JP2006520598A - 腸上皮細胞単層のための促進された培養システム - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞培養基質の助けを借りない現在可能なものよりも遥かに短い時間で高度に分化した腸上皮細胞単層の発生を可能にする培地処方物に関する。本発明は、また、特殊培地(specialized medium)を調製するための方法に加えて、細胞を培養する方法にも関する。これは、腸管の研究においてこのような細胞系に頼る研究者にとって、とりわけ腸における薬物吸収のためのモデルとしてこれらの細胞系を使用する製薬産業にとって、有益である。
腸上皮は、腸から物質を吸収し且つそれらを最終的に血流に輸送する機能を有する形態学的に極性な(polarized)細胞の単層から構成される。腸の内側を覆う細胞を真似た、幾らかの上皮インビトロ細胞培養系が過去数十年間で確立されてきた。その細胞系の幾つかが、Caco−2、HT−29、SW 1116、T84、IEC−18、及びIEC−6である。Caco−2及びHT−29腸細胞系は、最も広く使用され且つ最もよく特徴付けられた系である。研究されてきた他の実験モデルとしては、これらの系の種々のクローンが含まれる(例えば、Caco−2/TC−7(Caro et al., Int. J. Pharm., 1995, 116)、Caco−2BBe(Peterson and Mooseker, J. Cell Sci., 1992 102 (3))、HT29−MTX (Pontier et al., J. Pharm.Sci.,2001, 90(10))、共培養系(例えば、Caco−2/HT29−MTX(Walter et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85 (10))、及び、初代細胞培養(Fukamachi, J. Cell Sci., 1992, 103))。
伝統的な21日培養と比べて約4日以内に高度に分化されたCaco−2細胞単層の発生を可能にする新規な培地処方物を用いて、促進されたCaco−2モデルが開発された。本発明の培地処方物は、共に用いられたときに驚くべきことに分化を誘導する環境をもたらす特定のサプリメント(supplements)を含有する。細胞培養培地に添加されるサプリメントは、ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、トランスフェリン(好ましくはヒト)、インシュリン(好ましくはウシ)、上皮増殖因子(好ましくはヒト又はマウス)、酪酸ナトリウム又は酪酸、及び、ホルモンであるヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンである。
本発明の目的は、ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、ヒト上皮増殖因子、酪酸又はその塩、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンを補充した細胞培養増殖培地を含有する、腸上皮細胞系を培養するための組成物を提供することである。
第1表:促進されたCaco−2系の検証に使用されたモデル化合物の透過性
第2表
Claims (21)
- ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、ヒト上皮増殖因子、酪酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンを補充した、細胞培養増殖培地を含有する、腸上皮細胞系を培養するための組成物。
- 細胞増殖培地が、約1%の非必須アミノ酸を補充したDMEM/F−12培地である、請求項1に記載の組成物。
- ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン及びEGFの各々の濃度が、約0.01〜約200μg/mlである、請求項1に記載の組成物。
- ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンの各々の濃度が、約0.01〜約10μMである、請求項1に記載の組成物。
- 酪酸ナトリウムの濃度が、約0.05〜5mMである、請求項1に記載の組成物。
- 細胞培養培地が、約5〜約20%のウシ胎児血清で補充されている、請求項1に記載の組成物。
- 約10%のウシ胎児血清、約2μMのL−グルタミン、約1%の非必須アミノ酸、約100μg/mLのヒトトランスフェリン、約30μg/mlのウシインシュリン、約50ng/mLのヒト上皮増殖因子、約2mMの酪酸ナトリウム、並びに、約5μMのヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンの各々を補充した、DMEM/F−12培地を含有する、請求項1に記載の組成物。
- ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、ヒト上皮増殖因子、酪酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンを補充した細胞培養増殖培地を含有する組成物中で、細胞を再懸濁すること;乾燥細胞培養インサート上へ細胞を播種すること;及び、細胞を37℃にて5%CO2中でインキュベートすること、を包含するインビトロで腸細胞系を培養するための方法。
- 細胞がコンフルエントであり且つ約4日で分化される、請求項8に記載の方法。
- 細胞増殖培地が、約1%の非必須アミノ酸を補充したDMEM/F−12培地である、請求項8に記載の方法。
- ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン及びEGFの各々の濃度が、約0.01〜約200μg/mlである、請求項8に記載の方法。
- ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンの各々の濃度が、約0.01〜約10μMである、請求項8に記載の方法。
- 酪酸ナトリウムの濃度が、約0.05〜5mMである、請求項8に記載の方法。
- 細胞培養培地が、約5〜約20%のウシ胎児血清を補充されている、請求項8に記載の方法。
- 腸細胞系がCaco−2細胞系である、請求項8に記載の方法。
- ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、ヒト上皮増殖因子、酪酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンを補充した細胞培養増殖培地を滅菌条件下で混合することを包含する、細胞培養培地の組成物を調製するための方法。
- 細胞増殖培地が、約1%の非必須アミノ酸を補充したDMEM/F−12培地である、請求項16に記載の方法。
- ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン及びEGFの各々の濃度が、約0.01〜約200μg/mlである、請求項16に記載の方法。
- ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンの各々の濃度が、約0.01〜約10μMである、請求項16に記載の方法。
- 酪酸ナトリウムの濃度が、約0.05〜5mMである、請求項16に記載の方法。
- 細胞培養培地が、約5〜約20%のウシ胎児血清を補充されている、請求項16に記載の方法。
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