JPH05502379A - 細胞の保存と増殖のための二酸化炭素―非依存性増殖培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は概して細胞の増殖培地に関する。更に特定すると、本発明は通常の大気 のＣＯ３中における細胞の保存と増殖を可能にする増殖培地であっで、緩衝のた めの二酸化炭素豊富の外来性の調節した供給を要求しない培地に関する。

発明の背景 第１次の緩衝成分としての重炭酸イオンを含有する通常の増殖培地は、（約７． ２−７．４の生理的ｐＨを維持するために）特別の二酸化炭素雰囲気を必要とす る。

これは制御雰囲気を設置した経費のかかる培養器を必要とし、この特殊な雰囲気 の外側で行わねばならない通常の手動処理は培地のｐＨの急激な変化をもたらし 、これが翻って細胞を抑圧しそしてその機能を変えてしまう不利な点がある。

ＣＯを雰囲気中の細胞の増殖のために若干数の培地が市販されている。これらの 中でＲＰＭ１１６３０は、７種の腫瘍組織を代表する細胞系の増殖のための最近 の研究では満足出来ないことが見出された。

Ｌ−１５はＲＰＭ１１６３０より、添加重炭酸塩とＣＯ８豊富雰囲気でない大気 のＣＯｉ中で腫瘍細胞の培養のためにより優れていることが判っている。しかし 、Ｌ−１５培地はヒト腫瘍細胞の多種類を増殖するのには適当ではなく、その製 剤中における砂ｍＤ−グルコースの欠損に因って、テトラゾリウム還元終点を利 用する医薬品毒性評価には不適合であることが見出された。

発明の概略 従って、本発明の目的は、細胞増殖培地を提供することであって、その培地は今 まで知られている増殖培地と異なり、ＣＯ２豊富でない雰囲気中で、広範囲のヒ トおよび非ヒト由来の腫瘍および非腫瘍の細胞の増殖を支持する。

本発明の別の目的は、ヒト腫瘍細胞系の広いパネルを使用するｉｎ　ｖｉｔｒｏ の抗ガン剤の医薬スクリーニングに適したＣ　Ｏ２＝非依存性の培養培地を提供 することである。

本発明の別の目的は、培地のｐ）（を制御するためにＣＯ３を使用することは厄 介であり、経費高であり、非実用的でありまたは望ましくない場合に広範囲の細 胞培養技術に適しているＣ○、−非依存性培養培地を提供することである。

いろいろの別の目的と利点は、本発明の下記の詳細な記述から明瞭になるであろ う。

図面の簡単な説明 本発明のこれらのそして別の目的、特徴そして付随する利点は、添付した図面と 組み合わせて下記の詳細な説明を読めば更によ（理解される： 図１は、ＲＰＭ１１６４０．ＲＰＭ１１６３０、Ｌ−１５そしてＰＤＲＧ基礎増 殖培地の緩衝能の比較結果を示している。血清のない、ＲＰＭ１１６４０（ロ） 、ＲＰＭ１１６３０（・）、Ｌ−１５（冒）およびＰＤＲＧ基礎増殖培地（ム） をＩＮ　ＭＣＩでｐＨ６，０に調節した。水着化ナトリウム（ＩＮ）を１５μｍ の液滴で添加し１、ｐＨを決めた。

図２Ａ−２Ｇは、大気ＣＯ２雰囲気中の増殖に対するヒト腫瘍細胞系の適合の比 較結果を示す。ＲＰＭ１１６４０増殖培地中の細胞系を、トリプシン処理し、５ ％Ｃ０２中で増殖のためにＲＰＭＩ１６４０培地（ロ）中で、または大気Ｃｏ２ 中で増殖のためにＲＰＭ１１６３０（・）　、Ｌ−１５（ＩＩ）またはＰＤＲＧ 基礎増殖培地（ム）中で週毎に継代培養した。

図３　Ａ、　−３Ｇは、大気ＣＯ！中におけろヒト腫瘍細胞系の比較増殖曲線を 示す。Ｒ，ＰＭ１１６４０培地（ロ）、Ｌ−１５培地（■）またはＰＤＲＧ基礎 増殖培地（ム）中の細胞系を、ｌ・リブシン処理し、２５ｃｍ”フラスコ中へ接 種し、２４時間間隔で計数する。

図４Ａと４Ｂは、大気ＣＯ２中のＰＤＲＧ基礎増殖培地（ロ）中のまたは５％Ｃ ｏｔ中のＲ，ＰＭ１１６４０培地（■）中のＰ２Ｓ５およびＬ１２１０ネズミリ ンパ球白血病の増殖を示している。

図５Ａ−５Ｅは、大気ＣＯ０中のＰＤＲＧ基礎増殖培地（ロ）中の、４種のヒト 繊維芽細胞系（ＭＲＣ−５、ＣＣＤ−１９ＬＵ、ＭＡＲＢＥＬおよびＩＭＲ−９ ０）と一種のネズミ繊維芽細胞（３Ｔ３）　、宏たは５％二酸化炭素中の、ＲＰ ＭＩ　１６４０　（ＩＩ）培地中（ヒト繊維芽細胞）またはズルベコ′ス変形イ ーグル培地（ＤＭＥＭ）（８Ｔ３ネズミ繊維芽細胞）のいずれかにおける細胞の 増殖を示している。

ｅｉＨ６Ａと６Ｂはオキサロ酢酸（ｏｘａｌｏａｅｅＨｅ　ａｃｉｄ）による大 気ＣＯ２における大気Ｃ○、における細胞増殖の刺戟を示している。

ＰＤＲＧ基礎増殖培地に細胞系は、オキサロ酢酸の示した濃度に暴露された。細 胞をトリプシン処理し、５日後に計数した。

図７Ａと７Ｂは大気ＣＯ２における白血病細胞の増殖のためのＰＤＲＧ基礎増殖 培地の最適化を示している。

上部パネル：ＲＰＭＩＬ６４０増殖培地中のに５６２慢性骨髄性白血病細胞はＲ ＰＭ１１６４０培地（ロ）、ＰＤＲＧ基礎増殖培地（ム）中でまたはアデノシン （１０（ｍｇ／Ｌ単位で添加、以下同じ））、シチジン（１０）、グアノシン（ １０）、ウリジン（１０）　、イノシン（２５）、およびオロチン酸（１５）を 補給したＰＤＲＧ基礎増殖培地中で週毎に継代培養した。

下部パネル：細胞を各々の培地中で３回継代培養した後採取し、同じ培地中に示 した濃度で接種し、そして日毎に細胞数を計数した。

本発明の上述のいろいろな目的と利点は、大気Ｃ０２中で細胞の増殖または保存 のための基礎培地の調製により実施され、この培地は表２に掲示した成分から実 質的になる。

本発明の基礎培地は、ここではＰＤＲ’Ｇ基礎増殖培地と命名される。

他に定義されることがなければ、ここで使用される全ての技術的または科学的術 語は、本発明の当業者に通常理解されるのと同じ意味を持つ。ここで記述された 方法または材料と同じまたは同等の如何なるものは本発明の実施と試験に使用で きるが、好ましい方法と材料は今述べる。下記する全ての刊行物は参照によりこ こに包含される。

ここで使用されまたは予想される技術は、他に説明のないＦ！Ｌりこの技術の由 業者にはよく知られている標準の方法である。材料、方法および実施例は説明だ けのためであって、限定を意図していない。

ここで使用される術語「大気ＣＯ１」は、通常の温度と圧における大気中に自然 に存在するＣＯ１含有量を意味する。

ここで使用される術語ｒｃＯ２−非依存性」とは、外来性の、１！ＩＫＢされた 豊富化したＣＯ□が要求されないことを意味する。

ここで使用される術語「細胞」とは、Ｃ○、−非依存性の雰囲気中のｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ系で生長し、保存されまたは増殖することを要求されるヒトまたは非ヒト の、腫瘍または非厘瘍の細胞を意味する。

材料と方法 別に示さない限りは、全ての材料は市販品であった。

ＲＰＭ１１６４０．ＲＰＭ１１６３０、Ｌ−１５およびＰＤＲＧ基礎増殖培地の 緩衝能の比較 １５ｍ１の血清のない培地をｌＮＨＣｌでｐｌ（６，０まで中和した。水酸化す Ｉ・リウム（ＩＮ）を１５μｍの液滴で添加し激しく渦巻いた後ｐＨを決める。

大気ＣＯｔにおける増殖に対する細胞系の適合細胞系（表１）は、腫瘍貯蔵所か ら得た（フレデリック、メリーランド州）、ヒＩ・腫瘍細胞系を５％のウシ胎児 の血清（ハイクローン　ラボラドリース、ローガン、ユタ州）を含有するＲＰＭ １１６４０培地（クォリティバイオロジカル、ゲイテルスブルグ、メリーランド 州）中でルーチン的に増殖した。培養物を湿度９５％、二酸化炭素５％の湿潤雰 囲気中の７５ｃｍ’コスターニスフラスコ中に保持し、８５−９０９６の集密度 で継代培養した。細胞をトリプシン処理により取り出し、下記の手順に従って継 代培養した：培地を傾斜ｊノ、細胞を２ｍｌの０．１％のＥＤＴＡ　（クォリテ ィ　バイオロジカル、ゲイテルスブルグ、メリーランド州）を含有する０、０５ ％トリプシンで一回濯いだ。次いで細胞を１．５ｍｌのトリプシン溶液〔この溶 液はＣａ　”／　Ｍ　ｇ　”の無いリン酸塩緩衝食塩水中の１ｍｌの１％トリプ シン溶液（シグマ型■、２回再結晶）を５０ｍ１の０．０５％トリプシン（０， ０５％のＥＤＴ八を含有する。）に添加することにより製造した。〕で２２５５ 分間った。

膿瘍細胞を、７５　ｃｍ’コスタ−（Ｃａｓｔａｒ）培養フラスコ中で、ｌＸ１ ０’の濃度で、３０ｍ１のＲＰＭ１１６４０、ＲＰＭ１１８３０（クォリティ　 バイオロジカル、ゲイテルスブルグ、メリーランド州）、Ｌ−１５（クォリティ 　バイオロジカル、ゲイテルスブルグ、メリーランド州）または５％のウシ胎児 の血清を含有するＰＤＲＧ基礎増殖培地中で培養した。細胞を湿潤雰囲気中８７ ℃で、５％Ｃｏ２　（ＲＰＭ１１６４０）または大気ＣＯｘ　（ＲＰＭＩ　１６ ３０、Ｌ−１５とＰＤＲＧ基礎増殖培地）中保持した。細胞をトリプシン処理し 、各々の培地中で週毎に４週間にわたり継代培養した。

全ての細胞計数は、ＺＭ　クールタ型計数器（ＭｏｄｅｌＺＭ　Ｃｏｕｌｔｅｒ 　Ｃｏｕｎｔｅｒ）　（ハイアリ−、フロリダ州）で行った。

４種のヒト繊維芽細胞系（ＭＲＣ−５，ＣＣＤ１９−ＬＵ、Ｍａｒ　Ｂｅｌおよ びＩＭＲ−９０）と一種の繊維芽細胞（３Ｔ３）は、１０％のウシ胎児血清（ｆ ｅｔａｌｃａｌｆ　５ｅｒｕｔｎ：ＦＣ３＞を含有するＰＤＲＧ基礎増殖培地中 での大気Ｃ０２中の増殖に適合させた。１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭ１ １６４０培地中での５％ＣＯＺ中のそして大気ＣＯ２中でのＰＤＲＧ基礎増殖培 地中の各々の細胞の増殖曲線は、下記した通りに作製した。Ｌ１２１０、！：Ｐ ３８８のネズミのリンパ球白血病は同様に１０％のウシ胎児血清を含有するＰＤ ＲＧ基礎増殖培地中の増殖に適合させた。

大気Ｃ０２中における細胞系の増殖曲線６週間にわたる各々の培地中の通常人気 Ｃ０２中の増殖に対する細胞の適合化の後、Ｌ−１５とＰＤＲＧ基礎増殖培地中 の細胞系の増殖曲線を作製した。細胞を上述のようにトリプシン処理し、７ｍｌ の培地を含有する２５ｃｍ”のコスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）組織培養フラスコに７ ×１０′細胞／　ｃ　ｍ　”の密度で接種した。細胞を２４時間の間隔でトリプ シン処理し、上述のようにして計数した。

オキサロ酢酸による大気ＣＯ８中における細胞増殖の促進 細胞系の増殖に対するオキサロ酢酸の影響は下記の方法で検討した。この実験に 利用した細胞はＰＤＲＧ基礎増殖培地中での大気ＣＯ１における増殖に適合させ た。

細胞をトリプシン処理し、７ｍｌのＰＤＲＧ基礎増殖培地を含有する２　５　ｃ ｍ”のコスタ−フラスコ中に１゜４Ｘ１０’細胞／　ｃ　ｍ　”の密度で接種し た。２４時間後に、オキサロ酢酸を最終濃度が０．１ｍＭないし６．　ＯｍＭに なるようにして添加した。オキサロ酢酸（シグマケミカル社、セントルイス、ミ ズーリ州）は蒸留水の２００ｍＭ貯蔵液として調製し、ｐＨを６．５にＮａＯＨ で調整し、得られた貯蔵液を一８０℃で使用時まで貯蔵した。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏの医薬品の影響の量表現のための大気ＣＯ２中における微培養 テトラゾリウムおよびスルホローダニンＢ　（ＳＲＢ）検定 試験は、５％ＣＯ８内の医薬品に暴露した環境で増殖する細胞を使用して選別し た医薬品の用量−反応曲線が得られるかどうかそして大気Ｃ０ｆｆ１中での各々 の医薬品に対して暴露した環境で増殖する細胞を″使用して選別した医薬品の用 量−反応曲線と比較できるかどうかを決定するために行った。アドリアマイシン 、ＢＣＮＵおよびタモキシフェンは、フレデリック　カンサー　リサーチファシ リティ、国立ガン研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ 、　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）の医薬品合成実験 室から入手した。用量−反応曲線は、５％ＣＯを下のＲＰＭ１１６４０培地中で および大気ＣＯ２下でのＰＤＲＧ基礎増殖培地中で保存した細胞で実施した。

３日間にわたる医薬品暴露の後、医薬品の影響を、ＭＴＴテトラゾリウム検定（ アレイ他、１９８８、Ｃａｎｃｅｒ訃リエ、　４す：５８９−６０１）とＳＲＢ タンパク質検定（スケハン他、１９８９、Ｐｒｏｃ、　Ａｍｅｒ、　Ａｓ５ｏｃ 、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、３０：６１２）の両方により量（的に）表現した。

簡単に説明する：冷−５０％トリクロロ酢酸を最終濃度が１０％になるようにし て静かに増殖培地の表面上に層状に被せた。

そして細胞を４℃で６０分間にわたり固定し、固定した細胞を水道水で５回洗浄 し、０．１％酢酸中の０．４％ＳＢＲ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズ ーリ州）で１５分間にわたり染色する。結合しなかった染料を１％酢酸で５回濯 いで除き、そして染色した細胞を乾燥した。結合した染料を１０ｍＭ−非緩衝の Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ１０ないし１０．５）で抽出し、吸光度を５６４ｎＭで測定 した。

結果 培地の調製二大気ＣＯ８中における細胞増殖のための第１次緩衝剤の選択と最適 化 大気ＣＯ３におけるＰＤＲＧ基礎増殖培地（表２）の調製を試験するためにＨＴ ２９結腸腺癌を細胞系の代表として利用した。本製剤は、下記の若干数のし一ア ミノ酸の高濃度を包含している：アルギニン、システィン、ヒスチジン、リジン およびチロシン。これらのアミノ酸の高濃度の利用の他に、ＰＤＲＧ基礎増殖培 地は２０ｍＭのβ−グリセロホスペードの添加により緩衝されている。ＰＤＲＧ 基礎増殖培地はビオチン、重炭酸イオンの低側Ｌピルビン酸、アスパラギンとオ キサロ酢酸の培地中への添加により、大気ＣＯを中での細胞の増殖のために最適 化されている。

脂肪酸合成を包含する若干の生化学的過程のための重炭酸イオンの要求は、血清 により供給される濃度より多い濃度（７５ｍｇ／Ｌ）でＰＤＲＧ基礎増殖培地の 製剤中に包含されていることを必要とした。これが、安定なｐＨを維持するため に外来のＣＯ８緩衝を要求しない培地に添加することのできる重炭酸イオンの最 大の濃度であった。

ＲＰＭ１１６４０．、ＲＰＭ１１６３０、Ｌ−１５およびＰＤＲＧ基礎増殖培地 の比較緩衝能 各々の培養培地の蒙性化した液滴（ｐＨ６，０）の塩基滴定は、相対的緩衝能の 測定を提供する（図１）。この点に関しては、Ｐ、ＩＪＲＧ基礎増殖培地は重炭 酸塩に基づいた培養培地＋ＲＰＭ１１６４０に同一であり、そのアルカリ化に対 する抵抗性はＲＰＭ１１６３０またはＬ−１５のいずれよりも実質的により大き かった。ＲＰＭ１１６８０とＩ、−１５の塩基滴定は、培地のｐＨを６゜０から ７，５に増やすのに要求される［○Ｈ−］の当量は、ＰＤＲＧ基礎増殖培地で観 察されたのよりは各々が１．６倍と３．７倍少なかったことを示した。

大気ＣＯ２中における増殖に対するヒト腫瘍細胞系の適合 大気ＣＯを中で、病型の広範囲を代表するヒト腫瘍細胞系を増殖する容易さを検 査するために設定された試験の結果を図２に示した。最初の実験は、ＨＴ２９結 腸腺癌について行われた。大気ＣＯ２中でのＲＰＭｌ　１６３０、Ｌ−１５とＰ ＤＲＧ基礎増殖培地における増殖のプロファイルを、５％ＣＯｚ中でのＲＰＭ１ １６４０培地中で増殖した細胞で得られたそれらと比較した。これらの結果は、 ＨＴ２９の５％ＣＯ２環境からの取り出しとそれに続く大気ＣＯ２中でのＰＤＲ Ｇ基礎増殖培地中の増殖は、当初は細胞増殖を５Ｄ％減らすことを随伴している 、：とを示した。これは、Ｌ−１５とＲＰＭ１１６３０培地において培養したＨ Ｔ２９細胞の増殖において、各々、８．７倍と１２５倍減少したのと対照的であ った。

安定な増殖は、大気Ｃ０ｗ中でのＰＤＲＧ培地でのおよび５％ＣＯ，中ｆ７）Ｒ ＰＭＩ　１６４０ｊＩ地テ（７）ＨＴ−２９細胞では、各々の培地中で３−４回 の継代培養に続いて得られ、はぼ可等の増殖を与えている。

”他のパネルの細胞系を使用する同様の適合実験の結果（図２）は、下記の事実 を示している：（ａ）ＲＰＭＩ　１６３０培地は大気ＣＯ，におけるこれらの細 胞系の増殖のために不満足であることを示している； （ｂ）５％ＣＯ３中での増殖細胞の密度は、大気ｃｏ。

中での増殖細胞のための得られたそれより高い；そして（ｃ）Ｋ５６２骨髄性白 血病、ＨＴ２９結腸腺癌および５Ｎ１２に１腎臓癌の増殖のためには、ＰＤＲＧ 基礎増殖培地がＬ−１５培地より優れている；ＨＯＰ６２肺腺癌、ＸＦ２９８グ リア芽腫およびＭ１９Ｍｅ　１．黒色腫のためにはＰＤＲＧ基礎増殖培地とＬ・ −１５培地では細胞密度は同等であうた。

Ｌ−１５培地は、０ＶＣＡＲ−５、卵巣癌細胞系だけのためにＰＤＲＧ基礎増殖 培地に対して優れていたことが判明した。

大気ＣＯ２中の細胞系の増殖曲線 大気ＣＯ２におけるＰＤＲＧ基礎増殖培地、！：Ｌ−１５培地におけるおよび５ ％ＣＯ１におけるＲＰＭ１１６４０培地における選別したヒト腫瘍細胞系の増殖 曲線を図３に示す。各々の培地におけるぐ表３）における各々の細胞系のための ２倍になる時間の計算の結果は、ＨＯＰ６２１ｎｌ［、ＳＮ　１２　Ｋ　ＩＷＩ Ｅ癌、！：ＸＦ　４９８　クリアＷ腫のための２倍になる時間は、大気ｃｏ、に おけるＰＤＲＧ基礎増殖培地中のそれが、５％ＣＯ２下’ＯＲＰＭ１１６４０培 地中のそれより僅かに長いことを示している。

最も大きい撃離の２．７倍の増加は、０ＶＣＡＲ−５卵巣癌のためのであること が判明した。これと対照的に、Ｍｌ　９Ｍｅ　１黒色腫とＨＴ２９結腸腺癌のた めの２倍になる時間は５％ＣＯ６におけるより大気ｃｏ、における方が短かい。

５％ＣＯ３と大気ＣＯ２におけるＰＤＲＧ基礎増殖培地中のＰ２Ｓ５とＬ１２１ ０ネズミリンパ球白血病のための増殖曲線を図４に示す。５％ＣＯ１と大気ＣＯ ２におけるＰＤＲＧ基礎増殖培地中の４種の１＝トのそして１種のネズミの繊維 芽細胞のための増殖曲線は、殆ど同じである（図５）。

オキサロ酢酸による大気Ｃ０２中でのヒト腫瘍細胞系の増殖促進 オキサロ酢１１１　（＋−リカルボン酸回路の中間体）を重傷細胞系の各々の増 殖刺戟のために評価しまた（図６）。

ＰＤＲＧ基礎増＊＊地へのオキサロ酢着の添加は、最大で、ＨＯＰ　６２肺腺癌 では２５％、ＨＴ２９結腸腺癌では１３％、Ｓｎ　１２に１腎臓癌では２８％そ してＭｌ９　Ｍ　ｅ　１黒色騰では３８％の細胞増殖の増加をもたらした。

これらの細胞系のためのオキサロ酢酸による増殖刺戟は、０．５ないし６．０ｍ Ｍの濃度範囲にわたって起こった。ＸＦ４９８グリア芽腫、０ＶＣＡＲ５卵巣癌 およびに５６２骨髄性白血病はオキサロ酢酸による増殖刺戟に対しては無反応性 であった。

大気ＣＯ２における白血病細胞の増殖のためのＰＤＲＧ基礎増殖培地の最適化 中枢神経系の、結腸の、腎臓の、肺臓の、黒色腫のそして卵薬の組織を代表する 鳳瘍細胞系のＰＤＲＧ基礎増殖培地中での大気ＣＯ１での増殖への適合化は、概 ね２−３回の継代培養で完結した（図２）。これは、Ｋ５６２慢性骨髄性白血病 から得られた結果とは対照的であった。ＲＰ１１１８４０からに５６２を取り出 しそして大気ＣＯ１中のＰＤＲＧ基礎増殖培地中で増殖すると、概ね安定な増殖 をする５−８回の継代培養の後の３回の継代培養にわたる増殖において進行的減 少が伴った（図２）。

しかし、ＰＤＲＧ基礎増殖培地におけるに５６２の増殖は、Ｌ−１５またはＲＰ Ｍ１１６３０中ののそれよりも多いが、それはＲＰＭ１１６４０と５％ＣＯ１中 のそれよりは実質的に少なかりた（図３）。

これらの観察は、プリンとピリミジンの生合成における利用のためのＣＯ２の代 謝的生成が制限されているかも知れないことを示唆し、それらの補給のに５６２ の増殖に与える影響を詳細に検討するべく動機付けた。

プリンとピリミジン塩基またはそれらのリボ／デオキシリボヌクレオチドを使用 するＰＤＲＣ；基礎増殖培地の補給は、僅かな増殖刺戟をもたらした（データを 示さなかった。） しかし、プリンヌクレオシドのアデノシン、グアノシンおよびイノシン；ピリミ ジンヌクレオシドのシチジンとウリジン；およびピリミジン前駆体のオロチン酸 （表２）を使用するＰＤＲＧ基礎増殖培地の補給は、大気ＣＯ２における増殖へ のに５６２の適合の長々しい時間の排除と大気ＣＯ１におけるこの細胞系の増殖 の顕著な刺戟をもたらした（図７）。

大気ＣＯ１中でのこの変形したＰＤＲＧ基礎増殖培地中のそしてＲＰＭ１１６４ ０と５％ＣＯ６中のに５６２の増殖は比較できるものであった。両方の培地にお けるに５６２０２倍になる時間（Ｔｄ）の検討は、接種の後１−３日間は同様の ２倍になる時間を示している。

しかし、４−８日間にわたっては、変形したＰＤＲＧ基礎増殖培地中で増殖する 細胞は、ＲＰＭ１１６４０中で増殖する細胞より実質的に短い２倍になる時間（ ＴｃｉＳ）を持っていたく表４）。

両方の培地で増殖するに５６２細胞の特定の増殖速度を比較すると同様のパター ンが現れていた（表４）。

それに加えて、変形したＰＤＲＧ基礎増殖培地中で増殖するに５６２細胞の飽和 密度は、ＲＰＭＩ　１６４０テ得られたそれより５０％大きかった（図７）。

大気ＣＯｔにおける選択医薬品のＩＣ，。値大気ＣＯ１と５％ＣＯ１におけるア ドリアマイシン、ＢＣＮＵおよびタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）のＩＣ ｓ。値は表５に示した。同様の値を両方の条件下で得た。しかし、概して、細胞 はこれらの医薬品に対して、ＭＴＴテトラゾリウム検定を細胞の生育力を評価す るために利用した場合の方が、ＳＲＢタンパク質検定を利用した場合に比較して 、より高い感受性を示した。

この増強された感受性は、より低いＩＣｓ。値によって表されそして大気ｃｏ、 中と５％ｃＯ１中の両方で起きた。

要約すると、ここに示したデータは、第１次緩衝剤（ムーア他、１９６６、ＪＮ Ｃｌ、３６：４０５−４２１）として２塩基性のリン酸ナトリウムを使用するＲ ＰＭ１１６３０は満足できるものではなかったことを明瞭に示している（図２） 。

ライボヴイッツにより開発された、大気ＣＯ１における細胞の増殖用のＬ−１５ （ライボヴイッッ、１９６３、Ａｒｎｅｒ、　Ｊ、　ＨＹ　、　、　７８：１７ ２−１８０）は、現在の研究ではＲＰＭ１１６３０より優れているが（図２）、 テトラゾリウム塩を使用して細胞の生育力を測定する代謝検定における利用のた めには満足できないことが見出された。

ＰＤＲＧ基礎増殖培地を使用して得られた結果は、ネズミと異種の組織を代表す る広範囲のヒト腫瘍細胞系並びに若干数のヒトとネズミの繊維芽細胞は、ＰＤＲ Ｇ基礎増殖培地中での大気Ｃ０２中の増殖にうまく適合させることができること を示している（表２）。

この培地は、重炭酸イオンが第１次の緩衝成分として除去されるので外来のＣＯ ｌを必要とし′ない。

プリン、ピリミジンおよび脂肪酸生合成を含むいろいろの生化学的工程のために ＣＯ２の要求は、ＣＯｚの代謝的生産と利用を容易にするために設定して下記の 若干数の成分のＰＤＲＧ基礎増殖培地へ入れるようにしである＝（１）ビオチン （カルボキシル化反応の補因子）（２）ピルビン酸（脱炭酸を介して並びにトリ カルボン酸回路によるＣ　Ｏを生産の代謝的刺戟のためのアセチルＣｏＡ源を提 供することにより、ＣＯ２の代謝源として機能するモノカルボン酸）および（３ ）Ｌ−アスパラギン（細胞質ゾル酵素のし一アスパラギン＝アミドヒドロラーゼ （Ｅ、Ｃ，３，５，１，１，）とミトコンドリア酵素のし一アスパルテート＝２ −オキソグルタレート；アミノトランスフェラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，６，１，１， ）の、各々により、アスパラギン酸とオキサロ酢酸へ変換できるＣ４アミノ酸） 。更に、トリカルボン酸回路の中間体であるオキサロ酢酸を、ＣＯｔの部分的置 換物として試験した。

現在迄の検討では、オキサロ酢酸は若干数の細胞系の細胞増殖を増やすことが見 出されているが（図６）、それが０ＶＣＡＲ５卵巣癌、ＸＦ４９８グリア芽腫お よびに５６２骨髄性白血病における細胞増殖を著しく抑制するのでＰＤＲＧ基礎 増殖培地処方には含有されていない。

更に、オキサロ酢酸は増殖培地のアルカリ化を招く自動分解をする。

これらの結果は、各々の細胞系で増殖促進について評価されるべきであり、増殖 の促進が観察された場合にはこれらの細胞系を利用する実験的プロトコール中に 添加せしめるべきであることを示唆している。

更に、プリンヌクレオシド（アデノシン、グアノシンおよびイノシン）、ピリミ ジンヌクレオシド（シチジンとウリジン）とピリミジンの前駆体であるオロチン 酸の添加は、大気ＣＯ２中の増殖に対するに５６２慢性骨髄性白血病の適合期間 を削除し、そしてＲＰＭ１１６４０かつ５％Ｃ○、および変形ＰＤＲＧ基礎増殖 培地と大気ＣＯ□中の殆ど同じ増殖をもたらす（図７と表４）。

ＰＤＲＧ基礎増殖培地（図２．３．７）におけるに５６２の減少する増殖とこの 増殖差異を削除するためのプリンとピリミジンヌクレオシドの能力は、核酸前駆 体中への取込みのためのＣＯｔの代謝的生産はこの細胞系では限定的であろうこ とを示唆している。

ＰＤＲＧ基礎増殖培地は、ハイーフラッス（ｈｆｇｈ　ｆｌｕｘ）医薬品スクリ ーニング法に使用するのに幾つかの望ましい特性を発揮する。第１に、その培地 は、大気ＣＯｔにおける優れたｐＨ安定性と緩衝能を持っている。これは細胞が 検定プレート中に接種されている場合における並びに医薬品処理の間における培 地のｐ　Ｉ−１における変化を防止する。第２に、広範囲のヒト腫瘍細胞系の大 量増殖のための能力を発揮する。第３に、Ｄ−グルコースはその培地処方では主 要な炭水化物であるので、細胞生育力の測定のためのテトラゾリウムまたはタン パク質のどちらにも基づいた検定の使用には適合する。最後に、アドリアマイシ ン、ＢＣＮＵとタモキシフェンのためのＩＣ１ａ値は、大気ＣＯ２中でのＰＤＲ Ｇ基礎増殖培地中でとＲＰＭ１１６４０と５％ＣＯ２中でとで保持した細胞系で は同様であった。

勿論、当技術でよく知られているように、培地のｐＨを制御するためのＣＯ２の 使用が厄介であり、経費がかかり、非実用的でありまたは望ましくない場合にお いて一本発明の細胞培養培地は中空繊維と一緒にして使用し、そして、細胞の大 量製造のための技術と成長因子、ホルモン、抗生物質、生理的応答の調節剤等々 の製品と一緒にして使用できる。

本発明の増殖培地は、一般のまたは特定の細胞培養の両方に利用できる。

ここに記述された実施例と実施態様は説明の目的だけのものであり、その発明に 照らし合わせてのいろいろの応用と変化はこの技術の尚業者に示唆されるもので ありそしてこの出願の精神と範囲および添付した請求項の範囲内に包含されるべ きものと理解される。

表１．大気ＣＯ１における増殖のために利用した細胞系細胞系　組織 Ｘ　Ｆ　４９８　＋ニド中枢神経系（グリア芽ＩＩ）Ｍ１９ＭＥＬ　ヒト黒色腫 瘍 ０ＶＣＡＲ５ヒト卵巣腺癌 Ａ２７８０　ヒト卵巣腺癌 ＨＯＰ６２　ヒト卵巣腺癌 ５Ｎ１２ＫＩＸＪ　ヒト腎臓細膓癌 ＨＴ２９　ヒト結腸腺癌 に５６２　ヒト慢性骨髄性白血病 Ｐ３８８　ネズミリンパ球白血病 Ｌ１２１０　ネズミリンパ球白血病 ＭＲＣ−５ヒト繊維芽細胞 Ｃ０Ｄ−１９ＬＵ　ヒト繊維芽細胞 ＭａｒＢｅｌ　ヒト繊維芽細胞 ＩＭＲ−９０ヒト繊維芽細胞 ３Ｔ３　ネズミ繊維芽細胞 Ｌ−アルギニン（遊離塩基）　２６５ Ｌ−アスパラギン　８８ Ｌ−アスパラギン酸　５ Ｌ−シスチン・２８Ｃ１２４ Ｌ−グルタミン酸　５ Ｌ−グルタミン　３４３ グリシン　７９ Ｌ−ヒスチジン（遊離塩基）　１４１ Ｌ−リジン（遊離塩基）８６ Ｌ−メチオニン　３７ Ｌ−フェニルアラニン　６Ｓ Ｌ−スレオニン　１３６ Ｌ−トリプトファン　１３ Ｌ−チロシン（遊離塩基）　１３７ Ｌ−バリン　６９ アミノ酸誘導体 プトレシン・２ＨＣ１０，０６ ビタミン：補酵素と脂質 ビオチン　０．１０ 葉酸　２．１０ ニコチンアミド　１．７０ Ｄ−パントテン酸カルシウム　１．７０塩化コリン　６゜３０ ピリドキシン・ＨＣＩ　Ｏ，４Ｑ ピリドキサール・ＨＣＩ　１．３０ リボフラビン　０．１５ リボフラビン−５′−ホスペード　０．０３サイアミン＝モノホスヘー）　０． ３０サイアミン・ＨＣＩ　１．５０ ビタミンＢ＋ｚ　Ｏ，５０ 主−イノシトール　９．１０ リボ酸　０．０７ リルイン醗　０．０３ 炭水化物とその誘導体 Ｄ−グルコース　１０００ ピルビン酸ナトリウム　２５７ グアノシン”　１０．０ ヒポキサンチン　１．４ イノシン”　２５．０ オロチン酸”　１５．０ チミジン　０．２４ ウリジン”　ｔｏ、。

無機物 ＮａＣ１７０００ ＫＣＩ　３４１ Ｎａ宜ＨＰＯ４（ＡＮＨＹ）　１１１ ＮａＨＩ　ＰＯ４（ＡＮＨＹ）　３６ Ｍｇ５Ｏ，（ＡＮＨＹ）　６６ Ｍ　ｇ　Ｃ１ｔ　・６Ｈ！０　１０７ ＫＨ２ＰＯ４２０ ＣａＣ１ｚ　−ｚＨｚ　Ｏ１６５ 無機微量元素 Ｃｕ５Ｏａ　”　５Ｈ２００，０００８Ｆｅ　（Ｎｏｗ　）　ｓ　・９Ｈ！　０ 　０．　０３ＦｅＳＯｉ　”７Ｈｔ　Ｏ０，２８ ＺｎＳＯｉ　−ｙＨｔ　ＯＯ，２９ 緩衝剤と指示薬 Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ　７５ β−グリセロホスヘー）　４３２０ フエノールレツド　５ Ｔｄ（時間） ＨＯＰ６２　２Ｂ、５　４１．　０ ８Ｎ１２に１　１　７．　８　２５．　０Ｍ１９Ｍ８Ｌ　５　３．　６　２２． 　４ＨＴ２９　８１．　７　２８．　７ ＸＦ４９８　４　１．　０　５０．　６０ＶＡＣＡＲ５２４，Ｏ６５，０ Ｋ５６２　１６．　５　８３．　３ Φ　の　ト　Ｑ　り 細胞数／　ｃ　ｍ　” 継代数 細胞数／　ｃ　ｍ、　” 継代数 細胞数／　ｃ　ｍ　’ 継代数 細胞数／　ｃ　ｍ　２ 継代数 細胞数／　ｃ　ｍ　２ 継代数 細胞数／　ｃ　ｍ　１１ ＦＩＧ、３Ａ　”′ｌ！に／　Ｃｍ　’ＦＩＧ、３Ｂ　細胞数／　ｃ　ｍ　” 日数 細胞数／　ｃ　ｍ　” 日数 細胞数／Ｃｍ２ ０数 細胞数／ｃｍ２ 日数 細胞数／　ｃ　ｍ冨 ＦＩＧ、３Ｇ 日数 ＦＩＧ、　５Ｅ μ） φＮ ０　。

ムー メ ９　海 ＼　姻　０ ？　￥　９ ｃ、ｊ２　＜Ｊ　≦ 一 ２　へ Σ　ＯＯＣ％Ｊ Ｏ−− ｃｅ　Ｚ　二 ｃ！：Ｉ　（Ｊ −ｏ　ｗ き　。

ｏＱ−乙　−含 二　〇 ト Σ ＼、 飯 響 ０次 （り 要約書 ｆｎ　ｖｉｔｒｏでの細胞の増殖または保持のための、外気中に見出される濃度 より多いＣＯ２を要求しない培養培地が記載されている。この培地はＬ−アルギ ニン、Ｌ−システィン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジンおよびＬ−チロシンの遊離 塩基型；ビオチン、脂肪酸；ピルベート；アスパラギン；低１ノベルの重炭酸ナ トリウムを含有しモしてβ−グリセロホスペードで緩衝されている。

抗腫瘍剤化合物を試験するために腫瘍細胞を培養するための培地の使用法も開示 されている。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年７月２２０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＣＯ２−非依存性の雰囲気中での細胞の保持、生育または増殖のための増殖 培地であって、下記の成分：アミノ酸　　　　　　　　　　　　　　ｍｇ／（脱 イオン水ｌ）Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　　約　　　　　７８Ｌ−アル ギニン（遊離塩基）　　　　　　　　　　２６５Ｌ−アスパラギン　　　　　　 　　　　　　　　　　８８Ｌ−アスパラギン酸　　　　　　　　　　　　　　　 　５Ｌ−システイン　　　　　　　　　　　　　　　　　５２（還元済；遊離塩 基） Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　２４Ｌ−グルタミン酸　　 　　　　　　　　　　　　　　　５Ｌ−グルタミン　　　　　　　　　　　　　 　　　３４３グリシン７９ Ｌ−ヒスチジン（遊離塩基）　　　　　　　　　　１４１Ｌ−イソロイシン　　 　　　　　　　　　　　　　　７８Ｌ−ロイシン　　　　　　　　　　　　　　 　　　　８１Ｌ−リジン（遊離塩基）　　　　　　　　　　　　　８６Ｌ−メチ オニン　　　　　　　　　　　　　　　　　３７Ｌ−フェニルアラニン　　　　 　　　　　　　　　　６５Ｌ−プロリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　 １２Ｌ−セリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８４Ｌ−スレオニン　 　　　　　　　　　　　　　　　１３６Ｌ−トリプトファン　　　　　　　　　 　　　　　　１３Ｌ−チロシン（遊離塩基）　　　　　　　　　　　１３７Ｌ− バリン６９ アミノ酸誘導体　　　　　　　　　　　　　ｍｇ／（ｌ）プトレシン・２ＨＣｌ 　　　　　　　　　　　約０．０６ビタミン：補酵素と脂質 ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　　約０．１０葉酸　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　２．１０ニコチンアミド　　　　　　　　　　　　　 　　１．７０Ｄ−パントテン酸カルシウム　　　　　　　　　１．７０塩化コリ ン　　　　　　　　　　　　　　　　　６．３０ピリドキシン・ＨＣｌ　　　　 　　　　　　　　０．４０ピリドキサール・ＨＣｌ　　　　　　　　　　　１． ３０リポフラビン　　　　　　　　　　　　　　　　０．１５リポフラビン−５ ′−ホスヘート　　　　　　　０．０３サイアミンｍｍモノホスヘート　　　　 　　　　　０．０３サイアミン・ＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　１．５０ビ タミンＢ１２　　　　　　　　　　　　　　　０．５０ｉ−イノシトール　　　 　　　　　　　　　　　９．１０リポ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　０．０７リノレイン酸　　　　　　　　　　　　　　　　０．０３炭水化物と その誘導体 Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　　　約１０００ビルビン酸ナトリウム 　　　　　　　　　　　　　２５７核酸誘導体 アデノシン＊　　　　　　　　　　　　　　　約１０．０シチジン＊　　　　　 　　　　　　　　　　　　１０．０グアノシン＊　　　　　　　　　　　　　　 　　１０．０ｍｇ／（ｌ） ヒポキサンチン　　　　　　　　　　　　　　　　１．４イノシン＊　　　　　 　　　　　　　　　　　約２５．０オロチン酸＊　　　　　　　　　　　　　　 　　１５．０チミジン　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２４ウリジン ＊　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０無機物 ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　約７０００ＫＣｌ　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　３４１Ｎａ２ＨＰＯ４（ＡＮＨＹ）　　　　　　　 　　　１１１ＮａＨ２ＰＯ４（ＡＮＨＹ）　　　　　　　　　　　３６ＭｇＳＯ ４（ＡＮＨＹ）　　　　　　　　　　　　　６６ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　 　　　　　　　　　１０７ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ２０ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　１６５無機徴量元素 ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　約０．０００８Ｆｅ（ＮＯ２）２・９ Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　０．０３ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　 　　０．２８ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　０．２９緩衝剤と 指示薬 ＮａＨＣＯ２　　　　　　　　　　　　　　　　　約７５β−グリセロホスヘー ト　　　　　　　　　　　４３２０フェノールレッド　　　　　　　　　　　　 　　　　　５＊白血病培養の増殖のためのＰＤＲＧ基礎増殖培地の追加の補給を 示す。 からなる培地。 ２．該培地の最終ｐｈが約７．３である請求項１記載の増殖培地。 ３．最終の浸透圧が約２９０−２９５ｍｏｓ／ｋｇである請求項１記載の増殖培 地。 ４．ＣＯ２−非依存性の雰囲気中で請求項１記載の増殖培地中で該細胞を増殖す ることからなる細胞増殖の方法。 ５．更に中空−繊維技術を使用することからなる請求項４記載の方法。 ６．抗癌剤のｉｎｖｉｔｒｏのスクリーニング法であって； 抗癌剤の非存在下および存在下で請求項１記載の増殖培地中でｉｎｖｉｔｒｏで 腫瘍細胞を増殖し、抗癌剤の非存在下での細胞の増殖に対する、抗癌剤の存在下 での細胞の増殖の減少が該剤の抗癌剤能力を示していることからなるスクリーニ ング法。