CN111690602A - 用于hUTC生长的营养富集培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使锚着依赖性细胞(例如hUTC)在培养基中生长的方法，所述培养基包含氨基酸、维生素、盐、核苷、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠，其中所述培养基补充有血清。所述方法还包括添加无血清营养液，所述无血清营养液包含氨基酸、维生素、盐、核苷、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠。本发明还提供用于使锚着依赖性细胞生长的培养基和无血清营养液。

Description

用于hUTC生长的营养富集培养基
本申请是申请日为2013年12月12日，中国国家申请号为201380072759.4，发明名称为“用于hUTC生长的营养富集培养基”的发明申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及用于锚着依赖性细胞诸如脐带组织衍生细胞的生长的营养富集培养基。
背景技术
对于同种异体细胞疗法产品而言，细胞或组织是从供体获得的，故该细胞或组织在施用给患者之前需被进一步操作。通常，非均质细胞疗法产品的制造工艺包括下列步骤：使细胞库瓶解冻并使细胞扩增以接种制备容器；在制备容器中制备细胞；移除在细胞制备期间使用的非期望杂质，诸如血清和胰蛋白酶；浓集细胞；将细胞配制到最终配制缓冲液中；以及冷冻细胞。这种制造工艺可能十分复杂且昂贵。例如，一般在补充有血清的生长培养基中培养并扩增用于细胞疗法应用的细胞。由于血清、培养基和该工艺中使用的其他消耗品的高成本，故细胞疗法的生产成本可能非常高。多种因素可限制细胞生长到高细胞密度，包括营养限制、培养物中细胞副产物累积、物理环境等。因此，希望通过使细胞生长到高细胞密度来增加从制备容器制备的容积细胞。
之前，已表明可通过在运行的第3天更换包含15％胎牛血清(FBS)的细胞生长培养基，使锚着依赖性细胞诸如人脐带组织衍生细胞(hUTC)生长到高细胞密度。然而，由于高血清成本、制备所需的高血清使用量以及另外的运行操作，故这种培养基更换不太可取。因此，具有培养基更换的工艺在商业上不可行。
需要的是，用于在不需要更换细胞生长培养基的情况下使细胞生长的商业上可行的新方法。
发明内容
本发明的一个实施例是用于使锚着依赖性细胞生长的培养基，该培养基包含：(1)氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；(2)维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；(3)盐：氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和一种或多种磷酸钠盐；(4)核苷：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；(5)胰岛素；(6)转铁蛋白；(7)类脂酸/硫辛酸；(8)乙醇胺；(9)亚硒酸钠；和(10)一种或多种能源。
在一个实施例中，该培养基包含：
至少约0.05g/L的L-精氨酸、至少约0.02g/L的L-胱氨酸、至少约0.2g/L的L-谷氨酰胺、至少约0.01g/L的甘氨酸、至少约0.02g/L的L-组氨酸、至少约0.09g/L的L-异亮氨酸、至少约0.09g/L的L-亮氨酸、至少约0.09g/L的L-赖氨酸、至少约0.02g/L的L-甲硫氨酸、至少约0.05g/L的L-苯丙氨酸、至少约0.03g/L的L-丝氨酸、至少约0.08g/L的L-苏氨酸、至少约0.009g/L的L-色氨酸、至少约0.08g/L的L-酪氨酸、至少约0.08g/L的L-缬氨酸、至少约0.005g/L的L-半胱氨酸、至少约0.0004g/L的L-丙氨酸、至少约0.01g/L的L-天冬酰胺、至少约0.006g/L的L-天冬氨酸、至少0.03g/L的L-谷氨酸、至少约0.005g/L的L-脯氨酸和至少约0.0003g/L的L-牛磺酸；
各约5×10-6g/L至约0.015g/L的维生素；
至少约0.05g/L的无水氯化钙、至少约0.1g/L的氯化钾、至少约0.2g/L的硫酸镁、至少约0.08g/L的磷酸二氢钠一水合物和至少约0.0005g/L的磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4.7H2O)；
至少约0.0001g/L的胸苷以及各至少约0.005g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；以及
至少0.003g/L的胰岛素；至少0.05g/L的转铁蛋白；至少约5×10-6g/L的类脂酸/硫辛酸；至少0.05g/L的乙醇胺；和至少约0.00004g/L的亚硒酸钠。
本发明的另一个实施例是用于使锚着依赖性细胞生长的无血清营养液，该无血清营养液包含：
氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；
维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；
盐：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠七水合物；
核苷：腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；
胰岛素；转铁蛋白；类脂酸/硫辛酸；乙醇胺；和亚硒酸钠。
本发明还提供用于使锚着依赖性细胞生长的试剂盒。该试剂盒包含培养基和/或无血清营养液。该培养基、无血清溶液和试剂盒可用于使锚着依赖性细胞(诸如脐带组织衍生细胞)生长的方法中。
因此，本发明的另一个实施例是培养分离的脐带组织衍生细胞的方法，该方法包括：
使接种于微载体上的脐带组织衍生细胞在补充有血清的培养基中生长一段足够的时间以使细胞达到期望的初始群体密度，该培养基包含氨基酸、维生素、盐、核苷、类脂酸/硫辛酸、乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠；
在细胞已达到期望的初始群体密度之后加入无血清营养液，该无血清营养液包含氨基酸、维生素、盐、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、类脂酸/硫辛酸、亚硒酸钠；以及
使细胞生长一段足够的时间以使细胞达到期望的最终群体密度。
该方法还可包括另外的步骤。在一个实施例中，该方法还包括将细胞接种于微载体上。在另一个实施例中，该方法还包括在培养之后分离细胞。在一个实施例中，在3至4天之后达到期望的初始群体密度。该方法不需要培养基更换。该方法可在滚瓶培养系统中进行，并且微载体可具有胺处理的表面。
该方法中使用的脐带组织衍生细胞分离自基本上不含血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，具有分化的潜能，表达CD13、CD90、HLA-ABC，并且不表达CD34、CD117和HLA-DR。在一个实施例中，细胞不表达hTERT或端粒酶。在培养之前和之后，细胞的特征是基本上相同的。在一个实施例中，在培养之前和之后，细胞的特征是相同的。
在一个实施例中，用于该方法的培养基包含：
氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；
维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；
盐：氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和一种或多种磷酸钠盐；
核苷：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；
胰岛素；转铁蛋白；类脂酸/硫辛酸；乙醇胺；亚硒酸钠；和一种或多种能源(诸如D-葡萄糖和丙酮酸钠)。
在另一个实施例中，用于该方法的培养基包含：
至少约0.05g/L的L-精氨酸、至少约0.02g/L的L-胱氨酸、至少约0.2g/L的L-谷氨酰胺、至少约0.01g/L的甘氨酸、至少约0.02g/L的L-组氨酸、至少约0.09g/L的L-异亮氨酸、至少约0.09g/L的L-亮氨酸、至少约0.09g/L的L-赖氨酸、至少约0.02g/L的L-甲硫氨酸、至少约0.05g/L的L-苯丙氨酸、至少约0.03g/L的L-丝氨酸、至少约0.08g/L的L-苏氨酸、至少约0.009g/L的L-色氨酸、至少约0.08g/L的L-酪氨酸、至少约0.08g/L的L-缬氨酸、至少约0.005g/L的L-半胱氨酸、至少约0.0004g/L的L-丙氨酸、至少约0.01g/L的L-天冬酰胺、至少约0.006g/L的L-天冬氨酸、至少0.03g/L的L-谷氨酸、至少约0.005g/L的L-脯氨酸和至少约0.0003g/L的L-牛磺酸；
各约5×10-6g/L至约0.015g/L的维生素；
至少约0.05g/L的无水氯化钙、至少约0.1g/L的氯化钾、至少约0.2g/L的硫酸镁、至少约0.08g/L的磷酸二氢钠一水合物和至少约0.0005g/L的磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4.7H2O)；
至少约0.0001g/L的胸苷以及各至少约0.005g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；以及
至少0.003g/L的胰岛素；至少0.05g/L的转铁蛋白；至少约5×10-6g/L的类脂酸/硫辛酸；至少0.05g/L的乙醇胺；和至少约0.00004g/L的亚硒酸钠。
用于该方法的培养基补充有2至20％的FBS。在一个实施例中，培养基补充有约7.5％、约10％或约15％的FBS。
在一个实施例中，用于该方法的无血清营养液包含：
氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；
维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；
盐：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠七水合物；
痕量矿物质：硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)、硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)；
核苷：腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；
胰岛素；转铁蛋白；乙醇胺；类脂酸/硫辛酸；和亚硒酸钠。
培养基和无血清营养液还可包含另外的组分。例如，培养基和/或无血清营养液还可包含腐胺、稳定剂和/或发泡剂。
通过下述详述，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
具体实施方式
在例示性实施例的下述详述中，参考构成其一部分的附图。这些实施例充分详细地进行描述，以允许本领域技术人员实践本发明，并且应当理解可利用其他实施例，并且可作出逻辑结构、机械、电和化学变化，而不背离本发明的实质或范围。为了避免对于允许本领域技术人员实践本文描述的实施例不必要的细节，描述可省略本领域技术人员已知的某些信息。下述详述因此不应视为具有限制意义。
在一个方面，本发明提供了用于使附着于微载体上的锚着依赖性细胞诸如人脐带组织衍生细胞(“hUTC”)在含血清培养基中生长到高细胞密度而不必通过在运行中间为培养物供给无血清营养液进行培养基更换的工艺。该工艺允许细胞生长到高细胞密度而不影响细胞的生物学功能。由于本发明提高了从制备生物反应器得到的收率，因此本发明提供了经济益处和商业益处。
在另一个方面，本发明提供了适于使锚着依赖性细胞在旋转瓶中生长的培养基和营养液，优选地无需培养基更换。
在一个实施例中，本发明公开了在无需培养基更换的情况下使hUTC在旋转瓶中生长到高密度的富集培养基和浓缩无血清营养液的组成。该方法减少了血清使用量并提高了容积生产率，从而降低了制造成本。具体地，在培养基更换的情况下，该方法允许倍增加快。
在另一个实施例中，本发明提供无血清营养液，该无血清营养液包含：氨基酸(用以补充培养中消耗的氨基酸)、维生素、盐(用以维持培养中的渗透平衡)、核苷、胰岛素、转铁蛋白、以及任选地但优选地乙醇胺、和亚硒酸钠。本发明允许工艺向大规模生物反应器的可放大性。在又一个实施例中，本发明提供了培养基，该培养基包含氨基酸、维生素、盐、核苷、胰岛素、转铁蛋白、以及任选地但优选地乙醇胺、和亚硒酸钠。在使用之前，该培养基可补充有血清。
本发明的另一个方面是通过使含血清生长培养基富含营养物质并为培养物供给无血清营养物质，在旋转瓶中的悬浮培养中使附着于微载体上的hUTC生长到高细胞密度的方法。该方法无需培养基更换就可使hUTC生长到高密度。
整个说明书和权利要求书中使用了多个术语。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的普通含义。其他具体定义的术语应按照与本文所提供的定义相符的方式理解。
在一个实施例中，本发明中使用的细胞一般被称为产后细胞或产后衍生的细胞(PPDC)。这些细胞更具体地是“脐衍生的细胞”或“脐带衍生的细胞”(UDC)或“脐带组织衍生的细胞”(UTC)。此外，细胞可被描述为干细胞或祖细胞，后面的术语在广义中使用。术语“衍生的”用于指示细胞已从其生物来源获得并且在体外生长或以其他方式处理(例如，在生长培养基中培养以扩增群体和/或产生细胞系)。脐干细胞的体外操作和本发明的脐衍生的细胞的独特特征于下文详细地描述。
干细胞是由单细胞自我更新并分化以产生后代细胞的能力定义的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞和终末分化的细胞。干细胞还由它们的以下能力来表征：从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多个胚层的组织的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多数组织(如果不是所有的组织的话)的能力。
根据干细胞的发育潜能，将它们分类为：(1)全能的；(2)多能的；(3)多潜能的；(4)寡能的；和(5)单能的。全能细胞能够产生所有胚胎和胚胎外细胞类型。多能细胞能够产生所有胚胎细胞类型。多潜能细胞包括能够产生细胞谱系子类的那些细胞，但是所有这些细胞在特定组织、器官或生理系统内。例如，造血干细胞(HSC)可产生包括HSC(自我更新)、限制血细胞的寡能祖细胞、以及为血液正常组分的所有细胞类型和元件(如，血小板)的后代。寡能细胞可产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子类。单能细胞能够产生单细胞谱系(例如生精干细胞)。
干细胞也基于它们由其获得的来源进行分类。成体干细胞一般为在包括多个分化细胞类型的组织中发现的多潜能未分化细胞。成体干细胞可自我更新。在正常情况下，它也可分化产生特化的组织细胞类型(其起源于该组织)，并且可能产生其他组织类型。胚胎干细胞是来自胚泡期胚胎的内细胞团的多能细胞。胎儿干细胞是源于胎儿组织或膜的干细胞。产后干细胞是基本上源于可在分娩后获得的胚胎外组织(即脐带)的多潜能或多能细胞。已发现这些细胞具有多能干细胞的特征特性，包括快速增殖和分化成许多细胞谱系的潜能。产后干细胞可为血液衍生的(如，从脐带血液获得的那些)或非血液衍生的(如，从脐带和胎盘的非血液组织获得的)。
多个术语用于描述培养中的细胞。“细胞培养物”一般指从活生物体取得并在受控条件下生长(“在培养中”或“培养的”)的细胞。“原代细胞培养物”是在第一继代培养之前从生物体直接取得的细胞、组织或器官的培养物。当在利于细胞生长和/或分裂的条件下将细胞放置在生长培养基中时，细胞会“扩增”，从而产生更大的细胞群。当细胞在培养中扩增时，有时通过细胞数翻倍所需的时间量来测量细胞增殖率。此被称为“倍增时间”。
术语“细胞系”一般指通过原代细胞培养物的一次或多次继代培养形成的细胞群。每一轮继代培养都被称为传代。当对细胞进行继代培养时，该细胞称为被“传代”。有时特定的细胞群或细胞系是指被传代的次数或以被传代的次数为特征。例如，已被传代十次的培养细胞群可称为P10培养物。原代培养物(即，在将细胞从组织分离之后的第一培养物)被指定为P0。在第一次继代培养后，细胞被描述为次代培养物(P1或第1代)。在第二次继代培养后，细胞变成三代培养物(P2或第2代)，依此类推。本领域的技术人员应当理解，在传代期间，可以有多次群体倍增；因此，培养物的群体倍增数大于传代数。细胞在传代之间的期间中的扩增(即群体倍增数)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基底、培养基、生长条件和传代之间的时间。
“分化”是通过其未特化的(“未定型的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(例如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。“分化”细胞是已在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子类，并且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。“去分化”指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用，细胞的“谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。
在广义上，“祖细胞”是具有产生比其自身分化程度更高的后代的能力，然而保持补充祖细胞库能力的细胞。根据此定义，因为干细胞是最终分化细胞的更直接前体，故其本身也是祖细胞。如下文更详细地描述的，在提及本发明的细胞时，可使用该祖细胞广义定义。在狭义上，祖细胞通常定义为在分化途径中间(即，其起于干细胞)且在成熟细胞类型或细胞类型子类生产中间的细胞。该祖细胞类型一般不能够自我更新。因此，如果本文提及该细胞类型，则它将被称为“非更新的祖细胞”或“中间祖细胞或前体细胞”。
通常，“营养因子”定义为促进细胞存活、生长、增殖和/或成熟，或刺激细胞活性增加的物质。
如本文所用，术语“标准生长条件”指在37℃下、在包含5％的CO2的标准大气和维持在约100％的相对湿度中的细胞培养。虽然前述条件可用于培养，应当理解，此条件能够由本领域中将认识到可用选项的技术人员针对培养细胞改变。
如本文所用的术语“分离物”一般指已与其天然环境分开的细胞。该术语包括与其天然环境的肉眼可见的物理分开，例如从供体动物中取出。在优选实施例中，分离的细胞不存在于组织中，即细胞和它通常与之接触的相邻细胞分开或解离。优选地，细胞作为细胞悬浮液施用。如本文所用，短语“细胞悬浮液”包括与培养基接触且已例如通过对组织片实施轻轻研磨而解离的细胞。
本发明的一个实施例是利用本发明的培养基和无血清营养液培养分离的锚着依赖性细胞的方法。用于培养分离的锚着依赖性细胞(诸如脐带组织衍生细胞)的方法提供了在至少一种载体颗粒例如微载体上培养细胞。微载体可由天然或合成衍生材料构成。例子包括基于胶原蛋白的微载体、基于右旋糖酐的微载体或基于纤维素的微载体，以及玻璃、陶瓷、聚合物(诸如聚苯乙烯)或金属。微载体可为无蛋白质的或涂布有蛋白质，例如涂布有胶原蛋白。在又一个方面，微载体可由增强细胞结合于微载体并增强细胞从微载体释放的化合物构成或涂布有该化合物，该化合物包括但不限于透明质酸钠、聚(单硬脂酰基甘油酯-共-琥珀酸)、聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、赖氨酸、n-异丙基丙烯酰胺、玻连蛋白和胶原蛋白。例子还包括具有微电流的微载体，诸如具有产生低水平生物学相关电的锌和铜的颗粒电偶的微载体；或顺磁性的微载体，诸如顺磁性的海藻酸钙微载体。该方法可在滚瓶系统中进行。
应当理解，本发明并非仅限于特定的方法、试剂、化合物、组成、或生物系统，当然，该方法、试剂、化合物、组成、或生物系统可发生变化。另外应当理解，本文所用的术语只是为了描述具体实施例的目的，并非旨在进行限制。如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义。因此，例如，对“一种细胞”的提及包括两种或更多种细胞的组合等等。
“微载体”是指可用于培养中的锚着依赖性细胞的附着和生长的颗粒、小珠或小球。微载体具有下列特性：(a)它们足够小以允许它们用于悬浮培养(采用不会对微载体或细胞造成显著剪切损伤的搅拌速率)；(b)它们是实心的或具有实心核心且表面上带有多孔涂层；以及(c)它们的表面(就多孔载体而言，外表面和内表面)可带正电或带负电。在一个方面，微载体具有约150与350μm之间的总粒径，并且具有约0.8与2.0meq/g之间的正电荷密度。示例性的可用微载体包括
Figure BDA0002528558190000101
1、
Figure BDA0002528558190000103
2或
Figure BDA0002528558190000102
3(GE HealthcareLife Sciences)。
在另一个方面，微载体是实心载体。实心载体特别适用于附着细胞，例如锚着依赖性细胞。载体颗粒也可为多孔微载体。例子还包括具有微电流的微载体，诸如具有产生低水平生物学相关电的锌和铜的颗粒电偶的微载体；或顺磁性的微载体，诸如顺磁性的海藻酸钙微载体。
“多孔微载体”是指可用于培养中的锚着依赖性细胞的附着和生长的颗粒。多孔微载体具有下列特性：(a)它们足够小以允许它们用于悬浮培养(采用不会对微载体或细胞造成显著剪切损伤的搅拌速率)；(b)它们具有足够尺寸以允许细胞迁移到颗粒的内部空间的孔隙和内部空间；以及(c)它们的表面(外表面和内表面)可带正电或带负电。在一系列实施例中，载体(a)具有约150与350μm之间的总粒径；(b)具有平均开孔直径在约15与约40μm之间的孔隙；以及(c)具有约0.8与2.0meq/g之间的正电荷密度。在一些实施例中，DEAE(N,N,-二乙基氨基乙基)基团提供正电荷。可用多孔微载体包括但不限于Cytopore
Figure BDA0002528558190000104
和Cytopore
Figure BDA0002528558190000105
(GE Healthcare Life Sciences,PiscatawayN.J.)。
“锚着依赖性细胞”是包括哺乳动物细胞的细胞，其需要附着到表面，例如组织培养瓶表面或微载体颗粒表面，以在组织培养中复制。
如本文所用，术语“约”在涉及可测量值例如量、时距等等时，意指涵盖与指定值±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，并且还更优选地±0.1％的变化，因为此类变化适合执行本发明所公开的方法。
I.培养基和无血清营养供给溶液
本发明提供无血清的富集培养基和浓缩营养供给溶液。培养基和无血清营养液可用于使细胞生长到高密度。在一个优选的实施例中，培养基和无血清营养液可用于在旋转瓶中在较低血清消耗下使锚着依赖性细胞诸如hUTC生长到高密度。
在一个实施例中，培养基和无血清营养液用于脐带组织衍生细胞的生长。在另一个实施例中，培养基和无血清营养液适用于祖细胞的生长，该祖细胞包括但不限于间充质干细胞、骨髓衍生干细胞、衍生自胎盘组织的细胞、衍生自非骨髓组织诸如脂肪组织、肌肉组织、血管(包括胸廓内动脉衍生细胞)的贴壁细胞、衍生自牙齿的牙髓的细胞、衍生自羊水的细胞以及成纤维细胞(包括新生儿包皮成纤维细胞)。
A.培养基
本发明的一个方面是培养基，该培养基包含氨基酸、维生素、盐、核苷、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠、D-葡萄糖和丙酮酸钠。
在一个实施例中，培养基包含常见的L-氨基酸。在另一个实施例中，培养基包含下列氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、以及任选地L-半胱氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸。在一个另选实施例中，培养基包含各约0.0006g/L至约0.1g/L的氨基酸。
在又一个实施例中，培养基包含至少约0.1g/L的L-精氨酸、至少约0.05g/L的L-胱氨酸、至少约0.3g/L的L-谷氨酰胺、至少约0.02g/L的甘氨酸、至少约0.03g/L的L-组氨酸、至少约0.08g/L的L-异亮氨酸、至少约0.08g/L的L-亮氨酸、至少约0.1g/L的L-赖氨酸、至少约0.1g/L的L-甲硫氨酸、至少约0.05g/L的L-苯丙氨酸、至少约0.03g/L的L-丝氨酸、至少约0.08g/L的L-苏氨酸、至少约0.01g/L的L-色氨酸、至少约0.09g/L的L-酪氨酸、至少约0.07g/L的L-缬氨酸、以及任选地至少约0.007g/L的L-半胱氨酸、至少约0.0005g/L的L-丙氨酸、至少约0.02g/L的L-天冬酰胺、至少约0.006g/L的L-天冬氨酸、至少0.03g/L的L-谷氨酸、至少约0.01g/L的L-脯氨酸和至少约0.0006g/L的L-牛磺酸。
在一个另选实施例中，培养基包含约0.09705g/L的L-精氨酸、约0.06779g/L的L-胱氨酸、约0.009224g/L的L-半胱氨酸、约0.584g/L的L-谷氨酰胺、约0.031125g/L的甘氨酸、约0.048288g/L的L-组氨酸、约0.163713g/L的L-异亮氨酸、约0.163713g/L的L-亮氨酸、约0.16807g/L的L-赖氨酸、约0.036748g/L的L-甲硫氨酸、约0.073695g/L的L-苯丙氨酸、约0.05145g/L的L-丝氨酸、约0.108609g/L的L-苏氨酸、约0.018457g/L的L-色氨酸、约0.121813g/L的L-酪氨酸、约0.111105g/L的L-缬氨酸、约0.000668g/L的L-丙氨酸、约0.031978g/L的L-天冬酰胺、约0.0080g/L的L-天冬氨酸、约0.054728g/L的L-谷氨酸、约0.02403g/L的L-脯氨酸和约0.000844g/L的L-牛磺酸。
培养基还包含一种或多种维生素。在一个实施例中，培养基至少包含下列维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、以及任选地d-生物素、吡哆素、和维生素B12(氰钴胺)。培养基还可包含维生素C和维生素A。在另一个实施例中，培养基包含各约5×10-6g/L至约0.015g/L的维生素。在一个实施例中，培养基包含约0.004338g/L的D-泛酸钙、约0.006094g/L的氯化胆碱、约0.004302g/L的叶酸、约0.009568g/L的I-肌醇、约0.004302g/L的烟酰胺、约0.004153g/L的吡哆醛、约0.000431g/L的核黄素、约0.004304g/L的硫胺素、约3.75E-05g/L的d-生物素、约1.85E-05g/L的吡哆素和约0.000102g/L的维生素B12(氰钴胺)。
培养基还包含一种或多种无机盐。在一个实施例中，培养基包含氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和一种或多种磷酸钠盐。在另一个实施例中，培养基包含无水氯化钙、氯化钾、无水硫酸镁、磷酸二氢钠一水合物以及任选地磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4.7H2O)。根据所使用的盐的不同，培养基可包含至少约0.005g/L至至少约7g/L的盐。在一个实施例中，培养基包含至少约0.01g/L的无水氯化钙、至少约0.1g/L的氯化钾、至少约0.2g/L的硫酸镁、至少约0.08g/L的磷酸二氢钠一水合物以及任选地至少约0.0005g/L的磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4.7H2O)。在另一个实施例中，培养基包含约0.2g/L的无水氯化钙、约0.4g/L的氯化钾、约0.9767g/L的硫酸镁、至少约0.13g/L的磷酸二氢钠一水合物、约6.4g/L的氯化钠以及任选地至少约0.002g/L的磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4.7H2O)。
培养基还包含核苷。在一个实施例中，培养基包含核酸衍生物(核苷)：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷。在一个另选实施例中，培养基包含各至少约0.0001g/L至至少约0.02g/L的核苷。在一个实施例中，培养基包含至少约0.0001g/L的胸苷以及各至少约0.005g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷。在另一个实施例中，培养基包含约0.00045g/L的胸苷以及各约0.015g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷。
在一个实施例中，培养基还包含胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和硒酸钠。在另一个实施例中，培养基包含至少约0.003g/L的胰岛素。在另一个实施例中，培养基包含约0.01g/L的胰岛素。在一个另选实施例中，培养基包含至少约0.05g/L的转铁蛋白。在另一个实施例中，培养基包含约0.055g/L的转铁蛋白。在又一个实施例中，培养基包含至少约0.01g/L的乙醇胺。在一个另选实施例中，培养基包含约0.02g/L的乙醇胺。在一个实施例中，培养基包含至少约0.00004g/L的亚硒酸钠。在另一个实施例中，培养基包含约0.000067g/L的亚硒酸钠。在又一个实施例中，培养基不进一步包含胰岛素、转铁蛋白和乙醇胺。
本发明的一个实施例是培养基，该培养基包含：
氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；盐：氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和一种或多种磷酸钠盐；核苷(核酸衍生物)：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；胰岛素；转铁蛋白；乙醇胺；亚硒酸钠；和一种或多种能源。在一个实施例中，培养基包含各约0.0006g/L至约0.1g/L的氨基酸。在另一个实施例中，培养基包含至少约0.05g/L的L-精氨酸、至少约0.02g/L的L-胱氨酸、至少约0.2g/L的L-谷氨酰胺、至少约0.01g/L的甘氨酸、至少约0.02g/L的L-组氨酸、至少约0.09g/L的L-异亮氨酸、至少约0.09g/L的L-亮氨酸、至少约0.09g/L的L-赖氨酸、至少约0.02g/L的L-甲硫氨酸、至少约0.05g/L的L-苯丙氨酸、至少约0.03g/L的L-丝氨酸、至少约0.08g/L的L-苏氨酸、至少约0.009g/L的L-色氨酸、至少约0.08g/L的L-酪氨酸、至少约0.08g/L的L-缬氨酸、至少约0.005g/L的L-半胱氨酸、至少约0.0004g/L的L-丙氨酸、至少约0.01g/L的L-天冬酰胺、至少约0.006g/L的L-天冬氨酸、至少0.03g/L的L-谷氨酸、至少约0.005g/L的L-脯氨酸和至少约0.0003g/L的L-牛磺酸。在一个另选实施例中，培养基包含各约5×10-6g/L至约0.015g/L的维生素。在一个实施例中，培养基包含至少约0.005g/L的无水氯化钙、至少约0.1g/L的氯化钾、至少约02g/L的硫酸镁、至少约0.1g/L的磷酸二氢钠一水合物和至少约0.0005g/L的磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4.7H2O)。在另一个实施例中，培养基包含各至少约0.0001g/L至至少约0.02g/L的核苷。在一个实施例中，培养基包含至少约0.0001g/L的胸苷以及各至少约0.005g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷。在一个实施例中，培养基还包含至少0.005g/L的胰岛素和至少0.03g/L的转铁蛋白、至少0.01g/L的乙醇胺以及至少约0.00004g/L的亚硒酸钠。一种或多种能源可为D-葡萄糖和丙酮酸钠。
在另一个实施例中，培养基包含：(1)氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；(2)维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；(3)盐：氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和一种或多种磷酸钠盐；(4)核苷：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；(5)胰岛素；(6)转铁蛋白；(7)类脂酸/硫辛酸；(8)乙醇胺；(9)亚硒酸钠；和(10)一种或多种能源。
本发明的一个实施例是培养基，该培养基包含：氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；盐：氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和一种或多种磷酸钠盐；核苷(核酸衍生物)：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；类脂酸/硫辛酸；痕量矿物质：硝酸铁、硫酸铜、硫酸锌；和一种或多种能源。在一个实施例中，培养基包含各约0.0006g/L至约0.1g/L的氨基酸。在另一个实施例中，培养基包含至少约0.05g/L的L-精氨酸、至少约0.02g/L的L-胱氨酸、至少约0.2g/L的L-谷氨酰胺、至少约0.01g/L的甘氨酸、至少约0.02g/L的L-组氨酸、至少约0.09g/L的L-异亮氨酸、至少约0.09g/L的L-亮氨酸、至少约0.09g/L的L-赖氨酸、至少约0.02g/L的L-甲硫氨酸、至少约0.05g/L的L-苯丙氨酸、至少约0.03g/L的L-丝氨酸、至少约0.08g/L的L-苏氨酸、至少约0.009g/L的L-色氨酸、至少约0.08g/L的L-酪氨酸、至少约0.08g/L的L-缬氨酸、至少约0.005g/L的L-半胱氨酸、至少约0.0004g/L的L-丙氨酸、至少约0.01g/L的L-天冬酰胺、至少约0.006g/L的L-天冬氨酸、至少0.03g/L的L-谷氨酸、至少约0.005g/L的L-脯氨酸和至少约0.0003g/L的L-牛磺酸。在一个另选实施例中，培养基包含各约5×10-6g/L至约0.015g/L的维生素。在一个实施例中，培养基包含至少约0.01g/L的无水氯化钙、至少约0.1g/L的氯化钾、至少约0.2g/L的硫酸镁(无水)、至少约0.1g/L的磷酸二氢钠一水合物和至少约0.005g/L的磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4.7H2O)。在另一个实施例中，培养基包含各至少约0.0001g/L至至少约0.02g/L的核苷。在一个实施例中，培养基包含至少约0.0001g/L的胸苷以及各至少约0.005g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷。一种或多种能源可为D-葡萄糖和丙酮酸钠。
除了痕量矿物质亚硒酸钠之外，在某些实施例中，培养基还包含一种或多种另外的痕量矿物质。在一个实施例中，培养基还包含硝酸铁、硫酸铜和硫酸锌。在一个实施例中，培养基还包含硝酸铁(9H2O)、硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)和硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)。痕量矿物质可以各约5×10-8g/L至约3×10-4g/L的痕量矿物质范围内的量存在。在一个另选实施例中，培养基还包含约0.001g/L的硝酸铁(9H2O)、约9.33E-08g/L的硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)和3.24E-05g/L的硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)。
此外，培养基还可包含类脂酸/硫辛酸，其可包含至少约5×10-6g/L的溶液。在一个实施例中，培养基还包含约0.000015g/L的类脂酸/硫辛酸。
任选地，培养基还可包含腐胺、白蛋白、稳定剂和/或发泡剂。在一个实施例中，白蛋白是牛血清白蛋白。在一个实施例中，牛血清白蛋白以作为富含脂质的牛血清白蛋白的可商购获得的
Figure BDA0002528558190000162
I(GibcoTM细胞培养物，Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)的形式提供。在另一个实施例中，培养基还包含可商购获得的稳定剂/消泡剂
Figure BDA0002528558190000163
F68(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)。
培养基的示例性适合实施例示于下表中：
Figure BDA0002528558190000161
Figure BDA0002528558190000171
这些培养基还可包含牛血清白蛋白(BSA)、腐胺和
Figure BDA0002528558190000172
F68。具体地，对于实施例A，培养基还可包含3.02E-05g/L的腐胺、2.5g/L的BSA和0.015g/L的
Figure BDA0002528558190000173
F68。相似地，对于实施例B，无血清营养液还可包含至少约1E-05g/L的腐胺、1g/L的BSA和至少0.005g/L的
Figure BDA0002528558190000181
F68。在一个实施例中，培养基还包含腐胺和
Figure BDA0002528558190000182
F68，诸如3.02E-05g/L的腐胺、2.5g/L的BSA和0.015g/L的
Figure BDA0002528558190000183
F68。
本发明的培养基还可包含至少0.8g/L的D-葡萄糖和至少0.1g/L的丙酮酸钠。在一个实施例中，本发明的培养基还包含约1g/L的D-葡萄糖和约0.11g/L的丙酮酸钠。
在本发明的一个实施例中，培养基补充有血清，诸如胎牛血清(FBS)或新生牛血清(NCS)。血清含量可在0(无血清培养基)至20％培养基总体积的浓度范围内。在一个实施例中，培养基在培养基制备期间补充有血清(诸如FBS)。在另一个实施例中，培养基在紧接使用之前补充(诸如经由添加包含血清(例如FBS)的溶液)。在一个实施例中，培养基优选地补充有约2至15％(v/v)的FBS、或者约2至约10％、或者约3至约12％、或者约5至约15％、或者约4％至约10％。在所选实施例中，培养基补充有约7.5％、约10％或约15％(v/v)的FBS。
B.无血清营养液
本发明的另一个方面是无血清营养液，该无血清营养液包含：氨基酸、维生素、盐、核苷、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、和亚硒酸钠。如本文所用，就营养液而言，术语“无血清”意指在加入培养基之前营养液不包含血清。除非另有指明，针对无血清营养液的组分所公开的量基于无血清营养液已加入培养物中后每种组分的重量增加的测量值。
在一个实施例中，无血清营养液包含常见的20种L-氨基酸。在另一个实施例中，无血清营养液包含氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸以及任选的L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸。在一个实施例中，溶液包含各至少约0.0001g/L至至少约0.03g/L的这些氨基酸。在另一个实施例中，无血清营养液包含至少约0.005g/L的L-精氨酸、至少约0.002g/L的L-胱氨酸、至少约0.0003g/L的L-半胱氨酸、至少约0.0005g/L的甘氨酸、至少约0.002g/L的L-组氨酸、至少约0.01g/L的L-异亮氨酸、至少约0.01g/L的L-亮氨酸、至少约0.008g/L的L-赖氨酸、至少约0.002g/L的L-甲硫氨酸、至少约0.002g/L的L-苯丙氨酸、至少约0.002g/L的L-丝氨酸、至少约0.003g/L的L-苏氨酸、至少约0.0008g/L的L-色氨酸、至少约0.005g/L的L-酪氨酸、至少约0.005g/L的L-缬氨酸、至少约0.0001g/L的L-丙氨酸、至少约0.005g/L的L-天冬酰胺、至少约0.002g/L的L-天冬氨酸、至少约0.01g/L的L-谷氨酸、至少约0.008g/L的L-脯氨酸和至少约0.008g/L的L-牛磺酸。
在一个另选实施例中，无血清营养液包含约0.013g/L的L-精氨酸盐酸盐、约0.005g/L的L-胱氨酸二盐酸盐、约0.009g/L的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、约0.001g/L的甘氨酸、约0.006g/L的L-组氨酸盐酸盐一水合物、约0.059g/L的L-异亮氨酸、约0.059g/L的L-亮氨酸、约0.022g/L的L-赖氨酸盐酸盐、约0.007g/L的L-甲硫氨酸、约0.008g/L的L-苯丙氨酸、约0.009g/L的L-丝氨酸、约0.013g/L的L-苏氨酸、约0.002g/L的L-色氨酸、约0.018g/L的L-酪氨酸二钠盐二水合物、约0.018g/L的L-缬氨酸、约0.001g/L的L-丙氨酸、约0.032g/L的L-天冬酰胺一水合物、约0.008g/L的L-天冬氨酸、约0.055g/L的L-谷氨酸、约0.024g/L的L-脯氨酸和约0.0008的L-牛磺酸。这些氨基酸被认为能帮助补充培养中消耗的氨基酸。
无血清营养液还包含一种或多种维生素。在一个实施例中，无血清营养液至少包含下列维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)。溶液还可包含维生素C和维生素A。在一个实施例中，溶液包含各约5×10-6g/L至0.001g/L的一种或多种维生素。在一个实施例中，无血清营养液包含至少约0.0001g/L的D-泛酸钙、至少约0.0008g/L的氯化胆碱、至少约0.0001g/L的叶酸、至少约0.0008g/L的I-肌醇、至少约0.0001g/L的烟酰胺、至少约0.00005g/L的吡哆醛、至少约1×10-5g/L的核黄素、至少约0.00001g/L的硫胺素、至少约1×10-5g/L的d-生物素、至少约1×10-5g/L的吡哆素和至少约1×10-5g/L的维生素B12(氰钴胺)。在一个实施例中，无血清营养液包含约0.000338g/L D-泛酸钙、约0.002094g/L的氯化胆碱、约0.000302g/L的叶酸、约0.002568g/L的I-肌醇、约0.000302g/L的烟酰胺、约0.000153g/L的吡哆醛盐酸盐、约3.11E-05g/L的核黄素、约0.000304g/L的硫胺素盐酸盐、约3.75E-05g/L的d-生物素、约1.85E-05g/L的吡哆素盐酸盐和约0.000102g/L的维生素B12(氰钴胺)。
另外，无血清营养液包含一种或多种盐。在另一个实施例中，溶液包含约0.0005g/L至约0.001g/L的磷酸盐。在一个另选实施例中，溶液包含磷酸钠，诸如磷酸二氢钠和磷酸氢二钠七水合物。在又一个实施例中，溶液包含至少约0.005g/L的磷酸二氢钠和至少约0.001g/L的磷酸氢二钠七水合物。在一个另选实施例中，溶液包含约0.008g/L的磷酸二氢钠和约0.002g/L的磷酸氢二钠七水合物。
无血清营养液还包含核苷。在一个实施例中，无血清营养液包含核酸衍生物胸苷、腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷。在一个另选实施例中，溶液包含各至少约0.0001g/L至至少约0.005g/L的核苷。在一个实施例中，溶液包含至少约0.0001g/L的胸苷以及各至少约0.005g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷。在另一个实施例中，溶液包含约0.0005g/L的胸苷以及各约0.015g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷。
无血清营养液还包含胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠。在一个实施例中，溶液包含至少0.002g/L，或者约0.01g/L的胰岛素。在另一个实施例中，溶液包含至少约0.01g/L，或者约0.06g/L的转铁蛋白。在另选实施例中，溶液包含至少约0.005g/L，或者约0.02g/L的乙醇胺。在又一个实施例中，溶液包含至少约2×10-5g/L，或者约7×10-5g/L的亚硒酸钠。
除了痕量矿物质亚硒酸钠之外，在某些实施例中，无血清营养液还包含一种或多种另外的痕量矿物质。在一个实施例中，溶液包含各约3×10-8g/L至约2×10-5g/L的一种或多种另外的痕量矿物质。在一个实施例中，溶液还包含硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)和硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)。在另一个实施例中，溶液还包含至少约3×10-8g/L的硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)和至少约5×10-6g/L的硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)。在一个另选实施例中，溶液还包含约9×10-8g/L的硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)和约3×10-5g/L的硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)。
此外，除了脂质乙醇胺之外，无血清营养液还可包含类脂酸/硫辛酸，其可包含至少约1×10-5g/L溶液。
在本发明的一个实施例中，无血清营养液包含：
氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；
维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；
盐：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠七水合物；
核苷：腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；
胰岛素；转铁蛋白；乙醇胺；和亚硒酸钠。
无血清溶液可任选地还包含硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)和硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)。另外，无血清溶液可任选地还包含类脂酸/硫辛酸。在一个实施例中，溶液包含：(1)各约0.0001g/L至约0.03g/L的氨基酸；(2)各约0.00001g/L至约0.001g/L的维生素；(3)至少约5×10-6g/L的磷酸二氢钠和至少约0.001g/L的磷酸氢二钠七水合物；(4)至少约0.0001g/L的胸苷和各至少约0.005g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；(5)至少0.002g/L的胰岛素；(6)至少约0.03g/L的转铁蛋白；(7)至少约0.005g/L的乙醇胺；和(8)至少约5×10-5g/L的亚硒酸钠。任选地，溶液还包含(9)至少约7×10-8g/L的硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)；(10)至少约5×10-6g/L的硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)；和(11)至少约1×10-6g/L的类脂酸/硫辛酸。
在本发明的另一个实施例中，无血清营养液包含氨基酸、维生素、盐、核苷、硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)、硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)和类脂酸/硫辛酸。在该实施例中，溶液包含：
氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；
维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；
盐：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠七水合物；和
核苷：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷。
在一个实施例中，无血清营养液包含至少约0.005g/L的L-精氨酸、至少约0.002g/L的L-胱氨酸、至少约0.0003g/L的L-半胱氨酸、至少约0.0005g/L的甘氨酸、至少约0.002g/L的L-组氨酸、至少约0.01g/L的L-异亮氨酸、至少约0.01g/L的L-亮氨酸、至少约0.008g/L的L-赖氨酸、至少约0.002g/L的L-甲硫氨酸、至少约0.002g/L的L-苯丙氨酸、至少约0.002g/L的L-丝氨酸、至少约0.003g/L的L-苏氨酸、至少约0.0008g/L的L-色氨酸、至少约0.005g/L的L-酪氨酸、至少约0.005g/L的L-缬氨酸、至少约0.0001g/L的L-丙氨酸、至少约0.005g/L的L-天冬酰胺、至少约0.002g/L的L-天冬氨酸、至少约0.01g/L的L-谷氨酸、至少约0.008g/L的L-脯氨酸和至少约0.008g/L的L-牛磺酸。在另一个实施例中，该无血清营养液还包含至少约0.0001g/L的D-泛酸钙、至少约0.0008g/L的氯化胆碱、至少约0.0001g/L的叶酸、至少约0.0008g/L的I-肌醇、至少约0.0001g/L的烟酰胺、至少约0.00005g/L的吡哆醛、至少约1×10-5g/L的核黄素、至少约0.00001g/L的硫胺素、至少约1×10-5g/L的d-生物素、至少约1×10-5g/L的吡哆素和至少约1×10-5g/L的维生素B12(氰钴胺)。在一个另选实施例中，溶液还包含至少约0.0001g/L的胸苷以及各至少约0.01g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷。在另一个实施例中，溶液还包含至少约3×10-8g/L的硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)、约5×10-5g/L的硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)和约2×10-5g/L的类脂酸/硫辛酸。
任选地，无血清营养液还可包含腐胺、牛血清白蛋白、稳定剂和/或发泡剂。在一个实施例中，牛血清白蛋白以作为富含脂质的牛血清白蛋白的可商购获得的
Figure BDA0002528558190000223
I(GibcoTM细胞培养物，Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)的形式提供。在另一个实施例中，无血清营养液包含可商购获得的稳定剂/消泡剂
Figure BDA0002528558190000222
F68(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)。
无血清营养液的示例性适合实施例示于下表中：
Figure BDA0002528558190000221
Figure BDA0002528558190000231
Figure BDA0002528558190000241
这些无血清营养液还可包含牛血清白蛋白(BSA)、腐胺和
Figure BDA0002528558190000242
F68。具体地，对于实施例A，无血清营养液还可包含3.02E-05g/L的腐胺、2.5g/L的BSA和0.015g/L的
Figure BDA0002528558190000243
F68。相似地，对于实施例B，无血清营养液还可包含至少约1E-05g/L的腐胺、1g/L的BSA和至少0.005g/L的
Figure BDA0002528558190000244
F68。在一个优选的实施例中，无血清营养液还包含腐胺和
Figure BDA0002528558190000245
F68。
在实施例中，无血清营养液包含硒酸钠、乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、胸苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷和血清白蛋白(例如牛血清白蛋白)。
任选地，无血清营养液还可包含一种或多种能量底物，诸如葡萄糖和/或丙酮酸盐。
在本发明的一个实施例中，培养基和/或无血清营养液不包含外源添加的促进未分化细胞生长的因子。在一个优选的实施例中，培养基和/或无血清营养液不包含成纤维细胞生长因子，诸如碱性FGF或FGF-4。
II.人脐带组织衍生细胞(hUTC)
如以上在本发明的某些实施例中所讨论，培养基和无血清营养液可用于使分离的人脐带组织衍生细胞(“hUTC”或“UTC”)生长。适合与本发明的培养基、无血清营养液、试剂盒和方法一起使用的UTC和UTC群体详细描述于下文以及美国专利7,510,873、7,524,489、和美国公布申请2005/005863，所述专利全文以引用方式并入，因为它们涉及hUTC的描述、分离和表征。
A.脐带组织衍生细胞的分离和生长
根据本文所述的方法，哺乳动物脐带是在或足月或早产妊娠结束后或不久(例如，分娩后排出之后)回收的。产后组织可在无菌容器(诸如瓶、烧杯、培养皿或袋)中从分娩地点运输到实验室。容器可含有溶液或培养基，包括但不限于盐溶液，诸如杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)(也称为杜氏基本必需培养基(Dulbecco’s Minimal Essential Medium))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)或用于运输用于移植器官的任何溶液，诸如威斯康星大学溶液(University of Wisconsin solution)或全氟化合物溶液。可将一种或多种抗生素和/或抗真菌剂(诸如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素)添加到培养基或缓冲液中。可用抗凝血剂溶液诸如含肝素溶液冲洗产后组织。优选在提取UTC之前将组织保持在约4-10℃下。甚至更优选在提取UTC之前，组织不进行冷冻。
UTC的分离优选在无菌环境中发生。脐带可通过本领域已知的方法从胎盘分离。另选地，可在不分离的情况下使用脐带和胎盘。血液和碎片优选在UTC分离前从产后组织中去除。例如，可用缓冲液溶液(包括但不限于磷酸盐缓冲盐水)洗涤产后组织。洗涤缓冲液也可包含一种或多种抗真菌剂和/或抗生素，包括但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。
通过机械力(切断力或剪切力)分解包含脐带或其片段或区段的产后组织。在目前优选的实施例中，分离程序也利用酶消化工艺。许多酶是本领域已知的用于从复合组织基质分离个体细胞以有利于在培养物中生长。消化酶涵盖了弱消化的(例如脱氧核糖核酸酶和中性蛋白酶、分散酶)至强消化的范围(例如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)并且是可商购获得的。随同相容的酶的不完全列表包括粘液溶解酶活性、金属蛋白酶、中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶)和脱氧核糖核酸酶。目前优选的是选自金属蛋白酶、中性蛋白酶和溶解粘液的活性材料的酶活性材料。例如，已知胶原酶用于从组织分离多种细胞。脱氧核糖核酸酶可消化单链DNA且可在分离期间使细胞凝聚降到最低。优选的方法涉及用例如胶原酶和分散酶，或胶原酶、分散酶和透明质酸酶的酶促处理。在某些实施例中，在解离步骤中使用胶原酶和中性蛋白酶分散酶的混合物。更具体的实施例采用在来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的至少一种胶原酶，和蛋白酶活性材料、分散酶和嗜热菌蛋白酶中的任一种的存在下的消化。在另一些其他实施例中，用胶原酶和分散酶的酶活性材料两者进行消化。也利用了包括用除了胶原酶和分散酶活性材料之外的透明质酸酶活性材料消化的方法。技术人员将认识到，本领域已知用于从多种组织来源中分离细胞的多种此类酶处理。例如，以商品名LIBERASE(Roche,Indianapolis,Ind.)销售的用于组织解离的酶共混物适用于本发明方法。酶的其他来源是已知的，并且技术人员还可从它们天然来源直接获得此类酶。技术人员也拥有齐全的设备来评价新的或附加的酶或酶组合在它们分离本发明细胞方面的用途。优选的酶处理为0.5、1、1.5或2小时长或更长。在其他优选的实施例中，解离步骤的酶处理期间在37℃下温育组织。
在本发明的一些实施例中，将产后组织分成包含组织的多个部分(例如诸如新生儿、新生儿/母体、以及胎盘的母体部分)的区段。然后，根据本文所述的方法通过机械和/或酶解离来解离分离的部分。新生儿或母体谱系细胞可通过本领域已知的任何方法(例如，通过针对Y染色体的核型分析或原位杂交)来鉴定。
分离的细胞或UTC由其衍生的脐带组织可用于引发、或接种细胞培养物。将分离的细胞转移到无菌组织培养容器中，该无菌组织培养容器未涂布或涂布有细胞外基质或配体，诸如层粘连蛋白、胶原(天然、变性或交联的)、明胶、纤连蛋白及其他细胞外基质蛋白。除本文公开的培养基之外，还可将UTC培养在能够维持细胞生长的任何培养基中，诸如但不限于DMEM(高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB 201、伊格尔基础培养基、Ham’s F10培养基(F10)、Ham’s F-12培养基(F12)、伊斯科夫改良达尔贝科培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和以商品名CELL-GRO-FREE(Mediatch,Inc.,Herndon,Va.)销售的不含血清/介质的培养基。培养基可补充有一种或多种组分，包括例如胎牛血清(FBS)，优选约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS)；β-巯基乙醇(BME或2-ME)，优选约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸，包括L-缬氨酸；以及用于控制微生物污染的单独或组合的一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，诸如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。培养基可包括如实例中定义的生长培养基。
将细胞以允许细胞生长的密度接种在培养容器中。在一个优选的实施例中，细胞在占空气约0至约5体积％的CO2下培养。在一些优选的实施例中，细胞在占空气约2至约25％的O2下，优选占空气约5至约20％的O2下培养。细胞优选地在约25至约40℃的温度下培养，并且更优选地在37℃下培养。细胞优选地在培养箱中培养。培养容器中的培养基可以是静止的，也可例如使用生物反应器搅动。UTC优选在低氧化性应激下生长(例如，伴随谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸的添加)。“低氧化性应激”指对培养的细胞无自由基损伤或最低限度的自由基损伤的条件。
用于选择最适当的培养基、培养基制剂和细胞培养技术的方法是本领域为人们所熟知的，并且在多种来源中描述，包括Doyle等人(编辑)，1995，Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures，John Wiley&Sons,Chichester；以及Ho和Wang(编辑)，1991，Animal Cell Bioreactors，Butterworth-Heinemann,Boston，所述参考文献以引用的方式并入本文。
在将分离的细胞或组织片段培养足够时期后，UTC将由于来自产后组织的迁移或细胞分裂或两者而长出。在本发明的一些实施例中，将UTC传代或取出到分开的培养容器中，该培养容器含有与最初使用的培养基相同或不同类型的新鲜培养基，细胞群可在该培养容器中以有丝分裂方式扩增。本发明的细胞可在0代和衰老之间的任何时间点使用。细胞优选传代约3至约25次，更优选传代约4至约12次，并且优选传代10或11次。可进行克隆和/或亚克隆以确认已分离出无性细胞群。
在某些实施例中，产后组织中存在的不同细胞类型分级成由其可分离UTC的亚群。可使用标准细胞分离技术完成分级或选择，包括但不限于酶促处理以将产后组织解离成其组分细胞，然后克隆和选择特定的细胞类型，包括但不限于基于形态标志物和/或生物化学标志物的选择；期望细胞的选择性生长(阳性选择)、不需要细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于例如使用大豆凝集素在混合群体中的差异细胞凝集性的分离；冻-融工艺；混合群体中的细胞的附着性差异；过滤；常规和区带离心；离心淘洗(逆流离心)；单位重力分离；逆流分配；电泳；以及荧光激活细胞分选(FACS)来实现分级或选择。关于克隆选择和细胞分离技术的综述，参见Freshney，1994，Culture of Animal Cells：A Manual of BasicTechniques，第3版，Wiley-Liss,Inc.,New York，所述参考文献以引用方式并入本文。
培养基根据需要进行更换，例如，通过例如用移液器小心地从培养皿中抽出培养基并且补充新鲜培养基。继续温育直至培养皿中积聚足够数量或密度的细胞。可去除原始外植入组织部分，并且剩余细胞使用标准技术或使用细胞刮刀进行胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化之后，收集细胞，移至新鲜培养基中并如上温育。在一些实施例中，胰蛋白酶化后约24小时将培养基更换至少一次以去除任何漂浮的细胞。培养物中剩余的细胞视为UTC。
UTC可进行冷冻保存。因此，用于自体转移(用于母亲或孩子)的UTC可衍生自孩子出生后的适当产后组织，然后冷冻保存以便可在它们以后需要移植的情况下使用。
B.脐带组织衍生细胞的特征
UTC可通过例如下列进行表征：生长特征(例如群体倍增能力、倍增时间、至衰老的传代数)、核型分析(例如正常核型；母体或新生儿谱系)、流式细胞术(例如FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如用于检测表位)、基因表达谱(例如基因芯片阵列；聚合酶链反应(例如，逆转录酶PCR、实时PCR和常规PCR))、蛋白质阵列、蛋白质分泌(例如，通过PDC条件培养基的血浆凝固测定法或分析，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA))、混合淋巴细胞反应(例如，作为PBMC刺激的量度)和/或本领域已知的其他方法。
衍生自脐组织的合适UTC的例子于2004年6月10日保藏在美国典型培养物保藏中心(10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110)，并且指定如下ATCC登录号：(1)菌株名称UMB 022803(P7)被指定为登录号PTA-6067；并且(2)菌株名称UMB 022803(P17)被指定为登录号PTA-6068。
在各种实施例中，UTC具有下列生长特点中的一种或多种：(1)它们需要L-缬氨酸用于在培养中生长；(2)它们能够在包含约5％至至少约20％的氧气的大气中生长；(3)在衰老之前，它们在培养中具有至少约40倍增的潜能；以及(4)它们在涂布或未涂布组织培养容器上附着和扩增，其中该涂布组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、多鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的涂层。
在某些实施例中，UTC具有在细胞传代时维持的正常核型。染色体核型分析的方法是本领域技术人员可利用且已知的。
在其他实施例中，UTC可通过产生某些蛋白质来表征，包括(1)产生组织因子、波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白中的至少一种；以及(2)产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A,B,C细胞表面标志物中的至少一种，如通过流式细胞术检测的。在其他实施例中，UTC可通过下列进行表征：缺乏CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR,DP,DQ细胞表面标志物中的至少一种的产生，如通过流式细胞术检测的。特别优选的是产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少两种的细胞。更优选的是产生蛋白组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中所有三种的那些细胞。
在其他实施例中，UTC可通过基因表达来表征，相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，该基因表达对于编码下述中的至少一种的基因是增加的：白介素8；浆膜蛋白1；趋化因子(C-X-C基序)配体1(黑素瘤生长刺激活性，α)；趋化因子(C-X-C基序)配体6(粒细胞趋化蛋白2)；趋化因子(C-X-C基序)配体3；以及肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白3。
在另外其他实施例中，UTC可通过下列进行表征：相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，基因表达对于编码下列中的至少一种的基因是增加的：矮小同源盒2；热休克27kDa蛋白2；趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞衍生因子1)；弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄，威廉斯-博伊伦综合征)；智人，mRNA；cDNA DKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022)；间充质同源盒2(生长终止特异性同源盒)；sine oculis同源盒同源物1(果蝇属)晶状体蛋白，αB；形态发生紊乱关联激活因子2；DKFZP586B2420蛋白；类似于neuralin 1；四连接素(纤溶酶原结合蛋白)；src同源三(SH3)和富含半胱氨酸的域；胆固醇25-羟化酶；runt相关转录因子3；白介素11受体，α；前胶原C-肽链内切酶增强子；卷曲同源物7(果蝇属)；假设基因BC008967；胶原，VIII型，α1；腱生蛋白C(hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白5；膜铁转运辅助蛋白；整联蛋白，β8；突触小泡糖蛋白2；成神经细胞瘤，抑制瘤变蛋白1；胰岛素样生长因子结合蛋白2，36kDa；智人cDNA FLJ12280 fis，克隆MAMMA1001744；细胞因子受体样因子1；钾中间/小电导钙活化通道，亚族N，成员4；整联蛋白，β7；具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)；sine oculis同源盒同源物2(果蝇属)；KIAA1034蛋白；囊泡相关膜蛋白5(肌短蛋白)；含EGF腓骨蛋白样细胞外基质蛋白1；早期生长反应因子3；远端缺失同源盒5；假定蛋白FLJ20373；醛酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶，II型)；双糖链蛋白聚糖；具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)；纤粘蛋白1；前脑啡肽；整联蛋白，β样1(具有EGF样重复域)；智人mRNA全长插入cDNA克隆EUROIMAGE1968422；EphA3；KIAA0367蛋白；尿钠排泄肽受体C/鸟苷酸环化酶C(利尿钠排泄肽受体C)；假定蛋白FLJ14054；智人，mRNA；cDNA DKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222)；BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3样；AE结合蛋白1；以及细胞色素c氧化酶VIIa亚基多肽1(肌肉)。
在其他实施例中，UTC可在培养时通过下列来表征：分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、MDC、RANTES和TIMP1中的至少一种。此外，UTC可在培养时通过下列来表征：没有分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1A和VEGF中的至少一种，如ELISA所检测。
在一些实施例中，UTC衍生自基本上不含血液的脐带组织，并且能够在培养中自我更新和扩增，并且生长需要L-缬氨酸，并且可生长在至少约5％的氧气中，并且包括下列特征中的至少一种：在培养中至少约40倍增的潜能；在涂布或未涂布组织培养容器上附着和扩增，该组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、多鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的涂层；产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白；产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90；以及相对于人细胞的基因表达对于编码白介素8和浆膜蛋白1的基因是提高的，该人细胞是成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞。在一些实施例中，此类UTC不产生CD45和CD117。
在优选的实施例中，细胞具有上文列出的生长、蛋白质/表面标志物产生、基因表达或物质分泌特征中的两种或更多种。更优选的是包含特征中的三种、四种、五种或更多种的细胞。还更优选的是包含特征中的六种、七种、八种或更多种的UTC。目前还更优选的是包含所有上述特征的细胞。
在目前优选与本发明多个方面一起使用的细胞中有具有上述特征的产后细胞，并且更具体地是这样的细胞：其中细胞具有正常核型并随传代进行，保持正常核型，并且进一步地，其中细胞表达标志物CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A,B,C中的每一种，其中细胞产生免疫学可检测的对应于所列标志物的蛋白质。更优选的是这样的细胞：其除了前述之外，不产生对应于标志物CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR,DP,DQ中的任何一种的蛋白质，如通过流式细胞术检测。
在一个实施例中，UTC分离自基本上不含血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，具有分化的潜能，缺乏CD117或CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。这些UTC任选地表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或不表达CD31或CD34；和/或相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。
在另一个实施例中，UTC分离自基本上不含血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，具有分化的潜能，表达CD13和CD90，并且不表达CD34和CD117。任选地，这些细胞不表达hTERT或端粒酶。在又一个实施例中，细胞还表达CD10、CD44和CD43。在一个另选实施例中，细胞还不表达CD45和CD31。这些UTC任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1。
在另一个实施例中，UTC分离自基本上不含血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，具有分化的潜能，表达CD13、CD90和HLA-ABC，并且不表达CD34、CD117和HLA-DR。任选地，这些细胞不表达hTERT或端粒酶。在一个实施例中，细胞还表达CD10、CD44和CD43。在一个另选实施例中，细胞还不表达CD45和CD31。这些UTC任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1。
在另选实施例中，UTC分离自基本上不含血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，具有分化的潜能，并且具有下列特征：(1)表达CD10、CD13、CD44、CD90和HLA-ABC；(2)不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD117；以及(3)不表达hTERT或端粒酶。在另选实施例中，UTC分离自基本上不含血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，具有分化的潜能，并且具有下列特征：(1)表达CD10、CD13、CD44、CD90和HLA-ABC；(2)不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD117；(3)不表达hTERT或端粒酶；(4)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3、和/或粒细胞趋化蛋白；以及(4)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1。
在一个实施例中，hUTC作为细胞群提供，该细胞群可以是同质的。在一些实施例中，细胞群可以是异质的。本发明的异质细胞群可包含至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％本发明的UTC。本发明的异质细胞群还可包含干细胞或其他祖细胞，例如成肌细胞或其他肌肉祖细胞、成血管细胞或血管前体细胞；或它还可包含完全分化的骨骼肌细胞、平滑肌细胞、外膜细胞或血管内皮细胞。在一些实施例中，该群体是基本上同质的，即基本上仅包含UTC(优选至少约96％、97％、98％、99％或更多UTC)。本发明的同质细胞群由脐衍生的细胞组成。脐衍生的细胞的同质群体优选地不含母体谱系的细胞。同质细胞群可通过本领域已知的任何方法实现，例如通过细胞分选(如流式细胞术)或通过根据已知的方法的无性扩增。同质UTC群体可包含产后衍生的细胞的克隆细胞系。
在一个实施例中，培养后的hUTC具有与培养前的hUTC基本上相同的特征(例如标志物谱和/或基因表达谱)。在一个另选实施例中，培养后的hUTC具有与培养前的hUTC相同的特征(例如标志物谱和/或基因表达谱)。在一个实施例中，至少对于CD13、CD34、CD90和CD117而言，培养后的hUTC具有与培养前的hUTC相同的特征。
III.其他合适的细胞
如以上在本发明的某些实施例中所讨论，培养基和无血清营养液可用于使分离的人脐带组织衍生细胞(“hUTC”或“UTC”)生长。此外，培养基和无血清营养液可用于使其他锚着依赖性细胞生长。
在本发明的一个实施例中，培养基和无血清营养液用于使其他锚着依赖性细胞诸如衍生自胎盘的细胞生长。其他锚着依赖性细胞的例子包括但不限于骨髓衍生间充质干细胞、间充质干细胞的骨髓衍生祖细胞、衍生自非骨髓组织诸如脂肪组织、肌肉组织、血管(包括胸廓内动脉衍生细胞)的细胞、衍生自牙齿的牙髓的细胞。另外，已表明羊水是锚着依赖性干细胞的极为丰富来源。锚着依赖性细胞的另一个例子是成纤维细胞，包括新生儿包皮成纤维细胞。
IV.培养的方法
本发明的另一个实施例是培养细胞的方法，该方法包括使用本发明的条件培养基和无血清营养液。该方法可利用滚瓶、旋转瓶和/或微载体。在优选的实施例中，该方法用于培养锚着依赖性细胞，诸如hUTC细胞，并且需要微载体。
在一个优选的实施例中，该方法包括用本发明的条件培养基和无血清营养液培养hUTC，而无需血清更换。如上文所讨论，UTC可在多种培养基中生长。本发明的方法最佳地减少了血清使用量并提高了容积生产率，从而降低了制造包含锚着依赖性细胞例如hUTC的组合物的成本。此外，该方法允许在不进行培养基更换的情况下使细胞(例如hUTC)生长。
使细胞在滚瓶和微载体中生长的示例性方法分别公开于美国公布申请2007/0141700和2008/0166328中，所述申请全文以引用方式并入本文，因为其涉及滚瓶、微载体以及滚瓶和微载体上的培养的描述。示例性的合适滚瓶、旋转瓶、微载体、其特征以及合适培养参数在下文中有所讨论。
A.滚瓶
滚瓶培养系统是细胞培养领域已知的。如本文所用，滚瓶培养系统至少包括所关注细胞系、生长培养基、滚瓶、用于使瓶旋转的设备以及用于收获细胞的装置。
滚瓶培养系统通常还包括用于在温育期间控制温度的装置，以及用于例如在瓶中初始接种细胞期间或在后续转移期间无菌操作培养物的装置。细胞的收获可通过酶处理来实现，诸如使用胰蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA、分散酶和胶原酶，或其他酶或者酶与或不与其他组分的组合。可利用其他商品，诸如但不限于TrypLETM Express(Gibco,Inc.)。细胞也可通过人工操作(包括例如分批离心)来收获，或者收获可自动化。
在一个实施例中，在瓶中充入约100-300ml的生长培养基，在其他实施例中，使用约100-200ml。在一个另选实施例中，将约100-120ml或甚至105-115ml置于瓶中。在其他实施例中，在瓶中充入约112ml的生长培养基以实现最大群体倍增。在一个实施例中，以约2,500至约10,000个细胞/cm2对瓶进行接种。在一个实施例中，使用该范围的下端，例如以少于约3000个细胞/平方厘米进行接种。在附着和生长期间旋转接种瓶。可将旋转速度设定在约0.5至1rpm之间。优选地，转速在约0.75与1rpm之间。更优选地，将瓶以约0.8至1rpm旋转。
在另一个实施例中，在滚瓶中充入约100-300ml的生长培养基，优选地使用约300ml。以约2500至约10,000个细胞/平方厘米对瓶进行接种。在一个实施例中，使用该范围的下端，例如以少于约3000个细胞/平方厘米进行接种。还更优选的是其中以约2500个细胞/cm2进行接种的实施例。在附着和生长期间旋转接种瓶。将旋转速度设定在约0.5至1rpm之间。优选地，转速在约0.75与1rpm之间。更优选地，将瓶以约0.8至1rpm旋转。目前优选的是接近或约0.9-1.0rpm的转速。
将填充和接种的滚瓶旋转并温育约5至7天以实现最大倍增。目前，约5.5至约6.5天的温育时间是优选的。
滚瓶可涂布有帮助细胞附着于滚瓶的内表面的试剂，诸如明胶、细胞外基质分子(诸如明胶、层粘连蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白I、IV和VI型)等。此类可商购获得的涂布瓶的一个例子是涂布有CellBind(以目录号3907得自Corning)的瓶。可以设想，根据本文提供的方法，将发现各种涂布剂对于细胞附着和生长都是可接受的。
B.旋转瓶
旋转瓶培养系统也是细胞培养领域已知的。如本文所用，旋转瓶培养系统至少包括所关注细胞系、生长培养基、一个或多个旋转瓶、用于使一个或多个瓶旋转的装置以及用于收获细胞的装置。
旋转瓶培养系统通常还包括用于在温育期间控制温度的装置，以及用于例如在瓶中初始接种细胞期间或在后续转移期间无菌操作培养物的装置。细胞的收获可通过酶处理来实现，诸如使用胰蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA、分散酶和胶原酶，或其他酶或者酶与或不与其他组分的组合。可利用其他商品，诸如但不限于TrypLETM Express(Gibco,Inc.)。细胞也可通过人工操作(包括例如分批离心)来收获，或者收获可自动化。
在一个实施例中，将旋转速度设定在约35至约65rpm之间，或者在约35与45rpm之间，或者在约40与约50rpm之间，或者在约45rpm与约55rpm之间，或者在约55至约65rpm之间，或者约50至约60rpm。在优选的实施例中，保持约40rpm或60rpm的旋转速度。
在一个实施例中，使用3L旋转瓶，其可填充有大约3L的生长培养基、FBS、无血清营养液、微载体和细胞。在该实施例中，可将旋转速度设定在约35与45rpm之间。优选地，转速为约40rpm。
在另一个实施例中，使用125ml瓶。这些瓶可填充有大约100ml的溶液，该溶液包含生长培养基、FBS、无血清营养液、微载体和细胞。在一个实施例中，这些瓶包含大约85ml至115ml的生长培养基、FBS、无血清营养液、微载体和细胞。在该实施例中，可将旋转速度设定在约55与65rpm之间。优选地，转速为约50rpm。
在又一个实施例中，使用500ml的旋转瓶。这些瓶可填充有大约500ml的溶液，该溶液包含生长培养基、FBS、无血清营养液、微载体和细胞。在一个实施例中，这些瓶包含大约450ml至500ml的生长培养基、FBS、无血清营养液、微载体和细胞。在该实施例中，可将旋转速度设定在约55与65rpm之间。优选地，转速为约50rpm。
在一个另选实施例中，使用500ml的旋转瓶。这些瓶可填充有大约500ml的溶液，该溶液包含生长培养基、FBS、无血清营养液、微载体和细胞。在一个实施例中，这些瓶包含大约450ml至500ml的生长培养基、FBS、无血清营养液、微载体和细胞。在该实施例中，可将旋转速度设定在约35与45rpm之间。优选地，转速为约40rpm。
可以约2,500至约10,000个细胞/cm2对瓶进行接种。细胞可直接接种到瓶中，接种在瓶的表面上，或接种在置于瓶中的微载体上。在优选的实施例中，以约3,000至约7,500、或者以约3,000至约7,000、或者以约4,000至约7,000、或者以约3,000至约5,000、或者以约5,000至约7,000、或者以约3,500至约5,000、或者以约4,500至约7,500、或者约3,500至约5,500个细胞/cm2进行接种。在附着和生长期间旋转瓶。在一个实施例中，为了使群体倍增率最大化，将填充和接种的瓶旋转并温育约5至7天，其中约5至约6天的温育时间是优选的。
C.微载体
微载体培养是这样一种技术，其使锚着依赖性细胞例如锚着依赖性产后细胞的实际高收率培养成为可能。已在数毫升到大于一千升范围内的培养体积中专门针对细胞诸如哺乳动物产后细胞的培养开发了微载体。微载体是生物惰性的且为搅拌微载体培养提供了牢固但非刚性的基底。微载体可为透明的，从而允许附着细胞的显微镜检查。
Figure BDA0002528558190000361
3(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway N.J.)由与交联右旋糖酐的基质化学偶联的变性胶原蛋白的薄层组成。
Figure BDA0002528558190000362
3上的变性胶原蛋白层易被多种蛋白酶(包括胰蛋白酶和胶原酶)消化，并且提供从微载体移除细胞的能力，同时保持最大细胞活力、功能和完整性。
可使用无蛋白微载体来培养细胞。例如，用于制造和实验室或研究用途的以商品名
Figure BDA0002528558190000363
(SoloHill Engineering,Inc.,Ann Arbor,MI)销售的微载体小珠是改性聚苯乙烯小珠，其中阳离子三甲基铵附接到表面以便为微载体提供带正电的表面。小珠直径可在约90至约200μm直径的范围内。
细胞培养的基于微载体的方法提供多个优点，包括在多种应用中易于下游加工。微载体通常大致为球形形状，并且可为多孔或实心的。使用微载体使细胞附着有利于使用搅拌罐和相关反应器使锚着依赖性细胞生长。细胞附着于易于悬浮的微粒。可悬浮性的要求限制了微载体的物理参数。因此，微载体一般具有50-2000μm范围内的平均直径。在一些应用中，实心型微载体在约100至约250μm的范围内，而多孔型微载体小珠在约250至约2500μm的范围内。这些尺寸范围允许选择这样的微载体，该微载体足够大以适应许多锚着依赖性细胞，同时足够小以形成具有适用于搅拌反应器的特性的悬浮液。
在使用微载体小珠等中考虑的因素包括：附着效率、免疫原性、生物相容性、生物降解的能力、达到汇合的时间、附着细胞的生长参数(包括每单位表面积的最大可达到密度、需要时的脱离技术和脱离效率)、培养条件的可放大性以及在放大条件下培养物的均质性、成功放大脱离程序的能力及小珠是否将用于植入。这些考虑因素可受到微载体小珠的表面特性以及微载体的孔隙度、直径、密度和处理特性的影响。
例如，微载体颗粒或小珠的密度是一个考虑因素。过大密度可造成微载体颗粒或小珠从悬浮液中沉淀出来，或趋于保持完全朝向培养容器的底部，因此可导致反应器中细胞、培养基和气相的较差整体混合。另一方面，太低的密度可导致微载体过量漂浮。1.02至1.15g/cm3的密度是许多微载体小珠特有的。
微载体颗粒的小直径和可加入反应器中的颗粒的体积允许微载体贡献大量表面积，大大超过滚瓶中或使锚着依赖性细胞生长的其他方法(例如平板上)所发现的。多孔微载体提供每单位体积或重量甚至更大的表面积。这些多孔微载体具有可供锚着依赖性细胞生长的大腔体。这些腔体大大增加了表面积，并且可保护细胞免于有害机械效应，诸如剪切应力(例如来自混合或来自气体鼓泡)。
微载体表面可被纹理化以增强细胞附着和增殖。可通过包括但不限于模塑、浇铸、浸出和蚀刻的技术实现微载体表面纹理。纹理化表面的特征的分辨率可为纳米级。纹理化表面可用于诱导微载体表面上的特定细胞排列。多孔微载体内的孔的表面也可被纹理化以增强细胞附着和增殖。可通过诸如但不限于模塑、浇铸、浸出和蚀刻的技术实现孔表面纹理。
微载体表面可被等离子体涂布以将比电荷赋予微载体表面。这些电荷可增强细胞附着和增殖。
在其他实施例中，微载体包含或涂布有热响应聚合物例如聚-N-异丙基丙烯酰胺或具有机电特性。微载体也可具有微电流，诸如具有产生低水平生物学相关电的锌和铜的颗粒电偶的微载体。微载体可为顺磁性的，诸如顺磁性的海藻酸钙微载体。
多孔型和实心型微粒载体均可商购获得。可商购获得的实心微载体的例子包括
Figure BDA0002528558190000382
1和
Figure BDA0002528558190000381
3，两者均为得自GE Healthcare Life Sciences的基于右旋糖酐的微载体。合适的可商购获得的多孔微载体包括得自GE Healthcare Life Sciences,Biosilon(NUNC)和
Figure BDA0002528558190000383
(Percell Biolytical)的CytolineTM和CytoporeTM。
在某些实施例中，本发明的方法和试剂盒利用近似粒度为约60-90μm且在25℃下的密度为约1.03g/cm3的右旋糖酐小珠微载体。在其他实施例中，本发明的方法和试剂盒利用近似粒度为约114-198μm且在25℃下的密度为约1.04g/cm3的右旋糖酐小珠微载体。在又一个实施例中，本发明的方法和试剂盒利用近似粒度为约60-87μm且在25℃下的密度为约1.04g/cm3的右旋糖酐小珠微载体。在一个另选实施例中，本发明的方法和试剂盒利用多孔微载体。这些多孔微载体可具有约200-280μm的粒径、约1.1m2/g干重的有效表面积和约30μm的平均孔径开口。在其他实施例中，本发明的方法和试剂盒利用具有胺处理的表面的微载体。在优选的实施例中，具有胺处理的表面的微载体具有约160-200μm的粒度、约1.090-1.150的相对密度范围、约515cm2/g的表面积。此类微载体可以包含5.5×105微载体/g的溶液形式提供。
载体颗粒也可包含生物活性剂。载体颗粒也可包含可调控细胞或组织环境的生长或功能的生物活性剂或因子。合适的因子包括但不限于成纤维细胞生长因子、促红细胞生成素、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子和胰岛素样生长因子。可使用完整因子、其类似物或活性片段。
D.方法
通常，本发明的方法包括在已补充有血清(例如FBS)的本发明培养基中培养(例如扩增)细胞。在细胞已生长到期望密度(例如，生长约3-4天时间)后，加入无血清营养液。细胞可为锚着依赖性细胞，其可接种于微载体上。可在滚瓶或旋转瓶培养系统中进行培养。优选地，当锚着依赖性细胞接种于微载体上时，使用旋转瓶培养系统。期望时间段由诸如期望群体密度、期望群体倍增或时间之类的参数决定。在某些实施例中，将细胞培养4至7天，并且在约第3天加入无血清营养培养基。在其他实施例中，在加入无血清营养液之前使细胞生长1-2天或达到群体倍增或直到实现期望的初始群体密度。如上文所讨论，该方法允许在不进行培养基更换的情况下使细胞(例如hUTC)生长。
1.培养分离的锚着依赖性细胞的方法
本发明的一个实施例是用于培养(例如扩增)锚着依赖性细胞的方法。该方法包括在已补充有血清的本发明培养基中培养接种于组织瓶表面上或优选地微载体上的分离的锚着依赖性细胞，以及在细胞已生长一段足够的时间而实现期望的初始群体密度后加入无血清营养液。在一个实施例中，在加入无血清营养液之前，细胞生长时间介于约3与约7天之间、或者介于约3与约5天之间、或者介于约4天与约5天之间。在一个实施例中，在加入无血清营养液之前，细胞生长约3天。在另一个实施例中，在加入无血清营养液之前，使细胞生长到实现至少一次或两次群体倍增。在一个优选的实施例中，将细胞接种于本文公开的任何微载体上并生长于上述条件下的旋转瓶中。在一个实施例中，该方法包括解冻包含这些细胞的细胞库瓶以及扩增细胞以接种制备容器。另一个实施例包括首先分离细胞然后接种分离的细胞的步骤。
如所讨论，培养基(包括这些方法中使用的培养基)可补充有约2％至约20％的血清(例如FBS)。在一个实施例中，培养基在培养基制备期间补充有血清(诸如FBS)。在另一个实施例中，培养基在使用之前即刻补充(诸如经由添加包含血清(例如FBS)的溶液)。在另一个实施例中，培养基补充有优选地约2至15％(v/v)的FBS、或者约2至约10％、或者约3至约12％、或者约5至约15％、或者约4％至约10％。在所选实施例中，培养基补充有约7.5％、约10％或约15％(v/v)的FBS。
在另一个实施例中，该方法还涵盖接种锚着依赖性细胞。虽然目标接种密度可有所变化，但在某些实施例中，在约12至约30、或者约12至20、或者约18至约25、或者约15至约23g/L的微载体浓度下，接种约5,000至约8,000、或者约5,500至约7,500、或者约6,000至约8,000、或者约6,500至约7,500个活细胞/cm2。
2.培养分离的脐带组织衍生细胞的方法
本发明的一个实施例是培养脐带组织衍生细胞的方法。虽然该方法一般包括培养上文讨论的分离的锚着依赖性细胞的方法的步骤，但可存在一些变型。因此，本发明的一个实施例是一种通过使生长培养基富含无血清营养液，在旋转瓶中的悬浮培养中将附着于微载体上的分离的锚着依赖性hUTC培养到高细胞密度的方法。该方法最佳地消除了培养基更换(例如，在第3天)的需要，使细胞始终以>20,000个细胞/cm2生长。此外，该方法改善了hUTC传代的稳健性。该方法利用本发明的培养基和无血清营养液。
该方法包括将接种于微载体上的分离的hUTC在补充有血清(例如FBS)的本发明培养基中培养一段足够的时间以允许细胞达到期望的初始群体密度。在某些实施例中，使用培养基实施例A、B或C。在某些实施例中，将细胞培养于滚瓶中并在滚瓶系统上进行培养。在优选的实施例中，将细胞接种于微载体上，培养于旋转瓶中并在旋转瓶系统中进行培养。在一个实施例中，将细胞在大约37℃下于10％的CO2气氛下温育。
在另一个实施例中，瓶以约55至约65rpm、或者约55rpm至约60rpm、或者约58rpm至约61rpm的速率旋转。在另一个实施例中，瓶以约35rpm至约45rpm、或者约38rpm至约42rpm、或者约40rpm至约43rpm、或者约36rpm至约45rpm的速率旋转。在另一个实施例中，培养基中的微载体密度为约11.0至约13.0g/L。
在一个实施例中，将hUTC在大约37℃下于10％的CO2气氛下培养于125ml的瓶中，该瓶以约55rpm至约65rpm的rpm范围(优选约60rpm)旋转。在又一个实施例中，将hUTC在大约37℃下于10％的CO2气氛下培养于500ml的瓶中，该瓶以约55rpm至约65rpm的rpm范围(优选约60rpm)旋转。在另一个实施例中，将hUTC在大约37℃下于10％的CO2气氛下培养于500ml的瓶中，该瓶以约35rpm至约45rpm的rpm范围(优选约40rpm)旋转。在另一个实施例中，将hUTC在大约37℃下于10％的CO2气氛下培养于3L的瓶中，该瓶以约35rpm至约45rpm的rpm范围(优选约40rpm)旋转。在这些实施例中，该瓶可包含培养基中的约11.0至约13.0g/L的微载体(优选约12g/L)。
为了使群体密度最大化，所填充和接种的瓶或滚瓶包含hUTC，旋转并温育至少约5至7天，其中约5至约6天的温育时间是优选的。在大约温育的一半时间点(即，约2.5至约3.5天(优选3天)后)或当细胞已实现期望初始细胞密度时，将本发明的无血清营养液加入hUTC培养物中。在某些实施例中，使用无血清营养液实施例A、B或C。
在一个优选的实施例中，在加入无血清营养液之前使细胞生长一段足够的时间以允许细胞达到期望的初始群体密度。
因此，在一个实施例中，该方法包括使接种于微载体上的脐带组织衍生细胞在本发明培养基中生长一段足够的时间以允许细胞达到期望的初始群体密度；在细胞已实现期望的初始群体密度之后加入本发明的无血清营养液；以及使细胞生长一段足够的时间以使细胞达到期望的最终群体密度。
在另一个实施例中，使用培养基实施例A和无血清营养液实施例A。在另一个实施例中，使用培养基实施例B和无血清营养液实施例B。在一个实施例中，使用培养基实施例C和无血清营养液实施例C。
在一个实施例中，该方法包括在培养之前在微载体上接种hUTC。微载体可为以上提及的微载体中的任何一种。在某些实施例中，微载体具有胺处理的表面。在优选的实施例中，具有胺处理的表面的微载体具有约160-200μm的粒度、约1.090-1.150的相对密度范围、约515cm2/g的表面积。在一个实施例中，微载体为
Figure BDA0002528558190000411
II Ultra。
虽然目标接种密度可有所变化，但在某些实施例中，在约15至约30、或者约18至25、或者约15至约23g/L的微载体浓度下，接种约5,000至约8,000、或者约5,500至约7,500、或者约6,000至约8,000、或者约6,500至约7,500个活细胞/cm2。将接种的细胞加入瓶中。另选地，可在瓶中进行接种。在一个实施例中，接种包括解冻冻存的hTUC。在一个实施例中，该方法还包括在接种微载体之前解冻冻存的hTUC以及扩增细胞。在一个实施例中，在微载体上进行细胞扩增。
在一个实施例中，该方法中用于使hUTC生长的培养基补充有约2％至约20％的血清(例如FBS)。在一个实施例中，培养基在培养基制备期间补充有血清(诸如FBS)。在另一个实施例中，培养基在使用之前即刻补充(诸如经由添加包含血清(例如FBS)的溶液)。在一个实施例中，培养基补充有优选地约2至15％(v/v)的FBS、或者约2至约10％、或者约3至约12％、或者约5至约15％、或者约4％至约10％、或者约8％至约15％、或者约10％至约15％。在所选实施例中，培养基补充有约7.5％、约10％或约15％(v/v)的FBS。
3.本发明方法的其他特征
可用于在无需培养基更换的情况下使在旋转瓶或滚瓶培养中可实现的群体倍增数最大化的本发明方法中的自变量是旋转速度、瓶中的细胞接种密度、微载体的量、温育时间、培养基类型、无血清营养液类型和置于瓶中的培养基的体积。技术人员应当理解，所测试范围之外的其他值可使用相同方法常规地测试，并且这些值可证实提供群体倍增数的增量增益。因变量(此处是所实现的群体倍增数)的最大响应作为这些参数的函数来测量，并且未在本文明确举例的实施例被设想为本公开的一部分。
根据所提供的方法培养的细胞(例如hUTC)特征在于具有与起始细胞基本上相同的细胞表面标志物谱或基因表达谱。在一个实施例中，根据所提供的方法培养的细胞特征在于具有与起始细胞基本上相同的细胞表面标志物谱或基因表达谱。对于基于细胞的疗法的许多应用而言，重要的是，当放大培养条件以增加数量时，细胞特征不会变化。例如，形态、细胞表面标志物和帮助区分或指示治疗细胞的标志性基因的表达应保持基本上不变(如果不相同的话)。根据本发明提供的细胞和本文教导的方法基本上不变，或优选地此类特征与在实验条件和规模下生长的相同细胞相同。
V.包含培养基和无血清营养液的试剂盒
本发明的另一个实施例是用于使细胞生长的试剂盒，该试剂盒包含本发明的培养基和无血清营养液。在一个实施例中，试剂盒还包含细胞。在一个优选的实施例中，试剂盒包含人脐带组织衍生细胞。试剂盒也可还包含使用说明。任选地，试剂盒还包含微载体和血清诸如胎牛血清。在一个另选实施例中，试剂盒也可包含滚瓶系统。
无需进一步描述，据信本领域的普通技术人员能够利用前述说明和以下例示性实例制造和利用本发明并实践本发明所主张的方法。因此，以下工作实例具体指出本发明的优选实施例，并且不应被视为以任何方式限制本公开的其余内容。
实例
实例1
含富集培养基的旋转瓶中的微载体上的hUTC的生长和收获
在该实例中，研究了含各种富集培养基的旋转瓶中的微载体上的hUTC的生长和收获。为了该实例中的研究，将脐带组织衍生细胞从接种物扩增，然后在多种不同生长条件(条件1-9)下生长，每种条件采用如下所述的不同培养基。
用于该研究的微载体是
Figure BDA0002528558190000433
Ultra(Solohill Engineering,Ann Arbor,MI)，其具有515cm2/g的表面积。
如该实例中所用，术语“传代”被定义为在包含新鲜微载体的容器中接种来自单独容器的汇合微载体。此外，如该实例中所用，术语“群体倍增”被定义为细胞群体在给定时间内倍增的次数，并且计算如下：
Figure BDA0002528558190000431
细胞计数的程序
各种条件所需的细胞计数通过下列程序进行。从培养物中无菌地取出10ml的样本，并转移到15ml的锥形管中。然后以1600RPM将样本离心5分钟。小心地移除上清液，确保不移除任何微载体。然后将5至10ml的预热到37℃的TrypLETM Select
Figure BDA0002528558190000434
加入到微载体中并在转子上搅动15至30分钟。然后将离心管的内容物通过40μm的滤膜转移到50ml的锥形管中以移除微载体并且仅允许脱离的细胞穿过。通过滤膜用1×PBS进行两次洗涤。然后以1600RPM将50ml的锥形管离心5分钟。小心移除上清液，不要搅动细胞团块，直到管中留下约1至2ml的上清液为止。使用移液管测量剩余体积并将细胞重悬于该体积中。使用CEDEX(Innovatis)细胞计数设备对所得细胞悬浮液进行计数，该设备使用台盼蓝排除法。基于CEDEX细胞计数，按照如下计算培养容器中的细胞浓度：
Figure BDA0002528558190000432
Figure BDA0002528558190000441
细胞培养程序
将冷冻hUTC的小瓶解冻并用新鲜培养基洗涤。将细胞悬浮液转移到包含培养基和微载体的125ml的玻璃旋转瓶中。使用这些解冻的细胞制备接种物。
接种物的细胞制备
使接种物在不同尺寸(125ml、500ml和3L)的玻璃旋转瓶(Corning,NY)中由DMEM和15％v/v的FBS与12g/L的浓度的微载体构成的对照培养基中扩增多代。接种物中的细胞累积群体倍增小于35。下表中列出了接种物扩增期间的传代标准和培养条件。在传代目标日，进行细胞计数，如果实现了供传代的目标密度，则基于新容器中的目标接种密度，将细胞传代到新容器中。如果未实现供传代的目标密度，则进行80％的培养基更换并且在第二天对细胞进行计数。对于培养基更换，将容器从旋转平台取出置于一边，使微载体在重力作用下沉降5分钟，并且无菌地移除80％的培养基(不移除微载体)，加入等量的新鲜培养基并且将容器放回培养箱中的旋转平台上。
在用于接种物制备的连续传代期间的生长条件和参数概括于下表1-1中。
Figure BDA0002528558190000442
Figure BDA0002528558190000451
该实例中使用的各种生长条件
对于条件1至9中的每一者，接种日被视为第0天。另外对于这些条件中的每一者，对接种物进行细胞计数。
条件1(对照)：在约18g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约6000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约9g。加入由DMEM和15％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中60RPM的旋转平台上。在第3天，使用DMEM+15％FBS进行80％的培养基更换。使用上述程序进行周期性的细胞计数。在第3和5天，分别将3ml和2.5ml的葡萄糖加入瓶中。在第3天，加入2.5ml的200mM L-谷氨酰胺。
条件2：在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约6000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M5基础培养基和15％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中60RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F5。不进行培养基更换。另外，在第3天，加入2.5ml的葡萄糖。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第5天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
条件3：在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约7000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M1基础培养基和15％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中45RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F1。不进行培养基更换。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第3天，加入2.5ml的葡萄糖。在第4天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
条件4：在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约7000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M2基础培养基和15％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中45RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F2。不进行培养基更换。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第3天，加入2.5ml的葡萄糖(220g/L右旋糖一水合物的水溶液)。在第4天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
条件5：在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约7000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M3基础培养基和15％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中45RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F3。不进行培养基更换。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第3天，加入2.5ml的葡萄糖(220g/L右旋糖一水合物的水溶液)。在第4天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
条件6：在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约7000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M4基础培养基和15％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中45RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F4。不进行培养基更换。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第3天，加入2.5ml的葡萄糖(220g/L右旋糖一水合物的水溶液)。在第4天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
条件7：在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约7000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M5基础培养基和15％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中45RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F5。不进行培养基更换。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第3天，加入2.5ml的葡萄糖(220g/L右旋糖一水合物的水溶液)。在第4天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
条件8：在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约7000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M6基础培养基和15％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中45RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F6。不进行培养基更换。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第3天，加入2.5ml的葡萄糖(220g/L右旋糖一水合物的水溶液)。在第4天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
条件9：在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约7000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M7基础培养基和15％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中45RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F7。不进行培养基更换。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第3天，加入2.5ml的葡萄糖(220g/L右旋糖一水合物的水溶液)。在第4天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
收获
在第6天，收获所有瓶。为进行收获，使微载体在重力作用下沉降，并在不移除任何微载体的情况下移除尽可能多的培养基。将在37℃下预热的250-300ml的TrypLETM加入瓶中并置于37℃的培养箱中的旋转平台上。30分钟后，停止搅动，从瓶中取出25ml的样本，并且通过40μm的滤膜过滤。弃去保留于滤膜上的微载体，并且通过直接在CEDEX上运行样本，对样本进行细胞计数。基于所加入的TrypLETM体积和所获得的细胞计数，计算容器中的总细胞并计算细胞密度(细胞/cm2)。
细胞培养基的组成
DMEM(含1g/L的葡萄糖、4mM的L-谷氨酰胺和3.7g/L的碳酸氢钠且不含丙酮酸钠和酚红)是用于条件1(对照)的基础培养基。
还测试了若干其他基础培养基以鉴定对于消除培养基更换很关键的一些组分，从而降低血清消耗。配方中使用的组分之一是牛血清白蛋白，其以作为富含脂质的牛血清白蛋白的可商购获得的
Figure BDA0002528558190000482
I(GibcoTM细胞培养物，Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)的形式提供。表1-2提供了基础培养基(M1-M7)的配方。基础培养基和补料培养基两者均包含可商购获得的细胞膜稳定剂和消泡剂
Figure BDA0002528558190000481
F68。
表1-2基础培养基的配方
Figure BDA0002528558190000491
Figure BDA0002528558190000501
如上所述，在第3天，在条件1中进行80％的培养基更换。对于其余条件，加入补料以消除培养基更换。不同补料配方示于表1-3中。表1-3所示的量表示在加入补料时每升(L)培养物体积的组分重量增量(g)。
表1-3：补料配方
Figure BDA0002528558190000511
Figure BDA0002528558190000521
条件1至9中使用的培养基都在其中加入了FBS。以下示出了FBS的组分：
Figure BDA0002528558190000522
Figure BDA0002528558190000531
结果
来自不同条件的细胞计数示于下表1-5中。可以两个部分来分析结果。通过比较条件1和2，证实M5培养基和第3天F5补料的组合消除了培养基更换。这是重要的，因为这会使血清浓度大幅降低超过44％。通过比较条件3到9，证实下列三个条件具有与其他条件相比最低的性能：条件6，M4基础培养基+15％FBS，并且第3天加入F4补料；条件8，M6基础培养基+15％FBS，并且第3天加入F6补料；以及条件9，M7基础培养基+15％FBS，并且第3天加入F7补料。更仔细观察这些配方可看出这三个条件在培养基或补料中均没有核酸衍生物。因此，也可推断出核酸衍生物对于hUTC生长很关键。该实例表明，通过富集培养基并在第3天补充额外的培养基组分，可使hUTC在不进行培养基更换的情况下生长6天，并且为了保持相当的细胞生长，核酸衍生物很关键。
Figure BDA0002528558190000541
实例2
微载体上和含富集培养基的旋转瓶中的HUTC的生长和连续传代
如果在第3天细胞不能达到>20,000个细胞/cm2的预定最佳细胞密度，则在旋转瓶的悬浮培养中附着于微载体上的人脐带组织细胞(hUTC)的连续传代需要培养基更换。培养基更换为工艺带来了额外操作，并且难以预测细胞传代时间表。因此，细胞传代程序在商业上不可取。可通过更换含15％的胎牛血清的细胞生长培养基，使hUTC生长到高细胞密度。该实例研究了用于hUTC传代的商业上更可取的替代方法。通过使生长培养基富含无血清营养物质，使在旋转瓶的悬浮培养中附着于微载体上的hUTC生长到高细胞密度。该方法消除了第3天的培养基更换，使细胞始终以>20,000个细胞/cm2生长。该方法改善了hUTC传代的过程稳健性。
该研究中使用下列物质：DMEM(含2g/L的葡萄糖、4mM的L-谷氨酰胺和3.7g/L的碳酸氢钠且不含丙酮酸钠和酚红)；胎牛血清(15％v/v)；M5基础培养基(参见以上实例1)；F5补料(参见以上实例1)；并且使用
Figure BDA0002528558190000552
Ultra(Solohill Engineering,Ann Arbor,MI)微载体。
表面标志物分析方法：
将不含Ca或Mg的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中的3％的FBS用作染色缓冲液。使用六种抗体鉴定表面标志物并且两种抗体用作对照。
用于该测定的抗体列表及其在染色缓冲液中的稀释液示于下表2-1中。
Figure BDA0002528558190000551
方法：对样本进行细胞计数并将2.5×106个细胞重悬于10ml的DMEM+15％FBS培养基中。然后将细胞离心，移除上清液并重悬于染色缓冲液中，获得1×106个细胞/ml的细胞浓度。然后将该细胞悬浮液分成不同管，使得每管容纳20000个细胞。接着如上表2-1中所示加入适当量的稀释抗体和染色缓冲液。然后将样本在2-8℃下温育30分钟。温育后，加入3ml的DPBS并将样本离心。移除上清液并将细胞团块重悬于500μl的DPBS中。然后在
Figure BDA0002528558190000562
PCATM仪器(Millipore,MD,USA)上运行样本。在这六种表面标志物中，三种是阳性标志物(CD13、CD90、HLA-ABC)，并且三种是阴性标志物(CD34、CD117、HLA-DR)。
培养条件
hUTC的培养和连续传代方法在实例1中阐述。如所提及，该连续传代使用含15％的FBS的DMEM作为培养基，并且常常需要培养基更换以满足传代标准。在该实例中，试图消除连续传代期间的频繁培养基更换的需要。这通过使用改良M5培养基(含2g/L的葡萄糖而非1g/L)和15％的FBS(v/v)而实现。在该改良M5培养基与15％的FBS一起使用的情况下，传代日得以固定，并且传代六次都不必进行培养基更换。培养条件和标准示于下表2-2中。
Figure BDA0002528558190000561
传代六次细胞都稳健生长，如下表2-3中所示。在仅使用DMEM+15％FBS的过程中，在传代前的一天细胞常常需要培养基更换以实现1.5的群体倍增，从而将传代持续时间延长了额外一天。使用富集培养基时，细胞在3天(从小瓶解冻起4天)内始终具有至少超过1.5的群体倍增并且不需要任何培养基更换。在该培养基中传代七次，然后使细胞在该培养基中生长6天且在6天培养的第3天加入F5补料，这些细胞在此之后能保持其特性。这些细胞的表面标志物分析示于下表2-4中。
Figure BDA0002528558190000571
Figure BDA0002528558190000572
实例3
旋转瓶中的低血清培养基中的微载体上的hUTC的生长
可通过在运行的第3天更换包含15％的FBS的细胞生长培养基，使人脐带组织细胞(hUTC)生长到高细胞密度。培养基中的高血清浓度和培养基更换从商业角度看并不可取，这是由于高血清成本、制备期望的高血清使用量以及另外的运行操作。该实例公开了使附着于微载体上的hUTC在低血清生长培养基中且在不进行培养基更换同时实现高细胞密度的情况下生长的方法。
该实例中使用的培养基是含2g/L的D-葡萄糖而非1g/L的D-葡萄糖的M5基础培养基(参见上文)，并且该培养基中加有胎牛血清。使用F5补料培养基。葡萄糖以220g/L的右旋糖一水合物的水溶液形式提供。谷氨酰胺以200mM溶液形式提供。在该实例中，研究了不同生长条件。下文概述了这些条件。如这些条件中所用，接种日被视为第0天。此外，每个条件中使用
Figure BDA0002528558190000581
Ultra(Solohill Engineering,Ann Arbor,MI)微载体。
条件1(15％的FBS)：对接种物进行细胞计数。在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约6000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M5基础培养基和15％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中60RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F5。不进行培养基更换。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第3天和第5天，加入2.5ml的葡萄糖。在第4天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
条件2(10％的FBS)：对接种物进行细胞计数。在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约6000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M5基础培养基和10％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中60RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F5。不进行培养基更换。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第3天和第5天，加入2.5ml的葡萄糖。在第4天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
条件3(7.5％的FBS)：对接种物进行细胞计数。在约20g/L的微载体浓度下，该条件的目标接种密度为约6000个活细胞/cm2。基于接种物的细胞计数，将期望体积的接种物加入新的经高压灭菌的500ml的玻璃旋转瓶中。使微载体在重力作用下沉降。将来自接种物的培养基移除直到瓶中留下约100ml。然后加入新鲜的微载体，使得瓶中微载体的最终重量为约10g。加入由M5基础培养基和7.5％(v/v)的FBS构成的新鲜培养基，定容到500ml。将瓶置于37℃和10％的CO2培养箱中60RPM的旋转平台上。在第3天，加入补料F5。不进行培养基更换。如细胞计数部分阐述的那样进行周期性的细胞计数。在第3天和第5天，加入2.5ml的葡萄糖。在第4天，将5ml的200mM L-谷氨酰胺加入瓶中。
收获：在第6天，收获这两个瓶。为进行收获，使微载体在重力作用下沉降，并在不移除任何微载体的情况下移除尽可能多的培养基。将在37℃下预热的300ml的TrypLETM加入瓶中并置于37℃的培养箱中的旋转平台上。30分钟后，停止搅动，从瓶中取出25ml样本，并且通过40μm的滤膜过滤。弃去保留于滤膜上的微载体，并且通过直接在CEDEX上运行样本，对样本进行细胞计数。基于所加入的TrypLETM体积和所获得的细胞计数，计算容器中的总细胞并计算细胞密度(个细胞/cm2)。
结果：来自具有不同浓度FBS的三个条件的细胞计数示于下表中。除了来自该实例的结果之外，来自实例1、条件1(DMEM+15％FBS且在第3天进行培养基更换)的结果也包括在内以便比较。因此，富集培养基不仅消除了培养基更换，而且可降低培养基中的血清浓度，从而使培养中使用的血清量进一步最小化。
Figure BDA0002528558190000591
实例4
细胞的分离
脐细胞分离。脐带得自国家疾病研究交流会(NDRI，Philadelphia,PA)。在正常分娩后获得组织。在层流罩中无菌地进行细胞分离方案。为了去除血液和碎片，在100U/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素和0.25μg/ml的两性霉素B(Invitrogen Carlsbad,CA)的存在下，在磷酸盐缓冲盐水(PBS；Invitrogen,Carlsbad,CA)中洗涤脐带。然后在50ml培养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖；Invitrogen)的存在下，将组织在150cm2组织培养板中进行机械解离，直至将组织切成细浆。将切碎的组织转移到50ml锥形管(大约每管5克组织)。
随后将组织在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基中消化，这些培养基各自含有100U/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素、0.25μg/ml的两性霉素B和消化酶。在一些实验中，使用胶原酶和分散酶的酶混合物(“C:D”)(在DMEM-低葡萄糖培养基中胶原酶(Sigma,St Louis,MO)，500U/ml；并且分散酶(Invitrogen)，50U/ml)。在其他实验中，使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的混合物(“C:D:H”)(C:D:H＝在DMEM-低葡萄糖中胶原酶，500U/ml；分散酶；50U/ml；并且透明质酸酶(Sigma)，5U/ml)。包含组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃、225rpm的轨道式震荡器(Environ,Brooklyn,NY)中温育2小时。
消化后，将组织在150×g下离心5分钟，吸出上清液。将团块重悬于20ml生长培养基(DMEM：低葡萄糖(Invitrogen)、15％(v/v)胎牛血清(FBS；限定胎牛血清；批号AND18475；Hyclone,Logan,UT)、0.001％(v/v)的2-巯基乙醇(Sigma)、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素和0.25μg/ml的两性霉素B(各自来自Invitrogen,Carlsbad,CA)。通过70μm的尼龙BDFALCON细胞滤网(BD Biosciences,San Jose,CA)过滤细胞悬浮液。使另外5ml包含生长培养基的冲洗液经过滤网。然后使细胞悬浮液经过40μm的尼龙细胞滤网(BD Biosciences,San Jose,CA)，并且使另外5ml的包含生长培养基的冲洗液通过。
将滤液重悬于生长培养基(总体积为50ml)中，并在150×g下离心5分钟。抽吸上清液，并将细胞重悬于50ml新鲜生长培养基中。该过程再重复两次。
在最后一次离心后，抽吸上清液，并将细胞团块重悬于5ml新鲜生长培养基中。使用台盼蓝染色确定活细胞数量。然后在标准条件下培养细胞。
将从脐带组织中分离的细胞以5,000个细胞/cm2接种到明胶涂布的T-75cm瓶(Corning Inc.,Corning,NY)上的生长培养基中。在两天后，从瓶中抽吸耗尽的培养基和非贴壁细胞。用PBS洗涤贴壁细胞三次，以去除碎片和血液衍生的细胞。然后为细胞补充生长培养基，并允许细胞生长至汇合(从第0代到第1代约10天)。在后续的传代中(从第1代至第2代等)，细胞在4-5天内达到亚汇合(75-85％汇合)。对于这些后续的传代，细胞以5,000个细胞/cm2接种。细胞在含5％二氧化碳的加湿培养箱中在37℃下生长。
在一些实验中，在用LIBERASE(2.5mg/ml，Blendzyme 3；Roche AppliedSciences,Indianapolis,IN)和透明质酸酶(5U/ml，Sigma)消化后，从在DMEM-低葡萄糖培养基中的产后组织中分离细胞。组织消化和细胞分离如上文对于其他蛋白酶消化描述的，然而，使用LIBERASE/透明质酸酶混合物代替C:D或C:D:H酶混合物。用LIBERASE的组织消化导致从产后组织中分离容易扩增的细胞群体。
比较使用不同酶组合从脐带中分离细胞的程序。对于消化进行比较的酶包括：i)胶原酶；ii)分散酶；iii)透明质酸酶；iv)胶原酶:分散酶混合物(C:D)；v)胶原酶:透明质酸酶混合物(C:H)；vi)分散酶:透明质酸酶混合物(D:H)；和vii)胶原酶:分散酶:透明质酸酶混合物(C:D:H)。观察到利用这些不同酶消化条件在细胞分离中的差异(参见表4-1)。
作出通过不同方法从脐带中分离细胞库的其他尝试。在一种情况下，将脐带切片并用生长培养基洗涤，以取出血块和凝胶状材料。收集血液、凝胶状材料和生长培养基的混合物，并且以150×g离心。将团块重悬并接种到明胶涂布的瓶上的生长培养基中。根据这些实验，分离容易扩增的细胞群。
细胞还已从得自NDRI的脐带血液样本中分离。使用的分离方案是由Ho等人的国际专利申请PCT/US2002/029971的分离方案。将脐带血液样本(分别为50ml和10.5ml)(NDRI，Philadelphia PA)与裂解缓冲液(过滤灭菌的155mM氯化铵、10毫摩尔碳酸氢钾、0.1mMEDTA缓冲至pH7.2(所有组分均来自Sigma,St.Louis,MO))混合。细胞以1:20脐带血与裂解缓冲液的比率进行裂解。将所得的细胞悬浮液涡旋5秒，并且在环境温度下温育2分钟。将裂解产物离心(以200×g 10分钟)。将细胞团块重悬于完全最低必需培养基(Gibco,CarlsbadCA)中，该培养基含有10％的胎牛血清(Hyclone,Logan UT)、4mM的谷氨酰胺(MediatechHerndon,VA)、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素(Gibco,Carlsbad,CA)。将重悬的细胞离心(以200×g 10分钟)，抽吸上清液，并且在完全培养基中洗涤细胞团块。将细胞直接接种到T75瓶(Corning,NY)、T75层粘连蛋白涂布的瓶、或T175纤粘蛋白涂布的瓶(两者均来自Becton Dickinson,Bedford,MA)内。
为了测定细胞群是否可在不同条件下分离并在分离后立即在多种条件下扩增，将细胞在含或不含0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma,St.Louis,MO)的生长培养基中消化，使用C:D:H的酶组合，根据上文提供的操作。所有细胞均在100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的存在下生长。在所有测试的条件下，细胞在第0代和第1代之间均良好附着并扩增(表4-2)。在条件5-8和13-16中的细胞证实在接种后良好增殖最多至4次传代，在这时它们进行冷冻保存。
C:D:H的组合提供在分离后的最佳细胞收率，并且生成在培养中比其他条件扩增更多代的细胞(表4-1)。可扩增的细胞群无法使用单独的胶原酶或透明质酸酶获得。不作出测定该结果是否对于测试的胶原酶特异性的尝试。
Figure BDA0002528558190000621
细胞在对于酶消化和生长的测试的所有条件下在第0代和第1代之间均良好附着并扩增(表4-2)。在实验条件5-8和13-16中的细胞在接种后良好增殖最多至四次传代，在这时它们进行冷冻保存。所有细胞均冷冻保存用于进一步分析。
Figure BDA0002528558190000622
Figure BDA0002528558190000631
有核细胞快速附着并生长。这些细胞通过流式细胞术进行分析，并且类似于通过酶消化获得的细胞。
该制剂含有红血细胞和血小板。在前3周过程中有核细胞未附着并分裂。在接种后3周更换培养基，并且未观察到细胞附着并生长。
细胞群可使用酶组合胶原酶(金属蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)和透明质酸酶(分解透明质酸的粘液溶解酶)有效地从脐组织中分离。还可使用其为胶原酶和中性蛋白酶的共混物的LIBERASE。作为胶原酶(4Wunsch U/g)和嗜热菌蛋白酶(1714酪蛋白U/g)的Blendzyme 3也连同透明质酸酶一起用于分离细胞。当在明胶涂布的塑料上的生长扩增培养基中培养时，这些细胞容易地经过多次传代扩增。
细胞还从脐带中的残留血液而不是脐带血中分离。从组织中洗涤的血块中的细胞的存在可能是由于在解剖过程期间释放的细胞，该细胞在使用的条件下贴壁并生长。
实例5
细胞的核型分析
在细胞疗法中使用的细胞系优选是同质的且不含任何污染细胞类型。在细胞疗法中使用的人细胞应具有含正常结构的正常数(46)的染色体。为了鉴定脐衍生的细胞系是同质的且不含非脐组织起源的细胞，分析细胞样本的核型。
来自男性新生儿的产后组织的UTC在生长培养基中进行培养。选择来自男性新生儿(X,Y)的产后组织，以允许区别新生儿衍生的细胞和母体衍生的细胞(X,X)。细胞以5,000个细胞/平方厘米接种到T25瓶(Corning,Corning,NY)中的生长培养基中，并且扩增至80％汇合。含有细胞的T25瓶用生长培养基填充至颈部。通过快递将样本递送至临床细胞遗传学实验室(估计的实验室至实验室运输时间为一小时)。染色体分析由New Jersey MedicalSchool(Newark,NJ)的人类和分子遗传学中心(Center for Human&Molecular Genetics)进行。细胞在中期过程中进行分析，在该中期时染色体是最佳显现的。在计数的处于中期的二十个细胞中，五个就正常同质核型数(二)进行分析。如果观察到两个核型，则细胞样本表征为同质的。如果观察到超过两个核型，则细胞样本表征为异质的。当鉴定异质核型数(四)时，计数并分析另外的中期细胞。
送往染色体分析的所有细胞样本均由细胞遗传学实验室人员解释为显示出正常外观。分析的十六种细胞系中的三种显示出异质表型(XX和XY)，指示衍生自新生儿和母体起源的细胞的存在(表5-1)。细胞样本各自表征为同质的。(表5-1)。
Figure BDA0002528558190000641
染色体分析鉴定脐衍生的UTC，如由临床细胞遗传学实验室解释的，该UTC的核型看起来是正常的。核型分析还鉴定不含母体细胞的细胞系，如由同质核型测定的。
实例6
细胞表面标志物的流式细胞术评估
通过流式细胞术表征细胞表面蛋白或“标志物”可用于测定细胞系的身份。表达的一致性可由多个供体以及在暴露于不同处理和培养条件的细胞中进行测定。从脐中分离的产后细胞系通过流式细胞术进行表征，提供用于鉴定这些细胞系的谱。
细胞在等离子处理的T75、T150和T225组织培养瓶(Corning,Corning,NY)中的生长培养基中培养直至汇合。通过在室温下温育2％(w/v)明胶(Sigma,St.Louis,MO)20分钟，使瓶的生长表面涂布有明胶。
瓶中的贴壁细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)；(Gibco,Carlsbad,MO)中进行洗涤，并且用胰蛋白酶/EDTA(Gibco)解离。将细胞收获、离心并以1×107/ml的细胞浓度重悬于PBS中的3％(v/v)FBS中。根据制造商说明书，将针对所关注细胞表面标志物的抗体(参见下文)添加到100μl的细胞悬浮液中，并将混合物在4℃下在黑暗中温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤，并离心去除未结合抗体。将细胞重悬于500μl的PBS中，并通过流式细胞术进行分析。用FACS calibur仪器(Becton Dickinson,San Jose,CA)进行流式细胞术分析。
使用针对细胞表面标志物的下列抗体：
Figure BDA0002528558190000651
脐衍生的细胞在第8、15和20代时进行分析。
为了比较在供体中的差异，来自不同供体的脐带组织衍生的细胞彼此进行比较。在明胶涂布的瓶上培养的脐衍生的细胞也与在无涂布的瓶上培养的脐衍生的细胞进行比较。
比较了用于细胞分离和制备的四种处理。比较通过用下列处理的衍生自产后组织的细胞：1)胶原酶；2)胶原酶/分散酶；3)胶原酶/透明质酸酶；和4)胶原酶/透明质酸酶/分散酶。
通过流式细胞术分析的在第8、15和20代时的脐带衍生的细胞均表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C，通过相对于IgG对照增加的荧光指示的。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的，如与IgG对照一致的荧光值所指示。
通过流式细胞术分析的从分开供体分离的脐带衍生的细胞各自显示对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C产生是阳性的，反映相对于IgG对照增加的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的产生是阴性的，其中荧光值与IgG对照一致。
通过流式细胞术分析的在明胶涂布的瓶和未涂布的瓶上扩增的脐带衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的产生都是阳性的，具有相对于IgG对照增加的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ产生是阴性的，其中荧光值与IgG对照一致。
通过流式细胞术分析脐带衍生的细胞已确定这些细胞系的身份。这些脐带衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A,B,C是阳性的；并且对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的。该身份与变量中的变化一致，该变化包括供体、传代、培养容器表面涂层、消化酶和胎盘层。观察到单独荧光值直方曲线平均值和范围中的一些变化，但在测试的所有条件下的所有阳性曲线均为正态的，并且表达大于IgG对照的荧光值，从而证实了细胞包含具有标志物的阳性表达的同质群体。
实例7
通过寡核苷酸阵列的细胞分析
寡核苷酸阵列用于比较脐衍生的细胞和胎盘衍生的细胞与成纤维细胞、人间充质干细胞和源自人骨髓的另一种细胞系的基因表达谱。该分析提供了产后衍生的细胞和这些细胞经鉴定的独特分子标志物的表征。
产后组织衍生的细胞。经患者同意在正常足月分娩后从国家疾病研究交流会(NDRI，Philadelphia,PA)获得人脐带和胎盘。接受组织，并且在用C:D:H混合物消化后，如实例5中所述分离细胞。细胞在明胶涂布的塑料组织培养瓶上的生长培养基中进行培养。将培养物在37℃和5％CO2下温育。
成纤维细胞。人表皮成纤维细胞购自Cambrex Incorporated(Walkersville,MD；批号9F0844)和ATCC CRL-1501(CCD39SK)。两种细胞系均在具有10％(v/v)胎牛血清(Hyclone)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养。细胞生长于标准组织处理的塑料制品上。
人间充质干细胞(hMSC)。hMSC购自Cambrex Incorporated(Walkersville,MD；批号2F1655、2F1656和2F1657)并根据制造商说明书培养于MSCGM培养基(Cambrex)中。细胞在37℃和5％CO2下生长于标准组织培养的塑料制品上。
人髂嵴骨髓细胞(ICBM)。经患者同意，从NDRI接收人髂嵴骨髓。根据由Ho等人(WO03/025149)概述的方法处理骨髓。以1份骨髓对20份裂解缓冲液的比率，将骨髓与裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3和0.1mM EDTA，pH7.2)混合。对细胞悬浮液进行涡旋，在环境温度下温育2分钟，并在500×g下离心10分钟。弃去上清液，将细胞团块重悬于补充有10％(v/v)胎牛血清和4mM谷氨酰胺的最低必需培养基α(Invitrogen)中。再次离心细胞，并将细胞沉淀物重悬于新鲜培养基中。使用台盼蓝染色排除法(Sigma,St.Louis,MO)计算存活的单核细胞。将单核细胞以5×104个细胞/cm2接种到塑料组织培养瓶中。在标准大气O2或5％O2下，并于37℃和5％CO2下温育细胞。将细胞培养5天而不更换培养基。在培养5天后，去除培养基和非贴壁细胞。在培养中维持贴壁细胞。
用细胞刮刀将活跃生长的细胞培养物从瓶取出到冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。以300×g将细胞离心5分钟。除去上清液，并将细胞重悬于新鲜PBS中，再次离心。除去上清液，并将细胞沉淀物立即冷冻并保存于-80℃。提取细胞mRNA并转录成cDNA。随后将cDNA转录成cRNA并进行生物素标记。将生物素标记的cRNA与Affymetrix GENECHIP HG-U133A寡核苷酸阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)杂交。杂交和数据收集根据制造商的说明书进行。数据分析使用“Significance Analysis of Microarrays”(SAM)版本1.21计算机软件(Tusher,V.G.等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5116-5121)进行。分析软件的授权可通过斯坦福大学的技术授权办公室(Office of Technology Licensing,Stanford University)获得，并且更多信息可在万维网上的斯坦福大学统计系的Tibshirani教授网站处获得。
在该研究中分析了十四个不同的细胞群。细胞连同传代信息、培养基底和培养基一起列于表7-1中。细胞系通过其标识代码连同在分析时的传代、细胞生长基底和生长培养基一起列出。
Figure BDA0002528558190000681
数据通过用如上所述的SAM软件的主成分分析进行评估。分析揭示在测试的细胞中以相对不同的量表达的290种基因。该分析提供了在群体之间的相对比较。
表7-2示出了计算用于比较细胞对的欧氏距离。欧氏距离基于按照不同细胞类型间差异表达的290个基因得出的细胞比较结果。欧氏距离与290种基因的表达之间的相似性成反比。使用在细胞类型之间差异表达的这290种基因，对于细胞类型计算欧氏距离。细胞之间的相似性与欧氏距离成反比。
Figure BDA0002528558190000691
表7-3、7-4和7-5示出了在胎盘衍生的细胞中增加的基因表达(表7-3)、在脐带衍生的细胞中增加的基因表达(表7-4)，以及在脐带和胎盘衍生的细胞中减少的基因表达(表7-5)。
Figure BDA0002528558190000692
Figure BDA0002528558190000701
Figure BDA0002528558190000702
Figure BDA0002528558190000703
Figure BDA0002528558190000711
Figure BDA0002528558190000721
表7-6、7-7和7-8示出了在人成纤维细胞(表7-6)、ICBM细胞(表7-7)和MSC(表7-8)中增加的基因表达。
表7-6：与测定的其他细胞系相比较，表达在成纤维细胞中增加的基因。
双特异性磷酸酶2
KIAA0527蛋白
智人cDNA：FLJ23224 fis，克隆ADSU02206
动力蛋白，细胞质，中间多肽1
锚蛋白3，郎飞氏结(锚蛋白G)
抑制素，βA(激活素A，激活素ABα多肽)
胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶4(推定功能)
KIAA1053蛋白
微管相关蛋白1A
锌指蛋白41
HSPC019蛋白
智人cDNA：FLJ23564 fis，克隆LNG10773
智人，mRNA；cDNA DKFZp564A072(来自克隆DKFZp564A072)
LIM蛋白(类似于大鼠蛋白激酶C结合enigma)
B细胞中κ轻链多肽基因增强子的抑制剂，激酶复合物相关蛋白
假定蛋白FLJ22004
人(克隆CTG-A4)mRNA序列
EST，中等类似于细胞因子受体样因子2；细胞因子受体CRL2前体[智人]
转化生长因子，β2
假定蛋白MGC29643
单克隆抗体MRC OX-2识别的抗原
推定的X连锁视网膜病蛋白
Figure BDA0002528558190000722
Figure BDA0002528558190000731
Figure BDA0002528558190000732
进行该实例以提供衍生自脐带和胎盘的细胞的分子表征。该分析包括衍生自三个不同脐带和三个不同胎盘的细胞。该研究还包括两种不同的真皮成纤维细胞系、三种间充质干细胞系和三种髂嵴骨髓细胞系。由这些细胞表达的mRNA在GENECHIP寡核苷酸阵列上进行分析，该GENECHIP寡核苷酸阵列含有关于22,000种基因的寡核苷酸探针。
该分析揭示290种基因的转录物在这五种不同细胞类型中以不同量存在。这些基因包括在胎盘衍生的细胞中特异性增加的十种基因和在脐带衍生的细胞中特异性增加的七种基因。发现五十四种基因在胎盘衍生的细胞和脐带组织衍生的细胞中具有特异性更低的表达水平。
实例8
细胞表型的免疫组织化学表征
通过免疫组织化学分析在人脐带组织内发现的细胞的表型。
收获人脐带组织并在4℃下在4％(w/v)多聚甲醛中浸泡固定过夜。免疫组织化学使用针对下述表位的抗体进行(参见表8-1)：波形蛋白(1:500；Sigma,St.Louis,MO)、结蛋白(1:150，针对兔子产生；Sigma；或1:300，针对小鼠产生；Chemicon,Temecula,CA)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA；1:400；Sigma)、细胞角蛋白18(CK18；1:400；Sigma)、血管性血友病因子(vWF；1:200；Sigma)和CD34(人CD34III类；1:100；DAKOCytomation,Carpinteria,CA)。此外，测试了下述标志物：抗人GROα-PE(1:100；Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、抗-人GCP-2(1:100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA)、抗人氧化LDL受体1(ox-LDL R1；1:100；Santa Cruz Biotech)和抗-人NOGO-A(1:100；Santa Cruz Biotech)。用外科手术刀修剪固定的样本，然后放置于含乙醇的干冰浴上的OCT包埋化合物(Tissue-Tek OCT；Sakura,Torrance,CA)内。然后使用标准冰冻切片机(Leica Microsystems)对冰冻块进行切片(10μm厚)，并安装于载玻片上进行染色。
免疫组织化学类似于先前研究进行。(例如，Messina等人，Exper.Neurol.，2003；184:816-829)。组织切片用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)进行洗涤，并暴露于含有PBS、4％(v/v)山羊血清(Chemicon,Temecula,CA)和0.3％(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白质阻断溶液1小时以进入细胞内抗原。在所关注表位将位于细胞表面上(CD34、ox-LDL R1)的情况下，在流程的所有步骤中省略triton以防止表位丢失。此外，在一抗针对山羊产生(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况下，在整个流程中使用3％(体积比)驴血清替代山羊血清。一抗在阻断溶液中稀释后，施加到切片上并在室温下保持4小时的时间段。去除一抗溶液，并且在施加含阻断剂连同山羊抗小鼠IgG德克萨斯红(1:250；Molecular Probes,Eugene,OR)和/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1:250；Molecular Probes)或驴抗山羊IgGFITC(1:150；Santa Cruz Biotech)的二抗溶液前(在室温下1小时)，用PBS洗涤培养物。洗涤培养物，并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟，使细胞核显色。
在免疫染色后，使用在奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,NY)上的适当荧光滤光器显现荧光。阳性染色表示为超过对照染色的荧光信号。使用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics,Carlsbad,CA)捕获代表性图像。对于三染样本，每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(Adobe,San Jose,CA)制作分层剪辑。
Figure BDA0002528558190000751
波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vWF和CD34标志物在脐带内发现的细胞子集中表达(数据未示出)。具体地，vWF和CD34表达局限于脐带内所含的血管。CD34+细胞位于最内层(内腔侧)。在脐带的所有基质和血管中存在波形蛋白表达。SMA限制于基质以及动脉和静脉的外壁上，但不包含在血管自身内。CK18和结蛋白仅在血管中观察到，结蛋白局限于中层和外层。
这些标志物无一在脐带内观察到(数据未示出)。
波形蛋白、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、细胞角蛋白18、血管性血友病因子和CD 34在人脐带内的细胞中表达。基于显示仅表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的体外表征研究，数据提示脐带衍生的细胞分离的目前过程收获表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的细胞亚群，或分离的细胞改变标志物的表达，以表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。
实例9
营养因子的分泌
测量来自UTC的所选营养因子的分泌。选择具有血管生成活性的因子(例如肝细胞生长因子(HGF)(Rosen等人，Ciba Found.Symp.,1997；212:215-26)；单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(Salcedo等人，Blood，2000；96；34-40)；白介素-8(IL-8)(Li等人，J.Immunol.，2003；170:3369-76)；角质细胞生长因子(KGF)；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；血管内皮生长因子(VEGF)(Hughes等人，Ann.Thorac.Surg.2004；77:812-8)；基质金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP1)；促血管生成素2(ANG2)；血小板衍生的生长因子(PDGFbb)；促血小板生成素(TPO)；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)；基质来源的因子1α(SDF-1α)、神经营养/神经保护活性(脑来源的神经营养因子)(BDNF)(Cheng等人，Dev.Biol.，2003；258；319-33)；白介素-6(IL-6)；粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)；转化生长因子β2(TGFβ2)；或趋化因子活性(巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP1α)；巨噬细胞炎症蛋白1β(MIP1β)；单核细胞化学吸引剂-1(MCP-1)；Rantes(在活化时调节，通常T细胞表达并分泌的)；I309；胸腺和活化作用调节性趋化因子(TARC)；嗜酸细胞活化趋化因子；巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)；和(IL-8)。
在明胶涂布的T75瓶上的生长培养基中培养衍生自脐带的细胞以及衍生自人新生儿包皮的人成纤维细胞。冻存第11代的细胞并保存在液氮中。在解冻后，将生长培养基加入细胞，随后转移至15ml离心管，并以150×g将细胞离心5分钟。将细胞团块重悬于4ml生长培养基中，并对细胞进行计数。细胞以5,000个细胞/cm2接种到各自含有15ml生长培养基的T75瓶中，并且培养24小时。将培养基换成无血清培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco)、0.1％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、青霉素(50U/ml)和链霉素(50μg/ml,Gibco))，共8小时。在温育结束时通过在14,000×g下离心5分钟收集条件无血清培养基，并贮存于-20℃下。
为了估计每个瓶中的细胞数，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并使用2ml胰蛋白酶/EDTA(Gibco)解离。通过添加8ml生长培养基来抑制胰蛋白酶活性。以150×g将细胞离心5分钟。去除上清液，并将细胞重悬于1ml生长培养基中。用血球计估计细胞数。
细胞在37℃下在5％的CO2和大气氧中生长。通过ELISA(R&D Systems,Minneapolis,Mn.)测定由每份细胞样本产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2、IL-8和TGF-β2的量。所有测定均根据制造商的说明书进行。呈现的值是皮克/ml/百万细胞(n＝2,sem)。
使用SearchLight蛋白质组阵列(Pierce Biotechnology Inc.)测定趋化因子(MIP1α、MIP1β、MCP-1、Rantes、I309、TARC、嗜酸细胞活化趋化因子、MDC、IL8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGFbb、TPO、HB-EGF)。蛋白质组阵列是用于定量测量每孔的二至十六种蛋白的多重夹心ELISA。通过以2×2、3×3或4×4的模式将4至16种不同捕获抗体点样于96孔板的每孔来产生阵列。在夹心ELISA操作后，使整块板成像以捕获在板的每孔内的每个点样处生成的化学发光信号。每个点样处生成的信号与原始标准或样本中的靶蛋白的量成比例。
MCP-1和IL-6由脐衍生的PPDC和表皮成纤维细胞分泌(表9-1)。SDF-1α和GCP-2由成纤维细胞分泌。GCP-2和IL-8由脐衍生的PPDC分泌。通过ELISA，TGF-β2不由任一细胞类型分泌。
Figure BDA0002528558190000771
SearchlightTM多路ELISA测定法。TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1β、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8由脐衍生的PPDC分泌(表9-2和9-3)。未检出Ang2、VEGF或PDGFbb。
Figure BDA0002528558190000772
Figure BDA0002528558190000781
Figure BDA0002528558190000782
脐衍生的细胞分泌多种营养因子。这些营养因子中的一些例如HGF、bFGF、MCP-1和IL-8在血管生成中起重要作用。其他营养因子例如BDNF和IL-6在神经再生或保护方面具有重要作用。
实例10
用于端粒酶活性的测定法
端粒酶的功能是合成端粒重复序列，端粒重复序列用于保护染色体完整性并延长细胞的复制寿命(Liu,K,等人，PNAS，1999；96:5147-5152)。端粒酶由两种组分组成：端粒酶RNA模板(hTER)和端粒酶逆转录酶(hTERT)。端粒酶的调控通过hTERT而非hTER的转录进行测定。因此hTERT mRNA的实时聚合酶链反应(PCR)为用于测定细胞的端粒酶活性的可接受方法。
细胞分离
进行实时PCR实验以测定人脐带组织衍生的细胞的端粒酶产生。人脐带组织衍生的细胞依照上文实例和美国专利7,510,873中所述的实例进行制备。通常，在正常分娩后洗涤从国家疾病研究交流会(Philadelphia,Pa.)获得的脐带以去除血液和细胞碎片，并进行机械解离。然后将组织与消化酶(包括胶原酶、分散酶和透明质酸酶)一起在培养基中在37℃下温育。人脐带组织衍生的细胞根据‘012申请的实例中所示的方法进行培养。从Cambrex(Walkersville,Md)获得间充质干细胞和正常表皮成纤维细胞(cc-2509批号9F0844)。多能人睾丸胚胎癌(畸胎瘤)细胞系nTera-2细胞(NTERA-2cl.Dl)(参见，Plaia等人,StemCells，2006；24(3):531-546)购自ATCC(Manassas,Va.)，并且根据美国专利7,510,873中所示的方法进行培养。
总RNA分离
使用
Figure BDA0002528558190000792
试剂盒(Qiagen,Valencia,Ca.)从细胞提取RNA。RNA用50μl经DEPC处理的水洗脱并保存在-80℃下。使用随机六聚体与
Figure BDA0002528558190000793
逆转录试剂(AppliedBiosystems,Foster City,Ca.)以25℃下10分钟、37℃下60分钟以及95℃下10分钟，对RNA进行逆转录。将样本保存于-20℃下。
实时PCR
根据制造商的说明书(Applied Biosystems)，使用Applied Biosystems Assays-On-DemandTM(也称为
Figure BDA0002528558190000794
Gene Expression Assays)，对cDNA样本进行PCR。这种商业试剂盒广泛用于测定人细胞中的端粒酶。简而言之，使用具有ABI prism 7000SDS软件(Applied Biosystems)的7000序列检测系统，将hTert(人端粒酶基因)(Hs00162669)和人GAPDH(内对照)与cDNA和
Figure BDA0002528558190000795
Universal PCR预混液混合。热循环条件为初始50℃共2分钟和95℃共10分钟，随后为95℃共15秒和60℃共1分钟的40个循环。根据制造商的说明书分析PCR数据。
就hTert和18S RNA测定人脐带组织衍生的细胞(ATCC登录号PTA-6067)、成纤维细胞和间充质干细胞。如表10-1所示，hTert和因此端粒酶未在人脐带组织衍生的细胞中检出。
Figure BDA0002528558190000791
测定人脐带组织衍生的细胞(分离株022803，ATCC登录号PTA-6067)和nTera-2细胞，并且结果显示两个批次的人脐带组织衍生的细胞中均未表达端粒酶，而畸胎瘤细胞系显示出高水平的表达(表10-2)。
Figure BDA0002528558190000801
因此，可得出如下结论：本发明的人脐带组织衍生的细胞不表达端粒酶。
实例11
叶轮旋转瓶反应器中的微载体上的UTC的生长
材料和方法
细胞。将来自CBAT批次050604B第8代细胞的细胞解冻并在T225瓶中扩增一代。
微载体。将
Figure BDA0002528558190000802
3(GE Healthcare Life Sciences，目录号17-0485)微载体小珠在PBS中水合至少3小时并高压灭菌。
旋转瓶。具有内部顶置轴承叶轮组件的旋转瓶，100ml和250ml(Bellco,Inc.)。
汇合。汇合被定义为在代表性显微镜视野中观察到大约90％的微载体的大于大约60％的表面积覆盖有细胞。
传代。传代被定义为使用从单独旋转瓶培养物获得的汇合微载体的等分试样接种包含新鲜微载体的旋转瓶。
接种与培养。通过胰蛋白酶从T225瓶收获细胞并将4.0E+06细胞等分试样加入包含40ml培养基的100ml的叶轮或玻璃棒旋转瓶中330mg的微载体小珠中。在温育之前用5％的CO2气体冲洗瓶1分钟。接种物速度-频率为30rpm进行2分钟，每30分钟一次，持续8小时。在八小时处，将培养基体积增加到100ml并将旋转器速度设定为45rpm连续旋转并在37℃下温育。
传代。将第1代-(100ml至250ml的瓶)细胞培养八天。收集100ml的瓶中的所有微载体并使之在重力作用下与培养基分离。吸出培养基并将微载体重悬于10ml的新鲜培养基中。在上下抽吸以确保均匀分布之后，将5ml的含微载体的培养基移除并递送到250ml的旋转瓶中。还将大约660mg的新鲜水合和高压灭菌的
Figure BDA0002528558190000811
3微载体和培养基加入瓶中。将培养基体积增加到200ml，并且在温育之前用5％的CO2气体冲洗瓶1分钟。将旋转器速度设定为45rpm连续旋转并在37℃下温育。通过胰蛋白酶化来收获剩余的细胞并使用GuavaPCA仪器(Guava Technologies,Hayward,CA)进行计数。
将第2代-(250ml至250ml瓶)细胞培养六天。收集250ml的瓶中的所有微载体并使之在重力作用下与培养基分离。吸出培养基并将微载体重悬于25ml的新鲜培养基中。在上下抽吸以确保均匀分布之后，将5ml的含微载体的培养基移除并递送到250ml的旋转瓶中。还将大约660mg的新鲜水合和高压灭菌的
Figure BDA0002528558190000812
3微载体和培养基加入瓶中。将培养基体积增加到200ml，并且在温育之前用5％的CO2气体冲洗瓶1分钟。将旋转器速度设定为45rpm连续旋转并在37℃下温育。通过胰蛋白酶化来收获剩余的细胞并使用Guava PCA仪器进行计数。
培养基更换。将旋转瓶从培养物移除，并且使微载体在重力作用下沉降到瓶底。通过吸出将大约一半的培养基体积移除，并且替换为等体积的新鲜培养基。用5％的CO2气体冲洗瓶1分钟并返回培养。在第1天和第4天进行培养基更换。
活力染色。从瓶中取出1ml的等分试样并使微载体在重力作用下沉降。通过吸出将培养基移除并替换为1ml的活/死细胞染色液(Molecular Probes目录号L3224)，并且在37℃下温育15分钟。温育后，将20微升的等分试样涂覆在玻璃显微镜载片上并通过荧光显微镜法观察。活细胞染成绿色，死细胞染成红色。手动地分析显微镜视野以评价粘附于微载体上的活细胞与死细胞的分布和比率。评价至少三个显微镜视野并对活细胞的近似百分比计数。
细胞收获。从旋转瓶收集微载体，在PBS中洗涤三次，并且在两个50ml的锥形管之间均匀分布。将每管与25ml的胰蛋白酶一起在37℃下温育10分钟。用PBS将管定容到50ml的体积，并且使微载体在重力作用下沉降。通过吸出收集包含细胞的上清液并转移到预先充有2.5ml的FBS(得到使胰蛋白酶失活的5％的FBS溶液)的50ml的锥形管中。该过程重复四次，每个级分单独收集。将所有收获的细胞离心，重悬于包含血清的生长培养基中，并且使用Guava PCA仪器对细胞进行计数。
静态T-瓶培养。使用美国专利申请10/877012中陈述的方法，将从T225瓶收获的细胞的等分试样用于接种两个T225瓶并温育四天。收获细胞并通过流式细胞术进行分析
流式细胞术。使用Becton-Dickinson FACSCaliburTM仪器(Becton Dickinson,SanJose,CA)通过流式细胞术分析所收获的细胞以测定细胞表面标志物谱。所有抗体均购自BDPharmingen(SanDiego,CA)。
结果
细胞收获。表11-1示出了在旋转瓶培养中的
Figure BDA0002528558190000824
3微载体上从第九代扩增到第十一代的UTC细胞系050604B每代的收获级分、细胞收率和活力。
Figure BDA0002528558190000821
细胞动力学。表11-2示出了在旋转瓶培养中的
Figure BDA0002528558190000822
3微载体上从第九代扩增到第十一代的UTC细胞系050604B的生长动力学。该表示出了总倍增数为7.48，并且每次倍增的平均小时数为69.53(±17.52)小时。
Figure BDA0002528558190000823
活/死细胞染色。活/死细胞染色的微载体等分试样的分析表明，大多数微载体表面覆盖有染成绿色的(活)细胞，而染成红色的核(死细胞)的焦点稀疏分布。这些细胞所表现出的形态类似于静态条件中培养的细胞的形态。
流式细胞术分析。表11-3示出了由收获自旋转瓶中的微载体小珠的人脐带组织衍生的细胞(hUTC)所表达的细胞表面标志物的结果(“+阳性”或“-阴性”)，并与收获自静态T瓶中的培养物的hUTC进行比较。
该表示出了通过这两种方法制备的细胞所表达的标志物是一致的。
Figure BDA0002528558190000831
结论：将人脐带组织衍生的细胞(hUTC)培养于叶轮旋转瓶生物反应器中的
Figure BDA0002528558190000832
3微载体上。细胞在二十天内实现7.48次群体倍增，并且平均群体倍增时间为69小时。每代的细胞活力在94.4％至99.7％的范围内。培养于微载体上的hUTC上的十三种细胞表面标志物的表达分析与培养于细胞培养T瓶中的hUTC的细胞表面标志物表达一致。该实例指示微载体可用于在生物反应器系统中接种、扩增并收获hUTC。
实例12
旋转瓶中的胶原蛋白涂布的MGSA和PLGA微载体上扩增的hUTC的生长
研究了hUTC附着于带有胶原蛋白涂层的由合成吸收性生物材料制成的材料的能力，包括在旋转瓶培养中保持活力的能力以及在重新接种到静态培养中时增殖的能力。将经扩增的hUTC接种到胶原蛋白涂布或未涂布的聚-(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚(单硬脂酰基甘油酯-共-琥珀酸)(MGSA)微载体上。将含细胞的微载体在旋转瓶中培养五天，通过胰蛋白酶化来收获，并重新接种到静态培养中。
材料和方法
Figure BDA0002528558190000841
微载体制备。微载体润湿-将大约各1g的MGSA和PLGA微载体无菌地悬浮于25ml的70％乙醇中30分钟以润湿微载体。通过吸出将乙醇移除，然后用PBS冲洗微载体三次，并重悬于25ml的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
胶原蛋白涂布。通过离心使润湿的微载体(PBS)团块化，通过吸出将PBS移除，并且将微载体重悬于2.9％胶原蛋白溶液(Vitrogen 1000，Cohesion,Inc.Palo Alto,CA)中。将微载体在胶原蛋白中温育30分钟。通过吸出将残余胶原蛋白移除，并且用PBS将胶原蛋白涂布的微粒洗涤三次。
Figure BDA0002528558190000842
接种与培养该实例使用实例11中所用的材料、细胞类型、生长培养基、旋转瓶、接种与培养条件、培养基更换、活力染色和细胞收获方法。
结果
Figure BDA0002528558190000843
Figure BDA0002528558190000851
收获细胞重新接种。将从涂布和未涂布的MGSA和PLGA微载体收获的细胞以大约5,000个细胞/cm2重新接种到T225中。重新接种后四天，从这两种材料收获的细胞均增殖到超过50％的汇合度。
将扩增的hUTC接种到胶原蛋白涂布的PLGA和MGSA微载体上，在旋转瓶中培养五天，通过胰蛋白酶化来收获，并重新接种到静态培养中。从合成微载体收获的细胞超过90％有活力。重新接种的细胞在静态培养中在四天内扩增，证实它们的增殖能力得以保持。该实例证实了合成生物材料用作旋转瓶培养用微载体的能力。
实例13
连续旋转瓶培养中的微载体上的hUTC的扩增
该研究的目的是将粘附于旋转瓶中的商业微载体上的经扩增的hUTC连续培养多次群体倍增。微载体上的hUTC扩增多次群体倍增的能力可有助于模型系统放大进行hUTC的大规模制备，以用于细胞疗法应用。评价了两种hUTC分离株，即120304-在研究条件下分离、扩增并冻存，和CNTO 2476-在GMP条件下分离、扩增并冻存。还评价了商业微载体
Figure BDA0002528558190000852
1或
Figure BDA0002528558190000853
II。将冻存的细胞解冻并用于立即接种旋转瓶培养物。将细胞连续培养多代直到细胞达到大约30次的群体倍增。还将hUTC静态培养于T225瓶中作为对照。
在12.8次群体倍增时冻存的hUTC分离株120304能够被解冻，并且分别在
Figure BDA0002528558190000854
1和
Figure BDA0002528558190000855
II微载体上扩增到28.6和28.7次群体倍增。每次群体倍增的小时数在各代间是一致的，这指示稳定的对数生长，并且与T瓶生长动力学一致。在22.6次群体倍增时冻存的hUTC分离株CNTO2476能够被解冻，并且分别在
Figure BDA0002528558190000856
1和
Figure BDA0002528558190000857
II微载体上扩增到33.2和31.0次群体倍增。每次群体倍增的小时数在各代间是一致的，这指示稳定的对数生长，并且也与T瓶生长动力学一致。利用每个群体倍增数据点的所有小时的单因素方差分析进行的统计分析表明，对于所测试的所有条件，hUTC生长动力学都没有显著的差异。(p＝0.988)。对于所测试的所有条件，在最后收获时，细胞表面蛋白表达保持一致。
该实例证实了hUTC以保持细胞表面蛋白表型的稳定、一致方式在微载体上扩增到大约30次群体倍增的能力。
材料和方法
细胞。使用冻存的扩增hUTC分离株12034群体倍增(PD)12和hUTC分离株CNTO 2476批次25126078PD 22。
生长培养基。杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)-低葡萄糖(Gibco-GrandIsland,NY)、15％的FBS(HyClone-Logan UT)、青霉素/链霉素(P/S)(Gibco-Grand Island,NY)、β巯基乙醇(BME)(Sigma-St.Louis,MO)
微载体。将
Figure BDA0002528558190000861
1(GE Health Sciences-Piscataway,NJ)微载体在PBS中水合至少3小时并高压灭菌。
Figure BDA0002528558190000862
1微载体以3g/L的浓度使用。将
Figure BDA0002528558190000863
II(SoloHillEngineering,Inc.,Ann Arbor,MI)微载体在去离子水中水合至少30分钟并高压灭菌。
Figure BDA0002528558190000864
II微载体以12g/L的浓度使用。
旋转瓶。使用100ml和500ml的一次性使用、可弃型旋转瓶(Corning,Inc.-Corning,NY)。
100ml的旋转瓶中的接种和培养。将hUTC的冻存小瓶解冻，洗涤并重悬于生长培养基中。将6.6×106hUTC加入包含100ml培养基的100ml旋转瓶中的3000mg
Figure BDA0002528558190000865
1(5.0×103个细胞/cm2)中，并且置于37℃组织培养箱上并温育三至四天。将旋转板设定为60rpm连续旋转。将3.1×106hUTC加入包含100ml的培养基的100ml的旋转瓶中的1.2g
Figure BDA0002528558190000866
II(5.0×103个细胞/cm2)中，并且置于设定为60rpm连续旋转的旋转板上。将旋转板置于5％的CO2中。
培养物从一个100ml的旋转瓶向一个500ml的旋转瓶的传代。将100ml的旋转瓶从旋转板移除，并且使微载体沉降。通过吸出将培养基上清液移除。将剩余的装有贴壁细胞的微载体重悬于20ml的新鲜生长培养基中。然后通过移液管将含贴壁细胞的微载体无菌地转移到包含480ml的新鲜生长培养基和4.8g的
Figure BDA0002528558190000867
II(6g最终微载体含量)或1.2g的
Figure BDA0002528558190000868
1(1.5g的最终微载体含量)的500ml的旋转瓶中。然后将旋转瓶置于设定为60rpm连续旋转的旋转板上。将旋转板置于5％的CO2、37℃的组织培养箱中，并且温育三至四天。
培养物从一个500ml的旋转瓶向五个500ml的旋转瓶的传代。将500ml的旋转瓶从旋转板移除，并且使微载体沉降。通过吸出将培养基上清液移除。将剩余的装有贴壁细胞的微载体重悬于50ml的新鲜生长培养基中。然后通过移液管将含贴壁细胞的微载体的五份单独10ml的等分试样转移到五个单独的500ml的旋转瓶，每瓶包含490ml的新鲜生长培养基和4.8g的
Figure BDA0002528558190000871
II(6g的最终微载体含量)或1.2g的
Figure BDA0002528558190000872
1(1.5g的最终微载体含量)。然后将旋转瓶置于设定为60rpm连续旋转的旋转板上。将旋转板置于5％的CO2、37℃的组织培养箱中，并且温育三至四天。
粘附于
Figure BDA0002528558190000873
1微载体的细胞的收获。将500ml的旋转瓶从旋转板移除，并且使含贴壁细胞的微载体在重力作用下沉降。通过吸出将培养基上清液移除。将500ml的PBS加入旋转瓶中，并且使微载体在重力作用下沉降。通过吸出将PBS上清液移除。将500ml的DMEM-低葡萄糖加入旋转瓶中。然后将旋转瓶在旋转板上以60rpm温育20分钟。将旋转瓶从旋转板移除，并且使微载体在重力作用下沉降。通过吸出将DMEM-低葡萄糖上清液移除。将500ml的PBS加入旋转瓶中。然后将旋转瓶在旋转板上以60rpm温育20分钟。将旋转瓶从旋转板移除，并且使微载体在重力作用下沉降。通过吸出将PBS上清液移除。将250ml的TrypLEselect加入旋转瓶中。然后将旋转瓶在旋转板上以60rpm温育10分钟。将旋转瓶从旋转板移除，并且使微载体在重力作用下沉降。使用50ml的血清移液管，通过上下抽吸约10次来搅动微载体-TrypLETM select溶液，以使残余贴壁细胞从微载体解离。然后将250ml的PBS加入旋转瓶中，并且使微载体在重力作用下沉降。通过反复抽吸来收集包含细胞的上清液并转移到预先加载有5ml的FBS并在管开口中插有100μm的滤膜单元的多个锥形管中。将管在300rcf下离心5分钟，滗去上清液，并且将细胞重悬于生长培养基中。
粘附于
Figure BDA0002528558190000874
II微载体的细胞的收获。将500ml的旋转瓶从旋转板移除，并且使含贴壁细胞的微载体在重力作用下沉降。通过吸出将培养基上清液移除。将500ml的PBS加入旋转瓶中，并且使微载体在重力作用下沉降。将100ml的TrypLETM select加入旋转瓶中。然后将旋转瓶在旋转板上以60rpm温育10分钟。将旋转瓶从旋转板移除，并且使微载体在重力作用下沉降。使用25ml的血清移液管，通过上下抽吸约10次来搅动微载体-TrypLETMselect溶液，以使残余贴壁细胞从微载体解离。通过反复抽吸来收集包含细胞的上清液并转移到预先加载有5ml的FBS并在管开口中插有100μm的滤膜单元的多个锥形管中。将管在300rcf下离心5分钟，滗去上清液，并且将细胞重悬于生长培养基中。
活力染色。将培养基和微载体的1ml的等分试样转移到15ml的锥形管中，并且使微载体在重力作用下分离。通过吸出将培养基移除并替换为1ml的活/死细胞染色液(Molecular Probes目录号L3224)并且在37℃下温育15分钟。温育后，将20μl的等分试样涂覆在玻璃显微镜载片上并通过荧光显微镜法观察。活细胞染成绿色。手动地分析显微镜视野以评价粘附于微载体上的活细胞的分布。评价至少三个显微镜视野并对活细胞的近似百分比计数。
培养物中细胞计数-细胞核释放测定法。从旋转瓶容器中获得均匀微载体悬浮液的5ml(100ml的旋转瓶)或10ml(500ml的旋转瓶)的等分试样，并且转移到15ml的管中。使微载体在重力作用下分离并通过吸出将上清液移除。用10ml的PBS洗涤微载体一次，使微载体在重力作用下分离，并且通过吸出将PBS上清液移除。将微载体在细胞核释放溶液(包含0.1M的柠檬酸(Sigma-St.Louis,MO)的0.1％w/v的结晶紫(Sigma-St.Louis,MO))中在37℃下温育一小时。温育后，将包含微载体的细胞核释放溶液的100μl的等分试样加入100μl的PBS中。然后将该溶液的10μl的等分试样加载到血球计中，并且对所释放的细胞核计数。
培养物中细胞计数-TrypLETM测定法。从旋转瓶容器中获得均匀微载体悬浮液的5ml(100ml的旋转瓶)或10ml(500ml的旋转瓶)的等分试样，并且转移到15ml的管中。使微载体在重力作用下分离并通过吸出将上清液移除。用10ml的PBS洗涤微载体一次，使微载体在重力作用下分离，并且通过吸出将PBS上清液移除。将微载体在TrypLETM select中在37℃下温育十分钟。温育后，加入5ml的PBS，并且使微载体在重力作用下分离。通过反复抽吸来收集包含细胞的上清液并转移到预先加载有1ml的FBS的多个锥形管中。将管在300rcf下离心5分钟，滗去上清液，并且将细胞重悬于生长培养基中，并且使用Guava PCA仪器(GuavaTechnologies,Haywood,CA)取等分试样来测定细胞计数。
静态T-瓶培养。将hUTC的冻存小瓶解冻，洗涤并重悬于生长培养基中。使用US2004877012A中陈述的方法将细胞在T225中静态培养多代。
流式细胞术。使用US2004877012A中陈述的方法，利用Becton-DickinsonFACSCaliburTM仪器(Becton Dickinson,San Jose,CA)通过流式细胞术分析所收获的hUTC以测定细胞表面标志物谱。所有抗体均购自BD Pharmingen(SanDiego,CA)。
结果
Figure BDA0002528558190000891
Figure BDA0002528558190000892
Figure BDA0002528558190000893
Figure BDA0002528558190000894
Figure BDA0002528558190000901
Figure BDA0002528558190000902
在12.8次群体倍增时冻存的hUTC分离株120304能够被解冻，并且分别在
Figure BDA0002528558190000904
1和
Figure BDA0002528558190000903
II微载体上扩增到28.6和28.7次群体倍增。每次群体倍增的小时数在各代间是一致的，这指示稳定的对数生长，并且与T瓶生长动力学一致。在22.6次群体倍增时冻存的hUTC分离株CNTO2476能够被解冻，并且分别在
Figure BDA0002528558190000905
1和
Figure BDA0002528558190000906
II微载体上扩增到33.2和31.0次群体倍增。每次群体倍增的小时数在各代间是一致的，这指示稳定的对数生长，并且也与T瓶生长动力学一致。利用每个群体倍增数据点的所有小时的单因素方差分析进行的统计分析表明，对于所测试的所有条件，hUTC生长动力学都没有显著的差异。(p＝0.988)。另外，对于所测试的所有条件，在最后收获时，细胞表面蛋白表达保持一致。该数据证实了hUTC以保持细胞表面蛋白表型的稳定、一致方式在微载体上扩增到大约30次群体倍增的能力。
尽管已结合各种具体材料、程序和实例描述和例示了本发明，然而应当理解，本发明并不限于所选材料和程序的特定组合。本领域的技术人员将理解，可对这些细节作出多种改变。说明书和实例应被认为仅为示例性的，本发明的真实范围和实质由随附权利要求书限定。本申请中所提到的所有参考文献、专利和专利申请均全文以引用方式并入本文中。

Claims (23)

1.一种用于使锚着依赖性细胞生长的培养基，所述培养基包含：
氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；
维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；
盐：氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和一种或多种磷酸钠盐；
核苷：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；
胰岛素；转铁蛋白；类脂酸/硫辛酸；乙醇胺；亚硒酸钠；和一种或多种能量底物。
2.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基包含以下的一种或多种：
各0.0006g/L至0.1g/L的氨基酸；
各5×10-6g/L至0.015g/L的维生素；和
各至少0.0001g/L至至少0.02g/L的核苷。
3.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基还包含一种或多种另外的痕量矿物质。
4.根据权利要求3所述的培养基，其中所述培养基包含各5 x 10-8g/L至3 x 10-4g/L的痕量矿物质。
5.根据权利要求3所述的培养基，其中所述痕量矿物质是硝酸铁、硫酸铜和硫酸锌。
6.根据权利要求5所述的培养基，其中所述培养基包含硝酸铁(9H2O)、硫酸铜(II)五水合物(CuSO4.5H2O)和硫酸锌七水合物(ZnSO4.7H2O)。
7.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基还包含腐胺、稳定剂和/或消泡剂。
8.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基包含：
至少0.05g/L的L-精氨酸、至少0.02g/L的L-胱氨酸、至少0.2g/L的L-谷氨酰胺、至少0.01g/L的甘氨酸、至少0.02g/L的L-组氨酸、至少0.09g/L的L-异亮氨酸、至少0.09g/L的L-亮氨酸、至少0.09g/L的L-赖氨酸、至少0.02g/L的L-甲硫氨酸、至少0.05g/L的L-苯丙氨酸、至少0.03g/L的L-丝氨酸、至少0.08g/L的L-苏氨酸、至少0.009g/L的L-色氨酸、至少0.08g/L的L-酪氨酸、至少0.08g/L的L-缬氨酸、至少0.005g/L的L-半胱氨酸、至少0.0004g/L的L-丙氨酸、至少0.01g/L的L-天冬酰胺、至少0.006g/L的L-天冬氨酸、至少0.03g/L的L-谷氨酸、至少0.005g/L的L-脯氨酸和至少0.0003g/L的L-牛磺酸；
各5×10-6g/L至0.015g/L的维生素；
至少0.05g/L的无水氯化钙、至少0.1g/L的氯化钾、至少0.2g/L的硫酸镁、至少0.08g/L的磷酸二氢钠一水合物和至少0.0005g/L的磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4.7H2O)；
至少0.0001g/L的胸苷以及各至少0.005g/L的腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；以及
至少0.003g/L的胰岛素；至少0.05g/L的转铁蛋白；至少5×10-6g/L的类脂酸/硫辛酸；至少0.05g/L的乙醇胺；和至少0.00004g/L的亚硒酸钠。
9.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基还包含白蛋白。
10.根据权利要求9所述的培养基，其中所述白蛋白是牛血清白蛋白。
11.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基包含至少0.0001g/L的胸苷以及各至少0.005g/L的腺苷、胞苷和尿苷。
12.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基包含以下的一种或多种：
各0.0006g/L至0.1g/L的氨基酸；和
各5×10-6g/L至0.015g/L的维生素。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的培养基，其中所述培养基不包含外源添加的促进未分化细胞生长的因子。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的培养基，其中所述培养基不包含成纤维细胞生长因子。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的培养基，其中所述能量底物是葡萄糖或丙酮酸钠。
16.根据权利要求15所述的培养基，其中所述培养基包含至少0.8g/L的D-葡萄糖和至少0.1g/L的丙酮酸钠。
17.根据权利要求1-12中任一项所述的培养基，其中所述锚着依赖性细胞选自脐带组织衍生细胞、间充质干细胞、骨髓衍生干细胞、衍生自胎盘组织的细胞、衍生自非骨髓组织的贴壁细胞、衍生自牙齿的牙髓的细胞和衍生自羊水的细胞。
18.根据权利要求17所述的培养基，其中所述锚着依赖性细胞是脐带组织衍生细胞。
19.根据权利要求17所述的培养基，其中所述脐带组织衍生细胞分离自基本上不含血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，具有分化的潜能，表达CD13、CD90、HLA-ABC，并且不表达CD34、CD117和HLA-DR。
20.一种用于使锚着依赖性细胞生长的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-12中任一项所述的培养基和无血清营养液。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述无血清营养液包含：
氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-牛磺酸；
维生素：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素、d-生物素、吡哆素和维生素B12(氰钴胺)；
盐：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠七水合物；
核苷：腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷；以及
胰岛素；转铁蛋白；类脂酸/硫辛酸；乙醇胺；和亚硒酸钠。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述无血清营养液包含以下的一种或多种：
各至少0.0001g/L至至少0.03g/L的氨基酸；
各5×10-6g/L至0.001g/L的维生素；
0.0005g/L至0.001g/L的磷酸盐；和
各至少0.0001g/L至至少0.005g/L的核苷。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的试剂盒，其中所述无血清营养液还包含腐胺、稳定剂和/或消泡剂。
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