세포를 인산염 완충 식염수(PBS; 미주리주 칼스배드 소재의 깁코)에서 세척하여, 트립신/EDTA(깁코)로 분리시켰다. 세포를 수확하여, 원심분리하고, 1×10⁷/ml의 세포 농도로 PBS 중 3% (v/v)의 FBS에 재현탁시켰다. 제조업자의 설명서에 따라, 관심 대상의 세포 표면 마커에 대한 항체(하기 참조)를 100 μl의 세포 현탁액에 첨가하여, 혼합물을 암실에서 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하여 비결합 항체를 제거하였다. 세포를 500 μl의 PBS에서 재현탁시키고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 유세포 분석법에 의한 분석을 FACS 칼리버(calibur) 기기(캘리포니아주 새너제이 소재의 벡톤 디킨슨)를 이용하여 수행하였다.

세포 표면 마커에 대한 하기 항체를 사용하였다.

[표 6-1]

제대 유래 세포를 계대 8, 15 및 20에서 분석하였다.

공여체들 간의 차이를 비교하기 위하여, 상이한 공여체들로부터의 제대 조직 유래 세포를 서로 비교하였다. 또한, 젤라틴 코팅 플라스크에서 배양한 제대 유래 세포를 코팅되지 않은 플라스크에서 배양한 제대 유래 세포와 비교하였다.

세포의 단리 및 제조에 사용한 네 가지의 처리를 비교하였다. 산후 조직으로부터 유래된 세포들을 1) 콜라게나아제; 2) 콜라게나아제/디스파아제; 3) 콜라게나아제/히알루로니다아제; 및 4) 콜라게나아제/히알루로니다아제/디스파아제로 처리하여 비교하였다.

유세포 분석법에 의해 분석한 계대 8, 15 및 20의 제대 유래 세포는 모두 CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-알파 및 HLA-A, B, C를 발현하였으며, 이는 IgG 대조군에 비하여 증가된 형광값을 나타내었다. 이들 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 및 HLA-DR, DP, DQ에 대하여 음성이었으며, 이는 IgG 대조군과 일치하는 형광 값으로 나타났다.

유세포 분석법에 의해 분석한 개별 공여체들로부터 단리한 제대 유래 세포들 각각은 CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-알파 및 HLA-A, B, C의 생성에 대하여 양성을 나타냈으며, 이는 IgG 대조군에 비하여 증가된 형광 값으로 반영되었다. 이들 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 및 HLA-DR, DP, DQ의 생성에 대하여 음성이었으며, 이때 형광값은 IgG 대조군과 일치하였다.

유세포 분석법에 의해 분석한 젤라틴 코팅 및 코팅되지 않은 플라스크에서 증식된 제대 유래 세포들은 모두 CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-알파 및 HLA-A, B, C의 생성에 대하여 양성을 나타냈으며, 이는 IgG 대조군에 비하여 증가된 형광값을 나타내었다. 이들 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 및 HLA-DR, DP, DQ의 생성에 대하여 음성이었으며, 이때 형광 값은 IgG 대조군과 일치하였다.

유세포 분석법에 의한 제대 유래 세포의 분석에 의해 이들 세포주의 동일성을 확립하였다. 이들 제대 유래 세포는 CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, 및 HLA-A, B, C에 대하여 양성이며, CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 및 HLA-DR, DP, DQ에 대하여 음성이다. 이러한 동일성은 공여체, 계대, 배양 용기 표면 코팅, 소화 효소 및 태반 층을 비롯한 변수의 변동 사이에서 일치하였다. 개별적인 형광 값 히스토그램 곡선 평균 및 범위에 있어서 일부 변동이 관찰되었지만, 시험한 모든 조건 하에서의 모든 양의 곡선은 정상이었으며, IgG 대조군보다 더 큰 형광 값을 나타냈고, 따라서 세포가 양성 마커 발현을 갖는 균질한 집단을 포함함을 확인해 주었다.

실시예 7

올리고뉴클레오티드 어레이에 의한 세포의 분석

올리고뉴클레오티드 어레이를 사용하여 제대 조직 유래 세포 및 태반 유래 세포의 유전자 발현 프로파일을 섬유아세포, 인간 중간엽 줄기 세포 및 인간 골수로부터 유래된 다른 세포주와 비교하였다. 이 분석은 산후 유래 세포의 특성화를 제공하며, 이들 세포에 고유한 분자 마커를 동정하였다.

산후 조직 유래된 세포. 인간 제대 및 태반을 환자의 동의를 얻어 정상 만삭 분만으로부터, NDRI (펜실베이니아주 필라델피아 소재)로부터 획득하였다. 조직을 수령하여, C:D:H 혼합물로 분해 후에, 실시예 5에서 설명한 바와 같이, 세포를 단리하였다. 세포를 젤라틴 코팅 플라스틱 조직 배양 플라스크의 성장 배지에서 배양하였다. 배양물을 5% CO₂를 이용하여 37℃로 인큐베이션하였다.

섬유아세포. 인간 피부 섬유아세포를 캄브렉스 인코포레이티드(Cambrex Incorporated) (메릴랜드주 워커스빌 소재; 로트 번호: 9F0844) 및 ATCC CRL-1501(CCD39SK)로부터 구입하였다. 두 가지의 세포주를 10% (v/v) 소 태아 혈청(하이클론) 및 페니실린/스트렙토마이신(인비트로겐)을 포함하는 DMEM/F12 배지(캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)에서 배양하였다. 세포를 표준 조직 처리 플라스틱에서 성장시켰다.

인간 중간엽 줄기 세포(hMSC). hMSC를 캄브렉스 인코포레이티드(메릴랜드주 워커스빌 소재; 로트 번호 2F1655, 2F1656 및 2F1657)로부터 구매하고, 제조업자의 설명서에 따라 MSCGM 배지(캄브렉스)에서 배양하였다. 세포를 5% CO₂를 이용하여 37℃에서 표준 조직 배양 플라스틱에서 성장시켰다.

인간 장골능 골수 세포(ICBM) 인간 장골능 골수를 환자의 동의를 얻어 NDRI로부터 수령하였다. 상기 골수를 호 등이 약술한 방법(국제특허 공개 제WO03/025149호)에 따라 처리하였다. 상기 골수를 용해 완충제 20부에 대하여 골수 1부의 비율로 용해 완충제(155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ 및 0.1 mM EDTA, pH 7.2)와 혼합하였다. 세포 현탁액을 와동시키고, 주위 온도에서 2분 동안 인큐베이션하여, 500×g으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 10% (v/v) 소 태아 혈청 및 4 mM 글루타민이 보충된 최소 필수 배지-알파(인비트로겐)에 재현탁시켰다. 세포를 다시 원심분리하여, 세포 펠릿을 신선한 배지에 재현탁시켰다. 생존가능한 단핵 세포를 트립판 블루 배제(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)를 이용하여 계수하였다. 단핵 세포를 5 × 10⁴개의 세포/㎠로 플라스틱 조직 배양 플라스크에 접종하였다. 표준 대기중 O₂ 또는 5% O₂에서, 5% CO₂를 이용하여 37℃에서 세포를 인큐베이션하였다. 세포를 배지 교환 없이 5일 동안 배양하였다. 배지 및 비유착성 세포를 5일 간의 배양 후 제거하였다. 유착성 세포를 배양물에서 유지시켰다.

활발하게 성장 중인 세포 배양물을 냉각 인산염 완충 식염수(PBS) 중에서 셀 스크레이퍼를 이용하여 플라스크로부터 제거하였다. 상기 세포를 300×g으로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 신선한 PBS에 재현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 즉시 동결시키고, -80℃로 보관하였다. 세포 mRNA를 추출하여, cDNA로 전사시켰다. 그 후, cDNA를 cRNA로 전사시키고, 비오틴으로 표지하였다. 비오틴 표지된 cRNA를 아피메트릭스 유전칩(Affymetrix GENECHIP) HG-U133A 올리고뉴클레오티드 어레이(캘리포니아주 산타 클라라 소재의 아피메트릭스)와 혼성화하였다. 혼성화 및 데이터 수집을 제조업자의 설명서에 따라 실시하였다. 데이터 분석을 "SAM (Significance Analysis of Microarrays)" 버전 1.21 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 실시하였다(문헌[Tusher, V.G. et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA98: 5116-5121] 참조). 분석용 소프트웨어에 대한 라이센스는 스탠포드 대학의 기술 이전 사무소(Office of Technology Licensing)를 통하여 입수가능하며, 더 많은 정보는 스탠포드 대학 통계학과의 팁쉬라니(Tibshirani) 교수의 웹 사이트에서 월드 와이드 웹 상에서 이용가능하다.

이 연구에서 14가지의 상이한 세포 집단을 분석하였다. 계대 정보, 배양 기질 및 배양 배지와 함께 세포가 표 7-1에 열거되어 있다. 세포주는 분석 시의 계대, 세포 성장 기질 및 성장 배지와 함께 이의 세포 동정 코드에 의해 열거된다.

[표 7-1]

상술한 바와 같은 SAM 소프트웨어를 이용하여 주성분 분석에 의해 데이터를 평가하였다. 상기 분석은 시험한 세포에서 상이한 상대적인 양들로 발현되는 290가지의 유전자를 보여 주었다. 이 분석은 집단들 사이에서의 상대적인 비교를 제공하였다.

표 7-2는 세포쌍 비교용으로 계산된 유클리드 거리(Euclidean distance)를 나타낸다. 유클리드 거리는 세포 유형들 사이에서 차별적으로 발현된 290가지의 유전자를 기반으로 한 세포의 비교를 기초로 하였다. 유클리드 거리는 290가지의 유전자의 발현 사이의 유사성에 반비례한다. 유클리드 거리를 세포 유형들 사이에서 차별적으로 발현된 290가지의 유전자를 이용하여 세포 유형들에 대하여 계산하였다. 세포들 사이의 유사성은 유클리드 거리에 반비례한다.

[표 7-2]

표 7-3, 표 7-4, 및 표 7-5는 태반 유래 세포에서 증가된(표 7-3), 제대 유래 세포에서 증가된(표 7-4) 그리고 제대 및 태반 유래 세포에서 감소된(표 7-5) 유전자들의 발현을 나타낸다.

[표 7-3]

[표 7-4]

[표 7-5]

표 7-6, 표 7-7 및 표 7-8은 인간 섬유아세포(표 7-6), ICBM 세포(표 7-7), 및 MSC(표 7-8)에서 유전자 발현이 증가되었음을 나타낸다.

[표 7-6]

[표 7-7]

[표 7-8]

본 실시예는 제대 및 태반으로부터 유래된 세포의 분자적 특성화를 제공하기 위하여 실시하였다. 이러한 분석은 3가지의 상이한 제대 및 3가지의 상이한 태반으로부터 유래된 세포를 포함하였다. 본 연구는 또한 2가지의 상이한 피부 섬유아세포주, 3가지의 중간엽 줄기 세포주 및 3가지의 장골능 골수 세포주를 포함하였다. 이들 세포에 의해 발현된 mRNA를 22,000가지의 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 유전자칩 올리고뉴클레오티드 어레이에서 분석하였다.

이 분석은 290가지의 유전자에 대한 전사체가 이들 5가지의 상이한 세포 유형에서 상이한 양으로 존재함을 보여 주었다. 이들 유전자는 태반 유래 세포에서 특이적으로 증가하는 10가지의 유전자 및 제대 유래 세포에서 특이적으로 증가하는 7가지의 유전자를 포함한다. 54가지의 유전자는 태반 유래 세포 및 제대 조직 유래 세포에서 특이적으로 더 낮은 발현 수준을 갖는 것으로 밝혀졌다.

실시예 8

세포 표현형의 면역조직화학적 특성화

인간 제대 조직 내에서 발견되는 세포의 표현형을 면역조직화학법에 의해 분석하였다.

인간 제대 조직을 수확하여, 4%(w/ v) 파라포름알데히드에서 4℃에서 하룻밤 침지 고정시켰다. 면역조직화학법을 하기 에피토프에 대한 항체들을 사용하여 수행하였다 (표 8-1 참조): 비멘틴(1:500; 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마), 데스민(1:150, 토끼에 대하여 생성; 시그마; 또는 1:300, 생쥐에 대하여 생성; 케미콘(Chemicon), 캘리포니아주 테메쿨라 소재), 알파-평활근 액틴(SMA; 1:400; 시그마), 사이토케라틴 18(CK18; 1:400; 시그마), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor; vWF; 1:200; 시그마) 및 CD34(인간 CD34 클래스 III; 1:100; 캘리포니아주 카핀테리아 소재의 다코사이토메이션(DAKOCytomation)). 게다가, 하기 마커를 시험하였다: 항인간 GRO알파-PE(1:100; 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 디킨슨), 항인간 GCP-2(1:100; 캘리포니아주 산타 크루즈 소재의 산타 크루즈 바이오테크(Santa Cruz Biotech)), 항인간 산화 LDL 수용체 1(ox-LDL R1; 1:100; 산타 크루즈 바이오테크) 및 항인간 NOGO-A(1:100; 산타 크루즈 바이오테크). 고정시킨 시편을 메스로 트리밍하고(trim), 에탄올을 함유하는 드라이아이스조에서 OCT 매립 컴파운드(embedding compound)(티슈-텍 오씨티(Tissue-Tek OCT); 캘리포니아주 토란스 사쿠라 소재) 내에 두었다. 그 후, 냉동 블록을 표준 저온 유지 장치(cryostat)(라이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems))를 사용하여 박편화하고 (10 μm의 두께), 염색을 위하여 유리 슬라이드 상에 얹어놓았다.

면역조직화학법을 이전의 연구와 유사하게 실시하였다(예를 들어, 문헌[Messina et al., Exper. Neurol., 2003; 184: 816-829] 참조). 조직 절편을 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여, PBS, 4%(v/v) 염소 혈청 (미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재의 케미콘) 및 0.3%(v/v) 트리톤 (트리톤 X-100; 시그마)을 함유하는 단백질 차단 용액에 1시간 동안 노출시켜, 세포내 항원에 접근하였다. 관심대상의 에피토프가 세포 표면(CD34, ox-LDL R1) 상에 위치하는 경우, 에피토프 손실을 방지하기 위해 트리톤을 이 절차의 모든 단계에서 제외시켰다. 더욱이, 일차 항체를 염소(GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A)에 대하여 생성하는 경우에, 이 절차 전체에 걸쳐 3%(v/v) 당나귀 혈청을 염소 혈청 대신 사용하였다. 이어서, 차단 용액에서 희석시킨 일차 항체를 실온에서 4시간 동안 상기 절편에 적용하였다. 일차 항체 용액을 제거하고, 배양물을 PBS로 세척한 후, 차단액을 염소 항마우스 IgG -텍사스 레드(Texas Red)(1:250; 오리건주 유진 소재의 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes)) 및/또는 염소 항토끼 IgG - 알렉사(Alexa) 488(1:250; 몰레큘러 프로브즈) 또는 당나귀 항염소 IgG - FITC (1:150; 산타 크루즈 바이오테크)와 함께 함유하는 이차 항체 용액을 적용하였다(실온에서 1시간). 배양물을 세척하고, 10 마이크로몰의 DAPI(몰레큘러 프로브즈)를 10분 동안 적용하여 세포핵을 가시화하였다.

면역염색 후, 올림푸스(Olympus) 도립 형광 현미경(뉴욕주 멜빌 소재의 올림푸스)에서 적절한 형광 필터를 사용하여 형광을 가시화하였다. 양성 염색은 대조군 염색보다 더 많은 형광 신호를 나타냈다. 대표적인 이미지를 디지털 컬러 비디오 카메라 및 이미지프로(ImagePro) 소프트웨어(캘리포니아주 칼스배드 소재의 미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics))를 사용하여 포착하였다. 삼중 염색된 샘플에 있어서, 각각의 이미지를 한 번에 하나만을 방사 필터를 사용하여 촬영하였다. 이어서, 어도비 포토샵(Adobe Photoshop) 소프트웨어(캘리포니아주 새너제이 소재의 어도비)를 사용하여 층상 몽타주를 작성하였다.

[표 8-1]

비멘틴, 데스민, SMA, CK18, vWF 및 CD34 마커가 제대 내에서 발견되는 세포의 아형에서 발현되었다(데이터는 예시되어 있지 않음). 특히, vWF 및 CD34 발현은 제대 내에 함유된 혈관에 제한되었다. CD34+ 세포는 가장 안쪽의 층(세포내강측)에 있었다. 비멘틴 발현이 제대의 혈관 및 기질 전체에 걸쳐 발견되었다. SMA는 동맥 및 정맥의 외벽 및 기질에 한정되었지만, 혈관 그 자체 내에는 포함되지 않았다. CK18 및 데스민이 단지 혈관 내에서 관찰되었으며, 데스민은 중간층 및 외층에 제한되었다.

이들 마커들 중 어느 것도 제대 내에서 관찰되지 않았다(데이터는 예시되어 있지 않음).

비멘틴, 데스민, 알파-평활근 액틴, 사이토케라틴 18, 폰 빌레브란트 인자 및 CD 34는 인간 제대 내의 세포에서 발현된다. 단지 비멘틴 및 알파-평활근 액틴이 발현됨을 나타내는 시험관 내 특성화 연구를 기반으로 하면, 당해 데이터는 현재의 제대 유래 세포 단리 과정이 세포의 하위집단을 수확하거나 단리된 세포가 비멘틴 및 알파-평활근 액틴이 발현되도록 마커의 발현을 변화시킴을 시사한다.

실시예 9

영양 인자의 분비

UTC로부터 선택된 영양 인자의 분비를 측정하였다. 혈관신생 활성을 갖는 인자, 예를 들어, 간세포 성장 인자(HGF) (문헌[Rosen et al., Ciba Found. Symp., 1997; 212:215-26]); 단핵구 주화성 단백질 1 (MCP-1) (문헌[Salcedo et al., Blood, 2000; 96;34-40]); 인터류킨-8(IL-8)(문헌[Li et al., J. Immunol., 2003; 170:3369-76]); 케라틴세포 성장 인자 (KGF); 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF); 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) (문헌[Hughes et al., Ann. Thorac. Surg. 2004; 77:812-8]); 매트릭스 메탈로프로테이나아제의 조직 저해자 1 (TIMP1); 안지오포이에틴(angiopoietin) 2 (ANG2); 혈소판 유래 성장 인자 (PDGFbb); 트롬보포이에틴(TPO); 헤파린 결합 표피 성장 인자 (HB-EGF); 간질 유래 인자 1알파 (SDF-1알파), 신경 영양/신경보호 활성(뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF) (문헌[Cheng et al., Dev. Biol., 2003; 258;319-33]); 인터류킨-6 (IL-6); 과립구 주화성 단백질-2 (GCP-2); 형질전환 성장 인자 베타2 (TGF베타2)); 또는 케모카인 활성(대식세포 염증성 단백질 1알파 (MIP1알파); 대식세포 염증성 단백질 1 베타 (MIP1베타); 단핵구 화학유인물질-1 (MCP-1); Rantes (활성화 시에 조절된, 발현 및 분비된 정상 T 세포); I309; 흉선 및 활성화 조절 케모카인 (TARC); 에오탁신(Eotaxin); 대식세포 유래 케모카인 (MDC); 및 (IL-8)을 선택하였다.

인간 신생아 포피로부터 유래된 인간 섬유아세포 뿐만 아니라, 제대로부터 유래된 세포도 젤라틴 코팅 T75 플라스크에서 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 계대 11에서 동결보존하여, 액체 질소에서 보관하였다. 해동 후, 성장 배지를 세포에 첨가하고, 이어서 15 ml 원심분리 튜브에 옮겨, 세포를 150×g으로 5분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 4 ml 성장 배지에 재현탁시켜, 세포를 계수하였다. 세포를 각각 15 ml의 성장 배지를 포함하는 T75 플라스크에서 5,000개의 세포/㎠로 접종하여, 24시간 동안 배양하였다. 배지를 8시간 동안 무혈청 배지(DMEM-저농도 글루코스(깁코), 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민(시그마), 페니실린(50 U/ml) 및 스트렙토마이신(50 ㎍/ml, 깁코))로 교환하였다. 무혈청 조절 배지를 인큐베이션 종료 시에 14,000×g으로 5분 동안 원심분리하여 수집하고, -20℃에서 보관하였다.

각각의 플라스크에서의 세포수를 측정하기 위해, 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여, 2 ml 트립신/EDTA(깁코)를 사용하여 분리시켰다. 트립신 활성을 8 ml의 성장 배지의 첨가로 억제시켰다. 상기 세포를 150×g으로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하여, 세포를 1 ml의 성장 배지에 재현탁시켰다. 세포수를 혈구계를 이용하여 추정하였다.

세포를 5% CO₂ 및 대기 산소에서 37℃에서 성장시켰다. 각각의 세포 샘플에 의해 생성된 MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-1알파, GCP-2, IL-8, 및 TGF-베타2의 양을 ELISA(미네소타주 미니애폴리스 소재의 알앤디 시스템즈(R&D Systems))로 측정하였다. 모든 분석을 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 제시된 값들은 100만개의 세포당 1 ml당 피코그램이다(n=2, sem).

케모카인(MIP1알파, MIP1베타, MCP-1, Rantes, I309, TARC, 에오탁신, MDC, IL8), BDNF 및 혈관형성 인자(HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, ANG2, PDGFbb, TPO, HB-EGF)를 서치라이트 프로테옴 어레이즈(SearchLight Proteome Arrays; 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology Inc.))를 사용하여 측정하였다. 프로테옴 어레이즈는 웰당 2 내지 16가지의 단백질의 정량적 측정을 위한 다중 샌드위치 ELISA이다. 상기 어레이는 96-웰 플레이트의 각각의 웰 내에 4 내지 16가지의 상이한 포착 항체의 2×2, 3×3, 또는 4×4 패턴의 스팟팅(spotting)에 의해 생성된다. 샌드위치 ELISA 절차 이후에, 전체 플레이트를 플레이트의 각각의 웰 내에서 각각의 스팟(spot)에서 발생된 화학발광 신호를 포착하도록 이미지화한다. 각각의 스팟에서 발생된 신호는 원래의 표준물질 또는 샘플 중 표적 단백질의 양에 비례한다.

MCP-1 및 IL-6은 제대 유래 PPDC 및 피부 섬유아세포에 의해 분비되었다(표 9-1). SDF-1알파 및 GCP-2는 섬유아세포에 의해 분비되었다. GCP-2 및 IL-8은 제대 유래 PPDC에 의해 분비되었다. TGF-베타2는 ELISA에 의한 어떤 세포 유형으로부터도 검출되지 않았다.

[표 9-1]

서치라이트™ 다중 ELISA 분석. TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1베타, MCP1, RANTES, I309, TARC, MDC 및 IL-8이 제대 유래 PPDC로부터 분비되었다(표9-2 및 9-3). Ang2, VEGF 또는 PDGFbb는 검출되지 않았다.

[표 9-2]

[표 9-3]

제대 유래 세포는 다수의 영양 인자를 분비하였다. HGF, bFGF, MCP-1 및 IL-8과 같은 이들 영양 인자 중 일부는 혈관형성에 있어서 중요한 역할을 한다. 다른 영양 인자, 예를 들어 BDNF 및 IL-6은 신경 재생 또는 보호에서 중요한 역할을 한다.

실시예 10

텔로머라아제 활성에 대한 분석

텔로머라아제는 염색체의 완전성을 보호하고 세포의 복제 수명을 연장시키는 역할을 하는 말단 소립 반복체를 합성하는 기능을 한다 (문헌[Liu, K, et al., PNAS, 1999; 96:5147-5152]). 텔로머라아제는 2개의 구성요소, 텔로머라아제 RNA 주형(hTER) 및 텔로머라아제 역전사효소(hTERT)로 이루어진다. 텔로머라아제의 조절은 hTER이 아닌 hTERT의 전사에 의해 결정된다. 따라서, hTERT mRNA를 위한 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)은 세포의 텔로머라아제 활성을 측정하는 용인된 방법이다.

세포 단리

실시간 PCR 실험을 수행하여 인간 제대 조직 유래 세포의 텔로머라아제 생성량을 측정하였다. 인간 제대 조직 유래 세포를 상기 실시예 및 미국 특허 제7,510,873호에 기술된 실시예에 따라 준비하였다. 일반적으로, 정상 분만 후 NDRI (펜실베이니아주 필라델피아 소재)로부터 획득한 제대를 세척하여, 혈액 및 잔사를 제거하고, 기계적으로 해리시켰다. 그 후, 조직을 37℃에서 배양 배지 중에서 콜라게나아제, 디스파아제 및 히알루로니다아제를 포함하는 분해 효소와 함께 인큐베이션하였다. 인간 제대 조직 유래 세포를 '012 출원의 실시예에 기술된 방법에 따라 배양하였다. 중간엽 줄기 세포 및 정상 피부 섬유아세포 (cc-2509 로트 번호 9F0844)를 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 캄브렉스로부터 획득하였다. 만능성 인간 고환 태생성 암종(기형종) 세포주 nTera-2 세포(NTERA-2 cl.Dl) (문헌[Plaia et al., Stem Cell06; 24(3):531-546] 참조)를 ATCC (미국 버지니아주 매너서스 소재)로부터 구입하여, 미국 특허 제7,510,873호에 기술된 방법에 따라 배양하였다.

전체 RNA 단리

RNA를 알엔이지(RNeasy)®키트(캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 세포로부터 추출하였다. RNA를 50 μl의 DEPC 처리된 물로 용리시켜, -80℃로 보관하였다. RNA를 탁맨(TaqMan)® 역전사 시약(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 25℃에서 10분간, 37℃에서 60 분간, 그리고 95℃에서 10 분간 랜덤 헥사머(hexamer)를 사용하여 역전사시켰다. 샘플을 -20℃에서 보관하였다.

실시간 PCR

제조업자의 설명서(어플라이드 바이오시스템즈)에 따라, 어플라이드 바이오시스템즈 어세이즈-온-디맨드(Assays-On-Demand)™ (탁맨® 유전자 발현 검정으로도 알려짐)를 사용하여 cDNA 샘플에서 PCR을 수행하였다. 이러한 상업 키트는 인간 세포에서의 텔로머라아제를 분석하는 데 널리 사용된다. 간략하게는, hTert(인간 텔로머라아제 유전자; Hs00162669) 및 인간 GAPDH(내부 대조군)를 cDNA 및 탁맨® 범용 PCR 마스터 믹스와 혼합하였는데, 이는 ABI 프리즘 7000 SDS 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템즈)를 갖춘 7000 서열 검출 시스템을 이용하였다. 열 사이클(Thermal cycle) 조건은 처음에 2분간 50℃ 및 10분간 95℃, 이어서 15초간 95℃ 및 1분간 60℃의 40 사이클이었다. PCR 데이터를 제조업자의 설명서에 따라 분석하였다.

인간 제대 조직 유래 세포 (ATCC 수탁번호 PTA-6067), 섬유아세포 및 중간엽 줄기 세포를 hTert 및 18S RNA에 대해 분석하였다. 표 10-1에 나타낸 바와 같이, hTert 및 이에 따라 텔로머라아제는 인간 제대 조직 유래 세포에서 검출되지 않았다.

[표 10-1]

인간 제대 조직 유래 세포(분리주(isolate) 022803, ATCC 수탁번호 PTA-6067) 및 nTera-2 세포를 분석하였고, 그 결과는 2개의 로트(lot)의 인간 제대 조직 유래 세포에서 텔로머라아제의 발현을 나타내지 않았지만, 기형종 세포주는 높은 수준의 발현을 나타내었다(표 10-2).

[표 10-2]

그러므로, 본 발명의 인간 제대 조직 유래 세포는 텔로머라아제를 발현하지 않는 것으로 결론을 낼 수 있다.

실시예 11

임펠러(Impeller) 스피너 플라스크 반응기의 마이크로캐리어 상에서의 UTC의 성장

재료 및 방법

세포. CBAT 로트 번호 050604B로부터의 세포 계대 8 세포를 T225 플라스크에서 해동하여, 1회 계대 동안 증식시켰다.

마이크로캐리어. 사이토덱스® 3(GE 헬스케어 라이프 사이언시스, 카탈로그 번호 17-0485) 마이크로캐리어 비드를 PBS 중에서 적어도 3시간 동안 수화시키고, 오토클레이빙하였다.

스피너 플라스크. 내부 오버헤드 베어링 임펠러 조립체를 구비한 스피너 플라스크, 100 ml 및 250 ml(벨코, 인코포레이티드(Bellco, Inc.)).

컨플루언스. 컨플루언스는 전형적인 현미경 검사 시야에서 관찰되는 마이크로캐리어의 약 90%가 이들의 표면적의 약 60% 초과가 세포로 커버된 것으로 정의된다.

계대. 계대는 신선한 마이크로캐리어를 함유한 스피너 플라스크에 별도의 스피너 플라스크 배양물로부터 얻은 컨플루언트 마이크로캐리어의 분취량을 접종시키는 것으로 정의된다.

접종 및 배양. 트립신을 사용하여 세포를 T225 플라스크로부터 수확하고, 세포 분취량 4.0E+06을 배지 40 ml를 함유하는 100 ml 임펠러 또는 유리 막대 스피너 플라스크의 마이크로캐리어 비드 330 mg에 첨가하였다. 인큐베이션 전에, 플라스크를 5% CO₂ 기체로 1분 동안 플러싱(flush)하였다. 접종원 속도-빈도(inoculum speed-frequency)는 8시간 동안 30분 마다 2분간 30rpm이었다. 8시간째, 배지 부피를 100 ml로 증가시키고, 스피너 속도를 45-rpm 연속 회전으로 설정하여, 37℃로 인큐베이션하였다.

계대. 계대 1- (100 ml 내지 250 ml 플라스크) 세포를 8일 동안 배양하였다. 100 mL 플라스크의 모든 마이크로캐리어를 수집하고, 중력에 의해 배지로부터 분리되게 하였다. 배지를 흡인하고, 마이크로캐리어를 신선한 배지 10mL에 재현탁시켰다. 균등한 분배를 보장하기 위해 피펫팅한 후, 마이크로캐리어를 가진 5 ml의 배지를 제거하여, 250 ml 스피너 플라스크로 옮겼다. 약 660 mg의 수화되고, 오토클레이빙된 신선한 사이토덱스® 3 마이크로캐리어 및 배지를 또한 상기 플라스크에 첨가하였다. 배지 부피를 200 ml로 증가시키고, 인큐베이션 전에, 플라스크를 5% CO₂ 기체로 1분 동안 플러싱하였다. 스피너 속도를 45-rpm 연속 회전으로 설정하여, 37℃로 인큐베이션하였다. 나머지 세포를 트립신처리하여 수확하고, 구아바 PCA 기기(캘리포니아주 헤이와드 소재의 구아바 테크놀로지스(Guava Technologies))를 사용하여 계수하였다.

계대 2 - (250 ml 내지 250 ml 플라스크) 세포를 6일 동안 배양하였다. 250 ml 플라스크의 모든 마이크로캐리어를 수집하고, 중력에 의해 배지로부터 분리되게 하였다. 배지를 흡인하고, 마이크로캐리어를 신선한 배지 25 ml에 재현탁시켰다. 균등한 분배를 보장하기 위해 피펫팅한 후, 마이크로캐리어를 가진 5 ml의 배지를 제거하여, 250 ml 스피너 플라스크로 옮겼다. 약 660 mg의 수화되고, 오토클레이빙된 신선한 사이토덱스® 3 마이크로캐리어 및 배지를 또한 상기 플라스크에 첨가하였다. 배지 부피를 200 ml로 증가시키고, 인큐베이션 전에, 플라스크를 5% CO₂ 기체로 1분 동안 플러싱하였다. 스피너 속도를 45-rpm 연속 회전으로 설정하여, 37℃로 인큐베이션하였다. 나머지 세포를 트립신처리하여 수확하고, 구아바 PCA 기기를 사용하여 계수하였다.

배지 교환. 배양물에서 스피너 플라스크를 제거하여, 마이크로캐리어가 플라스크의 중력에 의해 바닥으로 침강시켰다. 배지 부피의 반 정도를 흡인하여 제거하고, 동일 부피의 신선한 배지로 교체하였다. 플라스크를 5% CO₂ 기체로 1분 동안 플러싱하고, 배양물에 돌려 놓았다. 배지 교환을 1일째 그리고 4일째 수행하였다.

생존율 염색(viability staining). 분취량 1 ml를 플라스크로부터 꺼내고, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 배지를 흡인하여 제거하고, 1ml 생사 염색(Live/Dead staining) 용액(몰레큘러 프로브스 카탈로그 번호 L3224)으로 교체하여, 15분 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 20-마이크로리터 분취량을 현미경 유리 슬라이드에 도포하여, 형광 현미경 검사로 관찰하였다. 살아있는 세포는 녹색으로 염색되고, 죽은 세포는 적색으로 염색된다. 현미경 시야를 수동으로 분석하여, 마이크로캐리어에 부착된 생존 세포와 죽은 세포의 분포 및 비율을 평가했다. 적어도 3번의 현미경 시야를 평가하여, 생존 세포의 대략적인 비율을 계산하였다.

세포 수확. 스피너 플라스크로부터 마이크로캐리어를 수집하고, PBS로 3회 세척하여, 2개의 50 ml 원뿔형 튜브에 균등하게 분배하였다. 각각의 튜브를 트립신 25 ml를 사용하여 37℃로 10분 동안 인큐베이션하였다. PBS를 사용하여 튜브를 50 ml 부피로 만들고, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 세포를 포함한 상청액을 흡인으로 수집하여, FBS 2.5 ml(5% FBS 용액을 형성하여, 트립신을 불활성화시킴)로 미리 충전된 50 ml 원뿔형 튜브에 옮겼다. 개별적으로 수집한 각 분획을 사용하여, 이런 공정을 4회 반복하였다. 수확한 모든 세포를 원심분리하고, 성장 배지를 함유한 혈청에 재현탁시켜, 세포를 구아바 PCA 기기를 사용하여 계수하였다.

정치(static) T-플라스크 배양. 미국 특허 출원 번호 제10/877012호에 언급된 방법에 따라, T225 플라스크로부터 수확한 세포의 분취량을 사용하여, 두 개의 T225 플라스크에 접종시키고, 4일 동안 인큐베이션한다. 세포를 수확하여, 유세포 분석법으로 분석하였다.

유세포 분석법. 수확한 세포를 벡톤-디킨슨 FACS 칼리버™ 기기(캘리포니아주, 새너제이 소재의 벡톤 디킨슨)를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하여, 세포 표면 마커 프로파일을 결정하였다. 모든 항체는 BD 파밍젠(캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 구입했다.

결과

세포 수확. 표 11-1은 스피너 플라스크 배양물 중에서 사이토덱스® 3 마이크로캐리어 상에서 계대 9부터 계대 11까지 증식된 UTC 세포주 050604B로부터의 수확 분획, 세포 수율 및 계대당 생존율을 나타낸다.

[표 11-1]

세포 동력학(Cell Kinetics). 표 11-2는 스피너 플라스크 배양물 중에서 사이토덱스® 3 마이크로캐리어 상에서 계대 9부터 계대 11까지 증식된 UTC 세포주 050604B의 성장 동력학을 보여준다. 표는 총 배가수가 7.48이고, 배가당 평균 시간은 69.53(± 17.52) 시간이었음을 나타낸다.

[표 11-2]

생사 염색. 생사 염색된 마이크로캐리어 분취량의 분석은 적색 염색된 핵(사멸)의 군집(foci)이 거의 없이, 마이크로캐리어 표면의 대부분이 녹색 염색된(생존) 세포로 커버되었음을 나타낸다. 세포는 정치 조건에서 배양된 세포의 형태와 유사한 형태를 나타낸다.

유세포 분석법에 의한 분석. 표 11-3은 정치 T 플라스크의 배양물로부터 수확한 hUTC와 대비하여, 스피너 플라스크의 마이크로캐리어 비드로부터 수확한 인간 제대 조직 유래 세포(hUTC)에 의해 발현된 세포 표면 마커에 대한 결과("+ 양성" 또는 "- 음성")를 나타낸다. 표는 두 가지 방법에 의해 생성된 세포에 의해 발현된 마커가 일치한다는 것을 나타낸다.

[표 11-3]

결론: 임펠러 스피너 플라스크 생물반응기의 사이토덱스® 3 마이크로캐리어 상에서 인간 제대 조직 유래 세포(hUTC)를 배양하였다. 세포는 20일에 걸쳐 7.48 집단 배가수를 달성하였고, 평균 집단 배가 시간은 69시간이었다. 계대 당 세포 생존율은 94.4% 내지 99.7%의 범위였다. 마이크로캐리어 상에서 배양된 hUTC에 대한 13가지의 세포 표면 마커의 발현에 대한 분석은 세포 배양 T 플라스크에서 배양된 hUTC에 의한 세포 표면 마커 발현과 일치하였다. 본 실시예는 마이크로캐리어가 생물반응기 시스템에서 hUTC를 접종, 증식 및 수확하는데 사용될 수 있음을 보여준다.

실시예 12

스피너 플라스크의 콜라겐 코팅 MGSA 및 PLGA 마이크로캐리어 상에서의 증식된 hUTC의 성장

스피너 플라스크 배양물에서 생존력을 유지하여, 정치 배양물로의 재접종 시에 증식하는 능력을 비롯하여, 콜라겐 코팅을 갖는 합성 흡수성 생체 재료로 제조된 재료에 부착하는 hUTC의 능력을 조사하였다. 증식된 hUTC를 콜라겐 코팅 또는 코팅되지 않은 폴리-(D,L-락티드-코-글리콜리드; PLGA) 및 폴리(모노스테아로일글리세라이드 코-숙신산; MGSA) 마이크로캐리어 상에 접종시켰다. 세포를 포함한 마이크로캐리어를 스피너 플라스크에서 5일 동안 배양하고, 트립신처리하여 수확하여, 정치 배양물에서 재접종시켰다.

재료 및 방법

[표 12-1]

마이크로캐리어 제조. 마이크로캐리어 습윤(Wetting)- 각각의 MGSA 및 PLGA 마이크로캐리어 약 1 g을 25 ml 70% 에탄올에서 30분 동안 무균적으로 현탁시켜, 마이크로캐리어를 습윤시켰다. 에탄올을 흡인에 의해 제거하고, 이어서 마이크로캐리어를 PBS로 3회 헹구어, 25 ml의 둘베코 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁시켰다.

콜라겐 코팅. 습윤된 마이크로캐리어(PBS)를 원심분리로 펠릿화하고, PBS를 흡인에 의해 제거하여, 마이크로캐리어를 2.9% 콜라겐 용액에 재현탁시켰다(비트로겐 1000, 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 코히즌 인코포레이티드(Cohesion, Inc.)). 마이크로캐리어를 콜라겐에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 잔류 콜라겐을 흡인하여 제거하고, 콜라겐 코팅 미립자를 PBS로 3회 세척하였다.

[표 12-2]

접종 및 배양. 실시예 11에서 사용한 재료, 세포 유형, 성장 배지, 스피너 플라스크, 접종 및 배양 조건, 배지 교환, 생존율 염색 및 세포 수확 방법을 본 실시예에서 사용하였다.

결과

[표 12-3]

재접종 세포 수확. 코팅 및 코팅되지 않은 MGSA 및 PLGA 마이크로캐리어로부터 수확한 세포를 약 5,000개의 세포/㎠로 T225에 재접종시켰다. 재접종 4일 후, 두 재료로부터 수확한 세포는 50% 컨플루언스 이상으로 증식하였다.

증식한 hUTC를 콜라겐 코팅된 PLGA 및 MGSA 마이크로캐리어에 접종시켜, 스피너 플라스크에서 5일 동안 배양하여, 트립신처리하여 수확하고, 정치 배양물로 재접종시켰다. 합성 마이크로캐리어에서 수확한 세포는 90% 이상 생존하였다. 재접종 세포는 4일 내에 정치 배양물에서 증식되어, 이들의 증식 능력의 유지를 입증하였다. 본 실시예는 스피너 플라스크 배양물용 마이크로캐리어로서 사용되는 합성 생체 재료의 능력을 입증한다.

실시예 13

연속 스피너 플라스크 배양물 중 마이크로캐리어 상에서의 hUTC의 증식

본 연구의 목적은 스피너 플라스크의 시판용 마이크로캐리어에 부착된 증식한 hUTC를 다수 집단 배가에 걸쳐 연속적으로 배양하는 것이었다. 마이크로캐리어 상에서 hUTC를 다수 집단 배가에 걸쳐 증식시키는 능력은 세포 요법 응용을 위한 hUTC의 대규모 생산을 위해 규모가 확대되는 모델 시스템을 제공할 것이다. 두가지 hUTC 분리주 (연구 조건 하에서 단리, 증식 및 동결보존된) 120304와 (GMP 조건 하에 단리, 증식 및 동결보존된) CNTO 2476을 평가하였다. 시판용 마이크로캐리어 사이토덱스®1 또는 힐렉스®II를 또한 평가하였다. 동결보존된 세포를 해동하여, 스피너 플라스크 배양물에 접종시키는데 바로 사용하였다. 세포를 다수 계대에 걸쳐서, 세포가 약 30의 집단 배가수에 도달할 때까지 연속적으로 배양하였다. hUTC를 또한 대조군으로서 T225 플라스크에서 정치 배양하였다.

집단 배가수 12.8에서 동결보존된 hUTC 분리주 120304는 해동되어, 사이토덱스®1 및 힐렉스®II 마이크로캐리어 상에서 각각, 집단 배가수 28.6 및 28.7로 증식될 수 있었다. 집단 배가당 시간은 계대에 걸쳐서 일정하므로, 안정적인 대수 생장을 보이며, T 플라스크 성장 동력학과 일치하였다. 집단 배가수 22.6에서 동결보존된 hUTC 분리주 CNTO 2476은 해동되어, 사이토덱스®1 및 힐렉스®II 마이크로캐리어 상에서 각각, 집단 배가수 33.2 및 31.0으로 증식될 수 있었다. 집단 배가당 시간은 계대에 걸쳐서 일정하므로, 안정적인 대수 생장을 보이며, T 플라스크 성장 동력학과 일치하였다. 집단 배가 당 시간의 모든 데이터 점에 대한 일원분산분석(one-way ANOVA)에 의한 통계 분석은 시험한 모든 조건의 hUTC 성장 동력학에 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.988). 세포 표면 단백질 발현은 시험한 모든 조건의 최종 수확에서 일관성을 유지하였다.

본 실시예는 마이크로캐리어 상에서 세포의 표면 단백질 표현형을 유지하는 안정적이고 일관된 방식으로, 약 30의 집단 배가수로 증식되는 hUTC의 능력을 입증한다.

재료 및 방법

세포. 동결보존된 증식 hUTC 분리주 12034 집단 배가(PD) 12 및 hUTC 분리주 CNTO 2476 로트 25126078 PD 22를 사용하였다.

성장 배지. 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)-저농도 글루코스 (뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 깁코), 15% FBS(유타주 로건 소재의 하이클론), 페니실린/스트렙토마이신(P/S; 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 깁코), 베타메르캅토에탄올(BME; 미주리 주 세인트 루이스 소재의 시그마)

마이크로캐리어. 사이토덱스®1 (뉴저지주 피스카타웨이 소재의 GE 헬스 사이언시스) 마이크로캐리어를 PBS에 적어도 3시간 동안 수화시켜, 오토클레이빙하였다. 사이토덱스®1 마이크로캐리어를 3 g/L의 농도로 사용하였다. 힐렉스®II (미시간주 앤아버 소재의 솔로힐 엔지니어링 인코포레이티드) 마이크로캐리어를 탈이온수에 적어도 30분 동안 수화시켜, 오토클레이빙하였다. 힐렉스®II 마이크로캐리어를 12 g/L의 농도로 사용하였다.

스피너 플라스크. 100 ml 및 500 ml 일회용(single-use, disposable) 스피너 플라스크 (뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인코포레이티드)를 사용하였다.

100 ml 스피너 플라스크에서의 접종 및 배양. hUTC의 동결보존된 바이알을 해동하고, 세척하여 성장 배지에 재현탁시켰다. 6.6 × 10⁶개의 hUTC를 100 ml 배지를 포함하는 100 ml 스피너 플라스크의 사이토덱스®1(5.0 × 10³개의 세포/㎠) 3000 mg에 첨가하고, 37℃ 조직 배양 인큐베이터에 넣어, 3 내지 4일 동안 인큐베이션하였다. 스피너 플레이트를 60-rpm 연속 회전으로 설정하였다. 3.1 × 10⁶개의 hUTC를 100 ml의 배지를 포함하는 100 ml 스피너 플라스크의 힐렉스®II(5.0 × 10³개의 세포/㎠) 1.2 g에 첨가하고, 60-rpm 연속 회전으로 설정된 스피너 플레이트 중에 두었다. 스피너 플레이트를 5% CO₂ 안에 두었다.

하나의 100 ml 스피너 플라스크에서 하나의 500 ml 스피너 플라스크로의 배양 계대. 100 ml 스피너 플라스크를 스피너 플레이트로부터 제거하고, 마이크로캐리어가 침강되게 두었다. 배지 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 유착성 세포와 패킹된(pack) 나머지 마이크로캐리어를 신선한 성장 배지 20 ml에 재현탁시켰다. 이어서, 유착성 세포를 포함한 마이크로캐리어를 신선한 성장 배지 480 ml 및 4.8 g의 힐렉스®II(6 g의 최종 마이크로캐리어 함량) 또는 1.2 g의 사이토덱스®1(1.5 g의 최종 마이크로캐리어 함량)을 포함하는 500 ml 스피너 플라스크에 피펫으로 무균적으로 옮겼다. 이어서, 스피너 플라스크를 60-rpm 연속 회전으로 설정된 스피너 플레이트 상에 두었다. 스피너 플레이트를 5% CO₂, 37℃ 조직 배양 인큐베이터에 넣고, 3 내지 4일 동안 인큐베이션하였다.

하나의 500 ml 스피너 플라스크에서 5개의 500 ml 스피너 플라스크로의 배양 계대. 500 ml 스피너 플라스크를 스피너 플레이트로부터 제거하고, 마이크로캐리어가 침강되게 두었다. 배지 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 유착성 세포와 패킹된 나머지 마이크로캐리어를 신선한 성장 배지 50 ml에 재현탁시켰다. 이어서, 유착성 세포를 포함하는 마이크로캐리어의 분리된 5개의 분취량 10 ml를 각각이 신선한 성장 배지 490 ml 및 4.8 g 힐렉스®II(6 g의 최종 마이크로캐리어 함량) 또는 1.2 g 사이토덱스®1(1.5 g의 최종 마이크로캐리어 함량)을 포함하는 5개의 분리된 500 ml 스피너 플라스크로 피펫으로 무균적으로 옮겼다. 이어서, 스피너 플라스크를 60-rpm 연속 회전으로 설정된 스피너 플레이트 상에 두었다. 스피너 플레이트를 5% CO₂, 37℃ 조직 배양 인큐베이터에 넣고, 3 내지 4일 동안 인큐베이션하였다.

사이토덱스®1 마이크로캐리어에 부착된 세포의 수확. 500 ml 스피너 플라스크를 스피너 플레이트로부터 제거하고, 유착성 세포를 포함하는 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 배지 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 500 ml의 PBS를 스피너 플라스크에 첨가하고, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. PBS 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 500 ml의 DMEM-저농도 글루코스를 스피너 플라스크에 첨가하였다. 이어서, 스피너 플라스크를 스피너 플레이트 상에서 20분 동안 60 rpm으로 인큐베이션하였다. 스피너 플라스크를 스피너 플레이트로부터 제거하고, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. DMEM-저농도 글루코스 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 500 ml의 PBS를 스피너 플라스크에 첨가하였다. 이어서, 스피너 플라스크를 스피너 플레이트 상에서 20분 동안 60 rpm으로 인큐베이션하였다. 스피너 플라스크를 스피너 플레이트로부터 제거하고, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. PBS 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. TrypLE 셀렉트 250 ml를 스피너 플라스크에 첨가하였다. 이어서, 스피너 플라스크를 스피너 플레이트 상에서 10분 동안 60 rpm으로 인큐베이션하였다. 스피너 플라스크를 스피너 플레이트로부터 제거하고, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 마이크로캐리어-TrypLE™ 셀렉트 용액을 50 ml 혈청용 피펫을 사용하여 위아래로 약 10회 피펫팅에 의해 교반시켜, 잔류 유착성 세포를 마이크로캐리어로부터 해리시켰다. 이어서, 250 ml의 PBS를 스피너 플라스크에 첨가하고, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 세포 함유 상청액을 반복된 피펫팅으로 수집하고, FBS 5ml와 튜브 개구에 삽입된 100 μm 필터 유닛이 미리 설치된 다중 원뿔형 튜브로 옮겼다. 튜브를 5분 동안 300 rcf로 원심분리하고, 상청액을 디캔팅(decant)하여, 세포를 성장 배지에 재현탁시켰다.

힐렉스®II 마이크로캐리어에 부착된 세포의 수확. 500 ml 스피너 플라스크를 스피너 플레이트로부터 제거하고, 유착성 세포를 포함하는 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 배지 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 500 ml의 PBS를 스피너 플라스크에 첨가하고, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. TrypLE™ 셀렉트 100 ml를 스피너 플라스크에 첨가하였다. 이어서, 스피너 플라스크를 스피너 플레이트 상에서 10분 동안 60 rpm으로 인큐베이션하였다. 스피너 플라스크를 스피너 플레이트로부터 제거하고, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 마이크로캐리어-TrypLE™ 셀렉트 용액을 25 ml 혈청용 피펫을 사용하여 위아래로 약 10회 피펫팅에 의해 교반시켜, 잔류 유착성 세포를 마이크로캐리어로부터 해리시켰다. 세포 함유 상청액을 반복된 피펫팅으로 수집하고, FBS 5ml와 튜브 개구에 삽입된 100-μm 필터 유닛이 미리 설치된 다중 원뿔형 튜브로 옮겼다. 튜브를 5분 동안 300 rcf로 원심분리하고, 상청액을 디캔팅하여, 세포를 성장 배지에 재현탁시켰다.

생존율 염색. 1 ml의 배지 분취량과 마이크로캐리어를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮겨, 마이크로캐리어를 중력에 의해 침강시켰다. 배지를 흡인에 의해 제거하고, 1 ml 생사 염색 용액(몰레큘러 프로브스 카탈로그 번호 L3224)으로 교체하여, 15분 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 20-μl 분취량을 현미경 유리 슬라이드에 도포하여, 형광 현미경으로 관찰하였다. 생존 세포는 녹색으로 염색된다. 현미경 시야를 수동으로 분석하여, 마이크로캐리어에 부착된 생존 세포의 분포를 평가하였다. 현미경 시야를 3회 이상 평가하고, 생존 세포의 대략적인 비율을 계산하였다.

배양물 중의 세포 계수- 핵 방출 검정(Nuclei release assay). 스피너 플라스크 용기로부터 균질한 마이크로캐리어 현탁액의 분취량 5 ml (100 ml 스피너 플라스크) 또는 10 ml (500 ml 스피너 플라스크)를 채취하여, 15 ml 튜브로 옮겼다. 마이크로캐리어를 중력 분리하고, 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 마이크로캐리어를 PBS 10 ml로 1회 세척하고, 마이크로캐리어를 중력 분리하여, PBS 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 마이크로캐리어를 핵 방출 용액(0.1% w/v 크리스탈 바이올렛(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)을 함유한 0.1M 시트르산(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마))에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 핵 방출 용액을 함유하는 마이크로캐리어의 분취량 100 μl를 PBS 100 μl에 첨가하였다. 이어서, 상기 용액의 분취량 10 μl를 혈구계(hemocytometer)에 로딩하고, 방출 핵을 계수하였다.

배양물 중 세포 계수- TrypLE™ 검정. 스피너 플라스크 용기로부터 균질한 마이크로캐리어 현탁액의 분취량 5 ml (100 ml 스피너 플라스크) 또는 10 ml (500 ml 스피너 플라스크)를 채취하여, 15 ml 튜브로 옮겼다. 마이크로캐리어를 중력 분리하고, 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 마이크로캐리어를 PBS 10 ml로 1회 세척하고, 마이크로캐리어를 중력 분리하여, PBS 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 마이크로캐리어를 TrypLE™ 셀렉트에서 10분 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, PBS 5 ml를 첨가하고, 마이크로캐리어를 중력 분리하였다. 세포 함유 상청액을 반복적인 피펫팅에 의해 수집하고, FBS 1 ml가 사전로딩된 다수의 원뿔형 튜브로 옮겼다. 튜브를 300 rcf로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 디캔팅하여, 세포를 성장 배지에 재현탁시키고, 분취량을 사용하여, 구아바 PCA 기기(캘리포니아주 할리우드 소재의 구아바 테크놀로지스)를 사용하여 세포 계수를 측정하였다.

정치 T-플라스크 배양. hUTC의 동결보존된 바이알을 해동하고, 세척하여 성장배지에 재현탁시켰다. US2004877012A에 명시된 방법을 사용하여, 세포를 다수 계대에 걸쳐서 T225에서 정치 배양하였다.

유세포 분석법. 수확한 hUTC를 벡톤-디킨슨 FACS칼리버™ 기기(캘리포니아주 새너제이 소재의 벡톤 디킨슨)를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하여, US2004877012A에 명시된 방법을 사용하여 세포 표면 마커 프로파일을 측정하였다. 모든 항체는 BD 파밍젠(캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 구입했다.

결과

[표 13-1]

[표 13-2]

[표 13-3]

[표 13-4]

[표 13-5]

[표 13-6]

집단 배가수 12.8에서 동결보존된 hUTC 분리주 120304는 해동되고, 사이토덱스®1 및 힐렉스®II 마이크로캐리어 상에서 각각 집단 배가수 28.6 및 28.7로 증식될 수 있었다. 집단 배가당 시간은 계대에 걸쳐서 일정하므로, 안정적인 대수 생장을 보이며 T 플라스크 성장 동력학과 일치하였다. 집단 배가수 22.6에서 동결보존된 hUTC 분리주 CNTO 2476은 해동되어, 사이토덱스®1 및 힐렉스®II 마이크로캐리어 상에서 각각, 집단 배가수 33.2 및 31.0으로 증식될 수 있었다. 집단 배가당 시간은 계대에 걸쳐서 일정하므로, 안정적인 대수 생장을 보이며 T 플라스크 성장 동력학과 또한 일치하였다. 집단 배가당 시간의 모든 데이터 점의 일원분산분석에 의한 통계 분석은 시험한 모든 조건의 hUTC 성장 동력학에 유의한 차이가 없음을 보여준다(p=0.988). 또한, 세포 표면 단백질 발현은 시험한 모든 조건의 최종 수확에서 일관성을 유지하였다. 이 데이터는 세포의 표면 단백질 표현형을 유지하는 안정적이고 일관된 방식으로, 마이크로캐리어 상에서 약 30의 집단 배가수로 증식되는 hUTC의 능력을 입증하였다.

본 발명을 다양한 특정한 재료, 절차 및 실시예를 참고로 하여 본 명세서에서 설명하고 예시하였지만, 본 발명은 이 목적용으로 선택된 재료 및 절차의 특정한 조합에 제한되지 않음이 이해된다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이러한 상세 사항에 대한 다양한 변화가 암시될 수 있다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주 되도록 의도되며, 이때 본 발명의 실제 범주 및 사상은 하기 청구범위에 의해 나타난다. 본 출원에서 언급되는 모든 참고 문헌, 특허 및 특허 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (23)

1. 제대 조직 유래 세포 성장용 배양 배지로서,
   아미노산: L-아르기닌; L-시스틴; L-시스테인; L-글루타민; 글리신; L-히스티딘; L-이소류신; L-류신; L-라이신; L-메티오닌; L-페닐알라닌; L-세린; L-트레오닌; L-트립토판; L-티로신; L-발린; L-알라닌; L-아스파라긴; L-아스파르트산; L-글루탐산; L-프롤린; 및 L-타우린;
   비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂;
   염: 염화칼슘, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨 및 하나 이상의 인산나트륨 염;
   뉴클레오시드: 티미딘, 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신;
   인슐린; 트랜스페린; 리포산/티옥트산; 에탄올아민; 아셀렌산나트륨; 및 D-글루코스 및 피루브산나트륨으로부터 선택되는 하나 이상의 에너지 기질을 포함하고, 상기 제대 조직 유래 세포가 혈액을 함유하지 않는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, 분화하는 잠재력을 갖고, CD13, CD90, HLA-ABC를 발현하며, CD34, CD117 및 HLA-DR을 발현하지 않는 것인, 제대 조직 유래 세포 성장용 배양 배지.
2. 제1항에 있어서, 상기 배지가 티미딘 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘 및 우리딘 각각 0.005 g/L 이상을 포함하는, 배양 배지.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지가
   각각의 아미노산 0.0006 g/L 내지 0.1 g/L; 및
   각각의 비타민 5 × 10^-6 g/L 내지 0.015 g/L
   중 하나 이상을 포함하는, 배양 배지.
4. 제1항에 있어서, 상기 배지가 하나 이상의 추가 미량 미네랄을 추가로 포함하는, 배양 배지.
5. 제4항에 있어서, 상기 배지가 미량 미네랄 각각을 5 × 10^-8 g/L 내지 3 × 10^-4 g/L로 포함하는, 배양 배지.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 미량 미네랄이 질산제2철, 황산구리 및 황산아연인, 배양 배지.
7. 제1항에 있어서, 상기 배지가 질산제2철(9H₂O), 황산구리(II) 오수화물(CuSO₄·5H₂O) 및 황산아연 칠수화물(ZnSO₄·7H₂O)를 포함하는, 배양 배지.
8. 제1항에 있어서, 상기 배지가 푸트레신, 소포제 또는 이들 둘다를 추가로 포함하는, 배양 배지.
9. 제1항에 있어서, 상기 에너지 기질이 피루브산나트륨인, 배양 배지.
10. 제9항에 있어서, 상기 배지가 D-글루코스 0.8 g/L 이상 및 피루브산나트륨 0.1 g/L 이상을 포함하는, 배양 배지.
11. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지는,
    L-아르기닌 0.05 g/L 이상; L-시스틴 0.02 g/L 이상; L-글루타민 0.2 g/L 이상; 글리신 0.01 g/L 이상; L-히스티딘 0.02 g/L 이상; L-이소류신 0.09 g/L 이상; L-류신 0.09 g/L 이상; L-라이신 0.09 g/L 이상; L-메티오닌 0.02 g/L 이상; L-페닐알라닌 0.05 g/L 이상; L-세린 0.03 g/L 이상; L-트레오닌 0.08 g/L 이상; L-트립토판 0.009 g/L 이상; L-티로신 0.08 g/L 이상; L-발린 0.08 g/L 이상; L-시스테인 0.005 g/L 이상; L-알라닌 0.0004 g/L 이상; L-아스파라긴 0.01 g/L 이상; L-아스파르트산 0.006 g/L 이상; L-글루탐산 0.03 g/L 이상; L-프롤린 0.005 g/L 이상; 및 L-타우린 0.0003 g/L 이상;
    각각의 비타민 5 × 10^-6 g/L 내지 0.015 g/L;
    무수 염화칼슘 0.05 g/L 이상, 염화칼륨 0.1 g/L 이상, 황산마그네슘 0.2 g/L 이상, 인산이수소나트륨 일수화물(sodium phosphate, monobasic, H₂O) 0.08 g/L 이상 및 인산일수소나트륨 칠수화물(sodium phosphate, dibasic heptahydrate; Na₂HPO₄·7H₂O) 0.0005 g/L 이상;
    티미딘 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신 각각 0.005 g/L 이상; 및
    인슐린 0.003 g/L 이상, 트랜스페린 0.05 g/L 이상, 리포산/티옥트산 5 × 10^-6 g/L 이상, 에탄올아민 0.05 g/L 이상 및 아셀렌산나트륨 0.00004 g/L 이상을 포함하는, 배양 배지.
12. 제1항에 있어서, 상기 에너지 기질이 D-글루코스인, 배양 배지.
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15. 제1항에 있어서, 상기 배지가 알부민을 추가로 포함하는, 배양 배지.
16. 제15항에 있어서, 상기 알부민이 소 혈청 알부민인, 배양 배지.
17. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 미분화 세포의 성장을 촉진하는 외부로부터 첨가된 인자를 함유하지 않는 것인, 배양 배지.
18. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 섬유아세포 성장 인자를 포함하지 않는 것인, 배양 배지.
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20. 제1항에 따른 배양 배지 및 무혈청 영양액을 포함하는, 제대 조직 유래 세포를 성장시키기 위한 키트로서, 상기 무혈청 영양액이,
    아미노산: L-아르기닌, L-시스틴, L-시스테인, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-타우린;
    비타민: D-판토텐산칼슘; 염화콜린; 엽산; I-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독살; 리보플라빈; 티아민; d-비오틴; 피리독신; 및 비타민 B₁₂;
    염: 인산이수소나트륨 및 인산일수소나트륨 칠수화물;
    뉴클레오시드: 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신; 및
    인슐린; 트랜스페린; 리포산/티옥트산; 에탄올아민; 및 아셀렌산나트륨을 포함하고,
    상기 제대 조직 유래 세포가 혈액을 함유하지 않는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, 분화하는 잠재력을 갖고, CD13, CD90, HLA-ABC를 발현하며, CD34, CD117 및 HLA-DR을 발현하지 않는 것인, 키트.
21. 제20항에 있어서, 상기 무혈청 영양액이 티미딘 0.0001 g/L 이상, 및 아데노신, 시티딘 및 우리딘 각각 0.005 g/L 이상을 포함하는, 키트.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 배지가
    각각의 아미노산 적어도 0.0001 g/L 내지 적어도 0.03 g/L;
    각각의 비타민 5 × 10^-6 g/L 내지 0.001 g/L; 및
    인산염 0.0005 g/L 내지 0.001 g/L
    중 하나 이상을 포함하는, 키트.
23. 제20항에 있어서, 상기 무혈청 영양액이 푸트레신, 소포제 또는 이들 둘다를 추가로 포함하는, 키트.