JP6404227B2 - hUTC増殖用栄養強化培地 - Google Patents
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Description
少なくとも約0.05g/LのL−アルギニン、少なくとも約0.02g/LのL−シスチン、少なくとも約0.2g/LのL−グルタミン、少なくとも約0.01g/Lのグリシン、少なくとも約0.02g/LのL−ヒスチジン、少なくとも約0.09g/LのL−イソロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−ロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−リシン、少なくとも約0.02g/LのL−メチオニン、少なくとも約0.05g/LのL−フェニルアラニン、少なくとも約0.03g/LのL−セリン、少なくとも約0.08g/LのL−トレオニン、少なくとも約0.009g/LのL−トリプトファン、少なくとも約0.08g/LのL−チロシン、少なくとも約0.08g/LのL−バリン、少なくとも約0.005g/LのL−システイン、少なくとも約0.0004g/LのL−アラニン、少なくとも約0.01g/LのL−アスパラギン、少なくとも約0.006g/LのL−アスパラギン酸、少なくとも0.03g/LのL−グルタミン酸、少なくとも約0.005g/LのL−プロリン、及び少なくとも約0.0003g/LのL−タウリンと、それぞれが約5×10−6g/L〜約0.015g/Lのビタミン類と、
少なくとも約0.05g/Lの無水塩化カルシウム、少なくとも約0.1g/Lの塩化カリウム、少なくとも約0.2g/Lの硫酸マグネシウム、少なくとも約0.08g/Lの第一リン酸ナトリウム、H2O、及び少なくとも約0.0005g/Lの第二リン酸ナトリウム7水和物(Na2HPO4・7H2O)と、
少なくとも約0.0001g/Lのチミジン並びにそれぞれが最少で約0.005g/Lのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも0.003g/Lのインスリン、少なくとも0.05g/Lのトランスフェリン、少なくとも約5×10−6g/Lのリポ酸/チオクト酸、少なくとも0.05g/Lのエタノールアミン、及び少なくとも約0.00004g/Lの亜セレン酸ナトリウムと、を含む。
アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム7水和物と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸/チオクト酸、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、付着依存性細胞を増殖させるための無血清培養液である。
アミノ酸類、ビタミン類、塩類、ヌクレオシド類、リポ酸/チオクト酸、エタノールアミン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムを含む培養培地におけるマイクロキャリア上に播種された臍帯組織由来細胞を増殖させる工程であって、該培養培地は、該細胞が所望の初期個体群密度に達することが可能な十分な期間にわたって、血清が補充される、工程と、
該細胞が該所望の初期個体群密度に達した後、無血清培養液を添加する工程であって、該無血清培養液は、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、リポ酸/チオクト酸、亜セレン酸ナトリウムを含む、工程と、
該細胞が所望の最終個体群密度に達することが可能な十分な期間にわたって該細胞を増殖させる工程と、を含む。
アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び1種又は2種以上のリン酸ナトリウム塩と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸/チオクト酸、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及び1種又は2種以上のエネルギー源(例えば、D−グルコース、及びピルビン酸ナトリウムなど)と、を含む。
少なくとも約0.05g/LのL−アルギニン、少なくとも約0.02g/LのL−シスチン、少なくとも約0.2g/LのL−グルタミン、少なくとも約0.01g/Lのグリシン、少なくとも約0.02g/LのL−ヒスチジン、少なくとも約0.09g/LのL−イソロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−ロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−リシン、少なくとも約0.02g/LのL−メチオニン、少なくとも約0.05g/LのL−フェニルアラニン、少なくとも約0.03g/LのL−セリン、少なくとも約0.08g/LのL−トレオニン、少なくとも約0.009g/LのL−トリプトファン、少なくとも約0.08g/LのL−チロシン、少なくとも約0.08g/LのL−バリン、少なくとも約0.005g/LのL−システイン、少なくとも約0.0004g/LのL−アラニン、少なくとも約0.01g/LのL−アスパラギン、少なくとも約0.006g/LのL−アスパラギン酸、少なくとも0.03g/LのL−グルタミン酸、少なくとも約0.005g/LのL−プロリン、及び少なくとも約0.0003g/LのL−タウリンと、
それぞれが約5×10−6g/L〜約0.015g/Lのビタミン類と、
少なくとも約0.05g/Lの無水塩化カルシウム、少なくとも約0.1g/Lの塩化カリウム、少なくとも約0.2g/Lの硫酸マグネシウム、少なくとも約0.08g/Lの第一リン酸ナトリウム、H2O、及び少なくとも約0.0005g/Lの第二リン酸ナトリウム7水和物(Na2HPO4・7H2O)と、
少なくとも約0.0001g/Lのチミジン並びにそれぞれが最少で約0.005g/Lのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも0.003g/Lのインスリン、少なくとも0.05g/Lのトランスフェリン、少なくとも約5×10−6g/Lのリポ酸/チオクト酸、少なくとも0.05g/Lのエタノールアミン、及び少なくとも約0.00004g/Lの亜セレン酸ナトリウムと、を含む。
アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム7水和物と、
微量のミネラル類である硫酸銅(II)5水和物(CuSO4・5H2O)、硫酸亜鉛7水和物(ZnSO4・7H2O)と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、リポ酸/チオクト酸、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む。
本発明により、栄養強化培地及び無血清の濃縮栄養供給溶液が提供される。その培地及び無血清培養液を使用して高密度に細胞を増殖させることができる。好ましい実施形態において、その培地及び無血清培養液を使用して、例えば、hUTCなどの付着依存性細胞を、スピナーフラスコ中でより低い血清消費量で高密度に増殖することができる。
本発明の一態様は、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、ヌクレオシド類、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、D−グルコース、及びピルビン酸ナトリウムを含む培養培地である。
アミノ酸類:L−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、ビタミン類:D−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、塩類:塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び1種又は2種以上のリン酸ナトリウム塩と、ヌクレオシド類(核酸誘導体):チミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、インスリンと、トランスフェリンと、エタノールアミンと、亜セレン酸ナトリウムと、1種又は2種以上のエネルギー源と、を含む、培養培地である。一実施形態において、この培養培地は、それぞれが約0.0006g/L〜約0.1g/Lのアミノ酸類を含む。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約0.05g/LのL−アルギニン、少なくとも約0.02g/LのL−シスチン、少なくとも約0.2g/LのL−グルタミン、少なくとも約0.01g/Lのグリシン、少なくとも約0.02g/LのL−ヒスチジン、少なくとも約0.09g/LのL−イソロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−ロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−リシン、少なくとも約0.02g/LのL−メチオニン、少なくとも約0.05g/LのL−フェニルアラニン、少なくとも約0.03g/LのL−セリン、少なくとも約0.08g/LのL−トレオニン、少なくとも約0.009g/LのL−トリプトファン、少なくとも約0.08g/LのL−チロシン、少なくとも約0.08g/LのL−バリン、少なくとも約0.005g/LのL−システイン、少なくとも約0.0004g/LのL−アラニン、少なくとも約0.01g/LのL−アスパラギン、少なくとも約0.006g/LのL−アスパラギン酸、少なくとも0.03g/LのL−グルタミン酸、少なくとも約0.005g/LのL−プロリン、及び少なくとも約0.0003g/LのL−タウリンを含む。代替の実施形態において、培養培地は、それぞれが約5×10−6g/L〜約0.015g/Lのビタミン類を含む。一実施形態において、培養培地は、少なくとも約0.005g/Lの無水塩化カルシウム、少なくとも約0.1g/Lの塩化カリウム、少なくとも約02g/Lの硫酸マグネシウム、少なくとも約0.1g/Lの第一リン酸ナトリウム、H2O、及び少なくとも約0.0005g/Lの第二リン酸ナトリウム7水和物(Na2HPO4・7H2O)を含む。別の実施形態において、培地は、それぞれが少なくとも約0.0001g/L〜少なくとも約0.02g/Lのヌクレオシド類を含む。一実施形態において、培地は、少なくとも約0.0001g/Lのチミジン、それぞれが最少で約0.005g/Lのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンを含む。一実施形態において、培養培地は、少なくとも0.005g/Lのインスリン、及び少なくとも0.03g/Lのトランスフェリン、少なくとも0.01g/Lのエタノールアミン、及び少なくとも約0.00004g/Lの亜セレン酸ナトリウムを含む。1種又は2種以上のエネルギー源は、D−グルコース及びピルビン酸ナトリウムであってもよい。
本発明の別の態様は、アミノ酸類と、ビタミン類と、塩類と、ヌクレオシド類と、インスリンと、トランスフェリンと、エタノールアミンと、亜セレン酸ナトリウムと、を含む、無血清培養液である。本明細書で使用される場合、培養液に関連して、用語「無血清の」は、培養培地に添加する前、培養液が血清を含有しないことを意味する。別途記載のない限り、無血清培養液の成分に関して開示された量は、無血清培養液が培養物に添加された後のそれぞれの成分の重量の増加分の測定に基づいている。
アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である第一リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム7水和物と
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリンと、トランスフェリンと、エタノールアミンと、亜セレン酸ナトリウムと、を含む。
アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、塩類であるリン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム7水和物と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、を含む。
本発明の特定の実施形態で上述されたように、培養培地及び無血清培養液を使用して単離されたヒト臍帯組織由来細胞(「hUTC」又は「UTC」)を増殖させることができる。本発明の培養培地、無血清培養液、キット、及び方法での使用に好適なUTC及びUTC個体群は、以下の詳細にわたる本明細書、並びに米国特許第7,510,873号、同第7,524,489号、及び米国特許出願公開第2005/005863号(これらの特許は、hUTCの説明、単離及び特性評価に関連しているので、その全体が参照により組み込まれている)において詳細に説明されている。
本明細書で説明される方法によれば、哺乳類の臍帯は、満期産若しくは早期産のいずれかの終了時に、又はその直後に、例えば、出産後の圧出の後に採取される。この分娩後組織は、出産場所から、実験室へと、フラスコ、ビーカー、培養皿、又は袋などの滅菌容器に入れて移送することができる。この容器は、溶液又は培地を有してもよく、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(ダルベッコ最小必須培地としても知られる)若しくはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの食塩水、又はウィスコンシン大学溶液若しくはパーフルオロケミカル溶液などの、移植に使用される器官の移送のために使用される任意の溶液が挙げられるが、これらに限定されない。限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンB、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの1種又は2種以上の抗生物質及び/又は抗真菌剤を、培地又は緩衝液に添加することができる。分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液ですすぐことができる。UTCの抽出の前にこの組織を約4〜10℃で保つことが好ましい。この組織は、UTCの抽出前に凍結させないことが、更により好ましい。
UTCは、例えば、増殖特性(例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代数)、核型分析(例えば、正常核型;母体系統又は新生児系統)、フローサイトメトリー(例えば、FACS分析)、免疫組織化学及び/又は免疫細胞化学(例えば、エピトープの検出に関する)、遺伝子発現プロファイリング(例えば、遺伝子チップアレイ;ポリメラーゼ連鎖反応(例えば、逆転写酵素PCR、リアルタイムPCR、及び従来のPCR))、タンパク質アレイ、タンパク質分泌(例えば、血漿凝固アッセイ又はPDC−馴化培地の分析によるもの、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によるもの)、混合リンパ球反応(例えば、PBMCの刺激の尺度として)、及び/又は当技術分野において既知の他の方法によって、特徴付けることができる。
上述のように、本発明の特定の実施形態において、培養培地及び無血清培養液を使用して単離したヒト臍帯組織由来細胞(「hUTC」又は「UTC」)を増殖させることができる。加えて、培養培地及び無血清培養液を使用して他の付着依存性細胞を増殖させることができる。
本発明の別の実施態様は、本発明の馴化培地及び無血清培養液の使用を含む、細胞を培養する方法である。本方法は、ローラーボトル、スピナーフラスコ、及び/又はマイクロキャリアを利用することができる。好ましい実施形態において、本方法を使用して、例えばhUTC細胞などの付着依存性細胞を培養し、マイクロキャリアを必要とする。
ローラーボトル培養システムは、細胞培養の分野では既知である。本明細書で使用されるように、ローラーボトル培養システムは、少なくとも、対象となる細胞株と、増殖培地と、ローラーボトルと、そのボトルを回転させる装置と、細胞を採取する手段と、を含む。
スピナーフラスコ培養システムもまた、細胞培養の技術分野において既知である。本明細書で用いられる際、スピナーフラスコ培養システムは、少なくとも、対象となる細胞株と、増殖培地と、1つ又は2つ以上のスピナーフラスコと、1つ又は2つ以上のフラスコを回転させる手段と、細胞を採取する手段と、を含む。
マイクロキャリア培養は、例えば、付着依存性分娩後細胞などの付着依存性細胞の培養の実用的な高収率培養を可能にする技術である。マイクロキャリアは、哺乳類の分娩後細胞など、培養容積が数ミリリットルから1000リットル超までの範囲に及ぶ細胞の培養用に特別に開発された。マイクロキャリアは、生物学的に不活性であり、撹拌式マイクロキャリア培養に対して強度があるが非剛性である基質を提供する。マイクロキャリアは、透明であってもよく、付着した細胞の顕微鏡検査が可能である。Cytodex(登録商標)3(GE Healthcare Life Sciences(Piscataway N.J.))は、架橋デキストランのマトリックスに化学的に連結した変性コラーゲンの薄層からなる。Cytodex(登録商標)3の変性コラーゲン層は、トリプシン及びコラゲナーゼを含む、種々のプロテアーゼにより消化されやすく、最大の細胞生存率、機能及び、完全性を維持しながらマイクロキャリアから細胞を除去することができる。
本発明の方法は、概ね、血清(例えば、FBS)が補充された、本発明の培養培地において細胞を培養する(例えば、増殖させる)工程を含む。細胞が、所望の密度に増殖された(例えば、約3〜4日の期間など)後、無血清培養液が添加される。細胞は、付着依存性細胞であってもよく、細胞は、マイクロキャリア上に播種されてもよい。培養は、ローラーボトル培養システム又はスピナーフラスコ培養システムにおいて実施することができる。好ましくは、付着依存性細胞がマイクロキャリア上に播種される際に、スピナーフラスコ培養システムが使用される。所望の時間は、例えば、所望の個体群密度、所望の集団倍加数又は時間などのかかるパラメーターによって決定される。特定の実施形態において、細胞は、4〜7日間培養され、約3日目に無血清培養液が添加される。その他の実施形態において、細胞は、1〜2日若しくは集団倍加の間、又は所望の初期個体群密度が得られるまで増殖された後、無血清培養液が添加される。上述のように、本方法は、培地の交換なしに細胞(例えば、hUTC)を増殖することができる。
本発明の一実施形態は、付着依存性細胞を培養する(例えば、増殖させる)方法である。本方法は、血清が補充されている本発明の培養培地における組織フラスコ(tissue flask)の表面上又は好ましくはマイクロキャリア上に播種された単離された付着依存性細胞を培養する工程と、所望の初期個体群密度を可能にするに十分な時間、細胞を増殖させた後、無血清培養液を添加する工程と、を含む。一実施形態において、細胞は、約3〜約7日、あるいは約3〜5日、あるいは約4〜5日、増殖された後、無血清培養液が添加される。一実施形態において、細胞は、約3日増殖された後、無血清培養液が添加される。別の実施形態において、細胞は、少なくとも1又は2回の集団倍加を可能にするように増殖された後、無血清培養液が添加される。好ましい実施形態において、細胞は、本明細書に開示された任意のマイクロキャリア上に播種され、上述した条件下でスピナーフラスコにおいて増殖される。一実施形態において、本方法は、これらの細胞を含有する細胞バンクバイアルを解凍し、細胞を増殖させ、生産容器にインキュベートする工程を含む。別の実施形態は、細胞を最初に単離し、次いで単離された細胞を播種する工程を含む。
本発明の一実施形態は臍帯組織由来細胞を培養する方法である。この方法は概ね、上記で考察した単離された付着依存性細胞を培養する方法の工程を含み、幾つかの変形例があり得る。したがって、本発明の一実施形態は、マイクロキャリアに付着した、単離した付着依存性hUTCをスピナーフラスコ内の懸濁培養において、無血清培養液を用いて増殖培地を高栄養化することによって、高細胞密度に培養する方法である。最適なことに、この方法により、(例えば、3日目の)培地交換の必要性がなくなり、一貫して20,000細胞/cm2超の細胞を増殖させることができる。更に、この方法により、hUTCの継代のための堅牢性が強化される。この方法は、本発明の培養培地及び無血清培養液を利用する。
スピナーフラスコ培養又はローラーボトル培養において培地の交換の必要なしに達成でき、集団倍加数を最大化するために使用される本発明の方法において、回転速度、ボトル内への細胞の播種密度、マイクロキャリアの量、インキュベーションの時間、培養培地の種類、無血清培養液の種類、及びボトル内に配置される培地の容積は、独立変数である。当業者は、試験された範囲外の他の値が同じ方法論を使用して普通に試験され、これらの値により集団倍加数に漸増した利益がもたらされると分かる可能性があることを認識するであろう。従属変数の最大応答、ここでは得られた集団倍加の数は、これらのパラメーターの関数として求められ、本明細書で具体的に例示されていない実施形態は、本開示の一部分として想到される。
本発明の別の実施形態は、本発明の培養培地及び無血清培養液を含む細胞増殖用のキットである。一実施形態において、キットは、細胞を更に含む。好ましい一実施形態において、キットは、ヒト臍帯組織由来細胞を含む。キットは、使用説明書を更に含む。任意追加的に、キットは、マイクロキャリア及びウシ胎児血清などの血清を更に含む。代替の実施形態において、キットはまた、ローラーボトルシステムを更に含む。
栄養強化培地を有するスピナーフラスコ内のマイクロキャリア上でのhUTCの増殖及び採取
本実施例では、各種栄養強化培地を有するスピナーフラスコ内のマイクロキャリア上でのhUTCの増殖及び採取が調査された。本実施例での研究のために、臍帯組織由来細胞を接種材料から増殖させ、次いで各種様々な増殖条件(条件1〜9)で増殖させ、それぞれの条件は以下に略述した様に様々な培養培地を使用した。
各種条件で必要とされるような細胞計数は以下の手順によって実施された。10mLのサンプルを無菌的に培養物から取り出し、15mL円錐遠心管に移した。次いで、サンプルを1600RPMで5分間遠心分離した。マイクロキャリアを確実に一切除去しないようにしながら、上清を注意深く除去した。次いで、37℃に事前に加温された5〜10mLのTrypLE(商標)Select(Gibco(登録商標))をマイクロキャリアに添加し、回転機上で15〜30分間撹拌した。次いで、遠心管の内容物を、マイクロキャリアを除去しかつ脱着した細胞だけを通過させる40μmフィルタを通過させて50mL円錐遠心管内へ移した。フィルタを通過させて1×PBSで2回の洗浄を行った。次いで、50mL円錐遠心管を1600RPMで5分間遠心分離した。管内に約1〜2mLの上清が残るまで、細胞ペレットを掻き乱さないように上清を注意深く除去した。ピペットを使用して残った物の体積を測定し、細胞は、この体積中で再懸濁された。得られた細胞懸濁液は、トリパンブルー排除法を使用するCEDEX(Innovatis)細胞計数装置を使用して計数された。CEDEX細胞計数に基づいて、培養容器中の細胞濃度が以下のように計算された。
凍結されたhUTCのバイアルを解凍し、新鮮培地で洗浄した。細胞懸濁液を、培地及びマイクロキャリアを含有する125mLガラス製スピナーフラスコ内へ移した。これらの解凍した細胞を使用して接種材料を調製した。
接種材料を、種々のサイズ(125mL,500mL、及び3L)のガラス製スピナーフラスコ(Corning(NY))内の12g/L濃度のマイクロキャリアを有するDMEM及び15% v/vのFBSからなる管理培地において複数の継代にわたって増殖させた。接種材料内の細胞の集団倍加の累計は、35未満であった。接種材料の増殖中の継代に対する基準及び培養条件は、以下の表において一覧表にした。継代の目標日に、細胞計数を行い、継代の目標密度が達成された場合、細胞は、新容器内の目標播種密度に基づく新容器内へ継代された。継代の目標密度が達成されていない場合、80%の培地を交換し翌日に細胞計数した。培地交換のために、容器をスピナープラットフォームから除いて、マイクロキャリアを5分間重力で沈殿させ、培地の80%を無菌的に除去し(マイクロキャリアを除去しないで)、等量の新鮮培地を添加し、容器をインキュベーター内のスピナープラットフォーム上に戻した。
条件1〜9のそれぞれに関して、接種の日は0日目と見なされる。更にそれぞれの条件に関して、細胞計数は、接種時に行われた。
6日目に全てのフラスコを採取した。採取のために、マイクロキャリアを重力で沈殿させ、マイクロキャリアを一切取り出さないで出来るだけ多くの培地を除去した。事前に37℃で加温された250〜300mLのTrypLE(商標)をフラスコに添加し、37℃のインキュベーター内のスピナープラットフォーム上に設置した。30分後に撹拌を停止し、フラスコから25mLのサンプルを除去し、40μmフィルタで濾過した。フィルタ上に留まったマイクロキャリアは廃棄し、サンプルを直接CEDEXにかけてサンプルの細胞計数を行った。添加したTrypLE(商標)の体積及び得られた細胞計数を基に、容器内の全細胞数を算出し、細胞密度(細胞/cm2)を算出した。
DMEM(1g/Lのグルコース、4mMのL−グルタミン、及び3.7g/Lの重炭酸ナトリウムを有し、かつピルビン酸ナトリウム及びフェノールレッドを有さない)が条件1(対照)用の基本培地であった。
種々の条件からの細胞計数を以下の表1−5に示す。結果は、2つの部分で解析できる。条件1と2との比較によって、M5倍地と3日目のF5フィードとの組み合わせにより培地交換を省くことができることが明らかである。これにより、血清濃度を44%超顕著に下げることとなるので重要である。条件3〜9の比較によって、以下の3つの条件(6,8,及び9)がその他の条件と比較して、最も低い性能であることが明らかである。条件6:M4基本培地+15% FBS、3日目にF4フィード、条件8:M6基本培地+15% FBS、3日目にF6フィード、及び条件9:M7基本培地+15% FBS、3日目にF7フィード。より詳しく配合を見ると、これら3つの条件はいずれも培地又はフィードの中に核酸誘導体を有さないことが分かる。それ故、核酸誘導体がhUTCの増殖に決定的な意味をもつと推察することができる。本実施例により、培養培地を高栄養化し、3日目に追加の培地成分を補充することによって、培地の交換なしにhUTCを6日間増殖させることができ、核酸誘導体が同程度の細胞増殖を維持するために重要であることが実証される。
マイクロキャリア上でかつ栄養強化培地を有するスピナーフラスコ内でのHUTCの増殖及び連続継代
スピナーフラスコ内の懸濁培養下のマイクロキャリア上に付着したヒト臍帯組織細胞(hUTC)の連続継代は、細胞が3日目において20,000細胞/cm2超の所定の最適細胞密度に達していない場合に培地交換が必要となる。この培地交換によりそのプロセスに追加の操作が加えられ、細胞継代の計画を予測するのが困難になる。したがって、この手順で細胞を継代させることは商業的に望ましくない。hUTCは、15%ウシ胎児血清を含有する細胞増殖培地に交換することによって高細胞密度に増殖することができる。本実施例では、hUTCを継代するためのより商業的に望ましい代替方法を検討した。マイクロキャリアに付着したhUTCは、増殖培地を無血清栄養物で高栄養化することによって、スピナーフラスコ内の懸濁培養下で高細胞密度に増殖した。この方法により、細胞は、3日目の培地交換をなくしても、一貫して20,000細胞/cm2超の細胞に増殖することができる。この方法により、hUTCの継代のためのプロセスの堅牢性が改善される。
Ca又はMgを有さない、3% FBSのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Dulbecco's Phosphate Buffer Saline)(DPBS)を染色緩衝液として使用した。表面マーカーを同定するために6種の抗体を使用し、対照として2種の抗体を使用した。抗体のリスト及び効力検定のための染色緩衝液における抗体の希釈物を以下の表2−1に示す。
hUTCの培養及び連続継代の方法を実施例1で説明した。上記のように、この連続継代では15% FBSを有するDMEMが培養培地として使用され、継代基準を満たすために度々培地交換が必要であった。本実施例では、連続継代中の度々の培地交換の必要性を排除することを試みた。これは、(1g/Lではなくて2g/Lのグルコースを有する)改変M5培地と15% FBS(v/v)との使用によって達成された。15% FBSを有するこの改変M5培地の使用により、継代の日数を固定し、6継代数にわたって培地交換なしで行われた。培養条件及び評価基準を以下の表2−2に示す。
スピナースラフコ内の血清が削減された培地におけるマイクロキャリア上でのhUTCの増殖
ヒト臍帯組織細胞(hUTC)は、連続稼動3日目に15% FBSを含有する細胞増殖培地を交換することによって高細胞密度に増殖することができる。血清コストが高いこと、産生のための血清使用が多いこと、及び追加的な作動操作であることによって、培地内の高血清濃度及び培地交換は商業的見地から望ましくない。本実施例では、高細胞密度を達成しつつ、血清が削減された増殖培地内のマイクロキャリア上に付着したhUTCを培地交換無しで増殖させる方法を開示する。
細胞の単離
臍細胞の単離。臍帯は、National Disease Research Interchange(NDRI(Philadelphia,PA))から得た。それらの組織は、正常分娩の後に得たものであった。細胞単離プロトコルを、層流フード内で、無菌的に実行した。血液及び残滓を除去するため、ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100mg/mL、アンホテリシンB 0.25μg/mL(Invitrogen(Carlsbad,CA))の存在下において、臍帯をリン酸緩衝生理食塩水(PBS;Invitrogen(Carlsbad,CA))で洗浄した。次いで、それらの組織を、150cm2の組織培養プレート内で、50mLの培地(DMEM−低グルコース又はDMEM−高グルコース(Invitrogen))の存在下で、組織が微細なパルプ状に細断されるまで機械的に解離させた。細断した組織を、50mL円錐遠心管に移した(遠心管1本当り組織約5グラム)。
細胞の核型分析
細胞療法に使用される細胞株は、好ましくは、同種であり、いずれの汚染細胞型も含まない。細胞治療に使用されるヒト細胞は、正常な構造を有する、正常な数(46個)の染色体を有していなければならない。同種であり、かつ、非臍組織起源の細胞を含まない臍由来細胞株を同定するため、細胞サンプルの核型分析を行った。
細胞表面マーカーのフローサイトメトリー評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質又は「マーカー」の特性評価を用いて、細胞株の同一性を判定することができる。この発現の一貫性は、複数のドナーから、並びに種々の処理及び培養条件に曝された細胞において、判定することができる。臍から単離された分娩後細胞株を、フローサイトメトリーによって特徴付けることにより、これらの細胞株の同定に関するプロファイルが提供された。
オリゴヌクレオチドアレイによる細胞分析
オリゴヌクレオチドアレイを使用して、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、線維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、及びヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この解析により、分娩後由来細胞の特性評価が提供され、これらの細胞に関係する固有の分子マーカーが特定された。
細胞表現型の免疫組織化学的特性評価
ヒト臍帯組織に見出される細胞の表現型を、免疫組織化学的検査によって分析した。
栄養因子の分泌
UTCからの選択された栄養因子の分泌を測定した。因子は、以下より選択した。血管由来の活性を有するもの(例えば、肝細胞増殖因子(HGF)(Rosenら、Ciba Found.Symp.、1997年、212、215〜26)、単球走化性タンパク質1(MCP−1)(Salcedoら、Blood、2000年、96、34〜40)、インターロイキン−8(IL−8)(Liら、J.Immunol.、2003年、170、3369〜76)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)(Hughesら、Ann.Thorac.Surg.2004年、77、812〜6)、マトリックスメタロプロテアーゼ−1の組織阻害剤(TIMP1)、アンジオポエチン2(ANG2)、血小板由来成長因子(PDGFbb)、トロンボポエチン(TPO)、ヘパリン結合性上皮成長因子(HB−EGF)、間質由来因子1α(SDF−1α)、神経栄養活性/神経保護活性を有するもの(脳由来神経栄養因子(BDNF)(Chengら、Dev.Biol.2003年、258、319〜33)、インターロイキン−6(IL−6)、顆粒球走化性タンパク質−2(GCP−2)、トランスフォーミング増殖因子β2(TGFβ2))、又はケモカイン活性を有するもの(マクロファージ炎症性タンパク質1α(MIP1α)、マクロファージ炎症性タンパク質1β(MIP1β)、単球化学誘引物質−1(MCP−1)、ランテス(Rantes)(活性化時調節正常T細胞発現及び分泌物)、I309、胸腺及び活性化調節ケモカイン(TARC)、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン(MDC)、及び(IL−8)。
テロメラーゼ活性の分析
テロメラーゼは、染色体の完全性を保護し、また細胞の複製寿命を延長するために役立つ、テロメア繰り返し体を合成するように機能する(Liu,Kら、PNAS,1999年:96:5147〜5152)。テロメラーゼは、テロメラーゼRNAテンプレート(hTER)、及びテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)の2つの成分からなる。テロメラーゼの調節は、hTERではなく、hTERTの転写によって決定される。hTERT mRNAに関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、それゆえ、細胞のテロメラーゼ活性を判定するための容認された方法である。
リアルタイムPCR実験を実行して、ヒト臍帯組織由来細胞のテロメラーゼ産生を判定した。ヒト臍帯組織由来細胞は、上記実施例及び米国特許第7,510,873号に記載の実施例に従って調製された。全般的には、正常な分娩後の、National Disease Research Interchange(Philadelphia,Pa.)から得た臍帯を洗浄して、血液及び残渣を除去し、機械的に解離させた。次いで、その組織を、培養培地中、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼを含む消化酵素と共に、37℃でインキュベートした。ヒト臍帯組織由来細胞は、‘012号特許出願の実施例に記載の方法に従って培養した。間葉系幹細胞及び通常の皮膚線維芽細胞(cc−2509ロット番号9F0844)は、Cambrex(Walkersville,Md)から入手した。多能性ヒト精巣胎児性癌(テラトーマ)細胞株nTera−2細胞(NTERA−2 cl.D1)(Plaiaら,Stem Cells,2006年;24(3):531〜546を参照)は、ATCC(Manassas,Va.)から購入し、米国特許第7,510,873号に記載の方法に従って培養した。
RNeasy(登録商標)キット(Qiagen(Valencia,Ca.))を使用して、RNAを細胞から抽出した。RNAは、50μLのDEPC−処理水で溶出させ、−80℃で貯蔵した。RNAは、TaqMan(登録商標)逆転写剤(Applied Biosystems(Foster City,Ca.))を有するランダムヘキサマーを使用して、25℃で10分間、37℃で60分間、95℃で10分間逆転写させた。サンプルを−20℃で保存した。
Applied Biosystems Assays−On−Demand(商標)(TaqMan(登録商標)遺伝子発現アッセイとしても既知)を、製造業者の仕様書(Applied Biosystems)に従って使用して、cDNAサンプルに対してPCRを実行した。この市販のキットは、ヒト細胞内のテロメラーゼをアッセイするために、広く使用されている。簡潔には、hTert(ヒトテロメラーゼ遺伝子)(Hs00162669)及びヒトGAPDH(内部対照)を、ABI prism 7000 SDSソフトウェア(Applied Biosystems)と共に7000配列検出システムを使用して、cDNA及びTaqMan(登録商標)Universal PCRマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初に50℃で2分間及び95℃で10分間とし、その後に、95℃で15秒間及び60℃で1分間の40サイクルとした。PCRデータを、製造業者の仕様書に従って解析した。
インペラスピナーフラスコリアクター内のマイクロキャリ上でのUTCの増殖
材料及び方法
細胞。CBATロット番号050604B継代数8細胞からの細胞を解凍し、1つの継代の間、T225フラスコ内で増殖させた。
細胞採取。表11−1に、スピナーフラスコ培養においてUTC細胞株050604BをCytodex(登録商標)3マイクロキャリア上で継代数9から継代数11まで増殖させた際の継代毎の採取画分、細胞収量及び生存率を示す。
スピナーフラスコ内のコラーゲンコーティングしたMGSA及びPLGAマイクロキャリア上での増殖したhUTCの増殖
スピナーフラスコ培養における生存率を維持する能力及び静置培養内へ再播種すると増殖する能力など、コラーゲンコーティングされた再吸収性合成生体材料で製造された材料に付着したhUTCの能力を調査した。増殖したhUTCを、コラーゲンをコーティングした、又はコーティングしてないポリ−(D、L−ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)、及びポリ(モノステアロイルグリセリド・コ−コハク酸)(MGSA)のマイクロキャリア上に播種した。細胞を有するマイクロキャリアをスピナーフラスコ内で5日間培養し、トリプシン処理によって採取し、静置培養内に再播種した。
連続型スピナーフラスコ培養内でのマイクロキャリア上でのhUTCの増殖
本研究の目的は、スピナーフラスコ内で市販のマイクロキャリアに付着し増殖したhUTCを複数回の集団倍加にわたって連続的に増殖させることである。複数回の集団倍加にわたってマイクロキャリア上でhUTCを増殖させる能力により、細胞療法の用途に向けてhUTCを大量生産するための規模拡大であるモデルシステムが提供されることとなる。2種類のhUTC単離株である、120304−研究条件下で単離、増殖、及び凍結保存、並びにCNTO 2476−GMP条件下で単離、増殖、及び凍結保存、を評価した。市販のマイクロキャリアCytodex(登録商標)1又はHillex(登録商標)IIもまた評価された。凍結保存された細胞は、解凍して直ぐにスピナーフラスコ培養に接種するために使用された。細胞は、およそ30回の集団倍加に達するまで、複数の継代数にわたって連続的に培養された。hUTCはまた、対照としてT225フラスコ内で静置培養された。
細胞。凍結保存した増殖したhUTC単離株12034集団倍加(PD)数12、及びhUTC単離株CNTO 2476ロット番号25126078 PD数22を使用した。
(1) アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び1種又は2種以上のリン酸ナトリウム塩と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸/チオクト酸、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及び1種又は2種以上のエネルギー源と、を含む、付着依存性細胞を増殖させるための培養培地。
(2) 前記培養培地は、
少なくとも約0.05g/LのL−アルギニン、少なくとも約0.02g/LのL−シスチン、少なくとも約0.2g/LのL−グルタミン、少なくとも約0.01g/Lのグリシン、少なくとも約0.02g/LのL−ヒスチジン、少なくとも約0.09g/LのL−イソロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−ロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−リシン、少なくとも約0.02g/LのL−メチオニン、少なくとも約0.05g/LのL−フェニルアラニン、少なくとも約0.03g/LのL−セリン、少なくとも約0.08g/LのL−トレオニン、少なくとも約0.009g/LのL−トリプトファン、少なくとも約0.08g/LのL−チロシン、少なくとも約0.08g/LのL−バリン、少なくとも約0.005g/LのL−システイン、少なくとも約0.0004g/LのL−アラニン、少なくとも約0.01g/LのL−アスパラギン、少なくとも約0.006g/LのL−アスパラギン酸、少なくとも0.03g/LのL−グルタミン酸、少なくとも約0.005g/LのL−プロリン、及び少なくとも約0.0003g/LのL−タウリンと、
それぞれが約5×10−6g/L〜約0.015g/Lのビタミン類と、
少なくとも約0.05g/Lの無水塩化カルシウム、少なくとも約0.1g/Lの塩化カリウム、少なくとも約0.2g/Lの硫酸マグネシウム、少なくとも約0.08g/Lの第一リン酸ナトリウム、H2O、及び少なくとも約0.0005g/Lの第二リン酸ナトリウム7水和物(Na2HPO4・7H2O)と、
少なくとも約0.0001g/Lのチミジン並びにそれぞれが最少で約0.005g/Lのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも0.003g/Lのインスリン、少なくとも0.05g/Lのトランスフェリン、少なくとも約5×10−6g/Lのリポ酸/チオクト酸、少なくとも0.05g/Lのエタノールアミン、及び少なくとも約0.00004g/Lの亜セレン酸ナトリウムと、を含む、実施態様1に記載の培養培地。
(3) アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム7水和物と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸/チオクト酸、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、付着依存性細胞を増殖させるための無血清培養液。
(4) 実施態様1に記載の培養培地を含む、付着依存性細胞を増殖させるためのキット。
(5) 無血清培養液を更に含み、該無血清培養液は、
アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム7水和物と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸/チオクト酸、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、実施態様4に記載のキット。
a.アミノ酸類、ビタミン類、塩類、ヌクレオシド類、リポ酸/チオクト酸、エタノールアミン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムを含む培養培地におけるマイクロキャリア上に播種された臍帯組織由来細胞を増殖させる工程であって、該培養培地は、該細胞が所望の初期個体群密度に達することが可能な十分な期間にわたって、血清が補充される、工程と、
b.該細胞が該所望の初期個体群密度に達した後、無血清培養液を添加する工程であって、該無血清培養液は、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、リポ酸/チオクト酸、亜セレン酸ナトリウムを含む、工程と、
c.該細胞が所望の最終個体群密度に達することが可能な十分な期間にわたって該細胞を増殖させる工程と、を含み、
該臍帯組織由来細胞は、実質的に血液を含んでいないヒト臍帯組織から単離され、培養中の自己再生及び自己増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、CD13、CD90、HLA−ABCを発現し、CD34、CD117、及びHLA−DRを発現しない、方法。
(7) 前記方法は、前記マイクロキャリア上に前記細胞を播種する工程を更に含む、実施態様6に記載の方法。
(8) 前記方法は、工程cの後に前記細胞を単離する工程を更に含む、実施態様6に記載の方法。
(9) 前記方法は、培地交換を必要としない、実施態様6に記載の方法。
(10) 前記方法は、スピナーフラスコ培養システムにおいて行われる、実施態様6に記載の方法。
(12) 培養の前及び後の前記細胞の特性は、同じである、実施態様11に記載の方法。
(13) 前記所望の初期個体群密度は、3〜4日後に達成される、実施態様6に記載の方法。
(14) 前記マイクロキャリアは、アミン処理された表面を有する、実施態様6に記載の方法。
(15) 前記培養培地は、
アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び1種又は2種以上のリン酸ナトリウム塩と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸/チオクト酸、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及び1種又は2種以上のエネルギー源と、を含む、実施態様6に記載の方法。
(17) 前記培養培地は、
少なくとも約0.05g/LのL−アルギニン、少なくとも約0.02g/LのL−シスチン、少なくとも約0.2g/LのL−グルタミン、少なくとも約0.01g/Lのグリシン、少なくとも約0.02g/LのL−ヒスチジン、少なくとも約0.09g/LのL−イソロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−ロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−リシン、少なくとも約0.02g/LのL−メチオニン、少なくとも約0.05g/LのL−フェニルアラニン、少なくとも約0.03g/LのL−セリン、少なくとも約0.08g/LのL−トレオニン、少なくとも約0.009g/LのL−トリプトファン、少なくとも約0.08g/LのL−チロシン、少なくとも約0.08g/LのL−バリン、少なくとも約0.005g/LのL−システイン、少なくとも約0.0004g/LのL−アラニン、少なくとも約0.01g/LのL−アスパラギン、少なくとも約0.006g/LのL−アスパラギン酸、少なくとも0.03g/LのL−グルタミン酸、少なくとも約0.005g/LのL−プロリン、及び少なくとも約0.0003g/LのL−タウリンと、
それぞれが約5×10−6g/L〜約0.015g/Lのビタミン類と、
少なくとも約0.05g/Lの無水塩化カルシウム、少なくとも約0.1g/Lの塩化カリウム、少なくとも約0.2g/Lの硫酸マグネシウム、少なくとも約0.08g/Lの第一リン酸ナトリウム、H2O、及び少なくとも約0.0005g/Lの第二リン酸ナトリウム7水和物(Na2HPO4・7H2O)と、
少なくとも約0.0001g/Lのチミジン並びにそれぞれが最少で約0.005g/Lのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも0.003g/Lのインスリン、少なくとも0.05g/Lのトランスフェリン、少なくとも約5×10−6g/Lのリポ酸/チオクト酸、少なくとも0.05g/Lのエタノールアミン、及び少なくとも約0.00004g/Lの亜セレン酸ナトリウムと、を含む、実施態様15に記載の方法。
(18) 前記培養培地は、2〜20%のFBSが補充されている、実施態様15に記載の方法。
(19) 前記培養培地は、約7.5%、約10%、又は約15%のFBSが補充されている、実施態様15に記載の方法。
(20) 前記培養培地は、プトレシン、安定化剤、及び/又は発泡剤を更に含む、実施態様15に記載の方法。
アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム7水和物と、
微量のミネラル類である硫酸銅(II)5水和物(CuSO4・5H2O)、硫酸亜鉛7水和物(ZnSO4・7H2O)と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、リポ酸/チオクト酸、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、実施態様6に記載の方法。
(22) 前記無血清溶液は、プトレシン、安定化剤、及び/又は発泡剤を更に含む、実施態様21に記載の方法。
Claims (7)
- アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び1種又は2種以上のリン酸ナトリウム塩と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸/チオクト酸、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及び、D−グルコース及びピルビン酸ナトリウムから選択される1種又は2種以上のエネルギー基質と、を含む、付着依存性の臍帯組織由来細胞を増殖させるための培養培地であって、前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液を含んでいないヒト臍帯組織から単離され、培養中の自己再生及び自己増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、CD13、CD90、HLA−ABCを発現し、CD34、CD117、及びHLA−DRを発現しない、培養培地。 - 約0.0006g/L〜約0.1g/Lの、それぞれのアミノ酸と、
約5×10 −6 g/L〜約0.015g/Lの、それぞれのビタミン類と、
約0.005g/L〜約7g/Lの、それぞれの塩類と、
約0.0001g/L〜約0.02g/Lの、それぞれのヌクレオシド類とを含む、請求項1に記載の培養培地。 - 前記培養培地は、
少なくとも約0.05g/LのL−アルギニン、少なくとも約0.02g/LのL−シスチン、少なくとも約0.2g/LのL−グルタミン、少なくとも約0.01g/Lのグリシン、少なくとも約0.02g/LのL−ヒスチジン、少なくとも約0.09g/LのL−イソロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−ロイシン、少なくとも約0.09g/LのL−リシン、少なくとも約0.02g/LのL−メチオニン、少なくとも約0.05g/LのL−フェニルアラニン、少なくとも約0.03g/LのL−セリン、少なくとも約0.08g/LのL−トレオニン、少なくとも約0.009g/LのL−トリプトファン、少なくとも約0.08g/LのL−チロシン、少なくとも約0.08g/LのL−バリン、少なくとも約0.005g/LのL−システイン、少なくとも約0.0004g/LのL−アラニン、少なくとも約0.01g/LのL−アスパラギン、少なくとも約0.006g/LのL−アスパラギン酸、少なくとも0.03g/LのL−グルタミン酸、少なくとも約0.005g/LのL−プロリン、及び少なくとも約0.0003g/LのL−タウリンと、
それぞれが約5×10−6g/L〜約0.015g/Lのビタミン類と、
少なくとも約0.05g/Lの無水塩化カルシウム、少なくとも約0.1g/Lの塩化カリウム、少なくとも約0.2g/Lの硫酸マグネシウム、少なくとも約0.08g/Lの第一リン酸ナトリウム、H2O、及び少なくとも約0.0005g/Lの第二リン酸ナトリウム7水和物(Na2HPO4・7H2O)と、
少なくとも約0.0001g/Lのチミジン並びにそれぞれが最少で約0.005g/Lのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも0.003g/Lのインスリン、少なくとも0.05g/Lのトランスフェリン、少なくとも約5×10−6g/Lのリポ酸/チオクト酸、少なくとも0.05g/Lのエタノールアミン、及び少なくとも約0.00004g/Lの亜セレン酸ナトリウムと、を含む、請求項1に記載の培養培地。 - プトレシン、安定化剤、及び/又は消泡剤を更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の培養培地。
- 付着依存性の臍帯組織由来細胞を増殖させるためのキットであって、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の培養培地と、
付着依存性の臍帯組織由来細胞を増殖させるための無血清培養液とを含む、キット。 - さらにマイクロキャリアを含む、請求項5に記載のキット。
- 請求項5または6に記載のキットであって、前記付着依存性の臍帯組織由来細胞を増殖させるための無血清培養液は、アミノ酸類であるL−アルギニン、L−シスチン、L−システイン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−プロリン、及びL−タウリンと、
ビタミン類であるD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、d−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンB12(シアノコバラミン)と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム7水和物と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸/チオクト酸、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、キット。
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