JPH0789954B2 - 細胞の保存と増殖のための二酸化炭素―非依存性増殖培地 - Google Patents
細胞の保存と増殖のための二酸化炭素―非依存性増殖培地Info
- Publication number
- JPH0789954B2 JPH0789954B2 JP3504839A JP50483991A JPH0789954B2 JP H0789954 B2 JPH0789954 B2 JP H0789954B2 JP 3504839 A JP3504839 A JP 3504839A JP 50483991 A JP50483991 A JP 50483991A JP H0789954 B2 JPH0789954 B2 JP H0789954B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- growth
- medium
- pdrg
- cells
- atmospheric
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/42—Organic phosphate, e.g. beta glycerophosphate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Carbon And Carbon Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は概して細胞の増殖培地に関する。更に特定する
と、本発明は通常の大気のCO2中における細胞の保存と
増殖を可能にする増殖培地であって、緩衝のための二酸
化炭素豊富の外来性の調節した供給を要求しない培地に
関する。
と、本発明は通常の大気のCO2中における細胞の保存と
増殖を可能にする増殖培地であって、緩衝のための二酸
化炭素豊富の外来性の調節した供給を要求しない培地に
関する。
発明の背景 第１次の緩衝成分としての重炭酸イオンを含有する通常
の増殖培地は、（約7.2−7.4の生理的pHを維持するため
に）特別の二酸化炭素雰囲気を必要とする。
の増殖培地は、（約7.2−7.4の生理的pHを維持するため
に）特別の二酸化炭素雰囲気を必要とする。
これは制御雰囲気を設置した経費のかかる培養器を必要
とし、この特殊な雰囲気の外側で行わねばならない通常
の手動処理は培地のpHの急激な変化をもたらし、これが
翻って細胞を抑圧しそしてその機能を変えてしまう不利
な点がある。
とし、この特殊な雰囲気の外側で行わねばならない通常
の手動処理は培地のpHの急激な変化をもたらし、これが
翻って細胞を抑圧しそしてその機能を変えてしまう不利
な点がある。
CO2雰囲気中の細胞の増殖のために若干数の培地が市販
されている。これらの中でRPM11630は、７種の腫瘍組織
を代表する細胞系の増殖のための最近の研究では満足出
来ないことが見出された。
されている。これらの中でRPM11630は、７種の腫瘍組織
を代表する細胞系の増殖のための最近の研究では満足出
来ないことが見出された。
Ｌ−15はRPMI1630より、添加重炭酸塩とCO2豊富雰囲気
でない大気のCO2中で腫瘍細胞の培養のためにより優れ
ていることが判っている。しかし、Ｌ−15培地はヒト腫
瘍細胞の多種類を増殖するのには適当ではなく、その製
剤中における砂糖 Ｄ−グルコースの欠損に因って、テ
トラゾリウム還元終点を利用する医薬品毒性評価には不
適合であることが見出された。
でない大気のCO2中で腫瘍細胞の培養のためにより優れ
ていることが判っている。しかし、Ｌ−15培地はヒト腫
瘍細胞の多種類を増殖するのには適当ではなく、その製
剤中における砂糖 Ｄ−グルコースの欠損に因って、テ
トラゾリウム還元終点を利用する医薬品毒性評価には不
適合であることが見出された。
発明の概略 従って、本発明の目的は、細胞増殖培地を提供すること
であって、その培地は今まで知られている増殖培知と異
なり、CO2豊富でない雰囲気中で、広範囲のヒトおよび
非ヒト由来の腫瘍および非腫瘍の細胞の増殖を支持す
る。
であって、その培地は今まで知られている増殖培知と異
なり、CO2豊富でない雰囲気中で、広範囲のヒトおよび
非ヒト由来の腫瘍および非腫瘍の細胞の増殖を支持す
る。
本発明の別の目的は、ヒト腫瘍細胞系の広いパネルを使
用するin vitroの抗ガン剤の医薬スクリーニングに適
したCO2−非依存性の培養培地を提供することである。
用するin vitroの抗ガン剤の医薬スクリーニングに適
したCO2−非依存性の培養培地を提供することである。
本発明の別の目的は、培地のpHを制御するためにCO2を
使用することは厄介であり、経費高であり、非実用的で
ありまたは望ましくない場合に広範囲の細胞培養技術に
適しているCO2−非依存性培養培地を提供することであ
る。
使用することは厄介であり、経費高であり、非実用的で
ありまたは望ましくない場合に広範囲の細胞培養技術に
適しているCO2−非依存性培養培地を提供することであ
る。
いろいろの別の目的と利点は、本発明の下記の詳細な記
述から明瞭になるであろう。
述から明瞭になるであろう。
図面の簡単な説明 本発明のこれらのそして別の目的、特徴そして付随する
利点は、添付した図面と組み合わせて下記の詳細な説明
を読めば更によく理解される： 図１は、RPMI1640、RPMI1630、Ｌ−15そしてPDRG基礎増
殖培地の緩衝能の比較結果を示している。血清のない、
RPMI1640（□）、RPMI1630（●）、Ｌ−15（■）および
PDRG基礎増殖培地（▲）を1N HClでpH6.0に調節した。
水酸化ナトリウム（1N）を15μｌの液滴で添加し、pHを
決めた。
利点は、添付した図面と組み合わせて下記の詳細な説明
を読めば更によく理解される： 図１は、RPMI1640、RPMI1630、Ｌ−15そしてPDRG基礎増
殖培地の緩衝能の比較結果を示している。血清のない、
RPMI1640（□）、RPMI1630（●）、Ｌ−15（■）および
PDRG基礎増殖培地（▲）を1N HClでpH6.0に調節した。
水酸化ナトリウム（1N）を15μｌの液滴で添加し、pHを
決めた。
図2A−2Gは、大気CO2雰囲気中の増殖に対するヒト腫瘍
細胞系の適合の比較結果を示す。RPMI1640増殖培地中の
細胞系を、トリプシン処理し、５％CO2中で増殖のため
にRPMI1640培地（□）中で、または大気CO2中で増殖の
ためにRPMI1630（●）、Ｌ−15（■）またはPDRG基礎増
殖培地（▲）中で週毎に継代培養した。
細胞系の適合の比較結果を示す。RPMI1640増殖培地中の
細胞系を、トリプシン処理し、５％CO2中で増殖のため
にRPMI1640培地（□）中で、または大気CO2中で増殖の
ためにRPMI1630（●）、Ｌ−15（■）またはPDRG基礎増
殖培地（▲）中で週毎に継代培養した。
図3A−3Gは、大気CO2中におけるヒト腫瘍細胞系の比較
増殖曲線を示す。RPMI1640培地（□）、Ｌ−15培地
（■）またはPDRG基礎増殖培地（▲）中の細胞系を、ト
リプシン処理し、25cm2フラスコ中へ接種し、24時間間
隔で計数する。
増殖曲線を示す。RPMI1640培地（□）、Ｌ−15培地
（■）またはPDRG基礎増殖培地（▲）中の細胞系を、ト
リプシン処理し、25cm2フラスコ中へ接種し、24時間間
隔で計数する。
図4Aと4Bは、大気CO2中のPDRG基礎増殖培地（□）中の
または５％CO2中のRPMI1640培地（■）中のP388およびL
1210ネズミリンパ球白血病の増殖を示している。
または５％CO2中のRPMI1640培地（■）中のP388およびL
1210ネズミリンパ球白血病の増殖を示している。
図5A−5Eは、大気CO2中のPDRG基礎増殖培地（□）中
の、４種のヒト繊維芽細胞系（MRC−５、CCD−19LU、MA
R BELおよびIMR−90）と一種のネズミ繊維芽細胞（3T
3）、または５％二酸化炭素中の、RPMI1640（■）培地
中（ヒト繊維芽細胞）またはズルベコ’ス変形イーグル
培地（DMEM）（3T3ネズミ繊維芽細胞）のいずれかにお
ける細胞の増殖を示している。
の、４種のヒト繊維芽細胞系（MRC−５、CCD−19LU、MA
R BELおよびIMR−90）と一種のネズミ繊維芽細胞（3T
3）、または５％二酸化炭素中の、RPMI1640（■）培地
中（ヒト繊維芽細胞）またはズルベコ’ス変形イーグル
培地（DMEM）（3T3ネズミ繊維芽細胞）のいずれかにお
ける細胞の増殖を示している。
図6Aと6Bはオキサロ酢酸（oxaloacetic acid）による大
気CO2における大気CO2における細胞増殖の刺戟を示して
いる。
気CO2における大気CO2における細胞増殖の刺戟を示して
いる。
PDRG基礎増殖培地に細胞系は、オキサロ酢酸の示した濃
度に暴露された。細胞をトリプシン処理し、５日後に計
数した。
度に暴露された。細胞をトリプシン処理し、５日後に計
数した。
図7Aと7Bは大気CO2における白血病細胞の増殖のためのP
DRG基礎増殖培地の最適化を示している。上部パネル:RP
MI1640増殖培地中のK562慢性骨髄性白血病細胞はRPMI16
40培地（□）、PDRG基礎増殖培地（▲）中でまたはアデ
ノシン（10（mg/L単位で添加、以下同じ））、シチジン
（10）、グアノシン（10）、ウリジン（10）、イノシン
（25）、およびオロチン酸（15）を補給したPDRG基礎増
殖培地（●）中で週毎に継代培養した。
DRG基礎増殖培地の最適化を示している。上部パネル:RP
MI1640増殖培地中のK562慢性骨髄性白血病細胞はRPMI16
40培地（□）、PDRG基礎増殖培地（▲）中でまたはアデ
ノシン（10（mg/L単位で添加、以下同じ））、シチジン
（10）、グアノシン（10）、ウリジン（10）、イノシン
（25）、およびオロチン酸（15）を補給したPDRG基礎増
殖培地（●）中で週毎に継代培養した。
下部パネル：細胞を各々の培地中で３回継代培養した後
採取し、同じ培地中に示した濃度で接種し、そして日毎
に細胞数を計数した。
採取し、同じ培地中に示した濃度で接種し、そして日毎
に細胞数を計数した。
発明の詳細な説明 本発明の上述のいろいろな目的と利点は、大気CO2中で
細胞の増殖または保存のための基礎培地の調製により実
施され、この培地は表２に掲示した成分から実質的にな
る。
細胞の増殖または保存のための基礎培地の調製により実
施され、この培地は表２に掲示した成分から実質的にな
る。
本発明の基礎培地は、ここではPDRG基礎増殖培地と命名
される。
される。
他に定義されることがなければ、ここで使用される全て
の技術的または科学的術語は、本発明の当業者に通常理
解されるのと同じ意味を持つ。ここで記述された方法ま
たは材料と同じまたは同等の如何なるものは本発明の実
施と試験に使用できるが、好ましい方法と材料は今述べ
る。下記する全ての刊行物は参照によりここに包含され
る。
の技術的または科学的術語は、本発明の当業者に通常理
解されるのと同じ意味を持つ。ここで記述された方法ま
たは材料と同じまたは同等の如何なるものは本発明の実
施と試験に使用できるが、好ましい方法と材料は今述べ
る。下記する全ての刊行物は参照によりここに包含され
る。
ここで使用されまたは予想される技術は、他に説明のな
い限りこの技術の当業者にはよく知られている標準の方
法である。材料、方法および実施例は説明だけのためで
あって、限定を意図していない。
い限りこの技術の当業者にはよく知られている標準の方
法である。材料、方法および実施例は説明だけのためで
あって、限定を意図していない。
ここで使用される術語「大気CO2」は、通常の温度と圧
における大気中に自然に存在するCO2含有量を意味す
る。
における大気中に自然に存在するCO2含有量を意味す
る。
ここで使用される術語「CO2−非依存性」とは、外来性
の、調節された豊富化したCO2が要求されないことを意
味する。
の、調節された豊富化したCO2が要求されないことを意
味する。
ここで使用される術語「細胞」とは、CO2−非依存性の
雰囲気中のin vitro系で生長し、保存されまたは増殖
することを要求されるヒトまたは非ヒトの、腫瘍または
非腫瘍の細胞を意味する。
雰囲気中のin vitro系で生長し、保存されまたは増殖
することを要求されるヒトまたは非ヒトの、腫瘍または
非腫瘍の細胞を意味する。
材料と方法 別に示なさい限りは、全ての材料は市販品であった。
RPMI1640、RPMI1630、Ｌ−15およびPDRG基礎増殖培地の
緩衝能の比較 15mlの血清のない培地を1NHClでpH6.0まで中和した。水
酸化ナトリウム（1N）を15μｌの液滴で添加し激しく渦
巻いた後pHを決める。
緩衝能の比較 15mlの血清のない培地を1NHClでpH6.0まで中和した。水
酸化ナトリウム（1N）を15μｌの液滴で添加し激しく渦
巻いた後pHを決める。
大気CO2における増殖に対する細胞系の適合 細胞系（表１）は、腫瘍貯蔵所から得た（フレデリッ
ク、メリーランド州）。ヒト腫瘍細胞系を５％のウシ胎
児の血清（ハイクローン ラボラトリース、ローガン、
ユタ州）を含有するRPMI1640培地（クオリティ バイオ
ロジカル、ゲイテルスブルグ、メリーランド州）中でル
ーチン的に増殖した。培養物を湿度95％、二酸化炭素５
％の湿潤雰囲気中の75cm2コスター培養フラスコ中に保
持し、85−90％の集密度で継代培養した。細胞をトリプ
シン処理により取り出し、下記の手順に従って継代培養
した：培地を傾斜し、細胞を2mlの0.1％のEDTA（クオリ
ティ バイオロジカル、ゲイテルスブルグ、メリーラン
ド州）を含有する0.05％トリプシンで一回濯いだ。次い
で細胞を0.5mlのトリプシン溶液〔この溶液はCa2+/Mg2+
の無いリン酸塩緩衝食塩水中の1mlの１％トリプシン溶
液（シグマ型III、２回再結晶）を50mlの0.05％トリプ
シン（0.05％のEDTAを含有する。）に添加することによ
り製造した。〕で２−５分間覆った。
ク、メリーランド州）。ヒト腫瘍細胞系を５％のウシ胎
児の血清（ハイクローン ラボラトリース、ローガン、
ユタ州）を含有するRPMI1640培地（クオリティ バイオ
ロジカル、ゲイテルスブルグ、メリーランド州）中でル
ーチン的に増殖した。培養物を湿度95％、二酸化炭素５
％の湿潤雰囲気中の75cm2コスター培養フラスコ中に保
持し、85−90％の集密度で継代培養した。細胞をトリプ
シン処理により取り出し、下記の手順に従って継代培養
した：培地を傾斜し、細胞を2mlの0.1％のEDTA（クオリ
ティ バイオロジカル、ゲイテルスブルグ、メリーラン
ド州）を含有する0.05％トリプシンで一回濯いだ。次い
で細胞を0.5mlのトリプシン溶液〔この溶液はCa2+/Mg2+
の無いリン酸塩緩衝食塩水中の1mlの１％トリプシン溶
液（シグマ型III、２回再結晶）を50mlの0.05％トリプ
シン（0.05％のEDTAを含有する。）に添加することによ
り製造した。〕で２−５分間覆った。
腫瘍細胞を、75cm2コスター（Costar）培養フラスコ中
で、１×104の濃度で、30mlのRPMI1640、RPMI1630（ク
オリティ バイオロジカル、ゲイテルスブルグ、メリー
ランド州）、Ｌ−15（クオリティ バイオロジカル、ゲ
イテルスブルグ、メリーランド州）または５％のウシ胎
児の血清を含有するPDRG基礎増殖培地中で培養した。細
胞を湿潤雰囲気中37℃で、５％CO2（RPMI1640）または
大気CO2（PRMI1630、Ｌ−15とPDRG基礎増殖培地）中保
持した。細胞をトリプシン処理し、各々の培地中で週毎
に４週間にわたり継代培養した。
で、１×104の濃度で、30mlのRPMI1640、RPMI1630（ク
オリティ バイオロジカル、ゲイテルスブルグ、メリー
ランド州）、Ｌ−15（クオリティ バイオロジカル、ゲ
イテルスブルグ、メリーランド州）または５％のウシ胎
児の血清を含有するPDRG基礎増殖培地中で培養した。細
胞を湿潤雰囲気中37℃で、５％CO2（RPMI1640）または
大気CO2（PRMI1630、Ｌ−15とPDRG基礎増殖培地）中保
持した。細胞をトリプシン処理し、各々の培地中で週毎
に４週間にわたり継代培養した。
全ての細胞計数は、ZN クールタ型計数器（Model ZM C
oulter Counter）（ハイアリー、フロリダ州）で行っ
た。
oulter Counter）（ハイアリー、フロリダ州）で行っ
た。
４種のヒト繊維芽細胞系（MRC−5,CCD19−LU,Mar Bel
およびIMR−90）と一種の繊維芽細胞（3T3）は、10％の
ウシ胎児血清（fetal calf serum:FCS）を含有するPDRG
基礎増殖培地中での大気CO2中の増殖に適合させた。10
％ウシ胎児血清を含有するRPMI1640培地中での５％CO2
中のそして大気CO2中でのPDRG基礎増殖培地中の各々の
細胞の増殖曲線は、下記した通りに作製した。L1210とP
388のネズミのリンパ球白血病は同様に10％のウシ胎児
血清を含有するPDRG基礎増殖培地中の増殖に適合させ
た。
およびIMR−90）と一種の繊維芽細胞（3T3）は、10％の
ウシ胎児血清（fetal calf serum:FCS）を含有するPDRG
基礎増殖培地中での大気CO2中の増殖に適合させた。10
％ウシ胎児血清を含有するRPMI1640培地中での５％CO2
中のそして大気CO2中でのPDRG基礎増殖培地中の各々の
細胞の増殖曲線は、下記した通りに作製した。L1210とP
388のネズミのリンパ球白血病は同様に10％のウシ胎児
血清を含有するPDRG基礎増殖培地中の増殖に適合させ
た。
大気CO2中における細胞系の増殖曲線 ６週間にわたる各々の培地中の通常大気CO2中の増殖に
対する細胞の適合化の後、Ｌ−15とPDRG基礎増殖培地中
の細胞系の増殖曲線を作製した。細胞を上述のようにト
リプシン処理し、7mlの培地を含有する25cm2のコスター
（Costar）組織培養フラスコに７×105細胞/cm2の密度
で接種した。細胞を24時間の間隔でトリプシン処理し、
上述のようにして計数した。
対する細胞の適合化の後、Ｌ−15とPDRG基礎増殖培地中
の細胞系の増殖曲線を作製した。細胞を上述のようにト
リプシン処理し、7mlの培地を含有する25cm2のコスター
（Costar）組織培養フラスコに７×105細胞/cm2の密度
で接種した。細胞を24時間の間隔でトリプシン処理し、
上述のようにして計数した。
オキサロ酢酸による大気CO2中における細胞増殖の促進 細胞系の増殖に対するオキサロ酢酸の影響は下記の方法
で検討した。この実験に利用した細胞はPDRG基礎増殖培
地中での大気CO2における増殖に適合させた。
で検討した。この実験に利用した細胞はPDRG基礎増殖培
地中での大気CO2における増殖に適合させた。
細胞をトリプシン処理し、7mlのPDRG基礎増殖培地を含
有する25cm2のコスターフラスコ中に1.4×104細胞/cm2
の密度で接種した。24時間後に、オキサロ酢酸を最終濃
度が0.1mMないし6.0mMになるようにして添加した。オキ
サロ酢酸（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ
州）は蒸留水の200mM貯蔵液として調製し、pHを6.5にNa
OHで調整し、得られた貯蔵液を−80℃で使用時まで貯蔵
した。
有する25cm2のコスターフラスコ中に1.4×104細胞/cm2
の密度で接種した。24時間後に、オキサロ酢酸を最終濃
度が0.1mMないし6.0mMになるようにして添加した。オキ
サロ酢酸（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ
州）は蒸留水の200mM貯蔵液として調製し、pHを6.5にNa
OHで調整し、得られた貯蔵液を−80℃で使用時まで貯蔵
した。
in vitroの医薬品の影響の量表現のための大気CO2中に
おける微培養テトラゾリウムおよびスルホローダニンＢ
（SRB）検定 試験は、５％CO2内の医薬品に暴露した環境で増殖する
細胞を使用して選別した医薬品の用量−反応曲線が得ら
れるかどうかそして大気CO2中での各々の医薬品に対し
て暴露した環境で増殖する細胞を使用して選別した医薬
品の用量−反応曲線と比較できるかどうかを決定するた
めに行った。アドリアマイシン、BCNUおよびタモキシフ
ェンは、フレデリック カンサー リサーチ ファシリ
ティ、国立ガン研究所（National Cancer Institute,Fr
ederick Cancer Research）の医薬品合成実験室から入
手した。用量−反応曲線は、５％CO2下のRPMI1640培地
中でおよび大気CO2下でのPDRG基礎増殖培地中で保存し
た細胞で実施した。
おける微培養テトラゾリウムおよびスルホローダニンＢ
（SRB）検定 試験は、５％CO2内の医薬品に暴露した環境で増殖する
細胞を使用して選別した医薬品の用量−反応曲線が得ら
れるかどうかそして大気CO2中での各々の医薬品に対し
て暴露した環境で増殖する細胞を使用して選別した医薬
品の用量−反応曲線と比較できるかどうかを決定するた
めに行った。アドリアマイシン、BCNUおよびタモキシフ
ェンは、フレデリック カンサー リサーチ ファシリ
ティ、国立ガン研究所（National Cancer Institute,Fr
ederick Cancer Research）の医薬品合成実験室から入
手した。用量−反応曲線は、５％CO2下のRPMI1640培地
中でおよび大気CO2下でのPDRG基礎増殖培地中で保存し
た細胞で実施した。
３日間にわたる医薬品暴露の後、医薬品の影響を、MTT
テトラゾリウム検定（アレイ他、1988、Cancer Res.,4
8:589−601）とSRBタンパク質検定（スケハン他、198
9、Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.,30:612）の両方によ
り量（的に）表現した。簡単に説明する：冷−50％トリ
クロロ酢酸を最終濃度が10％になるようにして静かに増
殖培地の表面上に層状に被せた。そして細胞を４℃で60
分間にわたり固定し、固定した細胞を水道水で５回洗浄
し、0.1％酢酸中の0.4％SBR（シグマケミカル社、セン
トルイス、ミズーリ州）で15分間にわたり染色する。結
合しなかった染料を１％酢酸で５回濯いで除き、そして
染色した細胞を乾燥した。結合した染料を10mM−非緩衝
のTris塩基（pH10ないし10.5）で抽出し、吸光度を564n
Mで測定した。
テトラゾリウム検定（アレイ他、1988、Cancer Res.,4
8:589−601）とSRBタンパク質検定（スケハン他、198
9、Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.,30:612）の両方によ
り量（的に）表現した。簡単に説明する：冷−50％トリ
クロロ酢酸を最終濃度が10％になるようにして静かに増
殖培地の表面上に層状に被せた。そして細胞を４℃で60
分間にわたり固定し、固定した細胞を水道水で５回洗浄
し、0.1％酢酸中の0.4％SBR（シグマケミカル社、セン
トルイス、ミズーリ州）で15分間にわたり染色する。結
合しなかった染料を１％酢酸で５回濯いで除き、そして
染色した細胞を乾燥した。結合した染料を10mM−非緩衝
のTris塩基（pH10ないし10.5）で抽出し、吸光度を564n
Mで測定した。
結果 培地の調製：大気CO2中における細胞増殖のための第１
次緩衝剤の選択と最適化 大気CO2におけるPDRG基礎増殖培地（表２）の調製を試
験するためにHT29結腸腺密を細胞系の代表として利用し
た。本製剤は、下記の若干数のＬ−アミノ酸の高濃度を
包含している：アルギニン、システイン、ヒスチジン、
リジンおよびチロシン。これらのアミノ酸の高濃度の利
用の他に、PDRG基礎増殖培地は20mMのβ−グリセロホス
ヘートの添加により緩衝されている。PDRG基礎増殖培地
はビチオン、重炭酸イオンの低濃度、ピルビン酸、アス
パラギンとオキサロ酢酸の培地中への添加により、大気
CO2中での細胞の増殖のために最適化されている。
次緩衝剤の選択と最適化 大気CO2におけるPDRG基礎増殖培地（表２）の調製を試
験するためにHT29結腸腺密を細胞系の代表として利用し
た。本製剤は、下記の若干数のＬ−アミノ酸の高濃度を
包含している：アルギニン、システイン、ヒスチジン、
リジンおよびチロシン。これらのアミノ酸の高濃度の利
用の他に、PDRG基礎増殖培地は20mMのβ−グリセロホス
ヘートの添加により緩衝されている。PDRG基礎増殖培地
はビチオン、重炭酸イオンの低濃度、ピルビン酸、アス
パラギンとオキサロ酢酸の培地中への添加により、大気
CO2中での細胞の増殖のために最適化されている。
脂肪酸合成を包含する若干の生化学的過程のための重炭
酸イオンの要求は、血清により供給される濃度より多い
濃度（75mg/L）でPDRG基礎増殖培地の製造中に包含され
ていることを必要とした。これが、安定なpHを維持する
ために外来のCO2緩衝を要求しない培地に添加すること
のできる重炭酸イオンの最大の濃度であった。
酸イオンの要求は、血清により供給される濃度より多い
濃度（75mg/L）でPDRG基礎増殖培地の製造中に包含され
ていることを必要とした。これが、安定なpHを維持する
ために外来のCO2緩衝を要求しない培地に添加すること
のできる重炭酸イオンの最大の濃度であった。
RPMI1640、RPMI1630、Ｌ−15およびPDRG基礎増殖培地の
比較緩衝能 各々の培養培地の酸性化した液滴（pH6.0）の塩基滴定
は、相対的緩衝能の測定を提供する（図１）。この点に
関しては、PDRG基礎増殖培地は重炭酸塩に基づいた培養
培地:RPMI1640に同一であり、そのアルカリ化に対する
抵抗性はRPMI1630またはＬ−15のいずれよりも実質的に
より大きかった。RPMI1630とＬ−15の塩基滴定は、培地
のpHを6.0から7.5に増やすのに要求される［OH-］の当
量は、PDRG基礎増殖培地で観察されたのよりは各々が1.
6倍と3.7倍少なかったことを示した。
比較緩衝能 各々の培養培地の酸性化した液滴（pH6.0）の塩基滴定
は、相対的緩衝能の測定を提供する（図１）。この点に
関しては、PDRG基礎増殖培地は重炭酸塩に基づいた培養
培地:RPMI1640に同一であり、そのアルカリ化に対する
抵抗性はRPMI1630またはＬ−15のいずれよりも実質的に
より大きかった。RPMI1630とＬ−15の塩基滴定は、培地
のpHを6.0から7.5に増やすのに要求される［OH-］の当
量は、PDRG基礎増殖培地で観察されたのよりは各々が1.
6倍と3.7倍少なかったことを示した。
大気CO2中における増殖に対するヒト腫瘍細胞系の適合 大気CO2中で、病型の広範囲を代表するヒト腫瘍細胞系
を増殖する容易さを検査するために設定された試験の結
果を図２に示した。最初の実験は、HT29結腸腺癌につい
て行われた。大気CO2中でのRPMI1630、Ｌ−15とPDRG基
礎増殖培地における増殖のプロファイルを、５％CO2中
でのRPMI1640培地中で増殖した細胞で得られたそれらと
比較した。これらの結果は、HT29の５％CO2環境からの
取り出しとそれに続く大気CO2中でのPDRG基礎増殖培地
中の増殖は、当初は細胞増殖を50％減らすことを随伴し
ていることを示した。これは、Ｌ−15とRPMI1630培地に
おいて培養したHT29細胞の増殖において、各々、3.7倍
と125倍減少したのと対照的であった。
を増殖する容易さを検査するために設定された試験の結
果を図２に示した。最初の実験は、HT29結腸腺癌につい
て行われた。大気CO2中でのRPMI1630、Ｌ−15とPDRG基
礎増殖培地における増殖のプロファイルを、５％CO2中
でのRPMI1640培地中で増殖した細胞で得られたそれらと
比較した。これらの結果は、HT29の５％CO2環境からの
取り出しとそれに続く大気CO2中でのPDRG基礎増殖培地
中の増殖は、当初は細胞増殖を50％減らすことを随伴し
ていることを示した。これは、Ｌ−15とRPMI1630培地に
おいて培養したHT29細胞の増殖において、各々、3.7倍
と125倍減少したのと対照的であった。
安定な増殖は、大気CO2中でのPDRG培地でのおよび５％C
O2中のRPMI1640培地でのHT−29細胞では、各々の培地中
で３−４回の継代培養に続いて得ら、ほぼ同等の増殖を
与えている。
O2中のRPMI1640培地でのHT−29細胞では、各々の培地中
で３−４回の継代培養に続いて得ら、ほぼ同等の増殖を
与えている。
他のパネルの細胞系を使用する同様の適合実験の結果
（図２）は、下記の事実を示している： （ａ）RPMI1630培地は大気CO2におけるこれらの細胞系
の増殖のために不満足であることを示している； （ｂ）５％CO2中での増殖細胞の密度は、大気CO2中での
増殖細胞のための得られたそれより高い； そして（ｃ）K562骨髄性白血病、HT29結腸腺癌およびSN
12K1腎臓癌の増殖のためには、PDRG基礎増殖培地がＬ−
15培地より優れている； HOP62敗腺癌、XF289グリア芽腫およびM19Mel.黒色腫の
ためにはPDRG基礎増殖培地とＬ−15培地では細胞密度は
同等であった。
（図２）は、下記の事実を示している： （ａ）RPMI1630培地は大気CO2におけるこれらの細胞系
の増殖のために不満足であることを示している； （ｂ）５％CO2中での増殖細胞の密度は、大気CO2中での
増殖細胞のための得られたそれより高い； そして（ｃ）K562骨髄性白血病、HT29結腸腺癌およびSN
12K1腎臓癌の増殖のためには、PDRG基礎増殖培地がＬ−
15培地より優れている； HOP62敗腺癌、XF289グリア芽腫およびM19Mel.黒色腫の
ためにはPDRG基礎増殖培地とＬ−15培地では細胞密度は
同等であった。
Ｌ−15培地は、OVCAR−５、卵巣癌細胞系だけのためにP
DRG基礎増殖培地に対して優れていたことが判明した。
DRG基礎増殖培地に対して優れていたことが判明した。
大気CO2中の細胞系の増殖曲線 大気CO2におけるPDRG基礎増殖培地とＬ−15培地におけ
るおよび５％CO2におけるRPMI1640培地における選別し
たヒト腫瘍細胞系の増殖曲線を図３に示す。各々の培地
における（表３）における各々の細胞系のために２倍に
なる時間の計数の結果は、HOP62肺腺癌、SN12K1腎臓癌
とXF498グリア芽腫のための２倍になる時間は、大気CO2
におけるPDRG基礎増殖培地中のそれが、５％CO2下のRPM
I1640培地中のそれより僅かに長いことを示している。
最も大きい乖離の2.7倍の増加は、OVCAR−５卵巣癌のた
めのであることが判明した。これと対照的に、M19Me1黒
色腫とHT29結腸腺癌のための２倍になる時間は５％CO2
におけるより大気CO2における方が短かい。
るおよび５％CO2におけるRPMI1640培地における選別し
たヒト腫瘍細胞系の増殖曲線を図３に示す。各々の培地
における（表３）における各々の細胞系のために２倍に
なる時間の計数の結果は、HOP62肺腺癌、SN12K1腎臓癌
とXF498グリア芽腫のための２倍になる時間は、大気CO2
におけるPDRG基礎増殖培地中のそれが、５％CO2下のRPM
I1640培地中のそれより僅かに長いことを示している。
最も大きい乖離の2.7倍の増加は、OVCAR−５卵巣癌のた
めのであることが判明した。これと対照的に、M19Me1黒
色腫とHT29結腸腺癌のための２倍になる時間は５％CO2
におけるより大気CO2における方が短かい。
５％CO2と大気CO2におけるPDRG基礎増殖培地中のP388と
L1210ネズミリンパ球白血病のための増殖曲線を図４に
示す。５％CO2と大気CO2におけるPDRG基礎増殖培地中の
４種のヒトのそして１種のネズミの繊維芽細胞のための
増殖曲線は、殆ど同じである（図５）。
L1210ネズミリンパ球白血病のための増殖曲線を図４に
示す。５％CO2と大気CO2におけるPDRG基礎増殖培地中の
４種のヒトのそして１種のネズミの繊維芽細胞のための
増殖曲線は、殆ど同じである（図５）。
オキサロ酢酸による大気CO2中でのヒト腫瘍細胞系の増
殖促進 オキサロ酢酸（トリカルボン酸回路の中間体）を腫瘍細
胞系の各々の増殖刺戟のために評価した（図６）。
殖促進 オキサロ酢酸（トリカルボン酸回路の中間体）を腫瘍細
胞系の各々の増殖刺戟のために評価した（図６）。
PDRG基礎増殖培地へのオキサロ酢酸の添加は、最大で、
HOP62肺腺癌では25％、PT29結腸腺癌では13％、Sn12K1
腎臓癌では28％そしてM19Me1黒色腫では38％の細胞増殖
の増加をもたらした。
HOP62肺腺癌では25％、PT29結腸腺癌では13％、Sn12K1
腎臓癌では28％そしてM19Me1黒色腫では38％の細胞増殖
の増加をもたらした。
これらの細胞系のためのオキサロ酢酸による増殖刺戟
は、0.5ないし6.0mMの濃度範囲にわたって起こった。XF
498グリア芽腫、OVCAR5卵巣癌およびK562骨髄性白血病
はオキサロ酢酸による増殖刺戟に対しては無反応性であ
った。
は、0.5ないし6.0mMの濃度範囲にわたって起こった。XF
498グリア芽腫、OVCAR5卵巣癌およびK562骨髄性白血病
はオキサロ酢酸による増殖刺戟に対しては無反応性であ
った。
大気CO2における白血病細胞の増殖のためのPDRG基礎増
殖培地の最適化 中枢神経系の、結腸の、腎臓の、肺臓の、黒色腫のそし
て卵巣の組織を代表する腫瘍細胞系のPDRG基礎増殖培地
中での大気CO2での増殖への適合化は、概ね２−３回の
継代培養で完結した（図２）。これは、K562慢性骨髄性
白血病から得られた結果とは対照的であった。RPMI1640
からK562を取り出しそして大気CO2中のPDRG基礎増殖培
地中で増大すると、概ね安定な増殖をする５−６回の継
代培養の後の３回の継代培養にわたる増殖において進行
的減少が伴った（図２）。
殖培地の最適化 中枢神経系の、結腸の、腎臓の、肺臓の、黒色腫のそし
て卵巣の組織を代表する腫瘍細胞系のPDRG基礎増殖培地
中での大気CO2での増殖への適合化は、概ね２−３回の
継代培養で完結した（図２）。これは、K562慢性骨髄性
白血病から得られた結果とは対照的であった。RPMI1640
からK562を取り出しそして大気CO2中のPDRG基礎増殖培
地中で増大すると、概ね安定な増殖をする５−６回の継
代培養の後の３回の継代培養にわたる増殖において進行
的減少が伴った（図２）。
しかし、PDRG基礎増殖培地におけるK562の増殖は、Ｌ−
15またはRPMI1630中ののそれよりも多いが、それはRPMI
1640と５％CO2中のそれよりは実質的に少なかった（図
３）。
15またはRPMI1630中ののそれよりも多いが、それはRPMI
1640と５％CO2中のそれよりは実質的に少なかった（図
３）。
これらの観察は、プリンとピリミジンの生合成における
利用のためのCO2の代謝的生成が制限されているかも知
れないことを示唆し、それらの補給のK562の増殖に与え
る影響を詳細に検討するべく動機付けた。
利用のためのCO2の代謝的生成が制限されているかも知
れないことを示唆し、それらの補給のK562の増殖に与え
る影響を詳細に検討するべく動機付けた。
プリンとピリミジン塩基またはそれらのリボ／デオキシ
リボヌクレオチドを使用するPDRG基礎増殖培地の補給
は、僅かな増殖刺戟をもたらした（データを示さなかっ
た。） しかし、プリンヌクレオシドのアデノシン、グアノシン
およびイノシン；ピリミジンヌクレオシドのシチジンと
ウリジン；およびピリミジン前駆体のオロチン酸（表
２）を使用するPDRG基礎増殖培地の補給は、大気CO2に
おける増殖へのK562の適合の長々しい時間の排除と大気
CO2におけるこの細胞系の増殖の顕著な刺戟をもたらし
た（図７）。
リボヌクレオチドを使用するPDRG基礎増殖培地の補給
は、僅かな増殖刺戟をもたらした（データを示さなかっ
た。） しかし、プリンヌクレオシドのアデノシン、グアノシン
およびイノシン；ピリミジンヌクレオシドのシチジンと
ウリジン；およびピリミジン前駆体のオロチン酸（表
２）を使用するPDRG基礎増殖培地の補給は、大気CO2に
おける増殖へのK562の適合の長々しい時間の排除と大気
CO2におけるこの細胞系の増殖の顕著な刺戟をもたらし
た（図７）。
大気CO2中でのこの変形したPDRG基礎増殖培地中のそし
てRPMI1640と５％CO2中のK562の増殖は比較できるもの
であった。両方の培地におけるK562の２倍になる時間
（Td）の検討は、接種の後１−３日間は同様の２倍にな
る時間を示している。
てRPMI1640と５％CO2中のK562の増殖は比較できるもの
であった。両方の培地におけるK562の２倍になる時間
（Td）の検討は、接種の後１−３日間は同様の２倍にな
る時間を示している。
しかし、４−８日間にわたっては、変形したPDRG基礎増
殖培地中で増殖する細胞は、RPMI1640中で増殖する細胞
より実質的に短い２倍になる時間（Tds）を持っていた
（表４）。
殖培地中で増殖する細胞は、RPMI1640中で増殖する細胞
より実質的に短い２倍になる時間（Tds）を持っていた
（表４）。
両方の培地で増殖するK568細胞の特定の基礎速度を比較
すると同様のパターンが現れていた（表４）。
すると同様のパターンが現れていた（表４）。
それに加えて、変形したPDRG基礎増殖培地中で増殖する
K562細胞の飽和密度は、RPMI1640で得られたそれより50
％大きかった（図７）。
K562細胞の飽和密度は、RPMI1640で得られたそれより50
％大きかった（図７）。
大気CO2における選択医薬品のIC50値 大気CO2と５％CO2におけるアドリアマイシン、BCNUおよ
びタモキシフェン（tamoxifen）のIC50値は表５に示し
た。同様の値を両方の条件下で得た。しかし、概して、
細胞はこれらの医薬品に対して、MTTテトラゾリウム検
定を細胞の生育力を評価するために利用した場合の方
が、SRBタンパク質検定を利用した場合に比較して、よ
り高い感受性を示した。
びタモキシフェン（tamoxifen）のIC50値は表５に示し
た。同様の値を両方の条件下で得た。しかし、概して、
細胞はこれらの医薬品に対して、MTTテトラゾリウム検
定を細胞の生育力を評価するために利用した場合の方
が、SRBタンパク質検定を利用した場合に比較して、よ
り高い感受性を示した。
この増強された感受性は、より低いIC50値によって表さ
れそして大気CO2中と５％CO2中の両方で起きた。
れそして大気CO2中と５％CO2中の両方で起きた。
要約すると、ここに示したデータは、第１次緩衝剤（ム
ーア他、1966、JNCI,36:405−421）として２塩基性のリ
ン酸ナトリウムを使用するRPMI1630は満足できるもので
はなかったことを明瞭に示している（図２）。
ーア他、1966、JNCI,36:405−421）として２塩基性のリ
ン酸ナトリウムを使用するRPMI1630は満足できるもので
はなかったことを明瞭に示している（図２）。
ライボヴィッツにより開発された、大気CO2における細
胞の増殖用のＬ−15（ライボヴィッツ、1963、Amer.J.H
yg.,78:172−180）は、現在の研究ではRPMI1630より優
れているが（図２）、テトラゾリウム塩を使用して細胞
の生育力を測定する代謝検定における利用のためには満
足できないことが見出された。
胞の増殖用のＬ−15（ライボヴィッツ、1963、Amer.J.H
yg.,78:172−180）は、現在の研究ではRPMI1630より優
れているが（図２）、テトラゾリウム塩を使用して細胞
の生育力を測定する代謝検定における利用のためには満
足できないことが見出された。
PDRG基礎増殖培地を使用して得られた結果は、ネズミと
異種の組織を代表する広範囲のヒト腫瘍細胞系並びに若
干数のヒトとネズミの繊維芽細胞は、PDRG基礎増殖培地
中での大気CO2中の増殖にうまく適合させることができ
ることを示している（表２）。
異種の組織を代表する広範囲のヒト腫瘍細胞系並びに若
干数のヒトとネズミの繊維芽細胞は、PDRG基礎増殖培地
中での大気CO2中の増殖にうまく適合させることができ
ることを示している（表２）。
この培地は、重炭酸イオンが第１次の緩衝成分として除
去されるので外来のCO2を必要としない。
去されるので外来のCO2を必要としない。
プリン、ピリミジンおよび脂肪酸生合成を含むいろいろ
の生化学的工程のためにCO2の要求は、CO2の代謝的生産
と利用を容易にするために設定して下記の若干数の成分
のPDRG基礎増殖培地へ入れるようにしてある：（１）ビ
オチン（カルボキシル化反応の補因子）（２）ピルビン
酸（脱炭酸を介して並びにトリカルボン酸回路によるCO
2生産の代謝的刺戟のためのアセチルCoA源を提供するこ
とにより、CO2の代謝源として機能するモノカルボン
酸）および（３）Ｌ−アスパラギン（細胞質ゾル酵素の
Ｌ−アスパラギン＝アミドヒドロラーゼ（E.C.3.5.1.
1.）とミトコンドリア酵素のＬ−アスパルテート＝２−
オキソグルタレート＝アミノトランスフェラーゼ（E.C.
2.6.1.1.）の、各々により、アスパラギン酸とオキサロ
酢酸へ変換できるC4アミノ酸）。更に、トリカルボン酸
回路の中間体であるオキサロ酢酸を、CO2の部分的置換
物として試験した。
の生化学的工程のためにCO2の要求は、CO2の代謝的生産
と利用を容易にするために設定して下記の若干数の成分
のPDRG基礎増殖培地へ入れるようにしてある：（１）ビ
オチン（カルボキシル化反応の補因子）（２）ピルビン
酸（脱炭酸を介して並びにトリカルボン酸回路によるCO
2生産の代謝的刺戟のためのアセチルCoA源を提供するこ
とにより、CO2の代謝源として機能するモノカルボン
酸）および（３）Ｌ−アスパラギン（細胞質ゾル酵素の
Ｌ−アスパラギン＝アミドヒドロラーゼ（E.C.3.5.1.
1.）とミトコンドリア酵素のＬ−アスパルテート＝２−
オキソグルタレート＝アミノトランスフェラーゼ（E.C.
2.6.1.1.）の、各々により、アスパラギン酸とオキサロ
酢酸へ変換できるC4アミノ酸）。更に、トリカルボン酸
回路の中間体であるオキサロ酢酸を、CO2の部分的置換
物として試験した。
現在迄の検討では、オキサロ酢酸は若干数の細胞系の細
胞増殖を増やすことが見出されているが（図６）、それ
がOVCAR5卵巣癌、XF498グリア芽腫およびK562骨髄性白
血病における細胞増殖を著しく抑制するのでPDRG基礎増
殖培地処方には含有されていない。
胞増殖を増やすことが見出されているが（図６）、それ
がOVCAR5卵巣癌、XF498グリア芽腫およびK562骨髄性白
血病における細胞増殖を著しく抑制するのでPDRG基礎増
殖培地処方には含有されていない。
更に、オキサロ酢酸は増殖培地のアルカリ化を招く自動
分解をする。
分解をする。
これらの結果は、各々の細胞系で増殖促進について評価
されるべきであり、増殖の促進が観察された場合にはこ
れらの細胞系を利用する実験的プロトコール中に添加せ
しめるできであることを示唆している。
されるべきであり、増殖の促進が観察された場合にはこ
れらの細胞系を利用する実験的プロトコール中に添加せ
しめるできであることを示唆している。
更に、プリンヌクレオシド（アデノシン、グアノシンお
よびイノシン）、ピリミジンヌクレオシド（シチジンと
ウリジン）とピリミジンの前駆体であるオロチン酸の添
加は、大気CO2中の増殖に対するK562慢性骨髄性白血病
の適合期間を削除し、そしてRPMI1640かつ５％CO2およ
び変形PDRG基礎増殖培地と大気CO2中の殆ど同じ増殖を
もたらす（図７と表４）。
よびイノシン）、ピリミジンヌクレオシド（シチジンと
ウリジン）とピリミジンの前駆体であるオロチン酸の添
加は、大気CO2中の増殖に対するK562慢性骨髄性白血病
の適合期間を削除し、そしてRPMI1640かつ５％CO2およ
び変形PDRG基礎増殖培地と大気CO2中の殆ど同じ増殖を
もたらす（図７と表４）。
PDRG基礎増殖培地（図２、３、７）におけるK562の減少
する増殖とこの増殖差異を削除するためのプリンとピリ
ミジンヌクレオシドの能力は、核酸前駆体中への取込み
のためのCO2の代謝的生産はこの細胞系では限定的であ
ろうことを示唆している。
する増殖とこの増殖差異を削除するためのプリンとピリ
ミジンヌクレオシドの能力は、核酸前駆体中への取込み
のためのCO2の代謝的生産はこの細胞系では限定的であ
ろうことを示唆している。
PDRG基礎増殖培地は、ハイ−フラックス（high flux）
医薬品スクリーニング法に使用するのに幾つかの望まし
い特性を発揮する。第１に、その培地は、大気CO2にお
ける優れたpH安定性と緩衝能を持っている。これは細胞
が検定プレート中に接種されている場合における並びに
医薬品処理の間における培地のpHにおける変化を防止す
る。第２に、広範囲のヒト腫瘍細胞系の大量増殖のため
の能力を発揮する。第３に、Ｄ−グルコースはその培地
処方では主要な炭水化物であるので、細胞生育力の測定
のためのテトラゾリウムまたはタンパク質のどちらにも
基づいた検定の使用には適合する。最後に、アドリアマ
イシン、BCNUとタモキシフェンのためのIC50値は、大気
CO2中でのPDRG基礎増殖培地中でとRPMI1640と５％CO2中
でとで保持した細胞系では同様であった。
医薬品スクリーニング法に使用するのに幾つかの望まし
い特性を発揮する。第１に、その培地は、大気CO2にお
ける優れたpH安定性と緩衝能を持っている。これは細胞
が検定プレート中に接種されている場合における並びに
医薬品処理の間における培地のpHにおける変化を防止す
る。第２に、広範囲のヒト腫瘍細胞系の大量増殖のため
の能力を発揮する。第３に、Ｄ−グルコースはその培地
処方では主要な炭水化物であるので、細胞生育力の測定
のためのテトラゾリウムまたはタンパク質のどちらにも
基づいた検定の使用には適合する。最後に、アドリアマ
イシン、BCNUとタモキシフェンのためのIC50値は、大気
CO2中でのPDRG基礎増殖培地中でとRPMI1640と５％CO2中
でとで保持した細胞系では同様であった。
勿論、本発明の細胞培養培地を中空繊維とその関連技術
と組み合わせて、当業技術で知られているように外来CO
2の使用が厄介で経費が掛かり非実用的であることが判
っている、細胞と細胞生産物例えば生長ホルモン、抗
体、生理学的応答調節剤（biological response modifi
ers）等の大量生産のために、使用できる。
と組み合わせて、当業技術で知られているように外来CO
2の使用が厄介で経費が掛かり非実用的であることが判
っている、細胞と細胞生産物例えば生長ホルモン、抗
体、生理学的応答調節剤（biological response modifi
ers）等の大量生産のために、使用できる。
本発明の増殖培地は、一般のまたは特定の細胞培養の両
方に利用できる。
方に利用できる。
ここに記述された実施例と実施態様は説明の目的だけの
ものであり、その発明に照らし合わせてのいろいろの応
用と変化はこの技術の当業者に示唆されるものでありそ
してこの出願の精神と範囲および添付した請求項の範囲
内に包含されるべきものと理解される。
ものであり、その発明に照らし合わせてのいろいろの応
用と変化はこの技術の当業者に示唆されるものでありそ
してこの出願の精神と範囲および添付した請求項の範囲
内に包含されるべきものと理解される。
表1.大気CO2における増殖のために利用した細胞系細胞系 組織 XF498 ヒト中枢神経系（グリア芽腫） M19MEL ヒト黒色腫瘍 OVCAR5 ヒト卵巣腺癌 A2780 ヒト卵巣腺癌 HOP62 ヒト卵巣腺癌 SN12K1XJ ヒト腎臓細胞癌 HT29 ヒト結腸腺癌 K562 ヒト慢性骨髄性白血病 P388 ネズミリンパ球白血病 L1210 ネズミリンパ球白血病 MRC−５ ヒト繊維芽細胞 CCD−19LU ヒト繊維芽細胞 Mer Bel ヒト繊維芽細胞 IMR−90 ヒト繊維芽細胞 3T3 ネズミ繊維芽細胞 表2.大気CO2における細胞増殖のためのプログラム・デ
ブロップメント・リサーチ・グループ（PDRG）基礎培地
の組成 アミノ酸 mg/(脱イオン水H2O) Ｌ−アラニン 78 Ｌ−アルギニン（遊離塩基） 265 Ｌ−アスパラギン 88 Ｌ−アスパラギン酸 5 Ｌ−システイン 52 （還元済；遊離塩基） Ｌ−シスチン・2HCl 24 Ｌ−グルタミン酸 5 Ｌ−グルタミン 343 グリシン 79 Ｌ−ヒスチジン（遊離塩基） 141 Ｌ−イソロイシン 78 Ｌ−ロイシン 81 Ｌ−リジン（遊離塩基） 86 Ｌ−メチオニン 37 Ｌ−フェニルアラニン 65 Ｌ−プロリン 12 Ｌ−セリン 84 Ｌ−スレオニン 136 Ｌ−トリプトファン 13 Ｌ−チロシン（遊離塩基） 137 Ｌ−バリン 69 アミノ酸誘導体 プトレシン・2HCl 0.06 ビタミン：補酵素と脂質 ビオチン 0.10 葉酸 2.10 ニコチンアミド 1.70 Ｄ−パントテン酸カルシウム 1.70 塩化コリン 6.30 ピリドキシン・HCl 0.40 ピリドキサール・HCl 1.30 リボフラビン 0.15 リボフラビン-5′-ホスヘート 0.03 サイアミン＝モノホスヘート 0.30 サイアミン・HCl 1.50 ビタミンB12 0.50 ｉ−イノシトール 9.10 リポ酸 0.07 リノレイン酸 0.03 炭水化物とその誘導体 Ｄ−グルコース 1000 ピルビン酸ナトリウム 257 核酸誘導体 アデノシン＊ 10.0 シチジン＊ 10.0 グアノシン＊ 10.0 ヒポキサンチン 1.4 イノシン＊ 25.0 オロチン酸＊ 15.0 チミジン 0.24 ウリジン＊ 10.0 無機物 NaCl 7000 KCl 341 Na2HPO4（ANHY） 111 NaH2PO4（ANHY） 36 MgSO4（ANHY） 66 MgCl2・6H2O 107 KH2PO4 20 CaCl2・2H2O 165 無機微量元素 CuSO4・5H2O 0.0008 Fe（NO3）３・9H2O 0.03 FeSO4・7H2O 0.28 ZnSO4・7H2O 0.29 緩衝剤と指示薬 NaHCO3 75 β−グリセロホスヘート 4320 フェノールレッド 5 ＊ 白血病の培養の増殖のためのPDRG基礎増殖培地への追
加の補給を示す。
ブロップメント・リサーチ・グループ（PDRG）基礎培地
の組成 アミノ酸 mg/(脱イオン水H2O) Ｌ−アラニン 78 Ｌ−アルギニン（遊離塩基） 265 Ｌ−アスパラギン 88 Ｌ−アスパラギン酸 5 Ｌ−システイン 52 （還元済；遊離塩基） Ｌ−シスチン・2HCl 24 Ｌ−グルタミン酸 5 Ｌ−グルタミン 343 グリシン 79 Ｌ−ヒスチジン（遊離塩基） 141 Ｌ−イソロイシン 78 Ｌ−ロイシン 81 Ｌ−リジン（遊離塩基） 86 Ｌ−メチオニン 37 Ｌ−フェニルアラニン 65 Ｌ−プロリン 12 Ｌ−セリン 84 Ｌ−スレオニン 136 Ｌ−トリプトファン 13 Ｌ−チロシン（遊離塩基） 137 Ｌ−バリン 69 アミノ酸誘導体 プトレシン・2HCl 0.06 ビタミン：補酵素と脂質 ビオチン 0.10 葉酸 2.10 ニコチンアミド 1.70 Ｄ−パントテン酸カルシウム 1.70 塩化コリン 6.30 ピリドキシン・HCl 0.40 ピリドキサール・HCl 1.30 リボフラビン 0.15 リボフラビン-5′-ホスヘート 0.03 サイアミン＝モノホスヘート 0.30 サイアミン・HCl 1.50 ビタミンB12 0.50 ｉ−イノシトール 9.10 リポ酸 0.07 リノレイン酸 0.03 炭水化物とその誘導体 Ｄ−グルコース 1000 ピルビン酸ナトリウム 257 核酸誘導体 アデノシン＊ 10.0 シチジン＊ 10.0 グアノシン＊ 10.0 ヒポキサンチン 1.4 イノシン＊ 25.0 オロチン酸＊ 15.0 チミジン 0.24 ウリジン＊ 10.0 無機物 NaCl 7000 KCl 341 Na2HPO4（ANHY） 111 NaH2PO4（ANHY） 36 MgSO4（ANHY） 66 MgCl2・6H2O 107 KH2PO4 20 CaCl2・2H2O 165 無機微量元素 CuSO4・5H2O 0.0008 Fe（NO3）３・9H2O 0.03 FeSO4・7H2O 0.28 ZnSO4・7H2O 0.29 緩衝剤と指示薬 NaHCO3 75 β−グリセロホスヘート 4320 フェノールレッド 5 ＊ 白血病の培養の増殖のためのPDRG基礎増殖培地への追
加の補給を示す。
最終pH＝7.3 最終浸透圧＝290−295mosM/kg
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スクジーロ，ドミニク アルバート アメリカ合衆国，メリーランド 21780, フレデリック，コラル エルエヌ．5507 (72)発明者 ボイド，ミカエル レイ アメリカ合衆国，メリーランド 21754, イジャムスヴィレ，フエイルグリーネ ウ エイ 5217 (72)発明者 モンクス，パトリシアアンネ アメリカ合衆国，メリーランド 21713, クラークスブルグ，フォンテイン ディー アール．12120 (56)参考文献 特公 昭63−18465（ＪＰ，Ｂ２) “Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｉｇｈｔｉｅｔｈ Ａｎｎｖａｌ Ｍ ｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ ｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”Ｖｏ ｌ．30（Ｍａｒｃｈ 1989）Ｐ．613Ｎｏ. 2440
Claims (4)
- 【請求項１】in vitroで腫瘍細胞を増殖することから
なる抗癌剤のin vitroのスクリーニング法であって、 重炭酸ナトリウムを代謝中間体として75mg/を超えな
い濃度で含有する細胞培養培地が、CO2の外部からの補
給なしで、抗癌剤の非存在下と存在下で、通常の温度と
圧で大気中に自然にある条件下でのヒト−と非ヒト−起
源の腫瘍細胞と非腫瘍細胞の保存、生長または増殖をさ
せ、 抗癌剤の非存在下における細胞の増殖に対するその抗癌
剤の存在下におけるその細胞の増殖における減少が該剤
の抗癌剤能力を示しているスクリーニング法。 - 【請求項２】細胞培養培地が炭素源、ビタミン、ミネラ
ル、アミノ酸、アミノ酸誘導体、補酵素、脂質、緩衝
剤、重炭酸ナトリウムおよび無機微量元素からなる請求
項１記載の抗癌剤のin vitroのスクリーニング法。 - 【請求項３】炭素源がＤ−グルコースまたはピルビン酸
ナトリウムおよびそれらの組み合わせからなる群から選
択される請求項２記載のスクリーニング法。 - 【請求項４】緩衝剤がベータ−グリセロホスヘートであ
る請求項３記載のスクリーニング法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US46793990A | 1990-01-22 | 1990-01-22 | |
| US467,939 | 1990-01-22 | ||
| PCT/US1991/000451 WO1991010726A1 (en) | 1990-01-22 | 1991-01-22 | Co-independent growth medium for maintenance and propagation of cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05502379A JPH05502379A (ja) | 1993-04-28 |
| JPH0789954B2 true JPH0789954B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=23857771
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3504839A Expired - Lifetime JPH0789954B2 (ja) | 1990-01-22 | 1991-01-22 | 細胞の保存と増殖のための二酸化炭素―非依存性増殖培地 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0512066B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0789954B2 (ja) |
| AT (1) | ATE145235T1 (ja) |
| AU (1) | AU653927B2 (ja) |
| CA (1) | CA2074363C (ja) |
| DE (1) | DE69123140T2 (ja) |
| DK (1) | DK0512066T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991010726A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10982003B2 (en) | 2009-08-11 | 2021-04-20 | Genentech, Inc. | Production of proteins in glutamine-free cell culture media |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6475725B1 (en) | 1997-06-20 | 2002-11-05 | Baxter Aktiengesellschaft | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same |
| WO1998059035A2 (en) | 1997-06-25 | 1998-12-30 | The Goverment Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services, National Institutes Of Health | Serum-free cell growth medium |
| AT409379B (de) | 1999-06-02 | 2002-07-25 | Baxter Ag | Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen |
| JP2001131009A (ja) | 1999-10-29 | 2001-05-15 | Ajinomoto Co Inc | イネ科植物の枯死防止及び速効的栄養補給剤。 |
| JP4502098B2 (ja) | 2000-11-27 | 2010-07-14 | 味の素株式会社 | 植物用分けつ促進剤および植物の分けつ促進方法 |
| DK2287288T3 (da) | 2002-07-09 | 2013-01-07 | Baxter Int | Medium frit for animalsk protein til dyrkning af celler |
| WO2004071208A1 (en) * | 2003-02-14 | 2004-08-26 | Mars Uk Limited | Skin composition |
| US20060094104A1 (en) | 2004-10-29 | 2006-05-04 | Leopold Grillberger | Animal protein-free media for cultivation of cells |
| EP1974014B1 (en) | 2006-01-04 | 2017-04-19 | Baxalta Incorporated | Oligopeptide-free cell culture media |
| SG181805A1 (en) * | 2009-12-18 | 2012-07-30 | Boehringer Ingelheim Int | Method for optimizing a biopharmaceutical production process |
| CA2827590C (en) | 2011-02-18 | 2020-09-01 | Stemcyte, Inc. | Stem cells packaging and shipping |
| US20150004620A1 (en) * | 2011-12-31 | 2015-01-01 | Agency For Science, Technology And Research | Method or device for identifying inhibitor of epithelial mesenchymal transition |
| WO2013143822A1 (en) | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Imax Discovery Gmbh | Adenosine as sweetness enhancer for certain sugars |
| US20140170748A1 (en) * | 2012-12-14 | 2014-06-19 | DePuy Synthes Products, LLC | Nutrient Enriched Media for hUTC Growth |
| WO2014141151A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited | Use of tricarboxylic acid (tca) intermediates to control ammonia generation in cell culture |
| CN108471736A (zh) | 2016-01-14 | 2018-08-31 | 德普伊新特斯产品公司 | 用于冷冻保存hutc的组合物和方法 |
| JP2018113907A (ja) * | 2017-01-18 | 2018-07-26 | 株式会社Ｒｅｇｅｎｅ Ｐｈａｒｍ | 動物細胞の培養方法 |
| JP2020184972A (ja) * | 2019-05-17 | 2020-11-19 | 株式会社Ｒｅｇｅｎｅ Ｐｈａｒｍ | 新規培地 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6318465A (ja) * | 1986-07-10 | 1988-01-26 | Fujitsu Ltd | 移動最小二乗関数回帰回路 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3883393A (en) * | 1972-05-18 | 1975-05-13 | Us Health Education & Welfare | Cell culture on semi-permeable tubular membranes |
| US4411990A (en) * | 1979-06-13 | 1983-10-25 | University Patents, Inc. | Primary bioassay of human tumor stem cells |
| JPS57194787A (en) * | 1981-05-28 | 1982-11-30 | Ajinomoto Co Inc | Culture medium for animal cell |
-
1991
- 1991-01-22 JP JP3504839A patent/JPH0789954B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-22 DK DK91904443.8T patent/DK0512066T3/da active
- 1991-01-22 WO PCT/US1991/000451 patent/WO1991010726A1/en active IP Right Grant
- 1991-01-22 EP EP91904443A patent/EP0512066B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-22 AU AU73001/91A patent/AU653927B2/en not_active Ceased
- 1991-01-22 DE DE69123140T patent/DE69123140T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-22 AT AT91904443T patent/ATE145235T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-22 CA CA002074363A patent/CA2074363C/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6318465A (ja) * | 1986-07-10 | 1988-01-26 | Fujitsu Ltd | 移動最小二乗関数回帰回路 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＥｉｇｈｔｉｅｔｈＡｎｎｖａｌＭｅｅｔｉｎｇｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ"Ｖｏｌ．３０（Ｍａｒｃｈ１９８９）Ｐ．６１３Ｎｏ．２４４０ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10982003B2 (en) | 2009-08-11 | 2021-04-20 | Genentech, Inc. | Production of proteins in glutamine-free cell culture media |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69123140T2 (de) | 1997-04-03 |
| ATE145235T1 (de) | 1996-11-15 |
| CA2074363A1 (en) | 1991-07-23 |
| EP0512066B1 (en) | 1996-11-13 |
| EP0512066A4 (en) | 1993-04-28 |
| CA2074363C (en) | 2004-11-09 |
| DE69123140D1 (de) | 1996-12-19 |
| DK0512066T3 (da) | 1996-12-02 |
| JPH05502379A (ja) | 1993-04-28 |
| AU7300191A (en) | 1991-08-05 |
| AU653927B2 (en) | 1994-10-20 |
| WO1991010726A1 (en) | 1991-07-25 |
| EP0512066A1 (en) | 1992-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0789954B2 (ja) | 細胞の保存と増殖のための二酸化炭素―非依存性増殖培地 | |
| US4657866A (en) | Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media | |
| Waymouth | Rapid proliferation of sublines of NCTC clone 929 (strain L) mouse cells in a simple chemically defined medium (MB 752/1) | |
| AU621972B2 (en) | Cell culture medium for human liver epithelial cell line | |
| Nowak et al. | L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture | |
| KR20070058584A (ko) | 인간 배아 줄기 세포의 배양 | |
| CN106834229B (zh) | 用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基 | |
| US7923245B2 (en) | Medium for ES culturing | |
| JP6845218B2 (ja) | 細胞におけるグルタチオンレベルを増加させる方法 | |
| Friedlander et al. | Increase in membrane fluidity and opening of tight junctions have similar effects on sodium-coupled uptakes in renal epithelial cells. | |
| Taylor et al. | Folate-dependent enzymes in cultured Chinese hamster ovary cells: induction of 5-methyltetrahydrofolate homocysteine cobalamin methyltransferase by folate and methionine | |
| EP2039758A1 (en) | Cell culture medium and method for culturing stem cells and progenitor cells | |
| Price et al. | A new culture medium for human skin epithelial cells | |
| Moser | Modern approaches to the study of mammalian cells in culture | |
| US5126261A (en) | High calcium chemically defined culture medium | |
| JPH03151873A (ja) | プラスミノゲン活性化因子産生細胞系 | |
| US5266479A (en) | High calcium chemically defined culture medium | |
| Agy et al. | Protein-free medium for C-1300 mouse neuroblastoma cells | |
| KR100567655B1 (ko) | 섬유아세포 배양용 배지, 상기 배지를 이용하여 진피대체물을 제조하는 방법 및 그에 의하여 제조되는 진피대체물, 상기 진피 대체물을 이용하여 피부 대체물을제조하는 방법 및 그에 의하여 제조되는 피부 대체물 | |
| Mitsuhashi | Polyamine as a growth promoter for cultured insect cells | |
| US5916809A (en) | Medium for culturing normal human epidermal melanocytes | |
| Mihich et al. | Effects of 6-Mercaptopurine on Respiration, Anaerobic Glycolysis and Succino-Dehydrogenase Activity in Normal and Tumor Tissues. | |
| Leung et al. | Characteristics of deoxythymidine transport and deoxythymidine kinase in 3T3 cells | |
| Chang | Vitamin requirements of three spiroplasmas | |
| DiSorbo et al. | Pyridoxine resistance in a rat hepatoma cell line |