JP6404227B2 - ｈＵＴＣ増殖用栄養強化培地 - Google Patents

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Description

本出願は、例えば、臍帯組織由来細胞などの付着依存性細胞の増殖のための栄養強化培地に関する。
同種細胞療法（allogeneic cell therapy）用製品のために、細胞又は組織がドナーから採取され、採取物は患者への投与の前に更に処理される。一般的に、非相同性細胞療法（non-homologous cell therapy）用製品の製造プロセスは、以下の、細胞バンクバイアルを解凍し、細胞を増殖させて生産容器に接種する工程と、生産容器内で細胞を産生する工程と、血清及びトリプシンなど、細胞の産生中に使用される不要な不純物を除去する工程と、細胞を濃縮する工程と、細胞を最終処方緩衝液内へ処方する工程と、細胞を凍結させる工程と、を含む。かかる製造プロセスは、大変複雑で費用が高い。例えば、細胞療法用途の細胞は、一般的に、血清が補充された増殖培地において培養及び増殖される。プロセスにおいて使用される血清、培地、及びその他の消耗品が高コストであるために細胞療法の製品のコストは非常に高い。栄養的な制約、培養中の細胞副産物の蓄積、物理的環境などを含む多様な因子により、細胞が高密度に増殖することが制限される場合がある。したがって、細胞を高細胞密度に増殖することによって生産容器から産生される細胞の体積を増加させることが望まれている。
以前、例えば、ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）などの付着依存性細胞は、１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する細胞増殖培地を連続稼動第３日目に交換することによって高細胞密度に増殖されることが示された。しかしながら、かかる培地交換は、血清が高コストであることと、産生のために血清を多量に使用することと、操作処置が追加されることと、により望ましくない。したがって、培地交換のあるプロセスは、商業的に実現可能ではない。
細胞増殖培地の交換が不要であり、商業的に実現可能である、細胞を増殖する新しい方法が必要とされている。
本発明の一実施形態は、（１）アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、（２）ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、（３）塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩と、（４）ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、（５）インスリンと、（６）トランスフェリンと、（７）リポ酸／チオクト酸と、（８）エタノールアミンと、（９）亜セレン酸ナトリウムと、１種又は２種以上のエネルギー源と、を含む、付着依存性細胞を増殖させるための培養培地である。
一実施形態において、培養培地は、
少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．２ｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．００９ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００４ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００６ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも０．０３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−タウリンと、それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌのビタミン類と、
少なくとも約０．０５ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）と、
少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン並びにそれぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも０．００３ｇ／Ｌのインスリン、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのトランスフェリン、少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌのリポ酸／チオクト酸、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのエタノールアミン、及び少なくとも約０．００００４ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムと、を含む。
本発明の別の実施形態は、
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム７水和物と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、付着依存性細胞を増殖させるための無血清培養液である。
本発明はまた、付着依存性細胞を増殖させるためのキットを提供する。キットは、培養培地及び／又は無血清培養液を含む。培養培地、無血清溶液、及びキットは、（例えば、臍帯組織由来細胞などの）付着依存性細胞を増殖させる方法において使用することができる。
したがって、本発明の別の実施形態は、単離された臍帯組織由来細胞を培養する方法であって、
アミノ酸類、ビタミン類、塩類、ヌクレオシド類、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムを含む培養培地におけるマイクロキャリア上に播種された臍帯組織由来細胞を増殖させる工程であって、該培養培地は、該細胞が所望の初期個体群密度に達することが可能な十分な期間にわたって、血清が補充される、工程と、
該細胞が該所望の初期個体群密度に達した後、無血清培養液を添加する工程であって、該無血清培養液は、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、リポ酸／チオクト酸、亜セレン酸ナトリウムを含む、工程と、
該細胞が所望の最終個体群密度に達することが可能な十分な期間にわたって該細胞を増殖させる工程と、を含む。
方法は、追加の工程を更に含んでもよい。一実施形態において、方法は、マイクロキャリア上に細胞を播種する工程を更に含む。別の実地形態では、方法は、培養後に細胞を単離する工程を更に含む。一実施形態において、所望の初期個体群密度は、３〜４日後に達成される。方法は、培地交換を必要としない。方法は、ローラーボトル培養システムにおいて実施することができ、マイクロキャリアは、アミン処理された表面を有してもよい。
本方法において使用される臍帯組織由来細胞は、実質的に血液を含んでいないヒト臍帯組織から単離され、培養中の自己再生及び自己増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、ＣＤ１３、ＣＤ９０、ＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、及びＨＬＡ−ＤＲを発現しない。一実施形態において、細胞は、ｈＴｅｒｔ又はテロメラーゼを発現しない。培養の前及び後の細胞の特性は実質的に同じである。一実施形態において、培養の前及び後の細胞の特性は同じある。
一実施形態において、本方法において使用される培養培地は、
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及び１種又は２種以上のエネルギー源（例えば、Ｄ−グルコース、及びピルビン酸ナトリウムなど）と、を含む。
別の実施形態において、本方法において使用される培養培地は、
少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．２ｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．００９ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００４ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００６ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも０．０３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−タウリンと、
それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌのビタミン類と、
少なくとも約０．０５ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）と、
少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン並びにそれぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも０．００３ｇ／Ｌのインスリン、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのトランスフェリン、少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌのリポ酸／チオクト酸、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのエタノールアミン、及び少なくとも約０．００００４ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムと、を含む。
本方法において使用される培養培地は、２〜２０％のＦＢＳが補充されている。一実施形態において、培養培地は、約７．５％、約１０％、又は約１５％のＦＢＳが補充されている。
一実施形態において、本方法において使用される無血清培養液は、
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム７水和物と、
微量のミネラル類である硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、リポ酸／チオクト酸、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む。
培養培地及び無血清培養液はまた、更なる成分を含有してもよい。例えば、培養培地及び／又は無血清培養液は、プトレシン、安定化剤、及び／又は消泡剤を更に含んでもよい。
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。
以下の例示的実施形態の詳細な説明において、本明細書の一部を構成する添付図面が参照されている。これらの実施形態は、当業者が本発明を実践できるように十分に詳細に説明されおり、本発明の趣旨又は範囲を逸脱することなく、他の実施形態を用いることができること、及び論理構造的、機械的、電気的及び化学的変更がなされ得ることが理解されよう。当業者が本明細書に記載された実施形態を実践するために必要でない詳細な説明を避けるために、当業者に既知の特定の情報の説明が省略されている場合がある。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で解釈されるべきではない。
一態様において、本発明は、血清含有培地内のマイクロキャリアに付着した、例えば、ヒト臍帯組織由来細胞（「ｈＵＴＣ」）などの付着依存性細胞を、連続稼動の途中で無血清培養液による流加培養によって培地交換をせずに高細胞密度に増殖させるプロセスを提供する。本プロセスによって、細胞は、細胞の生物学的機能に影響を与えること無く、高細胞密度に増殖することができる。本発明により、産生バイオリアクターからの収量が増加するので、経済的及び商業的利点がもたらされる。
別の態様では、本発明は、付着依存性細胞を、好ましくは培地交換の必要性なしにスピナーフラスコ内で増殖させるのに好適である培養培地及び培養液を提供する。
一実施形態において、本発明は、培地交換なしでスピナーフラスコ内でｈＵＴＣを高密度に増殖させるための栄養強化培地及び濃縮された無血清培養液の組成を開示する。この方法により、血清の使用量が減少し、体積生産性が増加し、製造コストが低下する。特に、本方法は、培地交換によって倍加を増大させることができる。
別の実施形態において、本発明は、アミノ酸類（培養中に消費されたアミノ酸を補充するため）、ビタミン類、塩類（培養中の浸透圧バランスを維持するため）、ヌクレオシド類、インスリン、トランスフェリン、並びに任意追加的にであるが好ましくはエタノールアミン及び亜セレン酸ナトリウムを含む、無血清培養液を提供する。本発明により、本プロセスは、大規模なバイオリアクターへ拡張することができる。更に別の実施形態において、本発明は、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、ヌクレオシド類、インスリン、トランスフェリン、並びに任意追加的にではあるが好ましくはエタノールアミン及び亜セレン酸ナトリウムを含む、培養培地を提供する。使用前に、この培養培地は、血清が補充されてもよい。
本発明の別の態様は、スピナーフラスコ内の懸濁培養において血清含有増殖培地を栄養強化することによって、マイクロキャリアに付着したｈＵＴＣを高細胞密度に増殖させる方法であり、培養物に無血清の栄養物を供給する工程も開示される。本方法により、培地交換が排除され、ｈＵＴＣを高密度に増殖させることができる。
本明細書及び特許請求の範囲を通して様々な用語が使用される。これらの用語には、別途記載のない限り、当該技術分野における通常の意味が与えられるものとする。他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈される。
一実施形態において、本発明に使用される細胞は、一般的に分娩後細胞（postpartum cell）又は分娩後由来細胞（postpartum-derived cell）（ＰＰＤＣ）と称される。これらの細胞は、より具体的には、「臍由来細胞」若しくは「臍帯由来細胞」（ＵＤＣ）、又は「臍帯組織由来細胞」（ＵＴＣ）である。更には、該細胞は、幹細胞又は前駆細胞であるとして説明することができ、後者の用語は広義に使用される。「由来する」という用語は、その細胞が、それらの生物学的起源から得られ、インビトロで、増殖されているか又は他の方法で操作されている（例えば、増殖培地中で培養されて、その個体群を増殖させ、かつ／又は細胞株を産生する）ことを示すために使用される。臍幹細胞のインビトロ操作、及び本発明の臍由来細胞の独自の特徴が、以下で詳細に説明される。
幹細胞は、単一細胞の、自己再生する能力、並びに自己再生前駆細胞、非自己再生前駆細胞、及び最終分化細胞を含めた子孫細胞を産生するために分化する能力の双方によって定義される、未分化細胞である。幹細胞はまた、インビトロで、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）から、様々な細胞系統の機能的細胞へと分化する能力によって、並びに、植え込み後に、複数の胚葉の組織を生じさせる能力、及び胚盤胞内への注射後に、全てではないが殆どの組織に実質的に寄与する能力によって特徴付けられる。
幹細胞は、その発達能によって、（１）分化全能性、（２）多能性、（３）多分化能性、（４）少能性、及び（５）分化単能性として分類される。分化全能性細胞は、全ての胚細胞型及び胚体外細胞型を生じさせることが可能である。多能性細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることが可能である。多分化能性細胞は、細胞系統の小集団で、特定の組織、臓器、又は生理系内の全てを生じさせることが可能であるものを含む。例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血球限定の少能性前駆細胞、並びに血液の正常構成要素である全ての細胞型及び成分（例えば、血小板）を含む後代を産生することができる。少能性細胞は、多分化能性幹細胞より多くの制限された細胞系統小集団を生じさせることができる。分化単能性細胞は、単一細胞系統（例えば、精子形成幹細胞）を生じさせる能力がある。
幹細胞はまた、それらの幹細胞を得ることができる供給源に基づいて分類される。成体幹細胞は、全般的には、複数の分化細胞型を含む組織内に見出される、多分化能の未分化細胞である。成体幹細胞は、自己再生することができる。通常の状況下では、成体幹細胞はまた、その細胞が起源とする組織の、特殊化した細胞型、また恐らくは他の組織型を産生するように、分化することもできる。胚幹細胞は、胚盤胞期の胚の内部細胞塊からの、多能性細胞である。胎生幹細胞は、胎児組織又は胎膜を起源とする幹細胞である。分娩後幹細胞は、出産後に入手可能な胚体外組織、すなわち、臍帯を実質的に起源とする、多分化能性若しくは多能性の細胞である。これらの細胞は、迅速な増殖、及び多くの細胞系統への分化に関する潜在能力を含む、多能性幹細胞に固有の特徴を保有することが分かっている。分娩後幹細胞は、血液由来の（例えば、臍帯血から得られる幹細胞のような）又は非血液由来（例えば、臍帯及び胎盤の非血液組織から得られるような）ものとすることができる。
培養中の細胞を説明するうえで様々な用語が用いられる。「細胞培養物」は、一般的には、生存生物から取り出され、管理された条件下で増殖する（「培養中の」又は「培養される」）細胞を指す。「初代細胞培養物」は、最初の継代培養前に、（複数の）生体から直接取り出された細胞、組織、又は臓器の培養物である。細胞は、細胞の増殖及び／又は分裂を促進する条件下で、増殖培地内に置かれると、培養中「増殖」して、より大きな細胞集団を形成する。細胞を培養中増殖させる場合、細胞増殖の速度は、細胞の数が倍加するのに必要な時間の量によってしばしば測定される。これは「倍加時間」と呼ばれる。
用語「細胞株」とは、一般的に初代細胞培養の１つ又は２つ以上の継代培養物によって形成される細胞集団を指す。継代培養の各回は、継代数と呼ばれる。細胞は、継代培養される時、「継代された」と呼ばれる。細胞の特定の母集団又は細胞株は、継代された回数でよばれたり、特徴付けられたりする場合がある。例えば、１０回継代された培養細胞集団はＰ１０培養物と呼ばれる場合がある。初代培養、すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養はＰ０と称される。最初の継代培養の後、細胞は、２次培養（Ｐ１又は継代数１）といわれる。２回目の継代培養の後では、細胞は、３次培養（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。継代の期間中には、多くの集団倍加が存在し得るため、培養物の集団倍加の数は、継代の数よりも大きいことが、当業者には理解されるであろう。それぞれの継代間の期間における細胞の増殖（すなわち、集団倍加数）は、播種密度、基質、培地、増殖条件、及び継代間の時間等を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存する。
「分化」は、機能特化していない（「傾倒していない」）又は機能特化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋肉細胞などの機能特化した細胞の特徴を取得するプロセスである。「分化した」細胞とは、細胞の系統内でより機能特化した（傾倒した）状態にある細胞である。分化のプロセスに用いられる際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化することができない、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。「脱分化」とは、細胞が細胞の系統内においてより機能特化（又は傾倒）していない状態に戻るプロセスを指す。本明細書で使用する際、細胞の「系統」とは、細胞の遺伝、すなわち、その細胞がどの細胞に由来し、どのような細胞を発生させることができるかを定義する。細胞の系統により、発生及び分化の遺伝体系内に細胞を位置付けることができる。
広義では、「前駆細胞」は、それ自身よりも分化した後代を産生する能力を有し、かつ、前駆体のプールを補充する能力も保持する細胞である。その定義によれば、幹細胞自体もまた、最終分化細胞へより近い前駆体であるため、前駆細胞である。以下でより詳細に説明されるように、本発明の細胞に言及する場合、この広い意味での前駆細胞の定義を使用することができる。より狭義には、前駆細胞は、分化経路での中間体である細胞として定義される場合が多く、すなわち、前駆細胞は、幹細胞から生じるものであり、成熟細胞型又は細胞型の小集団を産生する際の中間体である。このタイプの前駆細胞は、一般的に自己再生が不可能である。したがって、本明細書でこのタイプの細胞が言及される場合には、その細胞は「非再生前駆細胞」、又は「中間的前駆体若しくは前駆体細胞」と称される。
一般的に、「栄養因子」は、細胞の生存、成長、増殖、及び／又は成熟を促進するか、あるいは細胞の活性の増大を刺激する物質として定義される。
本明細書で使用される用語「標準増殖条件」は、５％のＣＯ２を含み、約１００％の相対湿度に維持された標準大気において、３７℃で細胞を培養することを指す。前述の条件は、培養にとって有用であるが、そのような条件は、細胞を培養するために当該技術分野において利用可能な選択肢を認識する当業者によって、変更することが可能である点を理解されたい。
本明細書で使用される用語「単離する」は、一般に、その自然環境から分離されている細胞を指す。この用語は、その自然環境からの全体的な物理的分離、例えばドナー動物からの除去を含む。好ましい実施形態において、単離細胞は組織内に存在しない。すなわち、単離細胞は、その細胞が通常は接触している近隣細胞から分離又は切り離されている。好ましくは、細胞は細胞懸濁液として投与される。本明細書で使用される語句「細胞懸濁液」は、培地に接触していて、かつ、例えば、組織片を穏やかな粉砕にかけることによって、切り離されている細胞を含む。
本発明の一実施形態は、単離された付着依存性細胞を本発明の培養培地及び無血清培養液を利用して培養する方法である。単離された付着依存性細胞（例えば、臍帯組織由来細胞など）を培養する方法は、少なくとも１種のキャリア粒子、例えばマイクロキャリア上で細胞を培養する工程を提供する。マイクロキャリアは、天然又は合成的に誘導された材料からなってもよい。例としては、コラーゲン系のマイクロキャリア、デキストラン系のマイクロキャリア、又はセルロース系のマイクロキャリア、並びにガラス、セラミックス、ポリマー（ポリスチレンなど）、又は金属が挙げられる。マイクロキャリアは、タンパク質を含まなくてもよく、又は例えばコラーゲンによってタンパク質コーティングされてもよい。更なる態様において、マイクロキャリアは、マイクロキャリアへの細胞の結合性を高め、かつマイクロキャリアからの細胞の放出を高める化合物から構成されてもよく、又はその化合物でコーティングされてもよく、それらの化合物としては、ヒアルロン酸ナトリウム、（ポリ（モノステアロイルグリセリド・コ−コハク酸）、ポリ−Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、リジン、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビトロネクチン、及びコラーゲンが挙げられるが、それらに限定されない。更なる例として、低レベルの生物学的に適切な電気を生じる、亜鉛と銅の微粒子ガルバニ対（particulate galvanic couple）を有するマイクロキャリアのような微少電流を有するマイクロキャリア、又は常磁性のアルギン酸カルシウムマイクロキャリアのような常磁性のマクロキャリアが挙げられる。本方法は、ローラーボトルシステムにおいて実施することができる。
本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物学的システムに限定されるものではなく、これらは無論のこと変更可能であることは理解されるはずである。また、本明細書において使用される用語は、あくまで特定の実施形態を説明することを目的としたものに過ぎず、限定的なものではない点も理解されるはずである。本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について特に明らかに断らないかぎり、複数の指示対象を含むものである。したがって、例えば、「ａ ｃｅｌｌ」と言う場合には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせなどを含む。
「マイクロキャリア」は、培養中の付着依存性細胞の付着及び増殖に有用な粒子、ビーズ、又はペレットを指す。マイクロキャリアは以下の特性を有する。（ａ）（マイクロキャリア又は細胞に有意なせん断損傷を引き起こさない撹拌速度での）懸濁培養において使用可能な程度に十分に小さい、（ｂ）中実である、あるいは表面に多孔質コーティングを有する中実コアを有している、及び（ｃ）表面（多孔質キャリアの場合は外側表面及び内側表面）は、正又は負に帯電していてもよい。一態様では、マイクロキャリアは、全般的に、約１５０〜３５０μｍの粒子直径を有し、約０．８〜２．０ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。代表的な有用なマイクロキャリアとして、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）２、又はＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。
別の態様では、マイクロキャリアは中実キャリアである。中実キャリアは、接着性細胞（例えば、付着依存性細胞）に特に好適である。キャリアの粒子はまた、多孔性マイクロキャリアであってもよい。例としては、例えば、低レベルの生物学的に適切な電気を生じる、亜鉛と銅の微粒子ガルバニ対を有するマイクロキャリアのような微少電流を有するマイクロキャリア、又は常磁性のアルギン酸カルシウムマイクロキャリアのような常磁性のマクロキャリアが更に挙げられる。
「多孔性マイクロキャリア」は、培養中の付着依存性細胞の付着及び増殖に有用な粒子を指す。多孔性マイクロキャリアは以下の特性を有する。（ａ）（マイクロキャリア又は細胞に有意なせん断損傷を引き起こさない撹拌速度での）懸濁培養において使用可能な程度に十分小さい、（ｂ）細胞を粒子の内部空間へと遊走させるのに十分な大きさの孔と内部空間とを有する、及び（ｃ）（外側及び内側）表面が、正又は負に帯電していてもよい。一連の実施形態において、キャリアは（ａ）全般的に約１５０〜３５０μｍの粒子直径を有し、（ｂ）約１５μｍ〜約４０μｍの平均孔開口直径を有する孔を有し、（ｃ）約０．８〜２．０ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。幾つかの実施形態において、ＤＥＡＥ（Ｎ,Ｎ−ジエチルアミノエチル）基により正電荷がもたらされる。有用な多孔性マイクロキャリアとして、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １（登録商標）及びＣｙｔｏｐｏｒｅ ２（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．））が挙げられるがこれらに限定されない。
「付着依存性細胞」は、組織培養で複製するために、表面（例えば、組織培養フラスコ表面又はマイクロキャリア粒子表面）に付着する必要のある、哺乳類細胞を含む細胞である。
本明細書において使用される、量、時間の長さなどの測定可能な値を指す際の用語「約」は、具体的に示された値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、いっそうより好ましくは±０．１％の変動を含むことを意味するが、かかる変動は開示される方法を実施するうえで適切なものである。
Ｉ．培養培地及び無血清の栄養供給溶液
本発明により、栄養強化培地及び無血清の濃縮栄養供給溶液が提供される。その培地及び無血清培養液を使用して高密度に細胞を増殖させることができる。好ましい実施形態において、その培地及び無血清培養液を使用して、例えば、ｈＵＴＣなどの付着依存性細胞を、スピナーフラスコ中でより低い血清消費量で高密度に増殖することができる。
一実施形態において、培養培地及び無血清培養液は、臍帯組織由来細胞の増殖用に使用される。別の実施形態において、培養培地及び無血清培養液は、前駆細胞の増殖に好適であり、その前駆細胞として、間葉系幹細胞、骨髄由来幹細胞、胎盤組織由来細胞、例えば、脂肪組織、筋肉組織、内乳動脈由来細胞を含む血管、歯の歯髄由来細胞、羊水由来細胞、及び新生児包皮線維芽細胞を含む線維芽細胞などの非骨髄組織由来接着性細胞が挙げられるがそれらに限定されない。
Ａ．培養培地
本発明の一態様は、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、ヌクレオシド類、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、Ｄ−グルコース、及びピルビン酸ナトリウムを含む培養培地である。
一実施形態において、培養培地は、共通のＬ−アミノ酸類を含む。別の実施形態において、培養培地は、以下のアミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、並びに任意追加的にＬ−システイン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンを含む。代替の実施形態において、培養培地は、それぞれが約０．０００６ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌのアミノ酸を含む。
更に別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．１ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．３ｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約０．０２ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．１ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．１ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．０７ｇ／ＬのＬ−バリン、及び任意追加的に少なくとも約０．００７ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００５ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００６ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも０．０３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．０００６ｇ／ＬのＬ−タウリンを含む。
代替の実施形態において、培養培地は、約０．０９７０５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、約０．０６７７９ｇ／ＬのＬ−シスチン、約０．００９２２４ｇ／ＬのＬ−システイン、約０．５８４ｇ／ＬのＬ−グルタミン、約０．０３１１２５ｇ／Ｌのグリシン、約０．０４８２８８ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、約０．１６３７１３ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、約０．１６３７１３ｇ／ＬのＬ−ロイシン、約０．１６８０７ｇ／ＬのＬ−リシン、約０．０３６７４８ｇ／ＬのＬ−メチオニン、約０．０７３６９５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、約０．０５１４５ｇ／ＬのＬ−セリン、約０．１０８６０９ｇ／ＬのＬ−トレオニン、約０．０１８４５７ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、約０．１２１８１３ｇ／ＬのＬ−チロシン、約０．１１１１０５ｇ／ＬのＬ−バリン、約０．０００６６８ｇ／ＬのＬ−アラニン、約０．０３１９７８ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、約０．００８０ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、約０．０５４７２８ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、約０．０２４０３ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び約０．０００８４４ｇ／ＬのＬ−タウリンを含む。
培養培地は、１種又は２種以上のビタミン類を更に含む。一実施形態において、培養培地は、少なくとも以下のビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、並びに任意追加的にｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）を含む。培地は、ビタミンＣ及びビタミンＡを更に含んでもよい。別の実施形態において、培養培地は、それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌのビタミン類を含む。一実施形態において、培養培地は、約０．００４３３８ｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、約０．００６０９４ｇ／Ｌの塩化コリン、約０．００４３０２ｇ／Ｌの葉酸、約０．００９５６８ｇ／ＬのＩ−イノシトール、約０．００４３０２ｇ／Ｌのナイアシンアミド、約０．００４１５３ｇ／Ｌのピリドキサル、約０．０００４３１ｇ／Ｌのリボフラビン、約０．００４３０４ｇ／Ｌのチアミン、約３．７５Ｅ−０５ｇ／Ｌのｄ−ビオチン、約１．８５Ｅ−０５ｇ／Ｌのピリドキシン、及び約０．０００１０２ｇ／ＬのビタミンＢ１２（シアノコバラミン）を含む。
培養培地は、１種又は２種以上の無機塩類を更に含む。一実施形態において、培養培地は、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩を含む。別の実施形態において、培養培地は、無水塩化カルシウム、塩化カリウム、無水硫酸マグネシウム、第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び任意追加的に第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）を含む。使用される塩に応じて、培養培地は、少なくとも約０．００５ｇ／Ｌ〜最少で約７ｇ／Ｌの塩類を含んでもよい。一実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び任意追加的に少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）を含む。別の実施形態において、培養培地は、約０．２ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、約０．４ｇ／Ｌの塩化カリウム、約０．９７６７ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも約０．１３ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、約６．４ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、及び任意追加的に少なくとも約０．００２ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）を含む。
培養培地は、ヌクレオシド類を更に含む。一実施形態において、培養培地は、核酸誘導体（ヌクレオシド類）チミヂン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンを含む。代替の実施形態において、培地は、それぞれ少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌ〜少なくとも約０．０２ｇ／Ｌのヌクレオシド類を含む。一実施形態において、培地は、少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン、それぞれ最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンを含む。別の実施形態において、培地は、約０．０００４５ｇ／Ｌのチミジン、それぞれが約０．０１５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンを含む。
一実施形態において、培養培地は、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、及びセレン酸ナトリウムを含む。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．００３ｇ／Ｌのインスリンを含む。別の実施形態において、培養培地は、約０．０１ｇ／Ｌのインスリンを含む。代替の実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．０５ｇ／Ｌのトランスフェリンを含む。別の実施形態において、培養培地は、約０．０５５ｇ／Ｌのトランスフェリンを含む。更に別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌのエタノールアミンを含む。代替の実施形態において、培養培地は、約０．０２ｇ／Ｌのエタノールアミンを含む。一実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．００００４ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムを含む。別の実施形態において、培養培地は、約０．００００６７ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムを含む。更に別の実施形態において、培養培地は、インスリン、トランスフェリン、及びエタノールアミンを更に含まない。
本発明の一実施形態は、
アミノ酸類：Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、ビタミン類：Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、塩類：塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩と、ヌクレオシド類（核酸誘導体）：チミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、インスリンと、トランスフェリンと、エタノールアミンと、亜セレン酸ナトリウムと、１種又は２種以上のエネルギー源と、を含む、培養培地である。一実施形態において、この培養培地は、それぞれが約０．０００６ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌのアミノ酸類を含む。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．２ｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．００９ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００４ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００６ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも０．０３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−タウリンを含む。代替の実施形態において、培養培地は、それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌのビタミン類を含む。一実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．００５ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約０２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）を含む。別の実施形態において、培地は、それぞれが少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌ〜少なくとも約０．０２ｇ／Ｌのヌクレオシド類を含む。一実施形態において、培地は、少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン、それぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンを含む。一実施形態において、培養培地は、少なくとも０．００５ｇ／Ｌのインスリン、及び少なくとも０．０３ｇ／Ｌのトランスフェリン、少なくとも０．０１ｇ／Ｌのエタノールアミン、及び少なくとも約０．００００４ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムを含む。１種又は２種以上のエネルギー源は、Ｄ−グルコース及びピルビン酸ナトリウムであってもよい。
別の実施形態において、培養培地は、（１）アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、（２）ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、（３）塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩と、（４）ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、（５）インスリンと、（６）トランスフェリンと、（７）リポ酸／チオクト酸と、（８）エタノールアミンと、（９）亜セレン酸ナトリウムと、（１０）１種又は２種以上のエネルギー源と、を含む。
本発明の一実施形態は、培養培地は、アミノ酸類：Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、ビタミン類：Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、塩類：塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩と、ヌクレオシド類（核酸誘導体）：チミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、リポ酸／チオクト酸と、微量のミネラル類である硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸銅、硫酸亜鉛と、１種又は２種以上のエネルギー源と、を含む。一実施形態において、培養培地は、それぞれが約０．０００６ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌのアミノ酸を含む。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．２ｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．００９ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００４ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００６ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも０．０３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−タウリンを含む。代替の実施形態において、培養培地は、それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌのビタミン類を含む。一実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム（無水）、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び少なくとも約０．００５ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）を含む。別の実施形態において、培地は、それぞれが少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌ〜少なくとも約０．０２ｇ／Ｌのヌクレオシド類を含む。一実施形態において、培地は、少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン、それぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン及びグアノシンを含む。１種又は２種以上のエネルギー源は、Ｄ−グルコース及びピルビン酸ナトリウムであってもよい。
微量のミネラルの亜セレン酸ナトリウムに加えて、特定の実施形態において、培養培地は、１種又は２種以上の追加的な微量のミネラル類を更に含む。一実施形態において、培地は、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸銅、及び硫酸亜鉛を更に含む。一実施形態において、培地は、硝酸鉄（ＩＩＩ）（９Ｈ２Ｏ）、硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、及び硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を更に含む。微量のミネラル類は、それぞれの微量のミネラル類が約５×１０−８ｇ／Ｌ〜約３×１０−４ｇ／Ｌｇの範囲の量で存在してもよい。代替の実施形態において、培地は、約０．００１ｇ／Ｌの硝酸鉄（ＩＩＩ）（９Ｈ２Ｏ）、約９．３３Ｅ−０８ｇ／Ｌの硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、及び３．２４Ｅ−０５ｇ／Ｌの硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を更に含む。
更に、培地は、培養液の少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌを含んでもよいリポ酸／チオクト酸を更に含んでもよい。一実施形態において、培地は、約０．００００１５ｇ／Ｌのリポ酸／チオクト酸を更に含んでもよい。
任意追加的に、培地は、プトレシン、アルブミン、安定化剤、及び／又は消泡剤を更に含んでもよい。一実施形態において、アルブミンは、ウシ血清アルブミンである。一実施形態において、ウシ血清アルブミンは、脂質の多いウシ血清アルブミンである、市販のＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の形態で提供される。別の実施形態において、培地は、市販の安定化剤／消泡剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を更に含む。
培養培地の代表的な好適な実施形態は以下の表に示される。
Figure 0006404227
Figure 0006404227
これらの培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プトレシン、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を更に含んでもよい。具体的には、実施形態Ａについては、培地は、３．０２Ｅ−０５ｇ／Ｌのプトレシン、２．５ｇ／ＬのＢＳＡ、及び０．０１５ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を更に含んでもよい。同様に実施形態Ｂについては、無血清培養液は、少なくとも約１Ｅ−０５ｇ／Ｌのプトレシン、１ｇ／ＬのＢＳＡ、及び少なくとも０．００５ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を更に含んでもよい。一実施形態において、培地は、例えば、３．０２Ｅ−０５ｇ／Ｌのプトレシン、２．５ｇ／ＬのＢＳＡ、及び０．０１５ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８のようなプトレシン及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を更に含む。
本発明の培養培地は、少なくとも０．８ｇ／ＬのＤ−グルコース及び少なくとも０．１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを更に含んでもよい。一実施形態において、本発明の培養培地は、約１ｇ／ＬのＤ−グルコース及び約０．１１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを更に含む。
本発明の一実施形態において、培養培地は、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又は新生仔ウシ血清（ＮＣＳ）などの血清が補充されている。血清含量は、培地の全容積の０（無血清培地）〜２０％の濃度の範囲に及んでもよい。一実施形態において、培地は、培地の調製中、血清（例えば、ＦＢＳなど）で補充されている。別の実施形態において、培地は、（例えば、血清（例えば、ＦＢＳ）を含む溶液の添加によってなど）使用直前に補充されている。一実施形態において、培養培地は、好ましくは、約２〜１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、あるいは約２〜約１０％、あるいは約３〜約１２％、あるいは約５〜約１５％、あるいは約４〜約１０％のＦＢＳが補充されている。選択された実施形態において、培養培地は、約７．５％、約１０％、又は約１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳが補充されている。
Ｂ．無血清培養液
本発明の別の態様は、アミノ酸類と、ビタミン類と、塩類と、ヌクレオシド類と、インスリンと、トランスフェリンと、エタノールアミンと、亜セレン酸ナトリウムと、を含む、無血清培養液である。本明細書で使用される場合、培養液に関連して、用語「無血清の」は、培養培地に添加する前、培養液が血清を含有しないことを意味する。別途記載のない限り、無血清培養液の成分に関して開示された量は、無血清培養液が培養物に添加された後のそれぞれの成分の重量の増加分の測定に基づいている。
一実施形態において、無血清培養液は、一般的な２０種のＬ−アミノ酸類を含む。別の実施形態において、無血清培養液は、アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、並びに任意追加的にＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンを含む。一実施形態において、培養液は、それぞれが少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌ〜少なくとも約０．０３ｇ／Ｌのこれらのアミノ酸を含む。別の実施形態において、無血清培養液は、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．００８ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．００３ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．０００８ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．０００１ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００８ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．００８ｇ／ＬのＬ−タウリンを含む。
代替の実施形態において、無血清培養液は、約０．０１３ｇ／ＬのＬ−アルギニン、ＨＣｌ、約０．００５ｇ／ＬのＬ−シスチン、２ＨＣｌ、約０．００９ｇ／ＬのＬ−システイン、ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、約０．００１ｇ／Ｌのグリシン、約０．００６ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、約０．０５９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、約０．０５９ｇ／ＬのＬ−ロイシン、約０．０２２ｇ／ＬのＬ−リシン、ＨＣｌ、約０．００７ｇ／ＬのＬ−メチオニン、約０．００８ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、約０．００９ｇ／ＬのＬ−セリン、約０．０１３ｇ／ＬのＬ−トレオニン、約０．００２ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、約０．０１８ｇ／ＬのＬ−チロシン、２Ｎａ、２Ｈ２Ｏ、約０．０１８ｇ／ＬのＬ−バリン、約０．００１ｇ／ＬのＬ−アラニン、約０．０３２ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、Ｈ２Ｏ、約０．００８ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、約０．０５５ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、約０．０２４ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び約０．０００８のＬ−タウリンを含む。アミノ酸類は、培養中に消費されたアミノ酸を補充させると考えられる。
無血清培養液は、１種又は２種以上のビタミン類を更に含む。一実施形態において、無血清培養液は、少なくとも以下のビタミン類：Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）を含む。培養液は、ビタミンＣ及びビタミンＡを更に含んでもよい。一実施形態において、培養液は、それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜０．００１ｇ／Ｌの１種又は２種以上のビタミン類を含む。一実施形態において、無血清培養液は、少なくとも約０．０００１ｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、少なくとも約０．０００８ｇ／Ｌの塩化コリン、少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌの葉酸、少なくとも約０．０００８ｇ／ＬのＩ−イノシトール、少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのナイアシンアミド、少なくとも約０．００００５ｇ／Ｌのピリドキサル、少なくとも約１×１０−５ｇ／Ｌのリボフラビン、少なくとも約０．００００１ｇ／Ｌのチアミン、少なくとも約１×１０−５ｇ／Ｌのｄ−ビオチン、少なくとも約１×１０−５ｇ／Ｌのピリドキシン、及び少なくとも約１×１０−５ｇ／ＬのビタミンＢ１２（シアノコバラミン）を含む。一実施形態において、無血清培養液は、約０．０００３３８ｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、約０．００２０９４ｇ／Ｌの塩化コリン、約０．０００３０２ｇ／Ｌの葉酸、約０．００２５６８ｇ／ＬのＩ−イノシトール、約０．０００３０２ｇ／Ｌのナイアシンアミド、約０．０００１５３ｇ／Ｌのピリドキサル、ＨＣｌ、約３．１１Ｅ−０５ｇ／Ｌのリボフラビン、約０．０００３０４ｇ／Ｌのチアミン、ＨＣｌ、約３．７５Ｅ−０５ｇ／Ｌのｄ−ビオチン、約１．８５Ｅ−０５ｇ／Ｌのピリドキシン、ＨＣｌ、及び約０．０００１０２ｇ／ＬのビタミンＢ１２（シアノコバラミン）を含む。
更に、無血清培養液は、１種又は２種以上の塩類を含む。別の実施形態において、培養液は、約０．０００５ｇ／Ｌ〜約０．００１ｇ／Ｌのリン酸塩を含む。代替の実施形態において、培養液は、第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム７水和物などのリン酸ナトリウムを含む。更に別の実施形態において、培養液は、少なくとも約０．００５ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム及び少なくとも約０．００１ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物を含む。代替の実施形態において、培養液は、約０．００８ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム及び約０．００２ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物を含む。
無血清培養液は、ヌクレオシド類を更に含む。一実施形態において、無血清培養液は、核酸誘導体のチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンを含む。代替の実施形態において、培養液は、それぞれが約０．０００１ｇ／Ｌ〜少なくとも約０．００５ｇ／Ｌのヌクオレシド類を含む。一実施形態において、培養液は、少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン、それぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン及びグアノシンを含む。別の実施形態において、培養液は、約０．０００５ｇ／Ｌのチミジン、それぞれが約０．０１５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンを含む。
無血清培養液は、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウムを更に含む。一実施形態において、培養液は、少なくとも０．００２ｇ／Ｌ、あるいは約０．０１ｇ／Ｌのインスリンを含む。別の実施形態において、培養液は、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌ、あるいは約０．０６ｇ／Ｌのトランスフェリンを含む。代替の実施形態において、培養液は、少なくとも約０．００５ｇ／Ｌ、あるいは約０．０２ｇ／Ｌのエタノールアミンを含む。更に別の実施形態において、培養液は、少なくとも約２×１０−５ｇ／Ｌ、あるいは約７×１０−５ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムを含む。
微量のミネラルの亜セレン酸ナトリウムに加えて、特定の実施形態において、無血清培養液は、１種又は２種以上の追加的な微量のミネラル類を更に含む。一実施形態において、培養液は、それぞれが約３×１０−８ｇ／Ｌ〜約２×１０−５ｇ／Ｌの１種又は２種以上の追加的な微量のミネラル類を含む。一実施形態において、培養液は、硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）及び硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を更に含む。別の実施形態において、培養液は、少なくとも約３×１０−８ｇ／Ｌの硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）及び少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌの硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を更に含む。代替の実施形態において、培養液は、約９×１０−８ｇ／Ｌの硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）及び約３×１０−５ｇ／Ｌの硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を更に含む。
更に、脂質エタノールアミンに加えて、無血清培養液は、培養液の少なくとも約１×１０−５ｇ／Ｌを含んでもよいリポ酸／チオクト酸を更に含んでもよい。
本発明の一実施形態において、無血清培養液は、
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である第一リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム７水和物と
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリンと、トランスフェリンと、エタノールアミンと、亜セレン酸ナトリウムと、を含む。
この無血清溶液は、任意追加的に硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）及び硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を更に含む。更に、無血清溶液は、任意追加的にリポ酸／チオクト酸を更に含んでもよい。一実施形態において、溶液は、（１）それぞれが約０．０００１ｇ／Ｌ〜約０．０３ｇ／Ｌのアミノ酸類、（２）それぞれが約０．００００１ｇ／Ｌ〜約０．００１ｇ／Ｌのビタミン類、（３）少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、及び０．００１ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物、（４）少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン及びそれぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン及びグアノシン、（５）少なくとも０．００２ｇ／Ｌのインスリン、（６）少なくとも約０．０３ｇ／Ｌのトランスフェリン、（７）少なくとも約０．００５ｇ／Ｌのエタノールアミン、並びに（８）少なくとも約５×１０−５ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムを含む。任意追加的に、この溶液は、（９）少なくとも約７×１０−８ｇ／Ｌの硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、（１０）少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌの硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、及び（１１）少なくとも約１×１０−６ｇ／Ｌのリポ酸／チオクト酸を更に含む。
本発明の別の実施形態において、無血清培養液は、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、ヌクレオシド類、硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、及びリポ酸／チオクト酸を含む。その実施形態において、培養液は、
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、塩類であるリン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム７水和物と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、を含む。
一実施形態において、この無血清培養液は、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．００８ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．００３ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．０００８ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．０００１ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００２ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００８ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．００８ｇ／ＬのＬ−タウリンを含む。別の実施形態において、この無血清培養液は、少なくとも約０．０００１ｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、少なくとも約０．０００８ｇ／Ｌの塩化コリン、少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌの葉酸、少なくとも約０．０００８ｇ／ＬのＩ−イノシトール、少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのナイアシンアミド、少なくとも約０．００００５ｇ／Ｌのピリドキサル、少なくとも約１×１０−５ｇ／Ｌのリボフラビン、少なくとも約０．００００１ｇ／Ｌのチアミン、少なくとも約１×１０−５ｇ／Ｌのｄ−ビオチン、少なくとも約１×１０−５ｇ／Ｌのピリドキシン、及び少なくとも約１×１０−５ｇ／ＬのビタミンＢ１２（シアノコバラミン）を更に含む。代替の実施形態において、この培養液は、少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミヂン、それぞれが最少で０．０１ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン及びグアノシンを更に含む。別の実施形態において、この培養液は、少なくとも約３×−８ｇ／Ｌの硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、約５×１０−５ｇ／Ｌの硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、及び約２×１０−５ｇ／Ｌのリポ酸／チオクト酸を更に含む。
任意追加的に、無血清培養液は、プトレシン、ウシ血清アルブミン、安定化剤、及び／又は消泡剤を更に含んでもよい。一実施形態において、ウシ血清アルブミンは、脂質の多いウシ血清アルブミンである市販のＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の形態で提供される。別の実施形態において、無血清培養液は、市販の安定化剤／消泡剤のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を含む。
無血清培養液の例示的な好適な実施形態は、以下の表において示される。
Figure 0006404227
これらの無血清培養液は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プトレシン、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を更に含んでもよい。具体的には、実施形態Ａについては、無血清培養液は、３．０２×Ｅ−０５ｇ／Ｌのプトレシン、２．５ｇ／ＬのＢＳＡ、及び０．０１５ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を更に含んでもよい。同様に、実施形態Ｂについては、無血清培養液は、少なくとも約１Ｅ−０５ｇ／Ｌのプトレシン、１ｇ／ＬのＢＳＡ、及び少なくとも０．００５ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を更に含んでもよい。一つの好ましい実施形態において、無血清培養液は、プトレシン及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を更に含む。
実施形態において、無血清培養液は、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、インスリン、トランスフェリン、チミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、グアノシン、及び血清アルブミン（すなわち、ウシ血清アルブミン）を含む。
任意追加的に、無血清培養液は、例えば、グルコース及び／又はピルビン酸塩などの１種又は２種以上のエネルギー基質を更に含んでもよい。
本発明の一実施形態において、培養培地及び／又は無血清培養液は、未分化細胞の増殖を促進する、外因的に付加される因子を含有しない。一つの好ましい実施形態において、培養培地及び／又は無血清培養液は、例えば、塩基性ＦＧＦ又はＦＧＦ−４などの線維芽細胞増殖因子を含まない。
ＩＩ．ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）
本発明の特定の実施形態で上述されたように、培養培地及び無血清培養液を使用して単離されたヒト臍帯組織由来細胞（「ｈＵＴＣ」又は「ＵＴＣ」）を増殖させることができる。本発明の培養培地、無血清培養液、キット、及び方法での使用に好適なＵＴＣ及びＵＴＣ個体群は、以下の詳細にわたる本明細書、並びに米国特許第７，５１０，８７３号、同第７，５２４，４８９号、及び米国特許出願公開第２００５／００５８６３号（これらの特許は、ｈＵＴＣの説明、単離及び特性評価に関連しているので、その全体が参照により組み込まれている）において詳細に説明されている。
Ａ．臍帯組織由来細胞の単離及び増殖
本明細書で説明される方法によれば、哺乳類の臍帯は、満期産若しくは早期産のいずれかの終了時に、又はその直後に、例えば、出産後の圧出の後に採取される。この分娩後組織は、出産場所から、実験室へと、フラスコ、ビーカー、培養皿、又は袋などの滅菌容器に入れて移送することができる。この容器は、溶液又は培地を有してもよく、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ダルベッコ最小必須培地としても知られる）若しくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの食塩水、又はウィスコンシン大学溶液若しくはパーフルオロケミカル溶液などの、移植に使用される器官の移送のために使用される任意の溶液が挙げられるが、これらに限定されない。限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの１種又は２種以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤を、培地又は緩衝液に添加することができる。分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液ですすぐことができる。ＵＴＣの抽出の前にこの組織を約４〜１０℃で保つことが好ましい。この組織は、ＵＴＣの抽出前に凍結させないことが、更により好ましい。
ＵＴＣの単離は、好ましくは、無菌環境内で実施される。臍帯は、当該技術分野において既知の手段によって胎盤から分離することができる。あるいは、臍帯及び胎盤は、分離することなく使用される。血液及び残渣は、ＵＴＣの単離前に、分娩後組織から除去することが好ましい。例えば、この分娩後組織は、緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水を含むがこれに限定されない）で洗浄することができる。この洗浄緩衝液はまた、１種又は２種以上の抗真菌剤及び／又は抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンを含むがこれらに限定されない）も含み得る。
臍帯又はその断片若しくは切片を含む分娩後組織は、機械的な力（細断力又は剪断力）によって脱凝集される。現時点で好ましい実施形態において、この単離手順はまた、酵素消化プロセスも利用する。多くの酵素が、培養下での増殖を促進するための、複合組織マトリックスからの個々の細胞の単離に関して有用であることは、当該技術分野において既知である。消化酵素は、弱い消化性（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、及び中性プロテアーゼであるディスパーゼ）から、強い消化性（例えば、パパイン及びトリプシン）まで様々であり、市販されている。本明細書に適合する酵素の非網羅的なリストとしては、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、又はエラスターゼなど）、及びデオキシリボヌクレアーゼが挙げられる。メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及び粘液溶解活性から選択される酵素活性が、現時点で好ましい。例えば、コラゲナーゼは、組織から様々な細胞を単離するために有用であることが既知である。デオキシリボヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡを消化することができ、単離中の細胞凝集を最小限に抑えることができる。好ましい方法には、例えばコラゲナーゼ及びディスパーゼで、又はコラゲナーゼ、ディスパーゼ及びヒアルロニダーゼで、酵素処置することを含む。特定の実施形態において、コラゲナーゼと中性プロテアーゼディスパーゼの混合物が、この分離する工程において使用される。より具体的な実施形態において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来の少なくとも１種のコラゲナーゼ、並びにプロテアーゼ活性のディスパーゼ、及びサーモリシンのいずれかの存在下での消化を採用する。更に別の実施形態において、コラゲナーゼとディスパーゼ両方の酵素活性での消化を採用する。また、コラゲナーゼ活性及びディスパーゼ活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性での消化を含む方法も利用される。様々な組織源から細胞を単離するための、そのような多くの酵素処理が、当該技術分野において既知であることが、当業者には理解されるであろう。例えば、商品名ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．））で販売される組織解離用の酵素混合物が本方法での使用に好適である。他の酵素の供給源が既知であり、当業者はまた、そのような酵素を、それらの天然源から直接取得することもできる。当業者はまた、本発明の細胞を単離する際の有用性に関して、新たな、又は追加的な酵素若しくは酵素の組み合せを評価するための設備も、十分に備えている。好ましい酵素処理は、０．５時間、１時間、１．５時間、又は２時間以上の長さである。他の好ましい実施形態において、解離工程の酵素処理の間、組織を３７℃でインキュベートする。
本発明のいくつかの実施形態において、分娩後組織は、例えば、胎盤の、新生児、新生児／母体、及び母体の態様などの、様々な組織の態様を含む切片へと分離される。次いで、分離された切片は、本明細書で説明される方法に従って、機械的解離及び／又は酵素的解離によって解離される。新生児系統又は母体系統の細胞は、当該技術分野において既知の任意の手段によって、例えば、Ｙ染色体に関して核型分析又は原位置ハイブリダイゼーションによって、同定することができる。
単離された細胞又はＵＴＣが由来する臍帯組織は、細胞培養を開始又は播種するのに使用することができる。細胞外マトリックス又はリガンド、例えば、ラミニン、コラーゲン（ネイティブ、変性、又は架橋）、ゼラチン、フィブロネクチン、及びその他の細胞外マトリックスタンパク質を用いてコーティングしてある又はコーティングしてない組織培養用滅菌容器に単離細胞を移入する。本明細書に開示される培養培地に加えて、ＵＴＣは、細胞の増殖を維持することができる任意の培養培地において培養することができ、これには例えば、ＤＭＥＭ（高グルコース又は低グルコース）、進化型ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ ２０１、イーグル基本培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ１２培地（Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ １６４０、及び商品名ＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ））として販売される、無血清培地（serum/media free medium）などが挙げられるがこれらに限定されない。この培養培地は、例えば、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウマ血清（ＥＳ）、ヒト血清（ＨＳ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ又は２−ＭＥ）、１種又は２種以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻止因子（ＬＩＦ）、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｌ−バリンを含むアミノ酸、例えば、単独若しくは組み合せでの、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を制御するための、１種又は２種以上の抗生物質並びに／あるいは抗真菌剤を含めた、１種又は２種以上の構成成分を添加することができる。培養培地は、実施例で定義される増殖培地を含んでもよい。
細胞は、細胞増殖を可能にする密度で、培養容器中に播種される。好ましい実施形態において、細胞は、空気中、ＣＯ２が約０〜約５体積％で培養される。幾つかの好ましい実施形態において、細胞は、空気中、Ｏ２が約２〜約２５％、好ましくは、空気中、Ｏ２が約５〜約２０％で培養される。細胞は、好ましくは、約２５〜約４０℃の温度で培養され、より好ましくは、３７℃で培養される。細胞は、好ましくは、インキュベーター内で培養される。培養容器内の培地は、静置状態であってもよく、又は例えば、バイオリアクターを使用して撹拌されてもよい。ＵＴＣは、好ましくは、低酸化ストレス下で（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインを添加して）増殖される。「低酸化ストレス」とは、培養される細胞に対するフリーラジカルによる損傷が無い又は最少である状態を指す。
最も適切な細胞培地、培地調製、及び細胞培養技術の選択方法は、当該技術分野において周知であり、Ｄｏｙｌｅら（編）、１９９５年、「Ｃｅｌｌ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）、Ｈｏ及びＷａｎｇ（編）、１９９１年、「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ」、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（Ｂｏｓｔｏｎ）を含む様々な出典に説明されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
単離された細胞又は組織断片を、十分な期間にわたって培養した後に、分娩後組織からの遊走、若しくは細胞分裂のいずれか、又は双方の結果として、ＵＴＣが増殖することとなる。本発明の幾つかの実施形態において、ＵＴＣは、継代され、又は、最初に使用されたものと同じタイプ、若しくは異なるタイプの新鮮培地を入れた、別個の培養容器に取り出され、そこにおいてその細胞の個体群は有糸分裂的に増殖することができる。本発明の細胞は、継代数０と老化との間の任意の時点で使用することができる。この細胞は、好ましくは、約３回〜約２５回継代され、より好ましくは、約４回〜約１２回継代され、好ましくは、１０回又は１１回継代される。クローニング及び／又はサブクローニングを実行することにより、細胞のクローン集団が単離されていることを確認することができる。
特定の実施形態において、分娩後組織に存在する多種の細胞が、亜集団に分画され、これらの亜集団からＵＴＣを単離することができる。分画又は選択は、細胞分離のための標準的技術を使用して達成することができ、それらの標準的技術としては、分娩後組織をその構成細胞へと解離する酵素処理、その後の特定の細胞型のクローニング及び選択、例えば、形態学的マーカー及び／又は生化学的マーカーに基づく選択、所望される細胞の選択的増殖（正の選択）、不必要な細胞の選択的破壊（負の選択）、例えば大豆凝集素を使用するような、混合集団中での示差的な細胞凝集能に基づく分離、凍結−解凍手順、混合集団中での示差的な細胞付着特性、濾過、従来の遠心分離法及びゾーン遠心分離法、遠心溶出法（対向流遠心分離法）、単位重力分離法、向流分布法、電気泳動、及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。クローン選択及び細胞分離技術の概説に関しては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９９４年，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
培養培地は、必要に応じて、例えばピペットで皿から培地を慎重に吸引し、かつ新鮮培地を補充することによって交換される。インキュベーションは、十分な数又は密度の細胞が皿内に蓄積するまで継続される。標準的技術を使用して、又はセルスクレーパーを使用して、元の外移植組織の切片を除去し、残余の細胞をトリプシン処理することができる。トリプシン処理の後、細胞を回収して、新鮮培地に除去し、上記のようにインキュベートする。いくつかの実施形態において、培地は、トリプシン処理の約２４時間後に、少なくとも１回交換して、あらゆる浮遊細胞を除去する。培養物に残存する細胞が、ＵＴＣであると考えられる。
ＵＴＣは、凍結保存することができる。したがって、自家移入に関する（母又は子のいずれかに関する）ＵＴＣは、子供の誕生後に適切な分娩後組織から誘導して、次いで、それらのＵＴＣが後に移植に必要とされる事象で利用可能となるように、凍結保存することができる。
Ｂ．臍帯組織由来細胞の特性
ＵＴＣは、例えば、増殖特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代数）、核型分析（例えば、正常核型；母体系統又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学及び／又は免疫細胞化学（例えば、エピトープの検出に関する）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、及び従来のＰＣＲ））、タンパク質アレイ、タンパク質分泌（例えば、血漿凝固アッセイ又はＰＤＣ−馴化培地の分析によるもの、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるもの）、混合リンパ球反応（例えば、ＰＢＭＣの刺激の尺度として）、及び／又は当技術分野において既知の他の方法によって、特徴付けることができる。
臍組織由来の好適なＵＴＣの例は、２００４年６月１０日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されており、以下のＡＴＣＣアクセッション番号が割り当てられている。（１）菌株表示ＵＭＢ ０２２８０３（Ｐ７）は、アクセッション番号ＰＴＡ−６０６７が割り当てられ、（２）菌株表示ＵＭＢ ０２２８０３（Ｐ１７）は、アクセッション番号ＰＴＡ−６０６８が割り当てられている。
様々な実施形態において、ＵＴＣは、１つ又は２つ以上の以下の増殖の特徴を有する。（１）培養下での増殖のためにＬ−バリンを必要とする、（２）約５％〜少なくとも約２０％の酸素を含有する大気中での増殖が可能である、（３）老化に到達する前に、培養下で少なくとも約４０回倍加する潜在能力を有する、（４）コーティングされた、若しくはコーティングされていない組織培養容器上に付着して増殖し、このコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む。
特定の実施形態において、ＵＴＣは、その細胞が継代される際に維持される、正常核型を有する。核型分析に関する方法は、当業者に利用可能であり、既知である。
他の実施形態において、ＵＴＣは、（１）組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つの産生；（２）フローサイトメトリーによって検出されるような、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生を含む、特定のタンパク質の産生によって特徴付けることができる。他の実施形態において、ＵＴＣは、フローサイトメトリーによって検出されるような、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生の欠如によって、特徴付けることができる。組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンのうちの少なくとも２つを産生する細胞が、特に好ましい。タンパク質組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンの３つ全てを産生するような細胞が、より好ましい。
その他の実施形態において、ＵＴＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜の骨髄細胞である、ヒト細胞と比べて、インターロイキン８、レチクロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、及びα−誘導タンパク質３のうちの、少なくとも１つをコードする遺伝子に関して増大する、遺伝子の発現によって特徴付けることができる。
更に他の実施形態において、ＵＴＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜の骨髄細胞である、ヒト細胞と比べて、低身長ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄症、ウィリアムズ−ビューレン症候群）、ホモサピエンスｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２由来）、間葉ホメオボックス２（増殖停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１（ドロソフィラ）、クリスタリン、αＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ関連アクチベータ２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）、ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）及びシステイン豊富ドメイン、コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ、ｒｕｎｔ関連転写因子３、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ドロソフィラ）、仮定的遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲン、ＶＩＩＩ型、α１、テネイシンＣ（ヘキサブラキオン）、ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク質２、神経芽腫、腫瘍形成抑制１、インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ、ホモサピエンスｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４、インテグリン、β７、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２（ドロソフィラ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１、初期成長応答３、ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス５、仮定的タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＩＩ型）、バイグリカン、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリン、β様１（ＥＧＦ様リピートドメインを有する）、ホモサピエンスｍＲＮＡ完全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮定的タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ホモサピエンスｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）のうちの、少なくとも１つをコードする遺伝子に関して減少する、遺伝子の発現によって特徴付けることができる。
その他の実施形態において、ＵＴＣは、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも一つの分泌物によって培養される場合に特徴付けることができる。加えて、ＵＴＣは、ＥＬＩＳＡによって検出されるように、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１Ａ、及びＶＥＧＦのうちの少なくとも一つの分泌物が欠如して培養される場合に特徴付けることができる。
幾つかの実施形態において、ＵＴＣは、実質的に血液を含まないで臍帯組織から誘導され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、増殖のためにＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で増殖可能であり、かつ、次の特性のうち少なくとも１つを含む。培養下で少なくとも約４０回倍加する潜在能力を有する、コーティングされた又はコーティングされていない組織培養容器（ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む）上に付着して増殖する、ビメンチン及びα−平滑筋アクチンの産生、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０の産生、並びに、遺伝子の発現が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜の骨髄細胞であるヒト細胞と比べて、インターロイキン８及びレチクロン１をコードする遺伝子に関して増大する。幾つかの実施形態において、そのようなＵＴＣは、ＣＤ４５及びＣＤ１１７を産生しない。
好ましい実施形態では、その細胞は、上記の増殖特性、タンパク質／表面マーカーの産生特性、遺伝子発現特性、又は物質分泌特性のうちの２つ以上を含む。これらの特性のうちの３つ、４つ、５つ又はそれ以上を含む細胞が、より好ましい。それらの特性のうちの６つ、７つ、８つ又はそれ以上を含むＵＴＣが、更により好ましい。上記特性の全てを含む細胞が、現時点で更により好ましい。
幾つかの態様で本発明と共に使用するために、現時点で好ましい細胞は、とりわけ、上述の特性を有する分娩後細胞であり、より具体的には、それらの細胞が、正常核型を有し、継代で正常核型を維持する場合であり、更には、それらの細胞が、マーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する場合であり、それらの細胞が、列記されたマーカーに対応する、免疫学的に検出可能なタンパク質を産生する場合である。前述に加えて、フローサイトメトリーによって検出されるような、マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれに対応するタンパク質も産生しないような細胞が、更により好ましい。
一実施形態において、ＵＴＣは、実質的に血液が含まれないヒト臍帯組織由来細胞から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化をする潜在能力を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生が欠如しており、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない。これらのＵＴＣは、任意追加的に、酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／若しくは顆粒球走化性タンパク質を任意追加的に発現し、並びに／又は、ＣＤ３１若しくはＣＤ３４を発現せず、並びに／又は、ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞に比べて、インターロイキン８若しくはレチクロン１の濃度上昇を発現し、並びに／又はＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０を発現する。
別の実施形態において、実質的に血液を含まないヒト臍帯組織から単離されたＵＴＣは、培養中に自己再生及び自己増殖することができ、分化する潜在力を有し、ＣＤ１３及びＣＤ９０を発現し、かつＣＤ３４及びＣＤ１１７を発現しない。任意追加的に、これらの細胞はｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない。更に別の実施形態において、細胞はまた、ＣＤ１０、ＣＤ４４、及びＣＤ４３を発現しない。代替の実施形態において、細胞はまた、ＣＤ４５及びＣＤ３１を発現しない。これらのＵＴＣは任意追加的に、（ｉ）酸化された低密度リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現する、及び／又は（ｉｉ）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜の骨髄細胞に対して、インターロイキン８又はレチクロン１の増加したレベルを発現する。
別の実施形態において、実質的に血液を含まないヒト臍帯組織から単離されたＵＴＣは、培養中に自己再生及び自己増殖することができ、分化する潜在能力を有し、ＣＤ１３及びＣＤ９０を発現し、かつＣＤ３４、ＣＤ１１７、及びＨＬＡ−ＤＲを発現しない。任意追加的に、これらの細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない。一実施形態において、細胞はまた、ＣＤ１０、ＣＤ４４、及びＣＤ４３を発現する。代替の実施形態において、細胞はまた、ＣＤ４５及びＣＤ３１を発現しない。これらのＵＴＣは任意追加的に、（ｉ）酸化された低密度リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現する、及び／又は（ｉｉ）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜の骨髄細胞に対して、インターロイキン８又はレチクロン１の増加したレベルを発現する。
代替の実施形態において、実質的に血液を含まないヒト臍帯組織から単離されたＵＴＣは、培養中に自己再生及び自己増殖することができ、分化する潜在能力を有し、かつ以下の特性を有する。（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、及びＨＬＡ−ＡＢＣを発現する、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１７を発現しない、並びに（３）ｈＴｅｒｔ及びテロメラーゼを発現しない。別の実施形態において、実質的に血液を含まないヒト臍帯組織から単離されたＵＴＣは、培養中に自己再生及び自己増殖することができ、分化する潜在能力を有し、かつ以下の特性を有する。（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、及びＨＬＡ−ＡＢＣを発現する、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１７を発現しない、（３）ｈＴｅｒｔ及びテロメラーゼを発現しない、（４）酸化された低密度のリポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現する、並びに（４）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜の骨髄細胞に対して、インターロイキン８又はレチクロン１の増加したレベルを発現する。
一実施形態において、ｈＵＴＣは、細胞集団として提供され、これらは同種であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞集団は、異種であってもよい。本発明の異種の細胞集団は、本発明のＵＴＣを少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％含み得る。本発明の異種の細胞集団は更に、幹細胞又はその他の前駆細胞（例えば筋芽細胞又はその他の筋肉前駆細胞、血管芽細胞、又は血管前駆細胞）を含んでもよく、あるいは更に、完全に分化した骨格筋細胞、平滑筋細胞、周細胞、又は血管内皮細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態において、この集団は、実質的に同種であり、すなわち、実質的にＵＴＣのみ（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％以上のＵＴＣ）を含む。本発明の同種の細胞集団は、臍由来細胞からなる。臍由来細胞の同種の集団は、好ましくは、母体系統の細胞を含まない。細胞集団の同種化は当業界で既知の任意の方法、例えば、細胞選別法（例えばフローサイトメトリー）又は既知の方法に従ったクローン増殖によって達成することができる。同種のＵＴＣ集団は、分娩後由来細胞のクローン細胞株を含んでもよい。
一実施形態において、培養後のｈＵＴＣは、実質的に培養前のｈＵＴＣと同一の特性（例えば、マーカープロファイル、及び／又は遺伝子発現プロファイル）を有する。代替の実施形態において、培養後のｈＵＴＣは、培養前のｈＵＴＣと同一の特性（例えば、マーカープロファイル、及び／又は遺伝子発現プロファイル）を有する。一実施形態において、培養後のｈＵＴＣは、少なくともＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ９０、及びＣＤ１１７に関して、培養前のｈＵＴＣと同一の特性を有する。
ＩＩＩ．その他の好適な細胞
上述のように、本発明の特定の実施形態において、培養培地及び無血清培養液を使用して単離したヒト臍帯組織由来細胞（「ｈＵＴＣ」又は「ＵＴＣ」）を増殖させることができる。加えて、培養培地及び無血清培養液を使用して他の付着依存性細胞を増殖させることができる。
本発明の一実施形態において、培養培地及び無血清培養液を利用して、胎盤由来細胞などの他の付着依存性細胞を増殖させる。他の付着依存性細胞の例としては、限定するものではないが、骨髄由来の間葉系幹細胞、骨髄由来の間葉系幹細胞の前駆細胞、非骨髄組織由来細胞（脂肪組織、筋組織、内乳動脈由来細胞を含む血管など）、歯の歯髄由来細胞が挙げられる。更に、羊水は、付着依存性幹細胞が非常に豊富な供給源であることが示されている。付着依存性細胞の別の例は、新生児包皮線維芽細胞を含む線維芽細胞である。
ＩＶ．培養の方法
本発明の別の実施態様は、本発明の馴化培地及び無血清培養液の使用を含む、細胞を培養する方法である。本方法は、ローラーボトル、スピナーフラスコ、及び／又はマイクロキャリアを利用することができる。好ましい実施形態において、本方法を使用して、例えばｈＵＴＣ細胞などの付着依存性細胞を培養し、マイクロキャリアを必要とする。
好ましい実施形態において、本方法は、本発明の馴化培地及び無血清培養液で、血清交換を必要としないｈＵＴＣを培養することを含む。上述のように、ＵＴＣは、様々な培養培地において増殖することができる。本発明の方法により、任意追加的に血清の使用が減少し、体積生産性が増加し、ｈＵＴＣなどの付着依存性細胞を含む組成物を製造するコストが削減される。更に、本方法により、培地の交換なしに細胞（例えばｈＵＴＣ）の増殖が可能である。
ローラーボトル及びマイクロキャリアにおいて細胞を増殖させる例示的な方法は、それらが、ローラーボトル、マイクロキャリア、並びにローラーボトル及びマイクロキャリア上での培養の記述に関連しているので、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第２００７／０１４１７００号及び同第２００８／０１６６３２８号にそれぞれ開示されている。例示的な好適なローラーボトル、スピナースラスコ、マイクロキャリア、それらの特性、及び好適な培養パラメーターが以下で考察される。
Ａ．ローラーボトル
ローラーボトル培養システムは、細胞培養の分野では既知である。本明細書で使用されるように、ローラーボトル培養システムは、少なくとも、対象となる細胞株と、増殖培地と、ローラーボトルと、そのボトルを回転させる装置と、細胞を採取する手段と、を含む。
ローラーボトル培養システムは典型的に、インキュベーション中の温度を制御する手段、並びに、例えば細胞のボトルへの初期播種中、又はその後の移行中、培養物を無菌的に取り扱う手段を更に含む。細胞の採取は、トリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ディスパーゼ、及びコラゲナーゼ、若しくは他の酵素又は他の成分を有する又は有しない酵素の組み合わせを用いるなどの酵素処理によってなされる。ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｃ）などの（それには限定されないが）他の市販品が利用されてもよい。細胞はまた、例えば、回分式遠心分離を含む手動操作によって採取されてもよく、又は採取は自動化されてもよい。
一実施形態において、ボトルは、約１００〜３００ｍＬの増殖培地で充填され、他の実施形態において、約１００〜２００ｍＬが使用される。代替の実施形態において、約１００〜１２０ｍＬが、又は更には１０５〜１１５ｍＬがボトル内に入れられる。他の実施形態において、ボトルは、約１１２ｍＬの増殖培地で充填され、最大の集団倍加を得ることができる。一実施形態において、ボトルは、約２，５００〜約１０，０００細胞／ｃｍ２播種される。一実施形態において、その範囲の下端が使用され、例えば、１平方センチメートルあたり約３０００未満の細胞が播種される。播種用ボトルは、付着及び増殖中に回転される。回転速度は、約０．５〜１ｒｐｍに設定されてもよい。好ましくは、回転は、約０．７５〜１ｒｐｍである。より好ましくは、ボトルは、約０．８〜１ｒｐｍで回転される。
別の実施形態において、ローラーボトルは、約１００〜３００ｍＬの増殖培地で充填され、好ましくは約３００ｍＬが使用される。ボトルは、１平方センチメートルあたり約２，５００〜約１０，０００の細胞が播種される。一実施形態において、その範囲の下端が使用され、例えば、１平方センチメートルあたり約３０００未満の細胞が播種される。播種が、約２５００細胞／ｃｍ２である実施形態が更により好ましい。播種されたボトルは付着及び増殖中に回転される。回転速度は、約０．５〜１ｒｐｍに設定される。好ましくは回転は、約０．７５〜１ｒｐｍである。より好ましくは、ボトルは、約０．８〜１ｒｐｍで回転される。現時点ではほぼ又は約０．９〜１．０ｒｐｍの回転が好ましい。
充填及び播種されたローラーボトルは、約５〜７日間回転及びインキュベートされ、最高の倍加が達成される。現時点では、約５．５〜６．５日のインキュベーション時間が好ましい。
ローラーボトルは、細胞がローラーボトルの内面に付着することを補助する、ゼラチン、細胞外マトリックス分子（例えば、ゼラチン、ラミニン、ビドロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、ＩＶ、及びＶＩ型）などの薬剤でコーティングされてもよい。かかる市販のコーティングされたボトルの一例は、ＣｅｌｌＢｉｎｄ（Ｃｏｒｎｉｎｇからカタログ番号３９０７として入手可能）でコーティングされたものである。様々なコーティング剤が、本明細書に提供される方法に従う細胞の付着及び増殖用に受け入れ可能であると想定される。
Ｂ．スピナーフラスコ
スピナーフラスコ培養システムもまた、細胞培養の技術分野において既知である。本明細書で用いられる際、スピナーフラスコ培養システムは、少なくとも、対象となる細胞株と、増殖培地と、１つ又は２つ以上のスピナーフラスコと、１つ又は２つ以上のフラスコを回転させる手段と、細胞を採取する手段と、を含む。
スピナーフラスコ培養システムは典型的に、インキュベーション中の温度を制御する手段、並びに例えばフラスコ内への初期の細胞の播種中、又はその後の移行中、培養物を無菌的に取り扱う手段を更に含む。細胞の採取は、トリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ディスパーゼ、及びコラゲナーゼ、若しくはその他の酵素又は他の成分を有する又は有しない酵素の組み合わせによるなどの酵素処理によってなされる。それに限定されないが、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｃ．）などのその他の市販品が利用できる。細胞はまた、例えば回分式遠心分離を含む手動操作によって採取されてもよく、又は採取は自動化されてもよい。
一実施形態において、回転速度は、約３５〜約６５ｒｐｍ、あるいは約３５〜約４５ｒｐｍ、あるいは約４０〜約５０ｒｐｍ、あるいは約４５〜約５５ｒｐｍ、あるいは約５５〜約６５ｒｐｍ、あるいは約５０〜約６０ｒｐｍに設定される。好ましい実施形態において、約４０ｒｐｍ又は６０ｒｐｍの回転速度が維持される。
一実施形態において、３Ｌスピナーフラスコが使用され、該フラスコは、およそ３Ｌの、増殖培地、ＦＢＳ、無血清培養液、マイクロキャリア、及び細胞を充填することができる。その実施形態において、回転速度は、約３５〜４５ｒｐｍに設定されてもよい。好ましくは、回転は、約４０ｒｐｍである。
別の実施形態において、１２５ｍＬフラスコが使用される。これらのフラスコは、増殖培地と、ＦＢＳと、無血清培養液と、マイクロキャリアと、細胞と、を含む、およそ１００ｍＬの溶液で充填され得る。一実施形態において、フラスコは、およそ８５ｍＬ〜１１５ｍＬの、増殖培地、ＦＢＳ、無血清培養液、マイクロキャリア、及び細胞を含有する。その実施形態において、回転速度は、約５５〜６５ｒｐｍに設定されてもよい。好ましくは、回転は、約５０ｒｐｍである。
更に別の実施形態において、５００ｍＬスピナーフラスコが使用される。これらのフラスコは、増殖培地と、ＦＢＳと、無血清培養液と、マイクロキャリアと、細胞と、を含む、およそ５００ｍＬの溶液が充填され得る。一実施形態において、フラスコは、およそ４５０ｍＬ〜５００ｍＬの、増殖培地、ＦＢＳ、無血清培養液、マイクロキャリア、及び細胞を含有する。その実施形態において、回転速度は、５５〜６５ｒｐｍに設定されてもよい。好ましくは、回転は、約５０ｒｐｍである。
代替の実施形態において、５００ｍＬスピナーフラスコが使用される。これらのフラスコは、増殖培地と、ＦＢＳと、無血清培養液と、マイクロキャリアと、細胞と、を含む、およそ５００ｍＬの溶液で充填され得る。一実施形態において、フラスコは、およそ４５０ｍＬ〜５００ｍＬの、増殖培地、ＦＢＳ、無血清培養液、マイクロキャリア、及び細胞を含有する。その実施形態において、回転速度は、約３５〜４５ｒｐｍに設定されてもよい。好ましくは、回転は、約４０ｒｐｍである。
フラスコは、約２，５００〜約１０，０００細胞／ｃｍ２で播種される。細胞は、フラスコ内へ直接播種されてもよく、フラスコの表面上に又はフラスコ内に配置されたマイクロキャリア上に播種されてもよい。好ましい実施形態において、播種は、約３，０００〜約７，５００、あるいは約３，０００〜約７，０００、あるいは約４，０００〜約７，０００、約３，０００〜約５，０００、あるいは約５，０００〜約７，０００、あるいは約３，５００〜約５，０００、あるいは約４，５００〜約７，５００、あるいは約３，５００〜約５，５００細胞／ｃｍ２で実施される。フラスコは、付着及び増殖中、回転される。一実施形態において、集団倍加速度を最大にするために、充填及び播種されたフラスコは回転され、約５〜７日間インキュベートされるが、約５〜約６日のインキュベーション時間が好ましい。
Ｃ．マイクロキャリア
マイクロキャリア培養は、例えば、付着依存性分娩後細胞などの付着依存性細胞の培養の実用的な高収率培養を可能にする技術である。マイクロキャリアは、哺乳類の分娩後細胞など、培養容積が数ミリリットルから１０００リットル超までの範囲に及ぶ細胞の培養用に特別に開発された。マイクロキャリアは、生物学的に不活性であり、撹拌式マイクロキャリア培養に対して強度があるが非剛性である基質を提供する。マイクロキャリアは、透明であってもよく、付着した細胞の顕微鏡検査が可能である。Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．））は、架橋デキストランのマトリックスに化学的に連結した変性コラーゲンの薄層からなる。Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３の変性コラーゲン層は、トリプシン及びコラゲナーゼを含む、種々のプロテアーゼにより消化されやすく、最大の細胞生存率、機能及び、完全性を維持しながらマイクロキャリアから細胞を除去することができる。
タンパク質を含まないマイクロキャリアを使用して細胞を培養することができる。例えば、商品名ＨＩＬＬＥＸ（登録商標）（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））で販売されている、製造及び研究又は調査で使用されるマイクロキャリアビーズは、表面に、マイクロキャリアに正電荷表面をもたらすカチオン性トリメチルアンモニウムが付着している、改質ポリスチレンビーズである。ビーズの直径は、直径約９０〜約２００μｍの範囲に及んでもよい。
マイクロキャリアに基づく細胞培養法により、多くの用途において後処理加工のし易さを含む多くの利点がもたらされている。マイクロキャリアは典型的には、ほぼ球状形状であり、多孔性であるか又は中実であるかのいずれかであり得る。細胞付着用のマイクロキャリア使用により、付着依存性細胞の増殖用の撹拌槽及び関連するリアクターの使用が容易になる。細胞は、容易に懸濁されるマイクロ粒子に付着する。懸濁可能である必要があることから、マイクロキャリアの物理的パラメーターは制限されるしたがって、マイクロキャリアは通例、５０〜２０００μｍの範囲の平均直径を有する。幾つかの用途では、中実型のマイクロキャリアは、約１００〜約２００μｍの範囲であり、一方、多孔質型のマイクロキャリアビーズは、約２５０〜約２５００μｍの範囲である。これらのサイズ範囲は、多くの付着依存性の細胞を収容するのに十分な程度に大きく、かつ撹拌型リアクター内での使用に好適な特性を有する懸濁液を形成するのに十分小さいマイクロキャリアの選別を可能にする。
マイクロビーズなどの使用の際に考慮される因子として、付着効率、免疫原性、生物適合性、生分解能、コンフルエンスに達する時間、単位表面積あたりの最大到達密度を含む付着細胞の増殖パラメーター、必要とされる箇所での脱着技術及び脱着効率、培養条件の拡張性、並びに規模が拡大された条件下での培養均質性、規模が拡大した脱離手順を成功裏に実施する能力、及びビーズが移植に使用できるかどうか、がある。これらの検討事項はマイクロキャリアビーズの表面特性、並びにマイクロキャリアの多孔性、直径、密度、及び取り扱い性によって影響され得る。
例えば、マイクロキャリア粒子又はビーズの密度は、検討事項である。密度が過剰だと、マイクロキャリア粒子又はビーズが懸濁液から沈殿する場合があり、あるいは培養容器の底に完全に沈殿したままである傾向があり、それ故リアクター内で混合する細胞、培養培地、及び気相の大容量性が乏しくなる場合がある。一方、密度が低すぎる場合、マイクロキャリアに過剰に浮揚する場合がある。多くのマイクロキャリアビーズの密度は、典型的には１．０２〜１．１５ｇ／ｃｍ３である。
リアクターに添加されるマイクロキャリア粒子の直径及び粒子の体積が小さいことにより、マイクロキャリアは、ローラーボトル又は付着依存性細胞を増殖させる他の方法（例えばプレート法）に見られる実質表面積よりはるかに大きい実質表面積をもたらすことができる。多孔性マイクロキャリアにより、単位体積又は単位重量あたり更に大きい表面積がもたらされる。これらの多孔性マイクロキャリアは、付着依存性細胞の増殖に利用できる大きい空洞を有している。これらの空洞により、表面積が大幅に増加し、例えば、混合又はガス吹込によるせん断応力などの有害な機械的影響から細胞を保護することができる。
マイクロキャリアの表面は、細胞の付着及増殖を高めるためにテクスチャ加工されてもよい。マイクロキャリアの表面のテクスチャは、限定するものではないが、型成形、鋳造、リーチング、及びエッチングを含む手法によってなされる。テクスチャ加工された表面の形体の解像度（resolution）は、ナノスケールであり得る。テクスチャ加工された表面を使用してマイクロキャリア表面上に特異的な細胞配列を誘導することができる。多孔性マイクロキャリア内部の孔の表面もまた、テクスチャ加工され、細胞付着性及び細胞増殖性を高めることができる。孔表面のテクスチャ加工は、限定するものではないが、例えば、型成形、鋳造、リーチング、及びエッチングなどの手法によりなされる。
マイクロキャリアの表面は、プラズマコーティングしてマイクロキャリア表面に特異的な電荷を付与することができる。これらの電荷は、細胞付着性と細胞増殖性を高めることができる。
その他の実施形態において、マイクロキャリアは、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどの熱応答性ポリマーを含む、若しくはそれでコーティングされるか、又は電気機械特性を有する。マイクロキャリアはまた、低レベルの生物学的に適切な電気を生成する銅と亜鉛の微粒子のガルバニ対を有するマイクロキャリアなど微小電流を有してもよい。マイクロキャリアは、常磁性アルギン酸カルシウムのマイクロキャリアのように常磁性であってもよい。
多孔型と中実型の両方の微粒子キャリアが市販されている。市販されている中実型マイクロキャリアの例として、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１及びＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３が挙げられ、その両者ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のデキストラン系マイクロキャリアである。市販されている好適な多孔性マイクロキャリアとしては、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣｉｔｏｌｉｎｅ（商標）及びＣｙｔｏｐｏｒｅ（商標）、Ｂｉｏｓｉｌｏｎ（ＮＵＮＣ）、及びＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ（登録商標）（Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａｌ）が挙げられる。
特定の実施形態において、本発明の方法及びキットは約６０〜９０μｍのおよその粒子サイズ及び２５℃において約１．０３ｇ／ｃｍ３の密度を有するデキストランビーズマイクロキャリアを利用する。その他の実施形態において、本発明の方法及びキットは、約１１４〜１９８μｍのおよその粒子サイズ及び２５℃において約１．０４ｇ／ｃｍ３の密度を有するデキストランビーズマイクロキャリアを利用する。更に別の実施形態において、本発明の方法及びキットは、約６０〜８７μｍのおよその粒子サイズ及び２５℃において約１．０４ｇ／ｃｍ３の密度を有するデキストランビーズマイクロキャリアを利用する。代替の実施形態において、本発明の方法及びキットは、多孔性マイクロキャリアを利用する。これらの多孔性マイクロキャリアは、約２００〜２８０μｍの粒子直径、約１．１ｍ２／ｇの有効表面面積、及び約３０μｍの平均孔径開口部を有することができる。別の実施形態において、本発明の方法及びキットは、アミン処理した表面を有するマイクロキャリアを利用する。好ましい実施形態において、アミン処理した表面を有するマイクロキャリアは、約１６０〜２００μｍの粒子サイズ、約１．０９０〜１．１５０の相対密度範囲、約５１５ｃｍ２／ｇの表面積を有する。かかるマイクロキャリアは、５．５×１０５マイクロキャリア／ｇを含有する溶液において提供され得る。
キャリア粒子はまた、生物活性剤を含有してもよい。キャリア粒子はまた、細胞の増殖若しくは機能又は組織環境を調節することができる生物活性剤又は生物活性因子を有してもよい。好適な因子としては、限定するものではないが、線維芽細胞増殖因子、エリスロポエチン、脈管内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、骨形態形成タンパク質、形質転換増殖因子、腫瘍壊死因子、上皮増殖因子、及びインスリン様増殖因子が挙げられる。完全な因子、模倣体、又はそれらの活性フラグメントを使用することができる。
Ｄ．方法
本発明の方法は、概ね、血清（例えば、ＦＢＳ）が補充された、本発明の培養培地において細胞を培養する（例えば、増殖させる）工程を含む。細胞が、所望の密度に増殖された（例えば、約３〜４日の期間など）後、無血清培養液が添加される。細胞は、付着依存性細胞であってもよく、細胞は、マイクロキャリア上に播種されてもよい。培養は、ローラーボトル培養システム又はスピナーフラスコ培養システムにおいて実施することができる。好ましくは、付着依存性細胞がマイクロキャリア上に播種される際に、スピナーフラスコ培養システムが使用される。所望の時間は、例えば、所望の個体群密度、所望の集団倍加数又は時間などのかかるパラメーターによって決定される。特定の実施形態において、細胞は、４〜７日間培養され、約３日目に無血清培養液が添加される。その他の実施形態において、細胞は、１〜２日若しくは集団倍加の間、又は所望の初期個体群密度が得られるまで増殖された後、無血清培養液が添加される。上述のように、本方法は、培地の交換なしに細胞（例えば、ｈＵＴＣ）を増殖することができる。
１．単離された付着依存性細胞を培養する方法
本発明の一実施形態は、付着依存性細胞を培養する（例えば、増殖させる）方法である。本方法は、血清が補充されている本発明の培養培地における組織フラスコ（tissue flask）の表面上又は好ましくはマイクロキャリア上に播種された単離された付着依存性細胞を培養する工程と、所望の初期個体群密度を可能にするに十分な時間、細胞を増殖させた後、無血清培養液を添加する工程と、を含む。一実施形態において、細胞は、約３〜約７日、あるいは約３〜５日、あるいは約４〜５日、増殖された後、無血清培養液が添加される。一実施形態において、細胞は、約３日増殖された後、無血清培養液が添加される。別の実施形態において、細胞は、少なくとも１又は２回の集団倍加を可能にするように増殖された後、無血清培養液が添加される。好ましい実施形態において、細胞は、本明細書に開示された任意のマイクロキャリア上に播種され、上述した条件下でスピナーフラスコにおいて増殖される。一実施形態において、本方法は、これらの細胞を含有する細胞バンクバイアルを解凍し、細胞を増殖させ、生産容器にインキュベートする工程を含む。別の実施形態は、細胞を最初に単離し、次いで単離された細胞を播種する工程を含む。
考察したように、これらの方法で使用される培地を含む培地は、約２％〜約２０％の血清（例えば、ＦＢＳ）が補充されてもよい。一実施形態において、培地は、その培地の調製中、血清（例えば、ＦＢＳなど）が補充されている。別の実施形態において、培地は、使用直前に補充される（血清（例えばＦＢＳ）を含む溶液の添加によるなど）。別の実施形態において、培地は、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）、あるいは約２〜約１０％、あるいは約３〜約１２％、あるいは約３〜約１２％、あるいは約５〜約１５％、あるいは約４〜約１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳが補充されている。選択された実施形態において、培養培地は、約７．５％、約１０％又は約１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳが補充されている。
別の実施形態において、本方法はまた、付着依存性細胞を播種する工程を包含する。目標播種密度は、変化し得るが、特定の実施形態において、約５，０００〜約８，０００、あるいは約５，５００〜約７，５００、あるいは約６，０００〜約８，０００、あるいは約６，５００〜約７，５００の生存細胞／ｃｍ２が、約１２〜約３０、あるいは約１２〜約２０、約１８〜約２５、約１５〜約２３ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度で播種される。
２．単離された臍帯組織由来細胞を培養する方法
本発明の一実施形態は臍帯組織由来細胞を培養する方法である。この方法は概ね、上記で考察した単離された付着依存性細胞を培養する方法の工程を含み、幾つかの変形例があり得る。したがって、本発明の一実施形態は、マイクロキャリアに付着した、単離した付着依存性ｈＵＴＣをスピナーフラスコ内の懸濁培養において、無血清培養液を用いて増殖培地を高栄養化することによって、高細胞密度に培養する方法である。最適なことに、この方法により、（例えば、３日目の）培地交換の必要性がなくなり、一貫して２０，０００細胞／ｃｍ２超の細胞を増殖させることができる。更に、この方法により、ｈＵＴＣの継代のための堅牢性が強化される。この方法は、本発明の培養培地及び無血清培養液を利用する。
方法は、血清（例えば、ＦＢＳ）が補充された本発明の培養培地におけるマイクロキャリア上に播種された単離したｈＵＴＣを、細胞が所望の初期個体群密度に達することができるような十分な時間培養する工程を含む。特定の実施形態において、実施形態Ａ、Ｂ、又はＣの培養培地が使用される。特定の実施形態において、細胞は、ローラーボトルにおいて培養され、培養は、ローラーボトルシステム上で実施される。好ましい実施形態において、細胞は、マイクロキャリア上に播種され、スピナーフラスコ内で培養され、培養は、スピナーフラスコシステム内で実施される。一実施形態において、細胞は、およそ３７℃で１０％ ＣＯ２雰囲気下でインキュベートされる。
別の実施形態において、フラスコは、約５５〜約６５ｒｐｍ、あるいは約５５〜約６０ｒｐｍ、あるいは約５８〜約６１ｒｐｍの速度で回転される。別の実施形態において、フラスコは、約３５〜約４５ｒｐｍ、あるいは約３８〜約４２ｒｐｍ、あるいは約４０〜約４３ｒｐｍ、あるいは約３６〜約４５ｒｐｍの速度で回転される。別の実施形態において、培地内のマイクロキャリアの密度は、約１１．０〜約１３．０ｇ／Ｌである。
一実施形態において、ｈＵＴＣは、およそ３７℃で１０％ ＣＯ２雰囲気下で１２５ｍＬのフラスコ内で培養され、フラスコは、約５５ｒｐｍ〜約６５ｒｐｍ（好ましくは約６０ｒｐｍ）の範囲のｒｐｍで回転される。更に別の実施形態において、ｈＵＴＣは、およそ３７℃で１０％ ＣＯ２雰囲気下で５００ｍＬフラスコ内で培養され、フラスコは、約５５ｒｐｍ〜約６５ｒｐｍ（好ましくは約６０ｒｐｍ）の範囲のｒｐｍで回転される。別の実施形態において、ｈＵＴＣは、およそ３７℃で１０％ ＣＯ２雰囲気下で５００ｍＬフラスコ内で培養され、フラスコは、約３５ｒｐｍ〜約４５ｒｐｍ（好ましくは約４０ｒｐｍ）の範囲のｒｐｍで回転される。別の実施形態において、ｈＵＴＣは、およそ３７℃で１０％ ＣＯ２雰囲気下で３Ｌのフラスコ内で培養され、フラスコは、約３５ｒｐｍ〜約４５ｒｐｍ（好ましくは約４０ｒｐｍ）の範囲のｒｐｍで回転される。これらの実施形態において、フラスコは、培地内で約１１．０〜約１３．０ｇ／Ｌ（好ましくは１２ｇ／Ｌ）のマイクロキャリアを含有することができる。
個体群密度を最大化するため、ｈＵＴＣを含有する、充填及び播種されたフラスコ又はローラーボトルは、回転され、少なくとも約５〜７日間、インキュベートされるが、インキュベート時間は約５〜約６日が好ましい。インキュベーションのおよそ半分の時点で（すなわち、約２．５〜約３．５日（好ましくは、３日）後）、又は細胞が所望の初期細胞密度に達した際に、本発明の無血清培養液がｈＵＴＣ培養物に添加される特定の実施形態において、実施形態Ａ、Ｂ、又はＣの無血清培養液が使用される。
好ましい実施形態において、細胞は、細胞が所望の初期個体群密度に達することができるような十分な時間増殖された後、無血清培養液が添加される。
したがって、一実施形態において、本方法は、マイクロキャリア上に播種された臍帯組織由来細胞を、本発明の培養培地において、細胞が所望の初期個体群密度に達することができるような十分な時間増殖させる工程と、細胞が所望の初期個体群密度に達した後に本発明の無血清培養液を添加する工程と、細胞が所望の最終個体群密度に達するのに十分な時間細胞を増殖させる工程と、を含む。
別の実施形態において、実施形態Ａの培養培地及び実施形態Ａの無血清培養液が使用される。別の実施形態において、実施形態Ｂの培養培地及び実施形態Ｂの無血清培養液が使用される。一実施形態において、実施形態Ｃの培養培地及び実施形態Ｃの無血清培養液が使用される。
一実施形態において、本方法は、培養する前にマイクロキャリアにｈＵＴＣを播種する工程を含む。マイクロキャリアは、上述のマイクロキャリアのうちのいずれか一つであってもよい。特定の実施形態において、マイクロキャリアは、アミン処理された表面を有する。好ましい実施形態において、アミン処理された表面を有するマイクロキャリアは、約１６０〜２００μｍの粒子サイズ、約１．０９０〜１．１５０の相対密度範囲、約５１５ｃｍ２／ｇの表面積を有する。一実施形態において、マイクロキャリアは、Ｈｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩ Ｕｌｔｒａである。
目標播種密度は、変化し得るが、特定の実施形態において、約５，０００〜約８，０００、あるいは約５，５００〜約７，５００、あるいは約６，０００〜約８，０００、あるいは約６，５００〜約７，５００の生存細胞／ｃｍ２が、約１５〜約３０、あるいは約１８〜約２５、あるいは約１５〜約２３ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度で播種される。播種された細胞は、フラスコに添加される。あるいは、播種は、フラスコ内で実施される。一実施形態において、播種する工程は、凍結保存されたｈＵＴＣを解凍する工程を含む。一実施形態において、本方法は、凍結保存されたｈＵＴＣを解凍し、細胞を増殖させた後、マイクロキャリアに播種する工程を更に含む。一実施形態において、細胞の増殖は、マイクロキャリア上で実施される。
一実施形態において、ｈＵＴＣを増殖するために本方法で使用される培養培地は、約２％〜約２０％の血清（例えばＦＢＳ）が補充されている。一実施形態において、培地は、培地の調製中に血清（例えば、ＦＢＳなど）が補充される。別の実施形態において、培地は、使用直前に（血清（例えば、ＦＢＳ）を含む溶液の添加によるなどで）補充される。一実施形態において、培養培地は、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）、あるいは約２〜約１０％、あるいは約３〜約１２％、あるいは約５〜約１５％、あるいは約４〜約１０％、あるいは約８〜約１５％、あるいは約１０〜約１５％のＦＢＳが補充されている。選択された実施形態において、培養培地は、約７．５％、約１０％、又は約１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳが補充されている。
３．本発明の方法のその他の特徴
スピナーフラスコ培養又はローラーボトル培養において培地の交換の必要なしに達成でき、集団倍加数を最大化するために使用される本発明の方法において、回転速度、ボトル内への細胞の播種密度、マイクロキャリアの量、インキュベーションの時間、培養培地の種類、無血清培養液の種類、及びボトル内に配置される培地の容積は、独立変数である。当業者は、試験された範囲外の他の値が同じ方法論を使用して普通に試験され、これらの値により集団倍加数に漸増した利益がもたらされると分かる可能性があることを認識するであろう。従属変数の最大応答、ここでは得られた集団倍加の数は、これらのパラメーターの関数として求められ、本明細書で具体的に例示されていない実施形態は、本開示の一部分として想到される。
提供された方法により培養される細胞（例えば、ｈＵＴＣなど）は、開始細胞と実質的に同一の細胞表面マーカープロファイル又は遺伝子発現プロファイルを有するとして特徴付けられる。一実施形態において、提供された方法により培養された細胞は、開始細胞と同一の細胞表面マーカープロファイル又は遺伝子発現プロファイルを有するとして特徴付けられる。細胞療法の多くの用途にとって、量的な増加のために培養条件の規模を拡大する際に細胞の特性が変化しないことは重要である。例えば、治療用細胞を識別又は示す、形態、細胞表面マーカー、及びホールマーク遺伝子（hallmark genes）の発現では、同じではないにしても、実質的に変化しないままであることが望ましい。本発明によって提供される細胞、及び本発明において教示される方法によって提供される細胞は、かかる特性が、実質的に変化しないか、又は、好ましくは、実験室での条件及び実験室での規模で成長した同一の細胞と同一である。
Ｖ．培養培地及び無血清培養液を含むキット
本発明の別の実施形態は、本発明の培養培地及び無血清培養液を含む細胞増殖用のキットである。一実施形態において、キットは、細胞を更に含む。好ましい一実施形態において、キットは、ヒト臍帯組織由来細胞を含む。キットは、使用説明書を更に含む。任意追加的に、キットは、マイクロキャリア及びウシ胎児血清などの血清を更に含む。代替の実施形態において、キットはまた、ローラーボトルシステムを更に含む。
更なる説明を行わずとも、当業者であれば、上記の説明及び以下の例示的な実施例を利用することで、本発明を行いかつ利用し、特許請求される方法を実施することが可能であるものと考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであって、本開示の残りの記載をいかなる意味においても限定するものとして解釈されるべきではない。
（実施例１）
栄養強化培地を有するスピナーフラスコ内のマイクロキャリア上でのｈＵＴＣの増殖及び採取
本実施例では、各種栄養強化培地を有するスピナーフラスコ内のマイクロキャリア上でのｈＵＴＣの増殖及び採取が調査された。本実施例での研究のために、臍帯組織由来細胞を接種材料から増殖させ、次いで各種様々な増殖条件（条件１〜９）で増殖させ、それぞれの条件は以下に略述した様に様々な培養培地を使用した。
本研究で使用したマイクロキャリアは、５１５ｃｍ２／ｇの表面積を有する、Ｈｉｌｌｅｘ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））であった。
本実施例で使用される際、用語「継代」は、別の容器からのコンフルエントのマイクロキャリアを有する新しいマイクロキャリアを含有する容器をインキュベートすることとして定義される。更に、本実施例で使用される際、用語「集団倍加」は所与の時間にわたって細胞の集団が倍加された回数として定義され以下のように計算される。
Figure 0006404227
細胞計数の手順
各種条件で必要とされるような細胞計数は以下の手順によって実施された。１０ｍＬのサンプルを無菌的に培養物から取り出し、１５ｍＬ円錐遠心管に移した。次いで、サンプルを１６００ＲＰＭで５分間遠心分離した。マイクロキャリアを確実に一切除去しないようにしながら、上清を注意深く除去した。次いで、３７℃に事前に加温された５〜１０ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））をマイクロキャリアに添加し、回転機上で１５〜３０分間撹拌した。次いで、遠心管の内容物を、マイクロキャリアを除去しかつ脱着した細胞だけを通過させる４０μｍフィルタを通過させて５０ｍＬ円錐遠心管内へ移した。フィルタを通過させて１×ＰＢＳで２回の洗浄を行った。次いで、５０ｍＬ円錐遠心管を１６００ＲＰＭで５分間遠心分離した。管内に約１〜２ｍＬの上清が残るまで、細胞ペレットを掻き乱さないように上清を注意深く除去した。ピペットを使用して残った物の体積を測定し、細胞は、この体積中で再懸濁された。得られた細胞懸濁液は、トリパンブルー排除法を使用するＣＥＤＥＸ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）細胞計数装置を使用して計数された。ＣＥＤＥＸ細胞計数に基づいて、培養容器中の細胞濃度が以下のように計算された。
Figure 0006404227
細胞培養手順
凍結されたｈＵＴＣのバイアルを解凍し、新鮮培地で洗浄した。細胞懸濁液を、培地及びマイクロキャリアを含有する１２５ｍＬガラス製スピナーフラスコ内へ移した。これらの解凍した細胞を使用して接種材料を調製した。
接種材料用の細胞の調製
接種材料を、種々のサイズ（１２５ｍＬ，５００ｍＬ、及び３Ｌ）のガラス製スピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（ＮＹ））内の１２ｇ／Ｌ濃度のマイクロキャリアを有するＤＭＥＭ及び１５％ ｖ／ｖのＦＢＳからなる管理培地において複数の継代にわたって増殖させた。接種材料内の細胞の集団倍加の累計は、３５未満であった。接種材料の増殖中の継代に対する基準及び培養条件は、以下の表において一覧表にした。継代の目標日に、細胞計数を行い、継代の目標密度が達成された場合、細胞は、新容器内の目標播種密度に基づく新容器内へ継代された。継代の目標密度が達成されていない場合、８０％の培地を交換し翌日に細胞計数した。培地交換のために、容器をスピナープラットフォームから除いて、マイクロキャリアを５分間重力で沈殿させ、培地の８０％を無菌的に除去し（マイクロキャリアを除去しないで）、等量の新鮮培地を添加し、容器をインキュベーター内のスピナープラットフォーム上に戻した。
接種材料を調製するための連続継代の間の増殖条件及びパラメーターを表１−１において以下に概述する。
Figure 0006404227
本実施例で使用された様々な増殖条件
条件１〜９のそれぞれに関して、接種の日は０日目と見なされる。更にそれぞれの条件に関して、細胞計数は、接種時に行われた。
条件１（対照）：この条件の目標播種密度は、約１８ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において、約６０００の生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内では最終重量が約９ｇのマイクロキャリアが得られた。ＤＭＥＭと１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ＣＯ２のインキュベーターにおいて６０ＲＰＭでスピナープラットフォーム上に設置した。３日目に、ＤＭＥＭ＋１５％ ＦＢＳを使用して８０％培地交換を実施した。上述した手順を用いて周期的に細胞計数を行った。３日目及び５日目にそれぞれ３ｍＬ及び２．５ｍＬのグルコースをフラスコに添加した。３日目に２．５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミン溶液を添加した。
条件２：この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度で、約６０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ５基本培地と１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し、容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の６０ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ５を添加した。培地交換は行わなかった。更に、３日目に２．５ｍＬのグルコースを添加した。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。５日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
条件３：この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において、約７０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて、所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ１基本培地と１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し、容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の４５ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ１を添加した。培地交換は行わなかった。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。３日目に２．５ｍＬのグルコースを添加した。４日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
条件４：この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において、約７０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ２基本培地と１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の４５ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ２を添加した。培地交換は行わなかった。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。３日目に２．５ｍＬのグルコース（２２０ｇ／Ｌのデキストロース１水和物の水溶液）を添加した。４日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
条件５：この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において、約７０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ３基本培地と１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の４５ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ３を添加した。培地交換は行わなかった。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。３日目に２．５ｍＬのグルコース（２２０ｇ／Ｌのデキストロース１水和物の水溶液）を添加した。４日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
条件６：この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において、約７０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ４基本培地と１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の４５ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ４を添加した。培地交換は行わなかった。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。３日目に２．５ｍＬのグルコース（２２０ｇ／Ｌのデキストロース１水和物の水溶液）を添加した。４日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
条件７：この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において、約７０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ５基本培地と１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の４５ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ５を添加した。培地交換は行わなかった。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。３日目に２．５ｍＬのグルコース（２２０ｇ／Ｌのデキストロース１水和物の水溶液）を添加した。４日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
条件８：この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において、約７０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ６基本培地と１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の４５ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ６を添加した。培地交換は行わなかった。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。３日目に２．５ｍＬのグルコース（２２０ｇ／Ｌのデキストロース１水和物の水溶液）を添加した。４日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
条件９：この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において、約７０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ７基本培地と１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の４５ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ７を添加した。培地交換は行わなかった。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。３日目に２．５ｍＬのグルコース（２２０ｇ／Ｌのデキストロース１水和物の水溶液）を添加した。４日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
採取
６日目に全てのフラスコを採取した。採取のために、マイクロキャリアを重力で沈殿させ、マイクロキャリアを一切取り出さないで出来るだけ多くの培地を除去した。事前に３７℃で加温された２５０〜３００ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）をフラスコに添加し、３７℃のインキュベーター内のスピナープラットフォーム上に設置した。３０分後に撹拌を停止し、フラスコから２５ｍＬのサンプルを除去し、４０μｍフィルタで濾過した。フィルタ上に留まったマイクロキャリアは廃棄し、サンプルを直接ＣＥＤＥＸにかけてサンプルの細胞計数を行った。添加したＴｒｙｐＬＥ（商標）の体積及び得られた細胞計数を基に、容器内の全細胞数を算出し、細胞密度（細胞／ｃｍ２）を算出した。
細胞培養培地の組成
ＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌのグルコース、４ｍＭのＬ−グルタミン、及び３．７ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを有し、かつピルビン酸ナトリウム及びフェノールレッドを有さない）が条件１（対照）用の基本培地であった。
幾つかのその他の基本培地も試験し、培地の交換をなくすのに重要であり、それにより血清の消費を減少させる成分を同定した。配合に使用された成分のうちの一つは、ウシ血清アルブミンであり、ウシ血清アルブミンは、脂質の豊富なウシ血清アルブミンであって、市販のＡｌｂｕＭａｘ（登録商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の形態で提供された。表１〜２により、基本培地（Ｍ１〜Ｍ７）の配合が提供される。基本培地及びフィード培地の両方が。市販の細胞膜の安定化剤及び消泡剤のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８を含有した。
Figure 0006404227
Figure 0006404227
上記で概説したように、条件１では３日目で８０％培地交換を実施した。残りの条件については、フィードを添加し培地交換を実施しなかった。種々のフィードの配合を表１−３に示す。表１−３に示した量は、フィードが添加される場合の培養容積リットル（Ｌ）あたりの成分の増加重量（ｇ）を示す。
Figure 0006404227
Figure 0006404227
条件１〜９に使用された培地は全て、ＦＢＳが添加されている。ＦＢＳの成分を以下に示す。
Figure 0006404227
結果
種々の条件からの細胞計数を以下の表１−５に示す。結果は、２つの部分で解析できる。条件１と２との比較によって、Ｍ５倍地と３日目のＦ５フィードとの組み合わせにより培地交換を省くことができることが明らかである。これにより、血清濃度を４４％超顕著に下げることとなるので重要である。条件３〜９の比較によって、以下の３つの条件（６，８，及び９）がその他の条件と比較して、最も低い性能であることが明らかである。条件６：Ｍ４基本培地＋１５％ ＦＢＳ、３日目にＦ４フィード、条件８：Ｍ６基本培地＋１５％ ＦＢＳ、３日目にＦ６フィード、及び条件９：Ｍ７基本培地＋１５％ ＦＢＳ、３日目にＦ７フィード。より詳しく配合を見ると、これら３つの条件はいずれも培地又はフィードの中に核酸誘導体を有さないことが分かる。それ故、核酸誘導体がｈＵＴＣの増殖に決定的な意味をもつと推察することができる。本実施例により、培養培地を高栄養化し、３日目に追加の培地成分を補充することによって、培地の交換なしにｈＵＴＣを６日間増殖させることができ、核酸誘導体が同程度の細胞増殖を維持するために重要であることが実証される。
Figure 0006404227
（実施例２）
マイクロキャリア上でかつ栄養強化培地を有するスピナーフラスコ内でのＨＵＴＣの増殖及び連続継代
スピナーフラスコ内の懸濁培養下のマイクロキャリア上に付着したヒト臍帯組織細胞（ｈＵＴＣ）の連続継代は、細胞が３日目において２０，０００細胞／ｃｍ２超の所定の最適細胞密度に達していない場合に培地交換が必要となる。この培地交換によりそのプロセスに追加の操作が加えられ、細胞継代の計画を予測するのが困難になる。したがって、この手順で細胞を継代させることは商業的に望ましくない。ｈＵＴＣは、１５％ウシ胎児血清を含有する細胞増殖培地に交換することによって高細胞密度に増殖することができる。本実施例では、ｈＵＴＣを継代するためのより商業的に望ましい代替方法を検討した。マイクロキャリアに付着したｈＵＴＣは、増殖培地を無血清栄養物で高栄養化することによって、スピナーフラスコ内の懸濁培養下で高細胞密度に増殖した。この方法により、細胞は、３日目の培地交換をなくしても、一貫して２０，０００細胞／ｃｍ２超の細胞に増殖することができる。この方法により、ｈＵＴＣの継代のためのプロセスの堅牢性が改善される。
以下が本研究で使用された。ＤＭＥＭ（２ｇ／Ｌのグルコース、４ｍＭのＬ−グルタミン、及び３．７ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを有するが、ピルビン酸ナトリウム及びフェノールレッドを有さない）、ウシ胎児血清（１５％ ｖ／ｖ）、Ｍ５基本培地（上記実施例１を参照）、Ｆ５フィード（上記実施例１を参照）、及びＨｉｌｌｅｘ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））マイクロキャリアを使用した。
表面マーカー解析法
Ｃａ又はＭｇを有さない、３％ ＦＢＳのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco's Phosphate Buffer Saline）（ＤＰＢＳ）を染色緩衝液として使用した。表面マーカーを同定するために６種の抗体を使用し、対照として２種の抗体を使用した。抗体のリスト及び効力検定のための染色緩衝液における抗体の希釈物を以下の表２−１に示す。
Figure 0006404227
手法：サンプルについて細胞計数を行い、２．５×１０６個の細胞を１０ｍＬのＤＭＥＭ＋１５％ ＦＢＳの培地内に再懸濁させた。次いで、細胞を遠心分離し、上清を除去し、染色緩衝液中に再懸濁させ、１×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度を得た。その後、この細胞懸濁液を各種遠心管に分配し、各遠心管が２００００細胞を受容した。次いで、適切な量の希釈した抗体及び染色緩衝液を上記表２−１に示されるように添加した。その後、サンプルを２〜８℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、３ｍＬのＤＰＢＳを添加し、サンプルを遠心分離した。上清を除去し、細胞パレットを５００μＬのＤＰＢＳの中に再懸濁させた。次いで、そのサンプルをＧｕａｖａ（登録商標）ＰＣＡ（商標）機器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＭＤ，ＵＳＡ））にかけた。６種の表面マーカーのうち、３種は陽性マーカー（ＣＤ１３、ＣＤ９０、ＨＬＡ−ＡＢＣ）であり、３種は陰性マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＨＬＡ−ＤＲ）であった。
培養条件
ｈＵＴＣの培養及び連続継代の方法を実施例１で説明した。上記のように、この連続継代では１５％ ＦＢＳを有するＤＭＥＭが培養培地として使用され、継代基準を満たすために度々培地交換が必要であった。本実施例では、連続継代中の度々の培地交換の必要性を排除することを試みた。これは、（１ｇ／Ｌではなくて２ｇ／Ｌのグルコースを有する）改変Ｍ５培地と１５％ ＦＢＳ（ｖ／ｖ）との使用によって達成された。１５％ ＦＢＳを有するこの改変Ｍ５培地の使用により、継代の日数を固定し、６継代数にわたって培地交換なしで行われた。培養条件及び評価基準を以下の表２−２に示す。
Figure 0006404227
細胞は、以下の表２−３に示したように６継代数にわたってしっかりと増殖した。ＤＭＥＭ＋１５％ ＦＢＳのみのプロセスでは、細胞は、１．５回の集団倍加を達成するために継代前日に度々培地交換を必要とし、それによって継代の期間が余分に１日だけ延長した。栄養強化培地によって、細胞は、３日（バイアル解凍から４日）以内に一貫して少なくとも１．５回超の集団倍加を行い、培地交換は一切不要であった。細胞は、この培地における７継代数後、それらの同一性を保持し、６日培養の３日目にＦ５フィードを行った本培地において６日間これらの細胞を増殖させた。これらの細胞の表面マーカー解析を以下の表２−４に示す。
Figure 0006404227
Figure 0006404227
（実施例３）
スピナースラフコ内の血清が削減された培地におけるマイクロキャリア上でのｈＵＴＣの増殖
ヒト臍帯組織細胞（ｈＵＴＣ）は、連続稼動３日目に１５％ ＦＢＳを含有する細胞増殖培地を交換することによって高細胞密度に増殖することができる。血清コストが高いこと、産生のための血清使用が多いこと、及び追加的な作動操作であることによって、培地内の高血清濃度及び培地交換は商業的見地から望ましくない。本実施例では、高細胞密度を達成しつつ、血清が削減された増殖培地内のマイクロキャリア上に付着したｈＵＴＣを培地交換無しで増殖させる方法を開示する。
本実施例で使用された培養培地は、１ｇ／Ｌの代わりに２ｇ／ＬのＤ−グルコースを有し、ウシ胎児血清が添加されたＭ５基本培地（上記参照）であった。Ｆ５フィード培地が使用された。グルコースを、２２０ｇ／Ｌのデキストロース１水和物の水溶液として与えた。グルタミンは、２００ｍＭ溶液として与えた。本実施例では、さまざまな増殖条件が研究された。これらの条件は、以下に概説されている。これらの条件で使用される場合、接種の日が０日目であると見なされる。更に、各条件において、Ｈｉｌｌｅｘ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））を使用した。
条件１（１５％ ＦＢＳ）：接種材料について細胞計数を行った。この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において約６０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ５基本培地と１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の６０ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ５を添加した。培地交換は行わなかった。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。３日目及び５日目に２．５ｍＬのグルコースを添加した。４日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
条件２（１０％ ＦＢＳ）：接種材料について細胞計数を行った。この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において約６０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ５基本培地と１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し、容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の６０ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ５を添加した。培地交換は行わなかった。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。３日目及び５日目に２．５ｍＬのグルコースを添加した。４日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
条件３（７．５％ ＦＢＳ）：接種材料について細胞計数を行った。この条件の目標播種密度は、約２０ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度において約６０００生存細胞／ｃｍ２であった。接種材料の細胞計数に基づいて、所望の体積の接種材料を、高圧滅菌した新しいガラス製５００ｍＬスピナーフラスコに添加した。マイクロキャリアは、重力により沈殿させた。接種材料からの培地は、約１００ｍＬがフラスコ内に残るまで除去された。次いで、新しいマイクロキャリアを添加し、フラスコ内には最終重量が約１０ｇのマイクロキャリアが得られた。Ｍ５基本培地と７．５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳからなる新鮮培地を添加し、容積を５００ｍＬにした。フラスコを３７℃で１０％ ＣＯ２のインキュベーター内の６０ＲＰＭのスピナープラットフォーム上に設置した。３日目にフィードＦ５を添加した。培地交換は行わなかった。細胞計数の部分で説明した通り周期的な細胞計数を行った。３日目及び５日目に２．５ｍＬのグルコースを添加した。４日目に５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミンをフラスコに添加した。
採取：６日目に両フラスコを採取した。採取のために、マイクロキャリアを重力で沈殿させ、一切マイクロキャリアを除去せずにできるだけ多くの培地を除去した。３７℃に事前に加温された３００ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）をフラスコに添加し、フラスコを３７℃のインキュベーター内のスピナープラットフォーム上に設置した。３０分後、撹拌を停止し、フラスコから２５ｍＬのサンプルを除去し、４０μｍフィルタを通過させて濾過した。フィルタ上に留まったマイクロキャリアを廃棄し、サンプルを直接的にＣＥＤＥＸ上にかけることによってサンプルの細胞計数を行った。添加したＴｒｙｐＬＥ（商標）の体積及び得られた細胞計数に基づいて、容器内の全細胞数を算出し、細胞密度（細胞／ｃｍ２）を算出した。
結果：それぞれにおいて異なるＦＢＳ濃度を有する３種類の条件から得られた細胞計数を以下の表に示す。本実施例からの結果に加えて、実施例１の条件１（ＤＭＥＭ＋１５％ ＦＢＳで３日目に培地交換有り）の結果を比較のために含める。その結果、栄養強化培地により、培地交換を無くすだけではなく、培地内の血清濃度を低減することができ、それによって培養において使用される血清の量を更に最小化することができる。
Figure 0006404227
(実施例４)
細胞の単離
臍細胞の単離。臍帯は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ））から得た。それらの組織は、正常分娩の後に得たものであった。細胞単離プロトコルを、層流フード内で、無菌的に実行した。血液及び残滓を除去するため、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ、アンホテリシンＢ ０．２５μｇ／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の存在下において、臍帯をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））で洗浄した。次いで、それらの組織を、１５０ｃｍ２の組織培養プレート内で、５０ｍＬの培地（ＤＭＥＭ−低グルコース又はＤＭＥＭ−高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の存在下で、組織が微細なパルプ状に細断されるまで機械的に解離させた。細断した組織を、５０ｍＬ円錐遠心管に移した（遠心管１本当り組織約５グラム）。
次いで、それぞれペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ、アンホテリシンＢ ０．２５μｇ／ｍＬ、及び消化酵素を含有する、ＤＭＥＭ−低グルコース培地又はＤＭＥＭ−高グルコース培地のいずれかにおいて組織を消化した。幾つかの実験では、コラゲナーゼ及びディスパーゼの酵素混合物（「Ｃ：Ｄ」）を使用した。（ＤＭＥＭ−低グルコース培地において、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、５００単位／ｍＬ、及びディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０単位／ｍＬ、）その他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）を使用した（ＤＭＥＭ−低グルコースにおいて、Ｃ：Ｄ：Ｈ＝コラゲナーゼ、５００単位／ｍＬ、ディスパーゼ、５０単位／ｍＬ、及びヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５単位／ｍＬ）。これらの組織、培地、及び消化酵素を含有する円錐遠心管を、２２５ｒｐｍの軌道振盪器（Ｅｎｖｉｒｏｎ（Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ））内で、３７℃で２時間インキュベートした。
消化後、１５０×ｇで５分間、組織を遠心分離して、上清を吸引した。ペレットは２０ｍＬの増殖培地において再懸濁された（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、規定のウシ胎児血清、ロット番号ＡＮＤ１８４７５（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ））、０．００１％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン、１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬ、及びアンホテリシン、０．２５μｇ／ｍＬ（それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）製）。細胞懸濁液を７０μｍナイロン製ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ細胞濾過器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））に通して濾過した。増殖培地を含む、追加の５ｍＬの洗液を、濾過器に通過させた。次いで、細胞懸濁液を４０−μｍのナイロン製細胞濾過器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））に通過させ、続いて、増殖培地の洗液を追加で５ｍＬ通過させた。
この濾液を、増殖培地（総容積５０ｍＬ）中に再懸濁させ、１５０×ｇで５分間、遠心分離した。上清を吸引して、５０ｍＬの新鮮増殖培地中に、細胞を再懸濁させた。この過程を更に２回繰り返した。
最終的な遠心分離の後に、上清を吸引して、５ｍＬの新鮮増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー染色を使用して、生存細胞の数を判定した。次いで、標準条件下で、細胞を培養した。
臍帯組織から単離した細胞を、増殖培地中、ゼラチンコーティングＴ−７５ｃｍフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））上に、５，０００細胞／ｃｍ２で播種した。２日後、消費した培地及び未付着の細胞を、フラスコから吸引した。ＰＢＳで付着細胞を３回洗浄して、残渣及び血液由来細胞を除去した。次いで、細胞に、増殖培地を補充して、コンフルエンスまで増殖させた（継代数０から継代数１まで約１０日）。その後の継代（継代数１から継代数２までなど）の際には、細胞は、４、５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％コンフルエンス）に到達した。これらの後続の継代に関しては、細胞を、５，０００細胞／ｃｍ２で播種した。細胞を、３７℃、二酸化炭素５％で、加湿したインキュベーター内で増殖させた。
幾つかの実施形態において、細胞は、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（２．５ｍｇ／ｍＬ、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ３、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））及びヒアルロニダーゼ（５単位／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を用いて消化させた後、ＤＭＥＭ−低グルコース培地内において、分娩後組織から単離した。組織の消化、及び細胞の単離は、上記の他のプロテアーゼ消化に関する説明と同様であったが、Ｃ：Ｄ又はＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりに、ＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼ混合物を使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥを使用する組織の消化は、分娩後組織から、容易に増殖する細胞集団の単離をもたらした。
種々の酵素の組み合せを使用して、臍帯から細胞を単離するための手順を比較した。消化に関して比較する酵素には、ｉ）コラゲナーゼ、ｉｉ）ディスパーゼ、ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ、ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）、ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）、ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）、ｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）を含めた。これらの種々の酵素消化条件を使用して、細胞単離の差異を観察した（表４−１を参照）。
種々の手法によって臍帯から細胞のプールを単離するために、他の試みを行なった。一例では、臍帯を薄切りにして、増殖培地で洗浄し、血餅及びゼラチン状物質を除去した。血液、ゼラチン状物質、及び増殖培地の混合物を回収して、１５０×ｇで遠心分離した。ペレットを再懸濁させ、ゼラチンコーティングされたフラスコ上に、増殖培地中で播種した。これらの実験から、容易に増殖する細胞集団が単離された。
細胞はまた、ＮＤＲＩから入手した臍帯血サンプルからも単離されている。単離プロトコルは、Ｈｏらの国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ第２００２／０２９９７１号に記載するものを使用した。臍帯血（ＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ））のサンプル（それぞれ５０ｍＬ及び１０．５ｍＬ）は、溶解用緩衝液（フィルタ殺菌済み１５５ｍＭの塩化アンモニウム、１０ミリモルの重炭酸カリウム、ｐＨ ７．２に緩衝された０．１ｍＭのＥＤＴＡ（全成分はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製）と混合した。臍帯血と溶解緩衝液との比率１：２０で、細胞を溶解させた。得られた細胞懸濁液を、５秒間ボルテックス攪拌して、周囲温度で２分間インキュベートした。この溶解液を、遠心分離した（２００×ｇで１０分間）。細胞ペレットは、１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ ＵＴ））、４ｍＭのグルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ））、１００単位／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を含有する完全最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ））において再懸濁された。再懸濁した細胞を、遠心分離して（２００×ｇで１０分間）、上清を吸引し、完全培地において細胞ペレットを洗浄した。Ｔ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（ＮＹ））、Ｔ７５ラミニンコーティングフラスコ、又はＴ１７５フィブロネクチンコーティングフラスコ（双方ともＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））内に、細胞を直接播種した。
細胞集団が種々の条件下で単離され、単離の直後に様々な条件下で増殖することが可能か否かを判定するために、上記の手順に従って、０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を有する増殖培地中、又は有さない増殖培地中で、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素の組み合せを使用して、細胞を消化させた。全細胞を１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンの存在下で増殖させた。全ての試験条件下で、細胞は、継代数０〜継代数１で良好に付着し増殖した（表４−２）。条件５〜８及び条件１３〜１６における細胞は、播種後、継代数４まで良好に増殖することが実証され、その時点でそれらの細胞を凍結保存した。
Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合せにより、単離後の、最良の細胞収量をもたらされ、他の条件よりも、多くの世代にわたって培養下で増殖する細胞が生じた（表４−１）。コラゲナーゼ又はヒアルロニダーゼを単独で使用しても、増殖可能な細胞集団は得られなかった。この結果が、試験したコラゲナーゼに特異的なものであるか否かを判定する試みは行なわなかった。
Figure 0006404227
細胞は、酵素消化及び増殖に関して試験した全条件下で、継代数０〜１の間で、良好に付着し増殖した（表４−２）。実験条件５〜８及び実験条件１３〜１６における細胞は、播種後、継代数４まで良好に増殖し、その時点で、それらの細胞を凍結保存した。全細胞は、更なる分析のために凍結保存された。
Figure 0006404227
有核細胞が付着し、急速に増殖した。これらの細胞をフローサイトメトリーによって分析したところ、酵素消化によって得られた細胞と同様であった。
これらの調製物は、赤血球及び血小板を含有した。最初の３週間は、有核細胞が付着及び分裂することはなかった。播種の３週間後に、培地を交換したが、細胞の付着及び増殖は観察されなかった。
酵素併用コラゲナーゼ（メタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）及びヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を破壊する粘液溶解酵素）を効果的に使用して、臍組織から細胞集団を単離することができた。コラゲナーゼと中性プロテアーゼとの配合物であるＬＩＢＥＲＡＳＥも使用することができる。コラゲナーゼ（４ Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇ）及びサーモリシン（１７１４カゼイン単位／ｇ）である、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ３もまた、細胞を単離するために、ヒアルロニダーゼと共に使用した。これらの細胞をゼラチンコーティングされたプラスチック上の増殖培地において培養した場合、多数回の継代にわたって、容易に増殖した。
細胞はまた、臍帯内の残留血液からも単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。使用した条件下で付着及び増殖する、この組織から洗い流された血餅中の細胞の存在は、解剖プロセス中に細胞が遊離することによるものである可能性がある。
（実施例５）
細胞の核型分析
細胞療法に使用される細胞株は、好ましくは、同種であり、いずれの汚染細胞型も含まない。細胞治療に使用されるヒト細胞は、正常な構造を有する、正常な数（４６個）の染色体を有していなければならない。同種であり、かつ、非臍組織起源の細胞を含まない臍由来細胞株を同定するため、細胞サンプルの核型分析を行った。
新生男児の分娩後組織由来のＵＴＣを、増殖培地中で培養した。新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）との識別が可能となるように、新生男児由来の分娩後組織（Ｘ，Ｙ）が選択された。細胞を、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））内の増殖培地中に、５，０００細胞／平方センチメートルで播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させた。細胞を含有するＴ２５フラスコは、首部分まで増殖培地で充填した。臨床細胞遺伝学研究所に、急送便でサンプルを配送した（研究所間の推定輸送時間は、１時間である）。染色体分析は、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ（Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪ）に所在するＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより行われた。細胞は、染色体が最も良好に可視化される、分裂中期の間に分析された。計数した分裂中期の２０個の細胞のうち、５個の細胞を、正常な同種核型数（２）に関して分析した。細胞サンプルは、２つの核型が観察された場合に同種であると特徴付けられた。細胞サンプルは、３つ以上の核型が観察された場合に異種であると特徴付けられた。異種性の核型数（４）が識別されると、更なる分裂中期細胞を計数して、分析した。
染色体分析に送られた全細胞サンプルは、細胞遺伝学研究所のスタッフによって、正常外見を呈していると解釈された。分析された１６個の細胞株のうちの３つは、新生児起源及び母体起源の双方に由来する細胞の存在を示す、異種性の表現型（ＸＸ及びＸＹ）を呈した（表５−１）。それぞれの細胞サンプルは、同種であると特徴付けられた。（表５−１）。
Figure 0006404227
染色体分析により、臨床細胞遺伝学研究所により解釈されると、核型が正常である臍由来ＵＴＣが同定された。核型分析はまた、同種核型により判断される、母体細胞を含まない細胞株も同定した。
（実施例６）
細胞表面マーカーのフローサイトメトリー評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質又は「マーカー」の特性評価を用いて、細胞株の同一性を判定することができる。この発現の一貫性は、複数のドナーから、並びに種々の処理及び培養条件に曝された細胞において、判定することができる。臍から単離された分娩後細胞株を、フローサイトメトリーによって特徴付けることにより、これらの細胞株の同定に関するプロファイルが提供された。
プラズマ処理されたＴ７５、Ｔ１５０、及びＴ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内で、細胞をコンフルエンスまで培養した。２％（ｗ／ｖ）のゼラチン（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を、室温で２０分間インキュベートすることによって、これらのフラスコの増殖表面をゼラチンでコーティングした。
フラスコ内の付着細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＭＯ））内で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して剥離させた。細胞を採取して遠心分離し、１×１０７細胞／ｍＬの濃度で、３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳのＰＢＳ中に再懸濁した。製造業者の仕様書に従って、１００μＬの細胞懸濁液に対象の細胞表面マーカーに対する抗体（下記参照）を添加し、その混合物を暗所において４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、非結合抗体を除去した。細胞を５００μＬＰＢＳ中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ計器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））を使用して実行した。
細胞表面マーカーに対する以下の抗体を使用した。
Figure 0006404227
臍由来細胞を、継代数８、１５、及び２０で分析した。
ドナー間の差異を比較するため、種々のドナーからの臍帯由来細胞を相互に比較した。更に、ゼラチンコーティングフラスコ上で培養した臍由来細胞を、非コーティングフラスコ上で培養した臍由来細胞と比較した。
細胞の単離及び準備に関して使用される、４つの処理を比較した。１）コラゲナーゼ、２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ、３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼを使用する処理によって、分娩後組織から得られた細胞を比較した。
フローサイトメトリーによって分析された、継代数８、１５、及び２０における臍帯由来細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、このことは、ＩｇＧ対照と比較しての蛍光の増大によって示された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示された。
フローサイトメトリーによって分析された、別個のドナーから単離された臍帯由来細胞はそれぞれ、ＩｇＧ対照と比較しての蛍光値の増大に反映される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生について陽性を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
ゼラチンコーティングフラスコ及び非ゼラチンコーティングフラスコ上で増殖して、フローサイトメトリーにより分析された臍帯由来細胞は、全てＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生に関して陽性であり、ＩｇＧ対照と比較して増加した蛍光値を有していた。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
フローサイトメトリーによる臍帯由来細胞の分析を通じて、これらの細胞株の同一性が実証された。これらの臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関して陽性であり、かつＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関して陰性である。この同一性は、ドナー、継代数、培養容器の表面コーティング、消化酵素、及び胎盤の層を含む変数が変動しても、一貫していた。個々の蛍光値ヒストグラム曲線の平均及び範囲には、ある程度の変動が観察されたが、全ての試験条件下での、全ての陽性曲線は正常であり、発現した蛍光値は、ＩｇＧ対照よりも大きく、それゆえ、これらの細胞が、マーカーの陽性発現を有する同種の集団を含むことが確認された。
（実施例７）
オリゴヌクレオチドアレイによる細胞分析
オリゴヌクレオチドアレイを使用して、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、線維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、及びヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この解析により、分娩後由来細胞の特性評価が提供され、これらの細胞に関係する固有の分子マーカーが特定された。
分娩後組織由来細胞。ヒト臍帯及びヒト胎盤は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ））より、患者の同意を得て、正常な満期分娩から得た。Ｃ：Ｄ：Ｈの混合物による消化後、実施例５に記述されるとおり、組織の受領及び細胞の単離が行われた。細胞は、ゼラチンコーティングされたプラスチック製組織培養フラスコ上の増殖培地において増殖された。この培養物を、５％のＣＯ２を使用して、３７℃でインキュベートした。
線維芽細胞ヒト皮膚線維芽細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；ロット番号９Ｆ０８４４）及びＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）より購入した。双方の株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中で培養した。これらの細胞は、標準的な組織処理プラスチック上で増殖させた。
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６、及び２Ｆ１６５７）より購入し、製造業者の仕様書に従って、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で培養した。これらの細胞は、５％のＣＯ２を使用して、３７℃で標準的な組織培養プラスチック上で増殖させた。
ヒト腸骨稜骨髄細胞（ＩＣＢＭ）。ヒト腸骨稜の骨髄は、患者の同意を得て、ＮＤＲＩより受け取った。この骨髄を、Ｈｏらによって概説される方法（国際公開第０３／０２５１４９号）に従って処理した。この骨髄を、溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ７．２）と、骨髄１部対溶解緩衝液２０部の比率で混合した。この細胞懸濁液を、ボルテックス攪拌して、周囲温度で２分間インキュベートし、５００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清及び４ｍＭのグルタミンが補充された最小必須培地−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁させた。これらの細胞を、再び遠心分離して、新鮮培地中に細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー色素排除（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、生存単核細胞を計数した。単核細胞は、５×１０４細胞／ｃｍ２にて、プラスチック製細胞培養フラスコ中に播種された。細胞を、標準大気Ｏ２又は５％ Ｏ２のいずれかで、５％ ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。培地を交換することなく、細胞を５日間培養した。５日間の培養の後、培地及び非付着細胞を除去した。付着細胞は、培養物中に維持された。
活発に増殖する細胞培養物を、低温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、細胞スクレーパによってフラスコから除去した。これらの細胞を、３００×ｇで５分間、遠心分離した。上清を除去して、新鮮なＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、再び遠心分離した。上清を除去して、細胞ペレットを直ちに凍結させ、−８０℃で保存した。細胞のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへと転写させた。次に、ｃＤＮＡをｃＲＮＡに転写させし、ビオチンで標識した。ビオチン標識済みｃＲＮＡについて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ ＨＧ−Ｕ１３３Ａオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））によってハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション及びデータ収集は、製造業者の仕様書に従って実施した。データ解析は、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）ｖｅｒｓｉｏｎ１．２１コンピュータソフトウェア（Ｔｕｓｈｅｒ、Ｖ．Ｇ．ら、２００１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：５１１６〜５１２１）を使用して実施した。解析ソフトウェアのライセンスはＯｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手可能であり、詳細な情報は、Ｄｅｐ’ｔ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＰｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉのウェブサイトにおいてインターネット情報検索システムから入手可能である。
１４個の異なる細胞集団を、この試験において分析した。これらの細胞を、継代情報、培養基質、及び培養培地と共に、表７−１に列記する。細胞株については、分析時の継代、細胞増殖基質、及び増殖培地と共に識別コードを列記した。
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データは、上述したＳＡＭソフトウェアによる主成分分析で評価した。分析により、試験対象の細胞において、様々な相対量で発現した２９０個の遺伝子が明らかとなった。この分析により、集団間の相対比較がもたらされた。
表７−２は、細胞対の比較のために算出された、ユークリッド距離を示す。ユークリッド距離は、細胞型間で示差的に発現した２９０個の遺伝子に基づく、細胞の比較に基づいたものである。ユークリッド距離は、２９０個の遺伝子の発現における類似性と反比例している。ユークリッド距離は、細胞の種類ごとに異なる発現をしたこれらの２９０個の遺伝子を使用して、細胞の種類に対して算出された。細胞間の類似性は、ユークリッド距離に反比例している。
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表７−３、表７−４、及び表７−５は、胎盤由来細胞内で増加した遺伝子の発現（表７−３）、臍帯由来細胞内で増加した遺伝子の発現（表７−４）、並びに臍帯由来細胞及び胎盤由来細胞内で減少した遺伝子の発現（表７−５）を示す。
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表７−６、表７−７、及び表７−８は、ヒト線維芽細胞（表７−６）、ＩＣＢＭ細胞（表７−７）、及びＭＳＣ（表７−８）内で増加した、遺伝子の発現を示す。
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本実施例は、臍帯由来細胞及び胎盤由来細胞の分子の特性評価を提供するために実行された。この分析は、３つの異なる臍帯及び３つの異なる胎盤に由来する細胞を含んだ。この研究はまた、皮膚繊維芽細胞の２つの異なる株、間葉系幹細胞の３つの株、及び腸骨稜骨髄細胞の３つの株も含んだ。これらの細胞により発現されたｍＲＮＡは、オリゴヌクレオチドプローブを含むＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイにおいて、２２，０００の遺伝子について分析された。
分析により、これら５つの異なる細胞型には、２９０の遺伝子の転写産物が異なる量で存在していることが明らかとなった。これらの遺伝子には、胎盤由来細胞内で特異的に増加した１０種の遺伝子、及び臍帯由来細胞内で特異的に増加した７種の遺伝子が含まれる。５４種の遺伝子が、胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞において、特異的に低い発現レベルを有することが分かった。
（実施例８）
細胞表現型の免疫組織化学的特性評価
ヒト臍帯組織に見出される細胞の表現型を、免疫組織化学的検査によって分析した。
ヒト臍帯組織を採取し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドにより４℃で一晩浸漬固定した。免疫組織化学的検査は、以下のエピトープに対する抗体を使用して実行した（表８−１を参照）。ビメンチン（１：５００、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、デスミン（１：１５０、抗ウサギ、Ｓｉｇｍａ、又は１：３００、抗マウス、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ））、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ、１：４００、Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８、１：４００、Ｓｉｇｍａ）、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ、１：２００、Ｓｉｇｍａ）、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ、１：１００、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ））。更に、以下のマーカーを試験した。抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ））、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及び抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。固定された検体を外科用メスを使用してトリミングし、エタノールを含有するドライアイス浴上の、ＯＣＴ包理化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ、Ｓａｋｕｒａ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ））内に定置した。次いで、凍結ブロックを、標準的なクリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して切片（厚さ１０μｍ）とし、染色のためにスライドガラス上に載置した。
以前に行われた試験に類似した免疫組織化学的検査を実施した。（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２００３年、１８４：８１６〜８２９）。組織切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ）を含有するタンパク質ブロッキング溶液に１時間曝した。目的のエピトープが細胞表面（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）上に位置している場合には、エピトープの損失を防ぐために、この手順の全ての段階で、Ｔｒｉｔｏｎを省略した。更に、一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）に対して産生された場合には、手順全体を通して、ヤギ血清の代わりに、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を使用した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で４時間にわたって、これらの切片に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））及び／若しくはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）又はロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にブロックを含有する、二次抗体溶液を付与した（室温で１時間）。培養物を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間付与して、細胞核を可視化した。
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ））上で、適切な蛍光フィルタを使用して、蛍光を可視化した。陽性染色は、対照染色を上回る蛍光シグナルによって表された。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルタを使用して、各画像を撮影した。次いで、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））を使用して、階層モンタージュを準備した。
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ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、及びＣＤ３４マーカーは、臍帯内部に見出される細胞のサブセットで発現した（データ示さず）。具体的には、ｖＷＦ及びＣＤ３４の発現は、臍帯内部に含まれる血管に限定されていた。ＣＤ３４＋細胞は、最内層（内腔側）に存在した。ビメンチンの発現は、臍帯のマトリックス及び血管の全域に見られた。ＳＭＡは、動脈並びに静脈の、マトリックス及び外壁に限定されたが、血管自体には含まれなかった。ＣＫ１８及びデスミンは、血管内部のみに観察され、デスミンは、中層及び外層に限定された。
これらのマーカーのいずれも、臍帯内部では観察されなかった（データ示さず）。
ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、ヴォン・ヴィレブランド因子、及びＣＤ３４は、ヒト臍帯内部の細胞内で発現する。ビメンチン及びα−平滑筋アクチンのみが発現することを示したインビトロ特性分析に基づいて、データは、臍帯由来細胞を単離する本プロセスが細胞の亜集団を採取するものであること、又は単離した細胞がマーカーの発現を変化させてビメンチン及びα−平滑筋アクチンを発現することを示唆している。
（実施例９）
栄養因子の分泌
ＵＴＣからの選択された栄養因子の分泌を測定した。因子は、以下より選択した。血管由来の活性を有するもの（例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎら、Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、１９９７年、２１２、２１５〜２６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏら、Ｂｌｏｏｄ、２０００年、９６、３４〜４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年、１７０、３３６９〜７６）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２００４年、７７、８１２〜６）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）、神経栄養活性／神経保護活性を有するもの（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２００３年、２５８、３１９〜３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２））、又はケモカイン活性を有するもの（マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１β）、単球化学誘引物質−１（ＭＣＰ−１）、ランテス（Rantes）（活性化時調節正常Ｔ細胞発現及び分泌物）、Ｉ３０９、胸腺及び活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、及び（ＩＬ−８）。
臍帯由来細胞、並びにヒト新生児包皮由来のヒト繊維芽細胞を、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ上の増殖培地において培養した。継代数１１で、細胞を凍結保存し、液体窒素中で保存した。細胞の解凍後、それらの細胞に増殖培地を添加し、その後、１５ｍＬ遠心管に移して、１５０×ｇで５分間、それらの細胞を遠心分離した。４ｍＬの増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を計数した。細胞を、それぞれが１５ｍＬの増殖培地を含有するＴ７５フラスコ内において、５，０００細胞／ｃｍ２で播種し、２４時間の培養を行った。培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ））に変えて、８時間培養した。インキュベーションの終了時に、１４，０００×ｇで５分間遠心分離を行い無血清馴化培地を収集し、−２０℃で保存した。
各フラスコ内の細胞数を推算するため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して脱離させた。８ｍＬの増殖培地の添加によって、トリプシン活性を抑制した。これらの細胞を、１５０×ｇで５分間、遠心分離した。上清を除去し、１ｍＬの増殖培地中に、細胞を再懸濁させた。細胞数は、血球計数器によって推算した。
細胞を５％ ＣＯ２及び大気酸素中３７℃で増殖させた。そらぞれの細胞サンプルによって産生された、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６，ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、及びＴＧＦ−β２の量はＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｎ．））によって測定した。全てのアッセイは、製造業者の説明書に従って行われた。提示された値は、１ｍＬごと、細胞１００万個ごとのピコグラムである（ｎ＝２，ｓｅｍ）。
ケモカイン（ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ−１、ランテス（Rantes）、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、Ｅｏｔａｘｉｎ、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＮＤＦ、及び血管由来因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２，ＰＤＧＦｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦ）は、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｒｒａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して測定された。このＰｒｏｔｅｏｍｅ Ａｒｒａｙは、ウェル当り２〜１６のタンパク質を定量測定するための、多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。これらのアレイは、９６ウェルプレートのそれぞれのウェル内に、２×２、３×３、又は４×４のパターンの、４〜１６個の異なる捕捉抗体をスポットすることによって産生される。サンドイッチＥＬＩＳＡ手順の後に、プレート全体を画像化して、プレートの各ウェル内部の各スポットで生成された、化学発光シグナルを捕捉する。各スポットで生成されるシグナルは、元の標準又はサンプル中の、標的タンパク質の量に比例する。
ＭＣＰ−１及びＩＬ−６は、臍由来ＰＰＤＣ及び皮膚線維芽細胞によって分泌された（表９−１）。ＳＤＦ−１α及びＧＣＰ−２は、線維芽細胞によって分泌された。ＧＣＰ−２及びＩＬ−８は、臍由来ＰＰＤＣによって分泌された。ＴＧＦ−β２は、いずれの細胞型においても、ＥＬＩＳＡによって検出されなかった。
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ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ（商標）多重ＥＬＩＳＡアッセイ。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ１、ランテス（RANTES）、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、及びＩＬ−８が、臍帯由来ＰＰＤＣから分泌された（表９−２及び９−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、又はＰＤＧＦｂｂは検出されなかった。
Figure 0006404227
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臍由来細胞は、多数の栄養因子を分泌した。ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１、及びＩＬ−８などの、これらの栄養因子のうちの一部は、血管新生において重要な役割を果たす。ＢＤＮＦ及びＩＬ−６などの他の栄養因子は、神経再生又は保護に重要な役割を果たす。
（実施例１０）
テロメラーゼ活性の分析
テロメラーゼは、染色体の完全性を保護し、また細胞の複製寿命を延長するために役立つ、テロメア繰り返し体を合成するように機能する（Ｌｉｕ，Ｋら、ＰＮＡＳ，１９９９年：９６：５１４７〜５１５２）。テロメラーゼは、テロメラーゼＲＮＡテンプレート（ｈＴＥＲ）、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の２つの成分からなる。テロメラーゼの調節は、ｈＴＥＲではなく、ｈＴＥＲＴの転写によって決定される。ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡに関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、それゆえ、細胞のテロメラーゼ活性を判定するための容認された方法である。
細胞単離
リアルタイムＰＣＲ実験を実行して、ヒト臍帯組織由来細胞のテロメラーゼ産生を判定した。ヒト臍帯組織由来細胞は、上記実施例及び米国特許第７，５１０，８７３号に記載の実施例に従って調製された。全般的には、正常な分娩後の、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から得た臍帯を洗浄して、血液及び残渣を除去し、機械的に解離させた。次いで、その組織を、培養培地中、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼを含む消化酵素と共に、３７℃でインキュベートした。ヒト臍帯組織由来細胞は、‘０１２号特許出願の実施例に記載の方法に従って培養した。間葉系幹細胞及び通常の皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット番号９Ｆ０８４４）は、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）から入手した。多能性ヒト精巣胎児性癌（テラトーマ）細胞株ｎＴｅｒａ−２細胞（ＮＴＥＲＡ−２ ｃｌ．Ｄ１）（Ｐｌａｉａら，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００６年；２４（３）：５３１〜５４６を参照）は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から購入し、米国特許第７，５１０，８７３号に記載の方法に従って培養した。
総ＲＮＡの単離
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ．））を使用して、ＲＮＡを細胞から抽出した。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ−処理水で溶出させ、−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写剤（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ．））を有するランダムヘキサマーを使用して、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間逆転写させた。サンプルを−２０℃で保存した。
リアルタイムＰＣＲ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイとしても既知）を、製造業者の仕様書（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用して、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを実行した。この市販のキットは、ヒト細胞内のテロメラーゼをアッセイするために、広く使用されている。簡潔には、ｈＴｅｒｔ（ヒトテロメラーゼ遺伝子）（Ｈｓ００１６２６６９）及びヒトＧＡＰＤＨ（内部対照）を、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ７０００ ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に７０００配列検出システムを使用して、ｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間及び９５℃で１０分間とし、その後に、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルとした。ＰＣＲデータを、製造業者の仕様書に従って解析した。
ヒト臍帯組織由来細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６０６７）、線維芽細胞、及び間葉系幹細胞を、ｈＴｅｒｔ及び１８Ｓ ＲＮＡに関してアッセイした。表１０−１に示すように、ｈＴｅｒｔ、よってテロメラーゼは、ヒト臍帯組織由来細胞内では検出されなかった。
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ヒト臍帯組織由来細胞（単離株０２２８０３、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６０６７）及びｎＴｅｒａ−２細胞をアッセイしたところ、それらの結果は、ヒト臍帯組織由来細胞の２つのロットでは、テロメラーゼの発現を示さなかったが、一方で、テラトーマ細胞株は、高レベルで発現することが明らかとなった（表１０−２）。
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したがって、本発明のヒト臍帯組織由来細胞は、テロメラーゼを発現しないと結論付けることができる。
（実施例１１）
インペラスピナーフラスコリアクター内のマイクロキャリ上でのＵＴＣの増殖
材料及び方法
細胞。ＣＢＡＴロット番号０５０６０４Ｂ継代数８細胞からの細胞を解凍し、１つの継代の間、Ｔ２２５フラスコ内で増殖させた。
マイクロキャリア。Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１７−０４８５）のマイクロキャリアビーズをＰＢＳ内で少なくとも３時間水和させ、高圧滅菌した。
スピナーフラスコ。１００ｍＬ及び２５０ｍＬの、内部オーバーヘッドベアリングインペラアセンブリ（Overhead Bearing Impeller Assembly）を備えたスピナーフラスコ（Ｂｅｌｌｃｏ，Ｉｎｃ．）。
コンフルエンス。コンフルエンスは、代表的な顕微鏡観察視野内で観察されるマイクロキャリアのおよそ９０％として定義され、細胞で覆われた表面積のおよそ６０％超である。
継代。継代は、新しいマイクロキャリアを含有するスピナーフラスコに、別個のスピナーフラスコ培養から得られたコンフルエントなマイクロキャリアの分取物を接種することとして定義される。
接種及び培養。細胞は、トリプシンによってＴ２２５フラスコから採取され、４．０Ｅ＋０６細胞の分取物は、４０ｍＬの培地を含有する１００ｍＬインペラ又はガラス棒付きスピナーフラスコ内の３００ｍｇのマイクロキャリアビーズに添加された。インキュベーションの前に、フラスコを５％ ＣＯ２ガスで１分間フラッシングした。接種材料の速度−頻度は、８時間にわたって３０分毎に２分間、３０ｒｐｍであった。８時間目に、培地の容積は、１００ｍＬに増加し、スピナー速度は、４５ｒｐｍの連続回転に設定され、３７℃でインキュベートした。
継代。継代数１−（１００ｍＬ〜２５０ｍＬフラスコ）細胞を８日間培養した。全てのマイクロキャリアを１００ｍＬフラスコから回収し、重力によって培地から分離させた。培地を吸引し、マイクロキャリアを１００ｍＬの新鮮培地に再懸濁させた。ピペット操作後、確実に同等な分配を行うように、マイクロキャリアを有する５ｍＬの培地を除去し２５０ｍＬスピナーフラスコ内に送達したおよそ６６０ｍｇの水和及び高圧滅菌された新しいＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリア及び培地もまた、フラスコに添加された。培地の容積を２００ｍＬに増加させ、フラスコを５％ ＣＯ２ガスで１分間フラッシングしてからインキュベートした。スピナー速度を４５ｒｐｍの連続回転に設定し、３７℃でインキュベートした。残った細胞をトリプシン処理によって採取し、ＧｕａｖａＰＣＡ機器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ））を使用して計数した。
継代２−（２５０ｍＬ〜２５０ｍＬフラスコ）細胞を６日間培養した。全てのマイクロキャリアを２５０ｍＬフラスコから回収し、重力によって培地から分離させた。培地を吸引し、マイクロキャリアを２５ｍＬの新鮮培地に再懸濁させた。ピペット操作後、確実に同等に分配するように、マイクロキャリアを有する５ｍＬの培地を除去し、２５０ｍＬスピナーフラスコ内に送達した。およそ６６０ｍｇの水和及び高圧滅菌した新しいＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリア及び培地もまたフラスコに添加された。培地の容積を２００ｍＬに増加させ、フラスコを５％ ＣＯ２ガスで１分間フラッシングしてからインキュベートした。スピナー速度を４５ｒｐｍの連続回転に設定し、３７℃でインキュベートした。残った細胞をトリプシン処理によって採取し、ＧｕａｖａＰＣＡ機器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ））を使用して計数した。
培地交換。スピナーフラスコを培養物から除去し、マイクロキャリアを重力でフラスコの底に沈殿させた。およそ半分の培地容積を吸引によって除去し、同じ容積の新鮮培地で置換した。フラスコを５％ ＣＯ２ガスで１分間フラッシングし培養物に戻した。培地交換を１日目、及び４日目に実行した。
活性染色法。１ｍＬの分取物をフラスコから除去し、マイクロキャリアを重力で沈殿させた。培地を吸引によって除去し、１ｍＬの生存／死亡染色溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｌ３２２４）で置換し、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、２０マイクロリットルの分取物をガラス製顕微鏡スライドに塗布し螢光顕微鏡によって観察した。生存細胞は、緑色に染色し、死細胞は赤色に染色する。顕微鏡視野を手動で分析し、マイクロキャリアに付着した生存細胞と死細胞の分布及び比率を評価した。少なくとも３つの顕微鏡視野を評価し、生存細胞の近似的な割合を計算した。
細胞採取。スピナーフラスコからマイクロキャリアを採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、２つの５０ｍＬ円錐遠心管の間に均等に配分した。各遠心管を２５ｍＬのトリプシンで３７℃において１０分間インキュベートした。遠心管をＰＢＳで５０ｍＬの容量にし、マイクロキャリアを重力で沈殿させた。細胞を含有する上清を吸引によって回収し、２．５ｍＬのＦＢＳが事前に充填してある５０ｍＬ円錐遠心管に移した（結果として５％ ＦＢＳ溶液をもたらしトリプトシンを不活性化した）。このプロセスを４回繰り返し、各々の画分を別々に回収した。全ての採取した細胞を遠心分離し、血清を含有する増殖培地中に再懸濁させ、Ｇｕａｖａ ＰＣＡ機器の使用によって細胞を計数した。
静置Ｔ−フラスコ培養。Ｔ２２５フラスコから採取した細胞の分取物を使用し２つのＴ２２５フラスコに播種し、米国特許出願第１０／８７７０１２号に記述の方法を使用して４日間インキュベートした。細胞を採取しフローサイトメトリーによって分析した。
フローサイトメトリー。採取した細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））を使用するフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面マーカーのプロファイルを判定した。全ての抗体は、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
結果
細胞採取。表１１−１に、スピナーフラスコ培養においてＵＴＣ細胞株０５０６０４ＢをＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリア上で継代数９から継代数１１まで増殖させた際の継代毎の採取画分、細胞収量及び生存率を示す。
Figure 0006404227
細胞動態。表１１−２に、スピナーフラスコ培養においてＵＴＣ細胞株０５０６０４ＢをＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリア上で継代数９から継代数１１に増殖させた際の増殖速度を示す。表は、全倍加数（total doublings）が７．４８であり、倍加あたりの平均時間が６９．５３（±１７．５２）時間であったと示している。
Figure 0006404227
生存／死亡の染色。生存／死亡の染色を行ったマイクロキャリア分取物の解析により、マイクロキャリア表面の大部分は緑色染色（生存）細胞で被覆され、僅か中心が赤色染色核（死亡）であることが示される。細胞は、静置条件で培養された細胞の形態と類似の形態を示す。
フローサイトメトリー解析。表１１−３は、スピナーフラスコ内のマイクロキャリアビーズから採取されたヒト臍組織由来細胞（ｈＵＴＣ）によって発現された細胞表面マーカーに対する結果（「＋陽性」又は「−陰性」）を静置Ｔフラスコ内の培養物から採取されたｈＵＴＣによるものと対比させて示す。表は、２つの方法によって産生された細胞によって発現されたマーカーは一致していたことを示している。
Figure 0006404227
結論：ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）をインペラスピナーフラスコバイオリアクター内のＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリア上で培養した。細胞は、２０日間にわたって７．４８回の集団倍加を達成し、平均集団倍加時間は６９時間であった。継代あたりの細胞生存率は９４．４％〜９９．７％の範囲であった。マイクロキャリア上で培養されたｈＵＴＣ上の１３個の細胞表面マーカーの発現の解析は、細胞培養Ｔフラスコにおいて培養されたｈＵＴＣによる細胞表面マーカーの発現と一致していた。本実施例により、マイクロキャリアを使用してバイオリアクターシステムにおいてｈＵＴＣを播種、増殖、及び採取することができることが示される。
（実施例１２）
スピナーフラスコ内のコラーゲンコーティングしたＭＧＳＡ及びＰＬＧＡマイクロキャリア上での増殖したｈＵＴＣの増殖
スピナーフラスコ培養における生存率を維持する能力及び静置培養内へ再播種すると増殖する能力など、コラーゲンコーティングされた再吸収性合成生体材料で製造された材料に付着したｈＵＴＣの能力を調査した。増殖したｈＵＴＣを、コラーゲンをコーティングした、又はコーティングしてないポリ−（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリ（モノステアロイルグリセリド・コ−コハク酸）（ＭＧＳＡ）のマイクロキャリア上に播種した。細胞を有するマイクロキャリアをスピナーフラスコ内で５日間培養し、トリプシン処理によって採取し、静置培養内に再播種した。
材料及び方法
Figure 0006404227
マイクロキャリアの調製。マイクロキャリアの湿潤−ＭＧＳＡ及びＰＬＧＡマイクロキャリアをそれぞれおよそ１ｇを無菌的に２５ｍＬの７０％エタノール内に３０分間懸濁させ、マイクロキャリアを湿潤させた。吸引によってエタノールを除去し、次いでマイクロキャリアをＰＢＳで３回濯ぎ、２５ｍＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。
コラーゲンのコーティング。湿潤化マイクロキャリア（ＰＢＳ）を遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳを吸引によって除去し、マイクロキャリアを２．９％コラーゲン溶液（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ １０００，Ｃｏｈｅｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））において再懸濁した。マイクロキャリアをコラーゲンにおいて３０分間インキュベートさせた。コラーゲン残留物を吸引によって除去し、コラーゲンをコーティングしたマイクロキャリアをＰＢＳで３回洗浄した。
Figure 0006404227
接種及び培養実施例１１で使用された、材料、細胞型、増殖培地、スピナーフラスコ、接種及び培養条件、培地交換、活性染色、及び細胞採取方法を本実施例で使用した。
結果
Figure 0006404227
採取細胞の再播種。コーティング有り及びコーティング無しのＭＧＳＡ及びＰＬＧＡマイクロキャリアから採取された細胞をおよそ５，０００細胞／ｃｍ２でＴ２２５中に再播種した。再播種後４日で両材料から採取した細胞は、５０％コンフルエンスを超えて増殖していた。
増殖したｈＵＴＣをコラーゲンをコーティングしたＰＬＧＡマイクロキャリア及びＭＧＳＡマイクロキャリア上に播種し、スピナーフラスコ内で５日間培養し、トリプシン処理によって採取し、静置培養内に再播種した。合成マイクロキャリアから採取された細胞は、９０％超生存していた。静置培養内で４日以内増殖した再播種細胞は、それらが増殖能を保持していることを実証した。本実施例により、合成生体材料がスピナーフラスコ培養用のマイクロキャリアとして使用される性能を有することが実証される。
（実施例１３）
連続型スピナーフラスコ培養内でのマイクロキャリア上でのｈＵＴＣの増殖
本研究の目的は、スピナーフラスコ内で市販のマイクロキャリアに付着し増殖したｈＵＴＣを複数回の集団倍加にわたって連続的に増殖させることである。複数回の集団倍加にわたってマイクロキャリア上でｈＵＴＣを増殖させる能力により、細胞療法の用途に向けてｈＵＴＣを大量生産するための規模拡大であるモデルシステムが提供されることとなる。２種類のｈＵＴＣ単離株である、１２０３０４−研究条件下で単離、増殖、及び凍結保存、並びにＣＮＴＯ ２４７６−ＧＭＰ条件下で単離、増殖、及び凍結保存、を評価した。市販のマイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１又はＨｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩもまた評価された。凍結保存された細胞は、解凍して直ぐにスピナーフラスコ培養に接種するために使用された。細胞は、およそ３０回の集団倍加に達するまで、複数の継代数にわたって連続的に培養された。ｈＵＴＣはまた、対照としてＴ２２５フラスコ内で静置培養された。
集団倍加数１２．８で凍結保存されたｈＵＴＣ単離株１２０３０４を解凍し、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１及びＨｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア上で増殖させ、それぞれ集団倍加数が２８．６及び２８．７となった。集団倍加あたりの時間は、継代間で一致していて、安定した対数増殖を示し、かつＴフラスコでの増殖速度と一致していた。集団倍加数２２．６で凍結保存したｈＵＴＣ単離株ＣＮＴＯ ２４７６を解凍し、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１及びＨｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア上で増殖させ、それぞれ集団倍加数が３３．２及び３１．０となった。集団倍加あたりの時間は、継代間で一致していて、安定した対数増殖を示し、かつＴフラスコでの増殖速度と一致していた。集団倍加あたりの全時間データ点の一元配置分散分析（one-way ANOA）による統計分析は、試験された全条件について、ｈＵＴＣの増殖速度に有意差がないことを示している。（ｐ＝０．９８８）。細胞表面のタンパク質の発現は、試験された全条件について、最終の採取において一致していた。
本実施例により、細胞の表面のタンパク質表現型を維持する、安定し、一貫したやり方で、マイクロキャリア上でおよそ集団倍加数３０に増殖するｈＵＴＣの能力が実証されている。
材料及び方法
細胞。凍結保存した増殖したｈＵＴＣ単離株１２０３４集団倍加（ＰＤ）数１２、及びｈＵＴＣ単離株ＣＮＴＯ ２４７６ロット番号２５１２６０７８ ＰＤ数２２を使用した。
増殖培地。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））、１５％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ））、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））
マイクロキャリア。Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））マイクロキャリアをＰＢＳ内で少なくとも３時間水和し、高圧滅菌した。Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリアを３ｇ／Ｌの濃度で使用した。Ｈｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））マイクロキャリアを脱イオン水内で少なくとも３０分間水和し、高圧滅菌した。Ｈｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアを１２ｇ／Ｌの濃度で使用した。
スピナーフラスコ。１００ｍＬ及び５００ｍＬの、１回使用、すなわち使い捨てのスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））を使用した。
１００ｍＬスピナーフラスコ内での接種及び培養。ｈＵＴＣの凍結保存バイアルを解凍、洗浄し、増殖培地に再懸濁した。６．６×１０６個のｈＵＴＣを、１００ｍＬの培地を含有する１００ｍＬスピナーフラスコ内の３０００ｍｇのＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１（５．０×１０３細胞／ｃｍ２）に添加し、３７℃の組織培養インキュベーター上に設置し３〜４日間インキュベートした。スピナープレートを６０−ｒｐｍの連続回転に設定した。３．１×１０６個のｈＵＴＣを、１００ｍＬの培地を含有する１００ｍＬスピナーフラスコ内の１．２ｇのＨｅｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩ（５．０×１０３細胞／ｃｍ２）に添加し、６０−ｒｐｍ連続回転に設定されたスピナープレート上に設置した。スピナープレートを５％ ＣＯ２内に設置した。
１つの１００ｍＬスピナーフラスコから１つの５００ｍＬスピナーフラスコへの培養の継代。スピナープレートから１００ｍＬスピナーフラスコを除去し、マイクロキャリアを沈殿させた。培地の上清を吸引によって除去した。細胞が付着した残りのマイクロキャリア一組を、２０ｍＬの新鮮増殖培地に再懸濁した。次いで、細胞が付着したマイクロキャリアを、４８０ｍＬの新鮮増殖培地と、４．８ｇのＨｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩ（６ｇの最終マイクロキャリア含量）、又は１．２ｇのＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１（１．５ｇの最終マイクロキャリア含量）と、を含有する５００ｍＬスピナーフラスコにピペットによって無菌的に移した。次いで、スピナーフラスコを６０−ｒｐｍ連続回転に設定されたスピナープレート上に設置した。スピナープレートを５％ ＣＯ２、３７℃の組織培養インキュベーター内に設置し、３〜４日間インキュベートした。
１つの５００ｍＬスピナーフラスコから５つのスピナーフラスコへの培養の継代。５００ｍＬスピナーフラスコが、スピナープレートから除去され、マイクロキャリアが据え置かれた。培地の上清を吸引によって除去した。細胞が付着した残りのマイクロキャリア一組を、５０ｍＬの新鮮増殖培地に再懸濁した。次いで、細胞が付着したマイクロキャリアの５つの別々の１０ｍＬの分取物を、それぞれが４９０ｍＬの新鮮増殖培地と、４．８ｇのＨｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩ（６ｇの最終マイクロキャリア含量）、又は１．２ｇのＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１（１．５ｇの最終マイクロキャリア含量）と、を含有する、５つの別々の５００ｍＬスピナーフラスコに、ピペットで無菌的に移した。次いで、スピナーフラスコを、６０−ｒｐｍの連続回転に設定されたスピナープレート上に設置した。スピナープレートを、５％ ＣＯ２、３７℃の組織培養インキュベーター内に設置し、３〜４日間インキュベートした。
Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリアに付着した細胞の採取。５００ｍＬスピナーフラスコをスピナープレートから除去し、細胞が付着したマイクロキャリアを重力によって沈殿させた培地の上清を吸引によって除去した。スピナーフラスコに５００ｍＬのＰＢＳを添加し、マイクロキャリアを重力によって沈殿させた。ＰＢＳの上清を吸引によって除去した。スピナーフラスコに５００ｍＬのＤＭＥＭ−低グルコースを添加した。次いで、スピナーフラスコをスピナープレート上で２０分間６０ｒｐｍでインキュベートした。５００ｍＬスピナーフラスコを、スピナープレートから除去し、マイクロキャリアを重力によって沈殿させた。ＤＭＥＭ−低グルコースの上清を吸引によって除去した。５００ｍＬのＰＢＳをスピナーフラスコに添加した。次いで、スピナーフラスコをスピナープレート上で２０分間６０ｒｐｍでインキュベートした。スピナーフラスコをスピナープレートから除去し、マイクロキャリアを重力で沈殿させた。ＰＢＳの上清を吸引によって除去した。２５０ｍＬのＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔをスピナーフラスコに添加した。次いで、スピナーフラスコを、スピナープレート上で１０分間６０ｒｐｍでインキュベートした。スピナーフラスコをスピナープレートから除去し、マイクロキャリアを重力により沈殿させた。５０ｍＬの血清ピペットを使用して、マイクロキャリア−ＴｒｙｐＬＥ（商標）ｓｅｌｅｃｔ溶液を、約１０回の上下のピペット操作によって撹拌し、残りの付着細胞をマイクロキャリアから解離させた。次いで、２５０ｍＬのＰＢＳをスピナーフラスコに添加し、マイクロキャリアを重力により沈殿させた。上清を含有する細胞は、ピペット操作を繰り返すことによって回収され、事前処置として５ｍＬのＦＢＳ及び１００μｍのフィルタユニットを管の開口部内に挿入した複数の円錐遠心管へ移送する遠心管を、３００ｒｃｆで５分間遠心分離し、上清を移し、細胞を増殖培地に再懸濁した。
Ｈｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩマイクロキャリアに付着した細胞の採取。５００ｍＬスピナーフラスコをスピナープレートから除去し、細胞が付着したマイクロキャリアを重力によって沈殿させた。培地の上清を吸引により除去した。５００ｍＬのＰＢＳをスピナーフラスコに添加し、マイクロキャリアを重力によって沈殿させた。１００ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）ｓｅｌｅｃｔをスピナーフラスコに添加した。次いで、スピナーフラスコを１０分間、６０ｒｐｍでスピナープレート上でインキュベートした。スピナーフラスコをスピナープレートから除去し、マイクロキャリアを重力によって沈殿させた。２５ｍＬの血清ピペットを使用して、マイクロキャリア−ＴｒｙｐＬＥ（商標）ｓｅｌｅｃｔ溶液を、約１０回の上下のピペット操作によって撹拌し、残りの付着細胞をマイクロキャリアから解離させた。細胞を含有する上清を、ピペット操作を繰り返して回収し、５ｍＬのＦＢＳを事前に充填し、遠心管開口部に１００μｍフィルタユニットを事前に挿入した複数の円錐遠心管に移した。遠心管を、３００ｒｃｆで５分間遠心分離し、上清を移し、細胞を増殖培地に再懸濁した。
活性染色法。培地の１ｍＬの分取物及びマイクロキャリアを、１５ｍＬの円錐遠心管へ移し、マイクロキャリアを重力によって分離させた。培地を吸引によって除去し、１ｍＬの生存／死亡の染色溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｌ３２２４）で置換し、３７℃で１５分インキュベートした。インキュベーション後、２０μＬの分取物を、ガラス製の顕微鏡スライドに塗布し、蛍光顕微鏡によって観察した。生存細胞は緑色に染色する。顕微鏡視野を、手動で分析し、マイクロキャリアに付着した生存細胞の分布を評価した。少なくとも３つの顕微鏡視野を評価し、生存細胞の近似的割合を計算した。
培養中の細胞計数−核放出評価。同種のマイクロキャリア懸濁液の５ｍＬ（１００ｍＬスピナーフラスコ）又は１０ｍＬ（５００ｍＬスピナーフラスコ）の分取物を、スピナーフラスコ容器から得て、１５ｍＬ遠心管へ移した。マイクロキャリアを重力分離させ、上清を吸引によって除去した。マイクロキャリアを、１０ｍＬのＰＢＳで一回洗浄し、マイクロキャリアを重力分離させ、ＰＢＳの上清を吸引によって除去した。マイクロキャリアを、核放出溶液（０．１％ ｗ／ｖのクリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含有する０．１Ｍのクエン酸（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））内で、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、核放出溶液を含有するマイクロキャリアの１００μＬの分取物を１００μＬのＰＢＳに添加した。次いで、この溶液の１０μＬの分取物を血球計算器内へ入れ、放出した核を計数した。
培養中の細胞の計数−ＴｒｙｐＬＥ（商標）評価。同種のマイクロキャリア懸濁液の５ｍＬ（１００ｍＬスピナーフラスコ）又は１０ｍＬ（５００ｍＬスピナーフラスコ）の分取物を、スピナーフラスコ容器から得て、１５ｍＬ遠心管へ移した。マイクロキャリアを重力分離させ、上清を吸引によって除去した。マイクロキャリアを、１０ｍＬのＰＢＳで一回洗浄し、マイクロキャリアを重力分離させ、ＰＢＳの上清を吸引によって除去した。マイクロキャリアを、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ｓｅｌｅｃｔ内で、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、５ｍＬのＰＢＳを添加し、マイクロキャリアを重力分離した。細胞を含有する上清を、ピペット操作を繰り返すことにより回収し、１ｍＬのＦＢＳを予め充填した複数の円錐遠心管へ移した。遠心管を３００ｒｃｆで５分間遠心分離し、上清を移し、細胞を増殖培地内に再懸濁し、分取物を用い、Ｇｕａｖａ ＰＣＡ器具（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈａｙｗｏｏｄ，ＣＡ））を使用して細胞計数を行った。
静置Ｔ−フラスコ培養。ｈＵＴＣの凍結保存したバイアルを解凍、洗浄し、増殖培地に再懸濁した。細胞は、米国特許第２００４／８７７０１２Ａ号に記述された方法を使用して、複数継代にわたって、Ｔ２２５内で静置培養された。
フローサイトメトリー。米国特許第２００４／８７７０１２Ａ号に記述された方法を使用して、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｂｕｒ（商標）機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））を用いたフローサイトメトリーによって、採取したｈＵＴＣを分析し、細胞表面マーカーのプロファイルを判定した。全ての抗体は、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
結果
Figure 0006404227
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集団倍加数１２．８で凍結保存されたｈＵＴＣ単離株１２０３０４を解凍し、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア及びＨｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア上で増殖させ、それぞれ集団倍加数が２８．６と２８．７となった。集団倍加あたりの時間は、継代間で一致しており、安定した対数的増殖を示し、Ｔフラスコでの増殖速度と一致していた。集団倍加数２２．６で凍結保存されたｈＵＴＣ単離株ＣＮＴＯ ２４７６を解凍し、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア及びＨｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア上で増殖させ、それぞれ集団倍加数が３３．２と３１．０となった。集団倍加あたりの時間は、継代間で一致しており、安定した対数的増殖を示し、Ｔフラスコでの増殖速度とも一致していた。集団倍加あたりの全時間データ点の一元配置分散分析による統計分析は、試験された全条件について、ｈＵＴＣ増殖速度に有意差がないことを示している。（ｐ＝０．９８８）。更に、最終的な採取における細胞表面タンパク質の発現は、試験された全条件について一致していた。このデータにより、細胞の表面タンパク質表現型を維持する、安定し、一貫したやり方で、マイクロキャリア上でおよそ集団倍加数３０まで増殖するｈＵＴＣの能力が実証された。
以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら、本明細書において説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、かかる細部には多くの変形例を含み得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、本発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。本出願において引用される参照文献、特許、及び特許出願は、いずれもそれらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。
〔実施の態様〕
（１） アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及び１種又は２種以上のエネルギー源と、を含む、付着依存性細胞を増殖させるための培養培地。
（２） 前記培養培地は、
少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．２ｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．００９ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００４ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００６ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも０．０３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−タウリンと、
それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌのビタミン類と、
少なくとも約０．０５ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）と、
少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン並びにそれぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも０．００３ｇ／Ｌのインスリン、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのトランスフェリン、少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌのリポ酸／チオクト酸、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのエタノールアミン、及び少なくとも約０．００００４ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムと、を含む、実施態様１に記載の培養培地。
（３） アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム７水和物と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、付着依存性細胞を増殖させるための無血清培養液。
（４） 実施態様１に記載の培養培地を含む、付着依存性細胞を増殖させるためのキット。
（５） 無血清培養液を更に含み、該無血清培養液は、
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム７水和物と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、実施態様４に記載のキット。
（６） 単離された臍帯組織由来細胞を培養する方法であって、
ａ．アミノ酸類、ビタミン類、塩類、ヌクレオシド類、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムを含む培養培地におけるマイクロキャリア上に播種された臍帯組織由来細胞を増殖させる工程であって、該培養培地は、該細胞が所望の初期個体群密度に達することが可能な十分な期間にわたって、血清が補充される、工程と、
ｂ．該細胞が該所望の初期個体群密度に達した後、無血清培養液を添加する工程であって、該無血清培養液は、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、リポ酸／チオクト酸、亜セレン酸ナトリウムを含む、工程と、
ｃ．該細胞が所望の最終個体群密度に達することが可能な十分な期間にわたって該細胞を増殖させる工程と、を含み、
該臍帯組織由来細胞は、実質的に血液を含んでいないヒト臍帯組織から単離され、培養中の自己再生及び自己増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、ＣＤ１３、ＣＤ９０、ＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、及びＨＬＡ−ＤＲを発現しない、方法。
（７） 前記方法は、前記マイクロキャリア上に前記細胞を播種する工程を更に含む、実施態様６に記載の方法。
（８） 前記方法は、工程ｃの後に前記細胞を単離する工程を更に含む、実施態様６に記載の方法。
（９） 前記方法は、培地交換を必要としない、実施態様６に記載の方法。
（１０） 前記方法は、スピナーフラスコ培養システムにおいて行われる、実施態様６に記載の方法。
（１１） 培養の前及び後の前記細胞の特性は、実質的に同じである、実施態様６に記載の方法。
（１２） 培養の前及び後の前記細胞の特性は、同じである、実施態様１１に記載の方法。
（１３） 前記所望の初期個体群密度は、３〜４日後に達成される、実施態様６に記載の方法。
（１４） 前記マイクロキャリアは、アミン処理された表面を有する、実施態様６に記載の方法。
（１５） 前記培養培地は、
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及び１種又は２種以上のエネルギー源と、を含む、実施態様６に記載の方法。
（１６） 前記１種又は２種以上のエネルギー源は、Ｄ−グルコース及びピルビン酸ナトリウムである、実施態様１５に記載の方法。
（１７） 前記培養培地は、
少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．２ｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．００９ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００４ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００６ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも０．０３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−タウリンと、
それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌのビタミン類と、
少なくとも約０．０５ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）と、
少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン並びにそれぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも０．００３ｇ／Ｌのインスリン、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのトランスフェリン、少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌのリポ酸／チオクト酸、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのエタノールアミン、及び少なくとも約０．００００４ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムと、を含む、実施態様１５に記載の方法。
（１８） 前記培養培地は、２〜２０％のＦＢＳが補充されている、実施態様１５に記載の方法。
（１９） 前記培養培地は、約７．５％、約１０％、又は約１５％のＦＢＳが補充されている、実施態様１５に記載の方法。
（２０） 前記培養培地は、プトレシン、安定化剤、及び／又は発泡剤を更に含む、実施態様１５に記載の方法。
（２１） 前記無血清培養液は、
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム７水和物と、
微量のミネラル類である硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、リポ酸／チオクト酸、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、実施態様６に記載の方法。
（２２） 前記無血清溶液は、プトレシン、安定化剤、及び／又は発泡剤を更に含む、実施態様２１に記載の方法。

Claims (7)

  1. アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
    ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
    塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩と、
    ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
    インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及び、Ｄ−グルコース及びピルビン酸ナトリウムから選択される１種又は２種以上のエネルギー基質と、を含む、付着依存性の臍帯組織由来細胞を増殖させるための培養培地であって、前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液を含んでいないヒト臍帯組織から単離され、培養中の自己再生及び自己増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、ＣＤ１３、ＣＤ９０、ＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、及びＨＬＡ−ＤＲを発現しない、培養培地。
  2. 約０．０００６ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌの、それぞれのアミノ酸と、
    約５×１０ −６ ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌの、それぞれのビタミン類と、
    約０．００５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌの、それぞれの塩類と、
    約０．０００１ｇ／Ｌ〜約０．０２ｇ／Ｌの、それぞれのヌクレオシド類とを含む、請求項１に記載の培養培地。
  3. 前記培養培地は、
    少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．２ｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．００９ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００４ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００６ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも０．０３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−タウリンと、
    それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌのビタミン類と、
    少なくとも約０．０５ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）と、
    少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン並びにそれぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
    少なくとも０．００３ｇ／Ｌのインスリン、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのトランスフェリン、少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌのリポ酸／チオクト酸、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのエタノールアミン、及び少なくとも約０．００００４ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムと、を含む、請求項１に記載の培養培地。
  4. プトレシン、安定化剤、及び／又は消泡剤を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養培地。
  5. 付着依存性の臍帯組織由来細胞を増殖させるためのキットであって、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養培地と、
    付着依存性の臍帯組織由来細胞を増殖させるための無血清培養液とを含む、キット。
  6. さらにマイクロキャリアを含む、請求項５に記載のキット。
  7. 請求項５または６に記載のキットであって、前記付着依存性の臍帯組織由来細胞を増殖させるための無血清培養液は、アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
    ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
    塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム７水和物と、
    ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
    インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、キット。
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