TWI620818B - 用於ｈＵＴＣ生長之營養滋養培養基 - Google Patents

用於ｈＵＴＣ生長之營養滋養培養基 Download PDF

Info

Publication number
TWI620818B
TWI620818B TW102146011A TW102146011A TWI620818B TW I620818 B TWI620818 B TW I620818B TW 102146011 A TW102146011 A TW 102146011A TW 102146011 A TW102146011 A TW 102146011A TW I620818 B TWI620818 B TW I620818B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
medium
culture
cell
serum
Prior art date
Application number
TW102146011A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201439321A (zh
Inventor
雷溫德 巴迪亞
麗珊 洪
沙德汀 歐茲特克
文凱特 卡瑪拉朱
Original Assignee
德派信迪思公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 德派信迪思公司 filed Critical 德派信迪思公司
Publication of TW201439321A publication Critical patent/TW201439321A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI620818B publication Critical patent/TWI620818B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本發明提供使固著依賴性細胞(例如hUTC)在培養基中生長之方法，培養基包含胺基酸、維生素、鹽類、核苷、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺與硒化鈉，其中該培養基係用血清來補充。該方法進一步包含加入一無血清營養溶液，該溶液包含胺基酸、維生素、鹽類、核苷、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺與硒化鈉。本發明亦提供用於生長固著依賴性細胞之培養基與無血清營養溶液。

Description

用於hUTC生長之營養滋養培養基
本申請案係關於用於固著依賴性細胞(anchorage-dependent cell)之營養滋養培養基，例如臍帶組織衍生細胞。
針對同種異體細胞(Allogeneic cell)療法產品，細胞或組織係得自捐贈者，並且在施用至患者前會進一步經過調控。一般而言，用於非同源細胞療法產品的製程會包括下列步驟：解凍一細胞銀行小瓶然後擴增細胞以接種一製造容器；在一製造容器中製造細胞；移除在細胞製造期間所用之不欲雜質如血清與胰蛋白酶；濃縮細胞；將細胞配製至最終配方緩衝液中；以及冷凍細胞。此類製程可能相當複雜而且昂貴。例如，用於細胞療法應用之細胞通常會在用血清補充之生長培養基中培養與擴增。由於血清、培養基與其他製程中所用之消耗品的費用高昂，細胞療法之製造成本可能會非常昂貴。多種因素可能會限制細胞生長至高細胞密度，包括營養限制、細胞副產物累積在培養基中、物理環境等。因此，理想者為透過使細胞生長至高細胞密度來增加產自一製造容器之體積細胞數。
早先已顯示固著依賴性細胞(例如人類臍帶組織衍生細胞(human umbilical cord tissue derived-cell,hUTC))，可透過在試驗的第3日更換含15%胎牛血清(FBS)之細胞生長培養基而生長至高細胞密度。然而，由於高血清成本、製造之高血清使用率與額外之操作調節，此一培養基更換係較不理想者。因此，使用培養基更換的製程商業上不可行。
所需者為一種商業上可行之新方法，其無需更換細胞生長培養基即可生長細胞。
本發明的一個實施例為一種用於生長固著依賴性細胞之培養基，其包含：(1)下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸、與L-牛磺酸；(2)下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；(3)下列鹽：氯化鈣、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉與一或多種磷酸鈉鹽；(4)下列核苷：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；(5)胰島素；(6)轉鐵蛋白；(7)類脂酸/硫辛酸；(8)乙醇胺；(9)亞硒酸鈉；以及(10)一或多種能量來源。
在一個實施例中，該培養基包含：至少約0.05g/L的L-精胺酸；至少約0.02g/L的L-胱胺酸；至少約0.2g/L的L-麩醯胺酸；至少約0.01g/L甘胺酸；至少約0.02g/L的L-組胺酸；至少約0.09g/L的L-異白胺酸；至少約0.09g/L的L-白胺酸；至少約0.09g/L的L-離胺酸；至少約0.02g/L的L-甲硫胺酸；至少約0.05g/L的L-苯丙胺酸；至少約0.03g/L的L-絲胺酸；至少約0.08g/L的L-蘇胺酸；至少約0.009g/L的L-色胺酸；至少約0.08g/L的L-酪胺酸；至少約0.08g/L的L-纈胺酸；至少約0.005g/L L-半胱胺酸；至少約0.0004g/L的L-丙胺酸；至少約0.01g/L的L-天冬醯胺酸；至少約0.006g/L的L-天冬胺酸；至少0.03g/L的L-麩胺酸；至少約0.005g/L的L-脯胺酸；與至少約0.0003g/L的L-牛磺酸；約5×10-6g/L至約0.015g/L的各維生素；至少約0.05g/L的無水氯化鈣、至少約0.1g/L的氯化鉀；至少約0.2g/L的硫酸鎂、至少約0.08g/L的磷酸二氫鈉單水合物、與至少約0.0005g/L的磷酸氫二鈉七水合物(Na2HPO4.7H2O)；至少約0.0001g/L的胸苷與至少約0.005g/L的各腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；以及至少0.003g/L的胰島素、至少0.05g/L的轉鐵蛋白、至少約5×10-6g/L的類脂酸/硫辛酸、至少0.05g/L的乙醇胺與至少約0.00004g/L的亞硒酸鈉。
本發明之另一個實施例為一種用於生長固著依賴性細胞之無血清營養溶液，其包含：下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸與L-牛磺酸；下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；下列鹽：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉七水合物；下列核苷：腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；胰島素；轉鐵蛋白；類脂酸/硫辛酸；乙醇胺；與亞硒酸鈉。
本發明亦提供用於生長固著依賴性細胞之套組。該等套組包含該培養基及/或無血清營養溶液。該培養基、無血清溶液與套組可用於一生長固著依賴性細胞(例如臍帶組織衍生細胞)之方法。
因此，本發明之另一實施例為一種培養經分離之臍帶組織衍生細胞的方法，其包含：使接種於微載體(microcarrier)上的生長臍帶組織衍生細胞在一培養基中生長，該培養基包含胺基酸、維生素、鹽類、核苷、類脂酸/硫辛酸、乙醇胺、胰島素、轉鐵蛋白、硒化鈉且以血清來補充，並且使細胞生長一段足夠時間以讓該些細胞達到所欲之初始族群密度；在該些細胞已達到所欲之初始族群密度後添加一無血清營養溶液，該溶液包含胺基酸、維生素、鹽類、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、類脂酸/硫辛酸、硒化鈉；以及使細胞生長一段足夠時間以讓細胞達到所欲之最終族群密度。
該方法可進一步包含額外步驟。在一個實施例中，該方法進一步包含將該些細胞接種於該些微載體上。在另一個實施例中，該方法進一步包含在培養後分離出該些細胞。在一個實施例中，所欲之初始族群密度係在3至4日後達到。該方法不需要進行培養基更換。該方法可在一旋轉瓶(roller bottle)培養系統中進行並且該些微載體可具有一經胺處理之表面。
用於本方法之臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不帶血之人類臍帶組織、能夠在培養中自我新生(self-renewal)與擴增、具有分化之潛能、會表現CD13、CD90、HLA-ABC並且不會表現CD34、CD117與HLA-DR。在一個實施例中，該些細胞不會表現hTERT或端粒酶。該些細胞之特徵在培養前與後實質上相同。在一個實施例中，該些細胞之特徵在培養前與後相同。
在一個實施例中，用於該方法中之培養基包含：下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸、與L-牛磺酸；下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；下列鹽：氯化鈣、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉與一或多種磷酸鈉鹽；下列核苷：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；胰島素；轉鐵蛋白；類脂酸/硫辛酸；乙醇胺；亞硒酸鈉；以及一或多種能量來源(例如D-葡萄糖與丙酮酸鈉)。
在另一個實施例中，用於該方法中之培養基包含：至少約0.05g/L的L-精胺酸；至少約0.02g/L的L-胱胺酸；至少約0.2g/L的L-麩醯胺酸；至少約0.01g/L甘胺酸；至少約0.02g/L的L-組胺酸；至少約0.09g/L的L-異白胺酸；至少約0.09g/L的L-白胺酸；至少約0.09g/L的L-離胺酸；至少約0.02g/L的L-甲硫胺酸；至少約0.05g/L的L-苯丙胺酸；至少約0.03g/L的L-絲胺酸；至少約0.08g/L的L-蘇胺酸；至少約0.009g/L的L-色胺酸；至少約0.08g/L的L-酪胺酸；至少約0.08g/L的L-纈胺酸；至少約0.005g/L L-半胱胺酸；至少約0.0004g/L的L-丙胺酸；至少約0.01g/L的L-天冬醯胺酸；至少約0.006g/L的L-天冬胺酸；至少0.03g/L的L-麩胺酸；至少約0.005g/L的L-脯胺酸；與至少約0.0003g/L的L-牛磺酸；約5×10-6g/L至約0.015g/L的各維生素； 至少約0.05g/L的無水氯化鈣、至少約0.1g/L的氯化鉀；至少約0.2g/L的硫酸鎂、至少約0.08g/L的磷酸二氫鈉單水合物、與至少約0.0005g/L的磷酸氫二鈉七水合物(Na2HPO4.7H2O)；至少約0.0001g/L的胸苷與至少約0.005g/L的各腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；以及至少0.003g/L的胰島素、至少0.05g/L的轉鐵蛋白、至少約5×10-6g/L的類脂酸/硫辛酸、至少0.05g/L的乙醇胺與至少約0.00004g/L的亞硒酸鈉。
用於該方法中之培養基係補充2至20%的FBS。在一個實施例中，該培養基係補充約7.5%、約10%或約15%的FBS。
在一個實施例中，用於該方法中之無血清營養溶液包含：下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸與L-牛磺酸；下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；下列鹽：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉七水合物；下列微量礦物質：硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)、硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)；下列核苷：腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；胰島素；轉鐵蛋白；乙醇胺；類脂酸/硫辛酸；與亞硒酸鈉。
該培養基與無血清營養溶液亦可含有進一步組分。例如，該培養基及/或無血清營養溶液可進一步包含腐胺、一穩定劑及/或一抗發泡劑。
本發明之其他特性與益處將因以下之詳細說明而清楚易見。
在下列說明性實施例之詳細說明中，參照係關聯至形成本說明書之一部分的隨附圖式。這些實施例係以足夠詳細之方式說明以讓熟習該項技術者能夠實行本發明，並會理解到尚可利用其他實施例，而且可在不偏離本發明之範疇或精神下作出邏輯結構、機械、電性與化學上的變化。為了要避免不必要之細節以讓熟悉該項技術領域者能夠實行本說明書中所述之實施例，本說明書可能會省略某些熟悉該項技術領域者所習知之資訊。因而不會以限制性的意義來採取下列詳細說明。
在一個態樣中，本發明提供一種用於使固著依賴性細胞(例如人類臍帶組織衍生細胞(「hUTC」)，其係附著於一含血清培養基中之微載體)生長至高細胞濃度之方法，並且該方法無須透過在試驗中間以無血清營養溶液餵養培養物來進行培養基更換。該方法讓細胞能夠生長至高細胞密度而且不會影響該些細胞之生物功能。由於本發明會提高製造生物反應器中之產率，本發明會提供經濟與商業效益。
在另一個態樣中，本發明提供培養基與營養溶液，其適用於使固著依賴性細胞在攪拌培養瓶(spirner flask)中生長，較佳為無需進行培養基更換。
在一個實施例中，本發明揭露一滋養培養基之組成與一濃縮無血清營養溶液，其用來使hUTC在攪拌培養瓶中生長至高密度並且無須進行培養基更換。此方法會減少血清使用率並增加體積生產力而降低製造成本。特定而言，該方法在有進行培養基更換下會讓倍增(doubling)能夠增強。
在另一實施例中，本發明提供一無血清營養溶液，其包含：胺基酸(以補充培養物中所消耗的胺基酸)、維生素、鹽類(以維持培養物中的滲透平衡)、核苷、胰島素、轉鐵蛋白、與可選擇地但較佳地乙醇胺、以及硒化鈉。本發明容許該方法在大規模生物反應器上之擴展性。在又一實施例中，本發明提供一培養基，其包含胺基酸、維生素、鹽類、核苷、胰島素、轉鐵蛋白與可選擇地但較佳地乙醇胺以及硒化鈉。在使用前，此培養基可用血清來補充。
本發明之另一個態樣為一種使附著於微載體之hUTC在攪拌培養瓶內之懸浮培養中生長至高細胞密度的方法，其係藉由用營養來滋
各種用語係用於說明書與申請專利範圍的各個部分中。這些 用話係以其在該項技術領域中之原始意義來使用，除非另有指明。其他經特別定義之用語的解讀係與本說明書中所提供之定義一致。
在一個實施例中，本發明中所使用之細胞通常係指產後細胞或產後衍生細胞(PPDC)。這些細胞更具體為「臍衍生細胞」(umbilicus-derived cell)或「臍帶衍生細胞」(umbilical cord-derived cell,UDC)，或者「臍帶組織衍生細胞」(UTC)。此外，可能會將該些細胞描述為幹細胞或先驅細胞(progenitor cell)，後項用語係以廣義的方式來使用。用語「衍生」係用來指明該些細胞係已得自其生物來源，並且生長或經其他方式體外調控(例如培養於一生長培養基以擴增其族群及/或製造一細胞系(cell line))。臍幹細胞之體外調控與本發明臍衍生細胞之獨有特性係詳述於後文中。
幹細胞為未分化之細胞，其係以單一細胞同時具有自我新生及分化以製造後裔細胞(progeny cell)的能力來定義，包括自我新生源祖(self-renewing progenitor)、非新生源祖(non-renewing progenitor)與最終分化細胞(terminally differentiated cell)。幹細胞之特徵亦在於其具有體外分化為來自多種胚層(內胚層、中胚層與外胚層)之各種細胞系譜功能性細胞的能力，以及在移植後形成多種胚層之組織的能力，並且能夠在注入囊胚後實質上促成大多數(如果不是全部)組織。
幹細胞依據其發展潛能分類如下：(1)全能性(totipotent)；(2)多能性(pluripotent)；(3)多潛能性(multipotent)；(4)少能性(oligopotent)；與(5)單能性(unipotent)。全能性細胞能夠形成所有胚胎與胚外細胞型。多能性細胞能夠形成所有胚胎細胞型。多潛能性細胞包括能夠形成細胞系譜亞群者，但所有皆屬於一特定之組織、器官或生理系統。例如，造血幹細胞(HSC)可以產生包括下列之後裔，即HSC(自我新生)、血細胞限制性少能性源祖與所有屬於血正常成分之細胞型與成分(例如血小板)。少能性細胞可以形成比多潛能性幹細胞之更受限細胞系譜亞群。單能性細胞能夠形成單一細胞系譜(例如生精幹細胞)。
幹細胞亦根據其獲得來源來分類。成體幹細胞(adult stem cell)為一多潛能性未分化細胞，其會在包含多重分化細胞型之組織中發現。該成體幹細胞可自我新生。在正常環境下，其亦可分化以產生其始源組織 之特殊細胞型，並且亦可能產生其他組織型。胚胎幹細胞(embryonic stem cell)為來自囊胚階段胚胎之內細胞團(inner cell mass)的多能性細胞。胎體幹細胞(fetal stem cell)為源自胎體組織或膜者。產後幹細胞(postpartum stem cell)為多潛能性或多能性細胞，其實質上源自生產後所能取得之胚外組織，亦即臍帶。已發現這些細胞擁有多能性幹細胞之特性特徵，包括快速增生與具有分化為多種細胞系譜之潛能。產後幹細胞可為血衍生(例如得自臍帶血者)或非血衍生(例如得自臍帶與胎盤之非血組織者)。
使用各種用語來描述培養中之細胞。「細胞培養物」通常係指取自活體生物並且在受控制條件下生長(「在培養物中」或「經培養」)的細胞。「初代細胞培養物」為在第一次亞培養前直接取自生物之細胞、組織或器官的培養物。當細胞置於生長培養基中並處於有利細胞生長及/或分裂之條件下時，其會在培養中「擴增」從而導致更大的細胞群。當細胞在培養中擴增時，細胞增生率有時會以細胞數目倍增所需的時間量來量度。此稱為「倍增時間」。
用語「細胞系」(cell line)通常指由初次細胞培養物之一或多個繼代培養(subcultivation)所形成的細胞群。每一輪繼代培養係稱為一次傳代(passage)。當細胞經過繼代培養時，則將它們稱為已「傳代」。特定之細胞群或一細胞系有時會以其已傳代的次數來指稱或標明。例如，已傳代十次的經培養細胞群可稱為P10培養物。初次培養物(在細胞自組織分離出來後的第一次培養物)係命名為P0。在第一次繼代培養後，該些細胞係描述為二次培養物(P1或傳代1)。在第二次繼代培養後，該些細胞即變成三次培養物(P2或傳代2)，依此類推。熟習該項技術者將會理解到，在傳代期間可能會有許多次的族群倍增；因此，一培養物之族群倍增次數會大於其傳代次數。在傳代間隔期間的細胞擴增(即族群倍增次數)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、基材、培養基、生長條件與傳代間隔時間。
「分化」為未特化(「未定向」(uncommitted))或特化程度較低細胞藉以獲得特化細胞(例如神經細胞或肌肉細胞)之特徵的過程。「已分化」細胞為已佔據細胞系譜內特化(「定向」(committed))程度較高之位置者。用語「定向」當應用於分化過程時，係指細胞在分化路徑中已進行達下列程度，即其(在正常環境下)將會持續分化為特定細胞型或細胞型 之亞群，並且無法(在正常環境下)分化為不同之細胞型或回復為分化程度較低之細胞型。「去分化」(De-differentiation)係指細胞藉以回復至細胞系譜內特化(或定向)程度較低之位置的過程。如本說明書中所用者，細胞之「系譜」(lineage)描述該細胞之遺傳，即該細胞來自哪些細胞以及該細胞可形成哪些細胞。細胞之系譜會為該細胞安排發育與分化之遺傳方案(hereditary scheme)。
廣義而言，「先驅細胞」(progenitor cell)為能夠產生較其本身分化程度更高之後裔，但又保有添補源祖池之能力的細胞。就此定義而言，幹細胞本身亦為先驅細胞，但為最終分化細胞之更接近前體。當提及本發明之細胞時，如以下所更詳述說明者，可能會使用此較廣之先驅細胞定義。狹義而言，先驅細胞常定義為在分化路徑中作為中間者之細胞，即其由幹細胞所形成並且在成熟細胞型或細胞型亞群之製造中作為中間者。此型先驅細胞通常無法自我新生。因此，如果在本說明書中提及此型細胞，其將會稱為「非新生先驅細胞」或「中間源祖或前體細胞」。
一般而言，「營養因子」(trophic factor)係定義為促進細胞生存、生長、增生及/或成熟之物質，或刺激細胞提高活性之物質。
用語「標準生長條件」如本說明書中所用者，係指在37℃下、在含5% CO2的標準大氣中以及維持在約100%的濕度下的細胞培養條件。雖然前述條件可用於培養，但會理解到此類條件可由瞭解培養細胞技術領域中之可用選項的熟悉該項技藝人士加以變化。
用語「分離物」如本說明書中所用者，通常指已自其天然環境中分離出來的細胞。此用語包括自其天然環境整體物理性分離出來，例如自其供應動物中取出。在較佳實施例中，經分離之細胞並非存在於一組織中，即該細胞係與其鄰接細胞(該細胞正常會接觸者)分開或解離。較佳的是，細胞係以細胞懸浮液來施用。如本說明書中所用者，詞組「細胞懸浮液」包括與培養基接觸之細胞以及已解離之細胞，例如藉由使一片組織經過溫和研碎者
本發明的一個實施例為一種利用本發明之培養基與無血清營養溶液來培養經分離之固著依賴性細胞的方法。該用於培養經分離之固著依賴性細胞(例如臍帶組織衍生細胞)的方法能夠在至少一種載體粒子 (例如微載體)上培養該些細胞。該微載體可包含天然或合成衍生之材料。例子包括膠原蛋白基微載體、葡聚糖基微載體或纖維素基微載體，以及玻璃、陶瓷、聚合物(例如聚苯乙烯)或金屬。該微載體可為不含蛋白質或經蛋白質塗覆，例如經膠原蛋白塗覆。在一進一步態樣中，該微載體可由下列構成或經下列塗覆，即滋養該細胞與該微載體之結合以及增進該細胞自該微載體之釋出的化合物，包括但不限於玻尿酸鈉(sodium hyaluronate)、聚(單硬脂醯甘油酯共-琥珀酸)(poly(monostearoylglyceride co-succinic acid))、聚-D,L-乳酸交酯-共-乙交酯、纖連蛋白素(fibronectin)、層黏蛋白(laminin)、彈性蛋白、離胺酸、正異丙基丙烯醯胺、玻連蛋白素(vitronectin)與膠原蛋白。實例進一步包括帶有微電流(microcurrent)之微載體，例如帶有粒狀之鋅與銅伽凡尼電偶(galvanic couple)的微載體，其會產生低度生物相關電流；或具有順磁性的微載體，例如順磁性鈣-藻酸鹽微載體。該些方法可在一旋轉瓶(roller bottle)系統中進行。
吾人會理解到本發明不限於特定方法、試劑、化合物、組成物或生物系統，其理所當然可加以變化。吾人亦會理解到本說明書中所使用的用語僅用於描述特定實施例之目的，並且不意欲為限制性。如本說明書與隨附之申請專利範圍中所用者，單數形式「一」與「該」皆包括複數的指涉，除非內容另有清楚指定。因此，例如對於「一細胞」之指稱包括兩或更多細胞之組合與類似者。
「微載體」係指可用於在培養物中附著與生長固著依賴性細胞的粒子、珠體或丸體。該些微載體具有下列性質：(a)它們微小至足以讓其能夠用於懸浮培養中(使用不會對於該些微載體或細胞造成明顯傷害的攪拌速率)；(b)它們為固體或具有固體核心(表面上有多孔性塗層)；以及(c)它們的表面(在多孔性載體的情況下即外部與內部表面)可能帶有正電荷或負電荷。在一個態樣中，該些微載體之整體粒徑介於約150與350μm間，並且其正電荷密度介於約0.8與2.0meq/g間。例示性的有用微載體包括Cytodex® 1、Cytodex® 2或Cytodex® 3(GE Healthcare Life Sciences)。
在另一個態樣中，該微載體為一固體載體。固體載體尤其適用於貼附細胞，例如固著依賴性細胞。該載體粒子亦可為一多孔性微載體。實例進一步包括帶有微電流之微載體，例如帶有粒狀之鋅與銅伽凡尼電偶 的微載體，其會產生低度生物相關電流；或具有順磁性的微載體，例如順磁性鈣-藻酸鹽微載體。
「多孔性微載體」係指可用於在培養物中附著與生長固著依賴性細胞的微粒。該些多孔性微載體具有下列性質：(a)它們微小至足以讓其能夠用於懸浮培養物中(使用不會對於該些微載體或細胞造成明顯傷害的攪拌速率)；(b)它們具有足夠大小的孔隙與內部空間以讓細胞能夠遷移至粒子的內部空間中；以及(c)它們的表面(外部與內部)可能帶有正電荷或負電荷。在實施例的一個系列，該些載體(a)具有介於約150與350μm間的整體粒徑；(b)具有介於約15與約40μm間的平均開孔直徑；並且(c)具有介於約0.8與2.0meq/g間的正電荷密度。在某些實施例中，DEAE(N,N,-二乙基胺基乙基)基團會提供正電荷。有用的多孔性微載體包括但不限於Cytopore 1®與Cytopore 2®(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway N.J.)。
「固著依賴性細胞」為需要附著在一表面以在組織培養物中複製的細胞(包括哺乳動物細胞)，表面例如一組織培養瓶表面或一微載體粒子表面。
如本說明書中所用者，用語「約」在指稱一可測量的值(例如數量、持續時間與類似者)時，意指涵蓋在指定值之±20%或±10%的變異，更佳為±5%，甚至更佳為±1%，並且又更佳為±0.1%，若此類變異為適合執行所揭露之方法者。
I.培養基與無血清營養飼養料溶液
本發明提供滋養培養基與無血清之濃縮營養飼養料溶液。該培養基與該無血清營養溶液可用來使細胞生長至高密度。在一較佳實施例，該培養基與該無血清營養溶液可用來在較低血清消耗下使固著依賴性細胞(例如hUTC)在攪拌培養瓶中生長至高密度。
在一個實施例中，該培養基與無血清營養溶液係用於臍帶組織衍生細胞之生長。在另一實施例中，培養基與無血清營養溶液係適用於先驅細胞之生長，上述先驅細胞包括但不限於間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)、骨髓衍生幹細胞、衍生自胎盤組織之細胞、衍生自非髓組織(例如脂肪組織、肌肉組織)之貼附性細胞、血管(包括內乳房動脈)衍生細 胞、衍生自牙髓之細胞、衍生自羊水與纖維母細胞(包括新生兒包皮纖維母細胞)之細胞。
A.培養基
本發明的一個態樣為一種培養基，其包含胺基酸、維生素、鹽類、核苷、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、亞硒酸鈉、D-葡萄糖與丙酮酸鈉。
在一個實施例中，該培養基包含一般L-胺基酸。在另一實施例中，該培養基包下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、與可選擇地L-半胱胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸、與L-牛磺酸。在一替代實施例中，該培養基包含約0.0006g/L至約0.1g/L的各胺基酸。
在又一實施例中，該培養基包含至少約0.1g/L的L-精胺酸；至少約0.05g/L的L-胱胺酸；至少約0.3g/L的L-麩醯胺酸；至少約0.02g/L甘胺酸；至少約0.03g/L的L-組胺酸；至少約0.08g/L的L-異白胺酸；至少約0.08g/L的L-白胺酸；至少約0.1g/L的L-離胺酸；至少約0.1g/L的L-甲硫胺酸；至少約0.05g/L的L-苯丙胺酸；至少約0.03g/L的L-絲胺酸；至少約0.08g/L的L-蘇胺酸；至少約0.01g/L的L-色胺酸；至少約0.09g/L的L-酪胺酸；至少約0.07g/L的L-纈胺酸；與可選擇地至少約0.007g/L L-半胱胺酸；至少約0.0005g/L的L-丙胺酸；至少約0.02g/L的L-天冬醯胺酸；至少約0.006g/L的L-天冬胺酸；至少0.03g/L的L-麩胺酸；至少約0.01g/L的L-脯胺酸；與至少約0.0006g/L的L-牛磺酸。
在一替代實施例中，該培養基包含至少約0.09705g/L的L-精胺酸；約0.06779g/L的L-胱胺酸；約0.009224g/L的L-半胱胺酸；約0.584g/L的L-麩醯胺酸；約0.031125g/L的甘胺酸；約0.048288g/L的L-組胺酸；約0.163713g/L的L-異白胺酸；約0.163713g/L的L-白胺酸；約0.16807g/L的L-離胺酸；約0.036748g/L的L-甲硫胺酸；約0.073695g/L的L-苯丙胺酸；約0.05145g/L的L-絲胺酸；約0.108609g/L的L-蘇胺酸； 約0.018457g/L的L-色胺酸；約0.121813g/L的L-酪胺酸；約0.111105g/L的L-纈胺酸；約0.000668g/L的L-丙胺酸；約0.031978g/L的L-天冬醯胺酸；約0.0080g/L的L-天冬胺酸；約0.054728g/L的L-麩胺酸；約0.02403g/L的L-脯胺酸；與約0.000844g/L的L-牛磺酸。
該培養基進一步包含一或多種維生素。在一個實施例中，培養基包含至少下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、與可選擇地d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)。該培養基可進一步包含維生素C與維生素A。在另一實施例中，該培養基包含約5×10-6g/L至約0.015g/L的各維生素。在一個實施例中，該培養基包含約0.004338g/L的D-泛酸鈣；約0.006094g/L的氯化膽鹼；約0.004302g/L的葉酸；約0.009568g/L的I-肌醇；約0.004302g/L的菸鹼醯胺；約0.004153g/L的吡哆醛；約0.000431g/L的核黃素；約0.004304g/L的噻胺；約3.75E-05g/L的d-生物素；約1.85E-05g/L的吡哆醇與約0.000102g/L的維生素B12(氰鈷胺)。
該培養基進一步包含一或多種無機鹽。在一個實施例中，該培養基包含氯化鈣、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉與一或多種磷酸鈉鹽。在另一實施例中，該培養基包含無水氯化鈣、氯化鉀、無水硫酸鎂、磷酸二氫鈉單水合物與可選擇地磷酸氫二鈉七水合物(Na2HPO4.7H2O)。取決於所用之鹽，該培養基可包含至少約0.005g/L至約至少約7g/L的上述鹽。在一個實施例中，該培養基包含至少約0.01g/L的無水氯化鈣、至少約0.1g/L的氯化鉀；至少約0.2g/L的硫酸鎂、至少約0.08g/L的磷酸二氫鈉單水合物、與可選擇地至少約0.0005g/L的磷酸氫二鈉七水合物(Na2HPO4.7H2O)。在另一實施例中，該培養基包含約0.2g/L的無水氯化鈣、約0.4g/L的氯化鉀；約0.9767g/L的硫酸鎂、至少約0.13g/L的磷酸二氫鈉單水合物、約6.4g/L的氯化鈉與可選擇地至少約0.002g/L的磷酸氫二鈉七水合物(Na2HPO4.7H2O)。
該培養基進一步包含核苷。在一個實施例中，該培養基包含核酸衍生物(核苷)胸苷、腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷。在一替代實施例中，該培養基包含至少約0.0001g/L至至少約0.02g/L的各核苷。在一個實施例中，該培養基包含至少約0.0001g/L的胸苷與至少約0.005g/L的各腺苷、 胞苷、尿苷與鳥苷。在另一實施例中，該培養基包含約0.00045g/L的胸苷與約0.015g/L的各腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷。
在一個實施例中、該培養基進一步包含胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺與硒酸鈉。在另一實施例中，該培養基包含至少約0.003g/L的胰島素。在另一實施例中，該培養基包含約0.01g/L的胰島素。在一替代實施例中，該培養基包含至少約0.05g/L的轉鐵蛋白。在另一實施例中，該培養基包含約0.055g/L的轉鐵蛋白。在又一實施例中，該培養基包含至少約0.01g/L的乙醇胺。在一替代實施例中，該培養基包含至少約0.02g/L的乙醇胺。在一個實施例中，該培養基包含至少約0.00004g/L的亞硒酸鈉。在另一實施例中，該培養基包含約0.000067g/L的亞硒酸鈉。在又一實施例中，該培養基未進一步包含胰島素、轉鐵蛋白與乙醇胺。
本發明的一個實施例為一種培養基，其包含：下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸、與L-牛磺酸；下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；下列鹽：鹽：氯化鈣、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉與一或多種磷酸鈉鹽；下列核苷(核酸衍生物)：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；胰島素；轉鐵蛋白；乙醇胺；亞硒酸鈉；與一或多種能量來源。在一個實施例中，此培養基包含約0.0006g/L至約0.1g/L的各胺基酸。在另一實施例中，該培養基包含至少約0.05g/L的L-精胺酸；至少約0.02g/L的L-胱胺酸；至少約0.2g/L的L-麩醯胺酸；至少約0.01g/L甘胺酸；至少約0.02g/L的L-組胺酸；至少約0.09g/L的L-異白胺酸；至少約0.09g/L的L-白胺酸；至少約0.09g/L的L-離胺酸；至少約0.02g/L的L-甲硫胺酸；至少約0.05g/L的L-苯丙胺酸；至少約0.03g/L的L-絲胺酸；至少約0.08g/L的L-蘇胺酸；至少約0.009g/L的L-色胺酸；至少約0.08g/L的L-酪胺酸；至少約0.08g/L的L-纈胺酸；至少約0.005g/L L-半胱胺酸；至少約0.0004g/L的L-丙胺酸；至少約0.01g/L的L-天冬醯胺酸；至少約0.006g/L的L-天冬胺酸；至少0.03g/L的L-麩胺酸；至少約0.005g/L 的L-脯胺酸；與至少約0.0003g/L的L-牛磺酸。在一替代實施例中，該培養基包含約5×10-6g/L至約0.015g/L的各維生素。在一個實施例中，該培養基包含至少約0.005g/L的無水氯化鈣、至少約0.1g/L的氯化鉀；至少約0.2g/L的硫酸鎂、至少約0.1g/L的磷酸二氫鈉單水合物、與至少約0.0005g/L的磷酸氫二鈉七水合物(Na2HPO4.7H2O)；在另一實施例中，該培養基包含至少約0.0001g/L至至少約0.02g/L的各核苷。在一個實施例中，該培養基包含至少約0.0001g/L的胸苷與至少約0.005g/L的各腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷。在一個實施例中，該培養基進一步包含至少0.005g/L的胰島素，以及至少0.03g/L的轉鐵蛋白、至少0.01g/L的乙醇胺與至少約0.00004g/L的亞硒酸鈉。該一或多能量來源可為D-葡萄糖與丙酮酸鈉。
在另一實施例中，該培養基包含：(1)下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸、與L-牛磺酸；(2)下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；(3)下列鹽：氯化鈣、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉與一或多種磷酸鈉鹽；(4)下列核苷：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；(5)胰島素；(6)轉鐵蛋白；(7)類脂酸/硫辛酸；(8)乙醇胺；(9)亞硒酸鈉；以及(10)一或多種能量來源。
本發明的一個實施例為一種培養基，其包含：下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸、與L-牛磺酸；下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；下列鹽：鹽：氯化鈣、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉與一或多種磷酸鈉鹽；下列核苷(核酸衍生物)：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；類脂酸/硫辛酸；下列微量礦物質：硝酸鐵、硫酸銅、硫酸鋅；與一或多種能量來源。在一個實施例中，此培養基包含約0.0006g/L至約 0.1g/L的各胺基酸。在另一實施例中，該培養基包含至少約0.05g/L的L-精胺酸；至少約0.02g/L的L-胱胺酸；至少約0.2g/L的L-麩醯胺酸；至少約0.01g/L甘胺酸；至少約0.02g/L的L-組胺酸；至少約0.09g/L的L-異白胺酸；至少約0.09g/L的L-白胺酸；至少約0.09g/L的L-離胺酸；至少約0.02g/L的L-甲硫胺酸；至少約0.05g/L的L-苯丙胺酸；至少約0.03g/L的L-絲胺酸；至少約0.08g/L的L-蘇胺酸；至少約0.009g/L的L-色胺酸；至少約0.08g/L的L-酪胺酸；至少約0.08g/L的L-纈胺酸；至少約0.005g/L L-半胱胺酸；至少約0.0004g/L的L-丙胺酸；至少約0.01g/L的L-天冬醯胺酸；至少約0.006g/L的L-天冬胺酸；至少0.03g/L的L-麩胺酸；至少約0.005g/L的L-脯胺酸；與至少約0.0003g/L的L-牛磺酸。在一替代實施例中，該培養基包含約5×10-6g/L至約0.015g/L的各維生素。在一個實施例中，該培養基包含至少約0.01g/L的無水氯化鈣、至少約0.1g/L的氯化鉀；至少約0.2g/L的硫酸鎂(無水)、至少約0.1g/L的磷酸二氫鈉單水合物與可選擇地至少約0.005g/L的磷酸氫二鈉七水合物(Na2HPO4.7H2O)。在另一實施例中，該培養基包含至少約0.0001g/L至至少約0.02g/L的各核苷。在一個實施例中，該培養基包含至少約0.0001g/L的胸苷與至少約0.005g/L的各腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷。該一或多種能量來源可為D-葡萄糖與丙酮酸鈉。
除了微量礦物質亞硒酸鈉以外，在某些實施例中，該培養基進一步包含一或多種額外微量礦物質。在一個實施例中，該培養基進一步包含硝酸鐵、硫酸銅與硫酸鋅。在一個實施例中，該培養基進一步包含硝酸鐵(9H2O)、硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)與硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)。該些微量礦物質之存在量範圍可在約5×10-8g/L至約3×10-4g/L的各微量礦物質。在一替代實施例中，該培養基進一步包含約0.001g/L的硝酸鐵(9H2O)、約9.33 E-08g/L的硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)與3.24 E-05g/L的硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)。
再者，該培養基可進一步包含類脂酸/硫辛酸，其可包含至少約5×10-6g/L的該溶液。在一個實施例中，該培養基進一步包含約0.000015g/L的類脂酸/硫辛酸。
再者，該培養基可進一步包含類脂酸/硫辛酸，其可包含至少約5×10-6g/L的該溶液。在一個實施例中，該培養基進一步包含約0.000015g/L的類脂酸/硫辛酸。
可選擇地，該培養基可進一步包含腐胺、白蛋白、一穩定劑及/或抗發泡劑。在一個實施例中，該白蛋白為牛血清白蛋白。在一個實施例中，牛血清白蛋白的提供形式為市售可得之AlbuMAX® I(GibcoTM Cell Culture,Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，其為富含脂質之牛血清白蛋白。在另一實施例中，該培養基進一步包含市售可得之穩定劑/抗發泡劑Pluronic® F68(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)。
該培養基之例示性合適實施例係示於下表中：
這些培養基可進一步包含牛血清白蛋白(BSA)、腐胺與Pluronic® F68。具體而言，針對實施例A，該培養基可進一步包含3.02 E-05g/L的腐胺、2.5g/L的BSA與0.015g/L的Pluronic® F68。同樣的，針對實施例B，該無血清營養溶液可進一步包含至少約1 E-05g/L的腐胺、至少1g/L的BSA與至少0.005g/L的Pluronic® F68。在一個實施例中，該培養基進一步包含腐胺與Pluronic® F68，例如3.02 E-05g/L的腐胺、2.5g/L的BSA與0.015g/L的Pluronic® F68。
本發明之培養基可進一步包含至少0.8g/L的D-葡萄糖與至少0.1g/L的丙酮酸鈉。在一個實施例中，本發明之培養基進一步包含約1g/L的D-葡萄糖與約0.11g/L的丙酮酸鈉。
在本發明的一個實施例中，該培養基係補充血清(例如胎牛血清(FBS)或新生小牛血清(NCS))。血清含量濃度範圍可在0(無血清培養基)至20%的總培養基體積。在一個實施例中，該培養基在其製備期間係補充血清(例如FBS)。在另一實施例中，該培養基係在使用前不久補充(例如經由添加一含血清(例如FBS)溶液)。在一個實施例中，該培養基較佳係補充約2至15%(v/v)的FBS，或者約2至約10%，或者約3至約12%，或者約5至約15%，或者約4%至約10%。在所選用的實施例中，該培養基係補充約7.5%、約10%或約15%(v/v)的FBS。
B.無血清營養溶液
本發明之另一個態樣為一種無血清營養溶液，其包含：胺基酸、維生素、鹽類、核苷、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、與亞硒酸鈉。如本說明書中所用者，當提及該營養溶液時，用語「無血清」意指該營養溶液在加至該培養基前未含有血清。除非另有指明，針對該無血清營養溶液之組分所揭露的用量皆基於在該無血清營養溶液已加至一培養物後各組分重量增加的測量結果。
在一個實施例中，該無血清營養溶液包含常見的20種L-胺基酸。在另一實施例中，該無血清營養溶液包含下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L- 酪胺酸、L-纈胺酸以及可選擇地L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸與L-牛磺酸。在一個實施例中，該溶液包含至少約0.0001g/L至至少約0.03g/L的各胺基酸。在另一實施例中，該無血清營養溶液包含至少約0.005g/L的L-精胺酸、至少約0.002g/L的L-胱胺酸、至少約0.0003g/L的L-半胱胺酸、至少約0.0005g/L的甘胺酸、至少約0.002g/L的L-組胺酸、至少約0.01g/L的L-異白胺酸、至少約0.01g/L的L-白胺酸、至少約0.008g/L的L-離胺酸、至少約0.002g/L的L-甲硫胺酸、至少約0.002g/L的L-苯丙胺酸、至少約0.002g/L的L-絲胺酸、至少約0.003g/L的L-蘇胺酸、至少約0.0008g/L的L-色胺酸、至少約0.005g/L的L-酪胺酸、至少約0.005g/L的L-纈胺酸、至少約0.0001g/L的L-丙胺酸、至少約0.005g/L的L-天冬醯胺酸、至少約0.002g/L的L-天冬胺酸、至少約0.01g/L的L-麩胺酸、至少約0.008g/L的L-脯胺酸與至少約0.008g/L的L-牛磺酸。
在一替代實施例中，無血清營養溶液包含約0.013g/L L-精胺酸，HCl；約0.005g/L L-胱胺酸，2HCl；約0.009g/L L-半胱胺酸HCl H2O；約0.001g/L甘胺酸；約0.006g/L L-組胺酸，HCl，H2O；約0.059g/L L-異白胺酸；約0.059g/L L-白胺酸；約0.022g/L L-離胺酸，HCl；約0.007g/L L-甲硫胺酸；約0.008g/L L-苯丙胺酸；約0.009g/L L-絲胺酸；約0.013g/L L-蘇胺酸；約0.002g/L L-色胺酸；約0.018g/L L-酪胺酸，2Na，2H2O；約0.018g/L L-纈胺酸；約0.001g/L L-丙胺酸；約0.032g/L L-天冬醯胺酸H2O；約0.008g/L L-天冬胺酸；約0.055g/L L-麩胺酸；約0.024g/L L-脯胺酸；與約0.0008L-牛磺酸。上述胺基酸被視為有助於補充培養物中所消耗的胺基酸。
該無血清營養溶液進一步包含一或多種維生素。在一個實施例中，無血清營養溶液包含至少下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)。該溶液可進一步包含維生素C與維生素A。在一個實施例中，該溶液包含約5×10-6g/L至0.001g/L的各一或多種維生素。在一個實施例中，該無血清營養溶液包含至少約0.0001g/L的D-泛酸鈣；至少約0.0008g/L的氯化膽鹼；至少約0.0001g/L的葉酸；至少約0.0008g/L的I-肌醇；至少約0.0001g/L的菸鹼醯胺；至少約0.00005g/L的吡哆醛；至少約1×10-5g/L的核黃素；至少約0.00001g/L的噻胺；至少約1×10-5g/L的 d-生物素；至少約1×10-5g/L的吡哆醇；與至少約1×10-5g/L的維生素B12(氰鈷胺)。在一個實施例中，該無血清營養溶液包含約0.000338g/L D-泛酸鈣；約0.002094g/L氯化膽鹼；約0.000302g/L葉酸；約0.002568g/L異-肌醇；約0.000302g/L菸鹼醯胺；約0.000153g/L吡哆醛，HCl；約3.11E-05g/L核黃素；約0.000304g/L噻胺，HCl；約3.75E-05g/L d-生物素；約1.85E-05g/L吡哆醇HCl；與約0.000102g/L維生素B12(氰鈷胺)。
此外，該無血清營養溶液包含一或多種鹽。在另一實施例中，該溶液包含約0.0005g/L至約0.001g/L的磷酸鹽。在一替代實施例中，該溶液包含磷酸鈉如磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉七水合物在又一實施例中，該溶液包含至少約0.005g/L的磷酸二氫鈉與至少約0.001g/L的磷酸氫二鈉七水合物。在一替代實施例中，該溶液包含約0.008g/L的磷酸二氫鈉與約0.002g/L的磷酸氫二鈉七水合物。
該無血清營養溶液進一步包含核苷。在一個實施例中，該無血清營養溶液包含下列核酸衍生物：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷。在一替代實施例中，該溶液包含至少約0.0001g/L至至少約0.005g/L的各核苷。在一個實施例中，該溶液包含至少約0.0001g/L的胸苷與至少約0.005g/L的各腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷。在另一實施例中，該溶液包含約0.0005g/L的胸苷與約0.015g/L的各腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷。
該無血清營養溶液進一步包含胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺與亞硒酸鈉。在一個實施例中，該溶液包含至少0.002g/L，或者約0.01g/L的胰島素。在另一個實施例中，該溶液包含至少約0.01g/L，或者約0.06g/L的轉鐵蛋白。在替代實施例中，該溶液包含至少約0.005g/L，或者約0.02g/L的乙醇胺。在又一實施例中，該溶液包含至少約2×10-5g/L，或者約7×10-5g/L的亞硒酸鈉。
除了微量礦物質亞硒酸鈉以外，在某些實施例中，該無血清營養溶液進一步包含一或多種額外微量礦物質。在一個實施例中，該溶液包含約3×10-8g/L至約2×10-5g/L的各一或多種額外微量礦物質。在一個實施例中，該溶液進一步包含硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)與硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)。在另一實施例中，該溶液進一步包含至少約3×10-8g/L的硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)與至少約5×10-6g/L的硫酸鋅七水 合物(ZnSO4.7H2O)。在一替代實施例中，該溶液進一步包含約9×10-8g/L的硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)與約3×10-5g/L的硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)。
再者，除了脂質乙醇胺外，該無血清營養溶液可進一步包含類脂酸/硫辛酸，其可包含至少約1×10-5g/L的該溶液。
在本發明的一個實施例中，該無血清營養溶液包含：下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸與L-牛磺酸；下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；下列鹽：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉七水合物；下列核苷：腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；胰島素；轉鐵蛋白；乙醇胺；與亞硒酸鈉。
此無血清溶液可選擇地可進一步包含硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)與硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)。此外，該無血清溶液可選擇地可進一步包含類脂酸/硫辛酸。在一個實施例中，該溶液包含：(1)約0.0001g/L至約0.03g/L的各胺基酸；(2)約0.00001g/L至約0.001g/L的各維生素；(3)至少約5×10-6g/L的磷酸二氫鈉與至少約0.001g/L的磷酸氫二鈉七水合物；(4)至少約0.0001g/L的胸苷與至少約0.005g/L的各腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；(5)至少0.002g/L的胰島素；(6)至少約0.03g/L的轉鐵蛋白；(7)至少約0.005g/L的乙醇胺與(8)至少約5×10-5g/L的亞硒酸鈉。可選擇地，此溶液進一步包含(9)至少約7×10-8g/L的硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)；(10)至少約5×10-6g/L的硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)；以及(11)至少約1×10-6g/L的類脂酸/硫辛酸。
在本發明的另一實施例中，該無血清營養溶液包含胺基酸、維生素、鹽類、核苷、硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)、硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)與類脂酸/硫辛酸。在此實施例中，該溶液包含：(CuSO4.5H2O)；(10)至少約5×10-6g/L的硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)；以及(11)至少約1×10-6g/L的類脂酸/硫辛酸。
在本發明的另一實施例中，該無血清營養溶液包含胺基酸、維生素、鹽類、核苷、硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)、硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)與類脂酸/硫辛酸。在此實施例中，該溶液包含：下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸與L-牛磺酸；下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；下列鹽；磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉七水合物；以及下列核苷：胸苷、腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷。
在一個實施例中，此無血清營養溶液包含至少約0.005g/L的L-精胺酸、至少約0.002g/L的L-胱胺酸、至少約0.0003g/L的L-半胱胺酸、至少約0.0005g/L的甘胺酸、至少約0.002g/L的L-組胺酸、至少約0.01g/L的L-異白胺酸、至少約0.01g/L的L-白胺酸、至少約0.008g/L的L-離胺酸、至少約0.002g/L的L-甲硫胺酸、至少約0.002g/L的L-苯丙胺酸、至少約0.002g/L的L-絲胺酸、至少約0.003g/L的L-蘇胺酸、至少約0.0008g/L的L-色胺酸、至少約0.005g/L的L-酪胺酸、至少約0.005g/L的L-纈胺酸、至少約0.0001g/L的L-丙胺酸、至少約0.005g/L的L-天冬醯胺酸、至少約0.002g/L的L-天冬胺酸、至少約0.01g/L的L-麩胺酸、至少約0.008g/L的L-脯胺酸與至少約0.008g/L的L-牛磺酸。在另一個實施例中，此無血清營養溶液進一步包含至少約0.0001g/L的D-泛酸鈣；至少約0.0008g/L的氯化膽鹼；至少約0.0001g/L的葉酸；至少約0.0008g/L的I-肌醇；至少約0.0001g/L的菸鹼醯胺；至少約0.00005g/L的吡哆醛；至少約1×10-5g/L的核黃素；至少約0.00001g/L的噻胺；至少約1×10-5g/L的d-生物素；至少約1×10-5g/L的吡哆醇；與至少約1×10-5g/L的維生素B12(氰鈷胺)。在一替代實施例中，此溶液進一步包含至少約0.0001g/L的胸苷與至少約0.01g/L的各腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷。在另一實施例中，此溶液進一步包 含至少約3×10-8g/L的硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)、約5×10-5g/L的硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)與約2×10-5g/L的類脂酸/硫辛酸。
可選擇地，該無血清營養溶液可進一步包含腐胺、牛血清白蛋白、一穩定劑及/或抗發泡劑。在一個實施例中，牛血清白蛋白的提供形式為市售可得之AlbuMAX® I(GibcoTM Cell Culture,Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，其為富含脂質之牛血清白蛋白。在另一實施例中，該無血清營養溶液包含市售可得之穩定劑/抗發泡劑Pluronic® F68(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)。
該無血清營養溶液之例示性合適實施例係示於下表中：
這些無血清營養溶液可進一步包含牛血清白蛋白(BSA)、腐胺與Pluronic® F68。具體而言，針對實施例A，該無血清營養溶液可進一步包含3.02 E-05g/L的腐胺、2.5g/L的BSA與0.015g/L的Pluronic® F68。同樣的，針對實施例B，該無血清營養溶液可進一步包含至少約1 E-05g/L的腐胺、至少1g/L的BSA與至少0.005g/L的Pluronic® F68。在一個較佳實施例中，該無血清營養溶液進一步包含腐胺與Pluronic® F68。
在實施例中，該無血清營養溶液包含硒酸鈉、乙醇胺、胰島素、轉鐵蛋白、胸苷、腺苷、胞苷、尿苷、鳥苷與血清白蛋白(例如牛血清白蛋白)。
可選擇地，該無血清營養溶液可進一步包含一或多種能量基質，例如葡萄糖及/或丙酮酸。
在本發明的一個實施例中，該培養基及/或無血清營養溶液不含會促進未分化細胞生長的外源加入因子。在一個較佳實施例中，該培養基及/或無血清營養溶液不包含一纖維母細胞(fibroblast)生長因子，例如鹼性FGF或FGF-4。
II.人類臍帶組織衍生細胞(hUTC)
如以上本發明之某些實施例中所討論者，該培養基與無血清營養溶液可用來生長經分離之人類臍帶組織衍生細胞(「hUTC」或「UTC」)。適合與本發明之培養基、無血清營養溶液、套組與方法搭配使用的UTC與UTC族群係詳細說明於本說明書後文以及美國專利第7,510,873號；7,524,489號；與美國專利揭露申請案第2005/005863號中，這些專利文獻因為其與hUTC之描述、分離及特徵化相關而以引用方式併入。
A.臍帶組織衍生細胞之分離與生長
根據本說明書中所述之方法，將一哺乳動物臍帶在足月或不足月懷孕結束時或結束後不久(例如在排出(expulsion)後或生產後)回收。該產後組織可在一無菌容器(例如一燒瓶、燒杯、培養皿或袋)中自生產地運輸至一實驗室。該容器可含有一溶液或培養基，包括但不限於一鹽溶液如達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)(亦稱為達爾伯克最低必需培養基(Dulbecco’s Minimal Essential Medium))或磷酸鹽緩衝液(PBS)，或者任何用來運輸用於移植之器官的溶液如威斯康辛大學溶液(University of Wisconsin solution)或全氟化化合物溶液(perfluorochemical solution)。可將一或多種抗生素及/或抗黴劑(例如但不限於青黴素(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)、雙性殺黴素B(amphotericin B)、建它黴素(gentamicin)與制黴菌素(nystatin))加至該培養基或緩衝液。該產後組織可用一抗凝劑溶液(例如含肝素溶液)來潤洗。較佳者為使該 組織在萃取UTC前保持在約4-10℃下。更佳者為使該組織在萃取UTC前未經冷凍。
UTC分離較佳為在一無菌環境中進行。臍帶可藉由該項技術領域中習知之方法而與胎盤分離。或者，臍帶與胎盤未經分離即可使用。較佳為在分離UTC前自產後組織移除血與殘渣。例如，產後組織可用緩衝液來清洗，包括但不限於磷酸鹽緩衝液。該清洗緩衝液亦可包含一或多種抗生素及/或抗黴劑，包括但不限於青黴素、鏈黴素、雙性殺黴素B、建它黴素與制黴菌素。
包含臍帶或者其碎片或斷片之產後組織係藉由機械力(切碎或剪切)來崩解。在目前較佳實施例中，分離程序亦使用酶消化法。許多種酶在該項技術領域中係習知可用來自複合組織基質中分離出個別細胞以利於在培養中生長。消化酶的範圍從弱消化性(例如去氧核糖核酸酶與中性蛋白酶即分散酶(dispase))到強消化性(例如木瓜酶與胰蛋白酶)者，並且為市售可得者。適用於本說明書之酶的非詳盡無遺清單包括黏液分解酶活性物、金屬蛋白酶(metalloprotease)、中性蛋白酶、絲胺酸蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶)與去氧核糖核酸酶。目前較佳者為選自金屬蛋白酶、中性蛋白酶與黏液分解活性物之酶活性物。例如，膠原蛋白酶已知可用來自組織分離出各種細胞。去氧核糖核酸酶可消化單股DNA並且可使分離期間的細胞凝集現象降至最低。較佳方法包含使用例如膠原蛋白酶與分散酶或者膠原蛋白酶、分散酶與玻尿酸酶來進行酶處理。在某些實施例中，膠原蛋白酶與中性蛋白酶分散酶之混合物會用於該解離步驟中。更具體之實施例會於至少一種來自溶組織芽胞梭菌(Clostridium histolyticum)之膠原蛋白酶以及蛋白酶活性物、分散酶與嗜熱菌蛋白酶的其中一者存在下來進行消化。尚有其他實施例會同時使用膠原蛋白酶與分散酶之酶活性物來進行消化。除了膠原蛋白酶與分散酶活性物外亦可利用多加入一玻尿酸酶活性物來進行消化者之方法。熟悉該項技藝人士將會瞭解到，許多種此類酶處理在該項技術領域中皆為習知可用於自各種組織來源分離出細胞。例如，用於組織解離且以商品名LIBERASE(Roche,Indianapolis,Ind.)販售之酶摻合物適合在快速方法中使用。其他酶來源為習知者，並且熟悉該項技藝人士亦可直接自此類酶之天然來源獲得這些酶。 熟悉該項技藝人士亦擁有充足知識，能夠針對新或其他酶或酶組合在用於分離本發明細胞方面評估其實用性。較佳酶處理為0.5、1、1.5或2小時久或更久。在其他較佳實施例中，在該解離步驟之酶處理期間將組織在37℃下孵養。
在本發明之某些實施例中，產後組織係分開為包含各種組織方面的斷片，舉例而言例如胎盤之新生兒、新生兒/母體與母體方面。接著根據本說明書中所述之方法藉由機械力及/或酶解離來解離分開之斷片。新生兒或母體系譜之細胞可藉由該項技術領域中習知的方式來識別，例如藉由核型分析(karyotype analysis)或Y染色體之原位雜交。
經分離之細胞或臍帶組織(UTC自其所衍生者)可用來起始或接種細胞培養。將經分離之細胞轉移至無菌組織培養容器，並且容器未經塗覆或經細胞外基質或配體如層黏蛋白、膠原蛋白(原生、變性或交聯)、明膠、纖連蛋白素與其他細胞外基質蛋白質塗覆。除了本說明書中所揭露之培養基外，可在任何能夠維持細胞生長之培養基中培養UTC，例如但不限於DMEM(高或低葡萄糖)、進階DMEM、DMEM/MCDB 201、伊格爾基礎培養基(Eagle’s basal medium)、Ham’s F10培養基(F10)、Ham’s F-12培養基(F12)、伊思考夫改良達爾伯克培養基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)、間葉幹細胞生長培養基(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium,MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640與以商品名CELL-GRO-FREE(Mediatch,Inc.,Herndon,Va.)販售之無血清/介質培養基。該培養基可補充一或多種組分，包括例如胎牛血清(FBS)(較佳為約2-15%(v/v))、馬血清(ES)、人血清(HS)、β-巰基乙醇(beta-mercaptoethanol,BME或2-ME，較佳為約0.001%(v/v))、一或多種生長因子，例如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子-1(IGF-1)、白血球抑制因子(LIF)與紅血球生成素(EPO)、胺基酸(包括L-纈胺酸)、與一或多種抗生素及/或抗黴劑以控制微生物汙染，例如青黴素G、硫酸鏈黴素、雙性殺黴素B、建它黴素及制黴菌素(單獨或合併使用上述者)。該培養基可包含如實例中所界定之生長培養基。
將該些細胞以讓細胞能夠生長之濃度下接種於培養容器中。在一較佳實施例中，將該些細胞在約0至約5%(依體積計)的CO2(在 空氣中)下培養。在某些較佳實施例中，將該些細胞在約2至約25% O2(在空氣中)下培養，較佳為約5至約20% O2(在空氣中)。較佳為將該些細胞在約25至約40℃的溫度下培養，並且更佳為在37℃下培養。較佳為將該些細胞在一孵養器中培養。該培養容器中的培養基可為靜止或經攪拌(例如使用一生物反應器)。較佳為使該UTC在低氧化壓力(oxidative stress)下生長(例如配合加入穀胱甘肽、維生素C、過氧化氫酶、維生素E、N-乙醯半胱胺酸)。「低氧化壓力」係指對於所培養細胞無自由基傷害或最低自由基傷害之條件。
用於選擇最適當培養基、培養基製備方式與細胞培養技術之方法在該項技術領域為熟知者，並且係描述於各種不同來源中，包括Doyle et al.,(eds.),1995,Cell & Tissue Culture：Laboratory Procedures,John Wiley & Sons,Chichester；與Ho and Wang(eds.),1991,Animal Cell Bioreactors,Butterworth-Heinemann,Boston，上述皆以引用方式併入本說明書中。
在培養分離之細胞或組織碎片一段足夠時間後，一UTC將會長出，此係由於自該產後組織遷移出來或細胞分裂，或者兩者皆是。在本發明的某些實施例中，將該UTC傳代至或者移至一含新鮮培養基(與初始使用相同或不同者)之不同培養容器中，而細胞群可在其中以有絲分裂的方式擴增。本發明之細胞可在傳代0與衰老(senescence)間的任何時點使用。較佳為將該些細胞傳代約3與約25次間，更佳為傳代約4至約12次，並且較佳為傳代10或11次。可執行選殖及/或次選殖(subcloning)以確認已分離出細胞的殖株族群(clonal population)。
在某些實施例中，出現在產後組織中的不同細胞型係離拆(fractionated)為亞群，而該UTC可自該些亞群分離出來。離拆或選擇可使用細胞分離標準技術來達成，包括但不限於進行酶處理以將產後組織解離為其組分細胞，接著選殖與選擇特定細胞型，包括但不限於根據形態及/或生物標記來選擇；選擇性生長所欲之細胞(正向選擇)、選擇性破壞不欲之細胞(負向選擇)；根據混合族群中之鑑別細胞可凝集性來進行分離，例如使用黃豆凝集素；冷凍-解凍程序；在混合族群中之細胞的鑑別貼附性；過濾；傳統與區帶(zonal)離心；離心淘析(對流離心(counter-streaming centrifugation))；單元重力分離(unit gravity separation)；逆流分配 (countercurrent distribution)；電泳；與螢光活化細胞分選(FACS)。關於殖株選擇與細胞分離技術之回顧，請參見Freshney,1994,Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Techniques,3rd Ed.,Wiley-Liss,Inc.,New York，其以引用方式併入本說明書中。
必要時會更換該培養基，例如藉由小心將該培養基自皿吸出(例如使用吸量管)然後以新鮮培養基補足。持續孵養直到皿中累積足夠細胞數目或密度。可取出原始外植之組織斷片然後使用標準技術或使用細胞刮杓來讓剩餘細胞進行胰蛋白酶消化(trypsinized)。在進行胰酶消化後，將該些細胞收集、移至新鮮培養基然後孵養如上。在某些實施例中，該培養基會在進行胰酶消化後約24小時更換至少一次以移除任何飄浮細胞。將培養物中剩餘之細胞視為是UTC。
該UTC可經凍存(cryopreserved)。因此，用於自體轉移之UTC(無論是用於母親或嬰兒)可衍生自在嬰兒出生後之適當產後組織，接著經過凍存從而可在母親與嬰兒發生需要移植事件時使用。
B.臍帶組織衍生細胞之特徵
該UTC可藉由下列方式來特徵化，例如藉由生長特徵(例如族群倍增能力、倍增時間、到達衰老之傳代數)、核型分析(例如正常核型、母體或新生兒系譜)、流動式細胞測量術(例如FACS分析)、免疫組織化學法及/或免疫細胞化學法(例如針對偵測抗原決定區者)、基因表現圖譜(例如基因晶片陣列分析、聚合酶連鎖反應(例如反轉錄酶PCR、即時PCR與傳統PCR))、蛋白質陣列分析、蛋白質分泌法(例如藉由血漿凝固檢定或PDC條件培養基分析(例如藉由酶聯免疫吸附檢定法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)))、混合淋巴球反應(例如作為PBMC刺激作用的量度方式)及/或其他該項技術領域中所習知的方法。
衍生自臍組織之合適UTC範例係寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110)，寄存日為2004年6月10日，並且獲派之ATCC存取號(Accession Number)如下：(1)品系代號UMB 022803(P7)所獲派之存取號為PTA-6067；以及(2)品系代號UMB 022803(P17)所獲派之存取號為PTA-6068。
在各種實施例中，該UTC具有一或多種下列生長特徵：(1)它們需要L-纈胺酸以在培養中生長；(2)它們能夠在含約5%到至少約20%氧的氣氛中生長(3)它們具有在培養物中進行至少約40次倍增(在到達衰老前)的潛能；以及(4)它們會在經塗覆或未經塗覆的組織培養容器上附著並擴增，其中該經塗覆之組織培養容器包含下列者之塗層：明膠、層黏蛋白、膠原蛋白、聚鳥胺酸、玻連蛋白素或纖連蛋白素。
在某些實施例中，該UTC具有一正常核型，其在該些細胞傳代時會維持。核型分析方法為熟悉該項技術領域者可使用且習知者。
在其他實施例中，該UTC可藉由會製造某些蛋白質來特徵化，包括(1)製造組織因子、波形蛋白(vimentin)與α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin)之至少其中一者；以及(2)製造CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、PD-L2與HLA-A,B,C細胞表面標記(如由流動式細胞測量術所偵測到者)。在其他實施例中，該UTC可藉由不會製造下列之至少一者來特徵化：CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G以及HLA-DR,DP,DQ細胞表面標記(如由流動式細胞測量術所偵測到者)。尤其較佳者為製造組織因子、波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白之至少兩者的細胞。更佳者為製造所有下列三種蛋白質即組織因子、波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白的細胞。
在其他實施例中，該UTC可藉由針對編碼在下列至少一者之基因的基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)會增加來特徵化：介白素8、網狀內皮素1(reticulon 1)、趨化激素(C-X-C基序)配體1(黑色素瘤生長刺激活性物，α)、趨化激素(C-X-C基序)配體6(顆粒性細胞趨化蛋白質2)、趨化激素(C-X-C基序)配體3、與腫瘤壞死因子，α-誘發蛋白質3。
在尚有其他實施例中，該UTC可藉由針對編碼在下列至少一者之基因的基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)會減少來特徵化：矮小同源盒2(short stature homeobox 2)、熱休克27kDa蛋白質2(heat shock 27kDa protein 2)、趨化激素(C-X-C基序)配體12(基質細胞衍生因子1)、彈性蛋白(瓣上主動脈狹窄，威廉氏症候群(Williams-Beuren syndrome))、智人(Homo sapiens)mRNA、cDNA DKFZp586M2022(來自殖株DKFZp586M2022)、間質同源盒2(生長休止特異性同源盒(growth arrest-specific homeo box))、sine oculis同源盒同源物1(果蠅(Drosophila))、αB水晶體蛋白、形態發生紊亂關聯活化物2(disheveled associated activator of morphogenesis 2)、DKFZP586B2420蛋白質、類似於neuralin 1者、結合四素(tetranectin，胞漿素原(plasminogen)結合蛋白質)、src同源體3(SH3)與多半胱胺酸區(cysteine rich domain)、膽固醇25-羥化酶、矮小相關轉錄因子3(runt-related transcription factor 3)、介白素11受體，α、原膠原C-內肽酶增強物(procollagen C-endopeptidase enhancer)、捲曲同源物7(frizzled homolog 7)(果蠅)、假想基因BC008967、第三型膠原蛋白α1、替拿素C(tenascin C,hexabrachion)、易洛魁族同源盒蛋白質5(iroquois homeobox protein 5)、希菲斯特蛋白(hephaestin)、組合蛋白(integrin)，β8、突觸囊泡醣蛋白2(synaptic vesicle glycoprotein 2)、神經胚細胞瘤，致腫瘤性抑制因子1、類胰島素生長因子結合蛋白質2，36kDa、智人(Homo sapiens)cDNA FLJ12280 fis，殖株MAMMA1001744類細胞介素受體因子1、鉀中間物/小電導鈣活化通道，次家族N，成員4、組合蛋白(integrin)，β7、具有PDZ-結合基序之轉錄共活化物(TAZ)、sine oculis同源盒同源物2(果蠅)、KIAA1034蛋白質、囊泡相關膜蛋白質5(肌短蛋白(myobrevin))、含EGF類fibulin細胞外基質蛋白質1(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1)、早期生長反應蛋白質3(early growth response 3)、無背端同源盒5(distal-less homeo box 5)、假想蛋白質FLJ20373、醛基-酮基還原酶家族1，成員C3(3-α羥類固醇去氫酶(3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase)，II型)、雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan)、具有PDZ-結合基序之轉錄共活化物(TAZ)、纖連蛋白素1、腦啡肽前質(proenkephalin)、組合蛋白(integrin)，類β1(具有類EGF重複區)、智人(Homo sapiens)mRNA全長插入物cDNA殖株EUROIMAGE 1968422、EphA3、KIAA0367蛋白質、利尿鈉胜肽受體C(natriuretic peptide receptor C)/鳥苷酸環化酶C(guanylate cyclase C)(心房利尿鈉胜肽受體C(atrionatriuretic peptide receptor C))、假想蛋白質FLJ14054、智人(Homo sapiens)mRNA、cDNA DKFZp564B222(來自殖株DKFZp564B222)、BCL2/類腺病毒E1B 19 kDa交互作用蛋白質3(adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like)、AE結合蛋白質1、與細胞色素c氧化酶次單元VIIa多肽1(肌肉)。
在其他實施例中，該UTC可藉由在培養時會分泌下列至少一者來特徵化：MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、MDC RANTES與TIMP1。此外，該UTC可藉由在培養時不會分泌下列至少一者來特徵化：TGF-beta2、ANG2、PDGFbb、MIP1A與VEGF(如由ELISA所偵測到者)。
在某些實施例中，該UTC係衍生自臍帶組織，並且該臍帶組織實質不含血、能夠在培養中自我新生與擴增、需要L-纈胺酸以供生長、可在至少約5%氧中生長，並且包含下列特徵之至少一者：在培養中會有至少約40次倍增的潛能；會在一經塗覆或未塗覆組織培養容器上附著並擴增，其中該經塗覆之組織培養容器包含下列者之塗層：明膠、層黏蛋白、膠原蛋白、聚鳥胺酸、玻連蛋白素或纖連蛋白素；會製造波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白；會製造CD10、CD13、CD44、CD73與CD90；以及，針對編碼介白素8與網狀內皮素1之基因的基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)會增加。在某些實施例中，此UTC不會製造CD45與CD117。
在較佳實施例中，該細胞包含兩或更多種上列生長、蛋白質/表面標記製造、基因表現或物質分泌特徵。更佳者為一包含三、四、五或更多上述特徵之細胞。再佳者為一包含六、七或更多上述特徵之UTC。再佳者為一包含所有上述特徵之細胞。
在與本發明搭配使用上(在其數種方面上)為目前較佳者的細胞為具有上述特徵之產後細胞，並且尤其是其中該些細胞具有正常核型並且在傳代時會維持正常核型者，而進一步是其中該些細胞會表現下列各標記者：CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α與HLA-A,B,C，其中該些細胞會製造免疫學上可偵測且對應上列標記之蛋白質。再佳者為除了前述者外不會製造對應於任何下列標記之蛋白質：CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR,DP,DQ(如由流動式細胞測量術所偵測到者)。
在一個實施例中，該UTC係分離自實質上不帶血之人類臍帶組織、能夠在培養中自我新生與擴增、具有分化之潛能、不會製造CD117或CD45並且不會表現hTERT或端粒酶。這些UTC可選擇地會表現氧化低密度脂蛋白受體1、網狀內皮素、趨化激素受體配體3及/或顆粒性細胞趨化蛋白質；及/或不會表現CD31或CD34；及/或會表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)增加之介白素8或網狀內皮素1水準；及/或會表現CD10、CD13、CD44、CD73與CD90。
在另一個實施例中，該UTC係分離自實質上不帶血之人類臍帶組織、能夠在培養中自我新生與擴增、具有分化之潛能、會表現CD13與CD90並且不會表現CD34與CD117。可選擇地，這些細胞不會表現hTERT或端粒酶。在又一實施例中，該些細胞亦會表現CD10、CD44與CD43。在一替代實施例中，該些細胞亦不會表現CD45與CD31。這些UTC可選擇地(i)會表現氧化低密度脂蛋白受體1、網狀內皮素、趨化激素受體配體3及/或顆粒性細胞趨化蛋白質；及/或(ii)會表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)增加之介白素8或網狀內皮素1水準。
在另一實施例中，該UTC係分離自實質上不帶血之人類臍帶組織、能夠在培養中自我新生與擴增、具有分化之潛能、會表現CD13、CD90、HLA-ABC並且不會表現CD34、CD117與HLA-DR。可選擇地，這些細胞亦不會表現hTERT或端粒酶。在一個實施例中，該些細胞亦會表現CD10、CD44與CD43。在一替代實施例中，該些細胞亦不會表現CD45與CD31。這些UTC可選擇地(i)會表現氧化低密度脂蛋白受體1、網狀內皮素、趨化激素受體配體3及/或顆粒性細胞趨化蛋白質；及/或(ii)會表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)增加之介白素8或網狀內皮素1水準。
在替代實施例中，該UTC係分離自實質上不帶血之人類臍帶組織、能夠在培養中自我新生與擴增、具有分化之潛能並且具有下列特徵：(1)會表現CD10、CD13、CD44、CD90與HLA-ABC；(2)不會表現CD31、CD34、CD45、HLA-DR與CD117；以及(3)不會表現hTERT或端粒酶。在替代實施例中，該UTC係分離自實質上不帶血之人類臍帶組織、能夠在培養中自我新生與擴增、具有分化之潛能並且具有下列特徵：(1)會表現 CD10、CD13、CD44、CD90與HLA-ABC；(2)不會表現CD31、CD34、CD45、HLA-DR與CD117；(3)不會表現hTERT或端粒酶；(4)會表現氧化低密度脂蛋白受體1、網狀內皮素、趨化激素受體配體3及/或顆粒性細胞趨化蛋白質；以及(4)會表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)增加之介白素8或網狀內皮素1水準。
在一個實施例中，該hUTC係以一可為同質性之細胞群來提供。在某些實施例中，該細胞群可為異質性。本發明之一異質性細胞群可包含至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的本發明UTC。本發明之異質性細胞群可進一步包含幹細胞或其他先驅細胞，例如肌母細胞(myoblast)或其他肌肉先驅細胞、血管母細胞(hemangioblast)或血管前體細胞；或其可進一步包含完全分化之骨骼肌細胞、平滑肌細胞、外皮細胞或血管內皮細胞。在某些實施例中，該族群實質上為同質性，即實質上僅包含該UTC(較佳為至少約96%、97%、98%、99%或更多UTC)。本發明之同質性細胞群係由臍衍生細胞構成。臍衍生細胞之同質性族群較佳為不含母體系譜細胞。細胞群之同質性可藉由任何該項技術領域中所習知的方法來達成，例如藉由細胞分選(例如流動式細胞測量術)或藉由殖株擴增(根據習知方法)。同質性UTC族群可包含產後衍生細胞之一殖株細胞系。
在一個實施例中，該hUTC之特徵在培養後會與該hUTC在培養前實質相同(例如標記圖譜及/或基因表現圖譜)。在一替代實施例中，該hUTC之特徵在培養後會與該hUTC在培養前相同(例如標記圖譜及/或基因表現圖譜)。在一個實施例中，該hUTC之至少CD13、CD34、CD90與CD117特徵在培養後會與該hUTC在培養前相同。
III.其他合適細胞
如以上本發明之某些實施例中所討論者，該培養基與無血清營養溶液可用來生長經分離之人類臍帶組織衍生細胞(「hUTC」或「UTC」)。此外，該培養基與無血清營養溶液可用來生長其他固著依賴性細胞。
在本發明的一個實施例中，該培養基與無血清營養溶液係用來生長其他固著依賴性細胞，例如衍生自胎盤的細胞。其他固著依賴性細胞的例子包括但不限於骨髓衍生間葉幹細胞、間葉幹細胞的骨髓衍生源祖、衍生自非骨髓組織(例如脂肪組織、肌肉組織)的細胞、血管(包括內乳房動脈)衍生細胞、衍生自牙髓之細胞。此外，羊水已顯示為固著依賴性幹細胞的極豐富來源。固著依賴性細胞的另一個例子為纖維母細胞，包括包皮纖維母細胞。
IV.培養方法
本發明之另一實施例為培養細胞的方法，其包含使用本發明之條件培養基與無血清營養溶液。該些方法可利用旋轉瓶、攪拌培養瓶及/或微載體。在較佳實施例中，該些方法係用來培養固著依賴性細胞(例如hUTC細胞)並且需要微載體。
在一較佳實施例中，該方法包含用本發明之條件培養基與無血清營養溶液來培養hUTC並且無需更換血清。如上所討論者，可使UTC在各種不同之培養基中生長。本發明之方法最佳為會減少血清使用並且增加體積生產力，以降低包含固著依賴性細胞(例如hUTC)之組成物的製造成本。再者，該方法能夠生長該些細胞(例如hUTC)並且無須進行培養基更換。
在旋轉瓶與微載體中生長細胞之例示性方法係分別揭露於美國揭露申請案第2007/0141700與2008/0166328號，上述皆以引用方式全文併入本說明書中，因為其關於旋轉瓶、微載體與在旋轉瓶與微載體上培養之描述。例示性合適旋轉瓶、攪拌培養瓶、微載體、上述者之特徵與合適培養參數係討論如下。
A.旋轉瓶
旋轉瓶培養系統在細胞培養技術領域中為習知者。如本說明書中所用者，旋轉瓶培養系統包含至少一感興趣之細胞系、生長培養基、旋轉瓶、一用於旋轉該些瓶之裝置與用於採獲該些細胞之方法。
旋轉瓶培養系統在細胞培養技術領域中為習知者。如本說明書中所用者，旋轉瓶培養系統包含至少一感興趣之細胞系、生長培養基、旋轉瓶、一用於旋轉該些瓶之裝置與用於採獲該些細胞之方法。
旋轉瓶培養系統典型進一步包含用於在孵養期間控制溫度之方法，以及用於無菌處理該些培養物之方法(例如在一開始用細胞接種該些瓶的期間，或者在後續轉移期間。)該些細胞之採獲可透過酶處理來達成，例如利用胰蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA、分散酶與膠原蛋白酶，或其他酶或酶組合(搭配或不搭配其他組分)。可使用其他市售產品例如但不限於TrypLETM Express(Gibco,Inc.)。該些細胞亦可藉由手動操作來採獲(包括例如批式離心)，或者採獲可自動化。
在一個實施例中，該些瓶係填充約100-300ml的生長培養基，在其他實施例中則使用約100-200ml。在一替代實施例中，瓶中置有約100-120ml或甚至105-115ml。在其他實施例中，該些瓶係填充有約112ml的生長培養基以達到最大族群倍增數。在一個實施例中，該些瓶係接種有約2,500至約10,000細胞/cm2。在一個實施例中，針對範例接種所用之範圍下限為小於約每平方公分3000細胞。該些接種瓶在貼附與生成期間會加以旋轉。旋轉速度可設定在約0.5至1rpm間。較佳的是，其旋轉係在約0.75與1rpm間。更佳的是，該些瓶係以約0.8至1rpm旋轉。
在另一個實施例中，旋轉瓶係填充約100-300ml的生長培養基，較佳為使用約300ml。該些瓶係接種有每平方公分約2500至約10,000細胞。在一個實施例中，針對範例接種所用之範圍下限為小於每平方公分約3000細胞。再佳者為其接種係在約2500細胞/cm2的實施例。該些接種瓶在貼附與生成期間會加以旋轉。旋轉速度係設定在約0.5至1rpm間。較佳的是，其旋轉係在約0.75與1rpm間。更佳的是，該些瓶係以約0.8至1rpm旋轉。接近或大約0.9-1.0rpm之旋轉為目前較佳者。
經填充與接種之旋轉瓶係旋轉與孵養約5至7日以達到最大倍增數。目前，約5.5至約6.5日之孵養時間為較佳者。
該些旋轉瓶可經一會幫助該些細胞附著於該些旋轉瓶之內表面的藥劑塗覆，例如明膠、細胞外基質分子(例如明膠、層黏蛋白、玻連蛋白素、纖連蛋白素、膠原蛋白I、IV與VI型)或類似者。此類市售經 塗覆瓶的一個例子為經CellBind(可得自Corning，目錄號3907)塗覆者。吾人會預想到，針對細胞之附著與生長，根據本說明書中所提供之方法將會找到各種可接受之塗覆劑。
B.攪拌培養瓶
攪拌培養瓶在細胞培養技術領域中亦為習知者。如本說明書中所用者，攪拌培養瓶包含至少一感興趣之細胞系、生長培養基、一或多個培養瓶、一用於旋轉該一或多個培養瓶之裝置與一用於採獲該些細胞之方法。
攪拌培養瓶培養系統典型進一步包含用於在孵養期間控制溫度之方法，以及用於無菌處理該些培養物之方法(例如在一開始用細胞接種該些培養瓶的期間，或者在後續轉移期間。)該些細胞之採獲可透過酶處理來達成，例如利用胰蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA、分散酶與膠原蛋白酶，或其他酶或酶組合(搭配或不搭配其他組分)。可使用其他市售產品例如但不限於TrypLETM Express(Gibco,Inc.)。該些細胞亦可藉由手動操作來採獲(包括例如批式離心)，或者採獲可自動化。
在一個實施例中，其旋轉速度係設定在介於約35至約65rpm間，或者介於約35與45rpm間，或者介於約40與約50rpm間，或者介於約45rpm與約55rpm間，或者介於約55至約65rpm間，或者從約50至約60rpm。在較佳實施例中，維持約40rpm或60rpm的旋轉速度。
在一個實施例中，使用3L攪拌培養瓶，其可填充有約3L的生長培養基、FBS、無血清營養溶液、微載體與細胞。在此實施例中，旋轉速度可設定在介於約35至45rpm間。較佳的是，其旋轉係約40rpm。
在另一實施例中，使用125ml的培養瓶。這些培養瓶可填充有含下列者之約100ml的溶液：生長培養基、FBS、無血清營養溶液、微載體與細胞。在一個實施例中，該些培養瓶含有約85ml至115ml的生長培養基、FBS、無血清營養溶液、微載體與細胞。在此實施例中，旋轉速度可設定在介於約55至65rpm間。較佳的是，其旋轉係約50rpm。
在又一實施例中，使用500ml的攪拌培養瓶。這些培養瓶可填充有含下列者之約500ml的溶液：生長培養基、FBS、無血清營養溶
在一替代實施例中，使用500ml的攪拌培養瓶。這些培養瓶可填充有含下列者之約500ml的溶液：生長培養基、FBS、無血清營養溶液、微載體與細胞。在一個實施例中，該些培養瓶含有約450ml至500ml的生長培養基、FBS、無血清營養溶液、微載體與細胞。在此實施例中，旋轉速度可設定在介於約35至45rpm間。較佳的是，其旋轉係約40rpm。
該些培養瓶可接種有約2,500至約10,000細胞/cm2。該些細胞可直接接種至該培養瓶中、至該培養瓶之表面上或至內置於該培養瓶中之微載體上。在一較佳實施例中，其接種係以約3,000至約7,500細胞/cm2來進行，或者以約3,000至約7,000，或者以約4,000至約7,000，或者以約3,000至約5,000，或者以約5,000至約7,000，或者以約3,500至約5,000，或者以約4,500至約7,500，或者約3,500至約5,500。該培養瓶在貼附與生成期間會加以旋轉。在一個實施例中，如果要最大化族群倍增率，經填充與接種之培養瓶係旋轉並孵養約5至7日，而約5至約6日的孵養時間為較佳者。
C.微載體
微載體培養為一種技術，其能夠實際進行固著依賴性細胞(固著依賴性產後細胞)之高產率培養。已專門針對培養體積在數毫升至超過一千升範圍之細胞(例如哺乳動物產後細胞)培養來開發微載體。該微載體為生物惰性並且會提供堅固但非堅硬的基材以用於經攪拌之微載體培養。該些微載體可為透明，從而能夠進行附著細胞的顯微檢驗。Cytodex® 3(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway N.J.)由化學偶合至交聯葡聚糖基質之變性膠原蛋白的薄層所組成。Cytodex® 3上的變性膠原蛋白層容易受各種蛋白酶(包括胰蛋白酶與膠原蛋白酶)消化，並且會提供自該些微載體移除細胞同時維持最大之細胞存活率、功能與完整性。
可使用無蛋白質之微載體來培養該些細胞。例如，用於製造與實驗室或研究用途且以HILLEX®(SoloHill Engineering,Inc.,Ann Arbor,MI)為商品名販售的微載體珠體為修飾聚苯乙烯珠體，其具有陽離子三甲基銨接附於其表面以為該微載體提供帶正電荷之表面。珠體直徑可在約90至約200μm的直徑範圍。
基於微載體之細胞培養方法會提供許多好處，包括在許多應用中容易進行下游處理。微載體典型在形狀上大致為球形，並且可為多孔性或無孔隙。使用微載體來進行細胞附著會有利於攪拌槽與相關用於生長固著依賴性細胞之反應器的使用。該些細胞會附著於輕易懸浮之微粒上。該懸浮性要求會限制該些微載體之物理參數。因此，微載體之平均直徑通常在50-2000μm的範圍。在某些應用中，無孔型微載體在約100至約250μm的範圍，而多孔型微載體珠體在約250至約2500μm的範圍。這些尺寸範圍會讓微載體之選擇得以進行，即大到足以容納許多固著依賴性細胞，而又小到足以形成具有適用於攪拌反應器中之性質的懸浮液。
在使用微載體珠體與類似者方面應該考慮的因素有：附著效率、免疫原性、生物相容性、生物降解能力、到達匯合(confluence)的時間、附著細胞的生長參數(包括每單位表面積最大可達密度、剝離(detachment)技術(若有需要)與剝離效率)、培養條件的規模可擴縮性(scalability)以及在擴大條件下的培養同質性、成功擴大剝離程序規模的能力與該些珠體是否將用於植入。這些考量可受到該些微載體珠體之表面性質影響，並且受到該微載體之孔隙率、直徑、密度與處理性質影響。
例如，該些微載體粒子或珠體之密度為一個考量。密度過高可能會造成該些微載體粒子或珠體在該懸浮液中沉降，或者傾向於完全朝向該培養容器的底部停留，並因而可能造成該些細胞、培養基與氣相在該反應器中的整體混合效果不佳。另一方面，密度太低可能會造成該微載體過度浮起。1.02至1.15g/cm3的密度為許多微載體珠體的典型密度。
小微載體粒子直徑與可加至一反應器中的粒子體積，會讓該些微載體能夠貢獻顯著的表面積，遠較旋轉瓶或其他生長固著依賴性細胞之方法(例如在盤上)中所能發現者要多。多孔性微載體會提供甚至更多的每單位體積或重量表面積。這些多孔性微載體具有能夠用來生長固著依賴性細胞的大量空孔。這些空孔會大幅提高表面積，並且可保護細胞免受有害機械效應，例如剪切應力(例如由於混合或由於氣體噴灑所致)。
該微載體之表面可經紋理化以增進細胞附著與增生。該微載體之表面紋理可藉由下列技術來達成，包括但不限於模製、鑄製、吸除(leeching)與蝕刻。該經紋理化表面之特徵解析度可在奈米尺度。該經紋理 化表面可用來在該微載體表面上引起特定細胞排列。該些多孔性微載體內之孔隙的表面亦可經紋理化以增進細胞附著與增生。孔隙之表面紋理可藉由下列技術來達成，例如模製、鑄製、吸除(leeching)與蝕刻。
該微載體之表面可經電漿塗覆以將特定電荷賦予微載體表面。這些電荷可增進細胞附著與增生。
在其他實施例中，該些微載體含有下列或者經下列塗覆：熱應答型(thermoresponsive)聚合物例如聚-N-異丙基丙烯醯胺，或者具有機電性質。該些微載體可具有一微電流，例如帶有粒狀之鋅與銅伽凡尼電偶的微載體，其會產生低度生物相關電流。該些微載體可為順磁性，例如順磁性鈣-藻酸鹽微載體。
多孔型與無孔型微粒狀載體皆為市售可得者。市售可得之無孔微載體例子包括Cytodex ® 1與Cytodex® 3，兩者皆為葡聚糖基微載體(來自GE Healthcare Life Sciences)。合適市售多孔性微載體包括CytolineTM與CytoporeTM(來自GE Healthcare Life Sciences)、Biosilon(NUNC)與Cultispher®(Percell Biolytical)。
在某些實施例中，本發明之方法與套組使用一葡聚糖珠體微載體，其概略粒徑為約60-90μm而密度為約1.03g/cm3(在25℃下)。在其他實施例中，本發明之方法與套組使用一葡聚糖珠體微載體，其概略粒徑為約114-198μm而密度為約1.04g/cm3(在25℃下)。在另一實施例中，本發明之方法與套組使用一葡聚糖珠體微載體，其概略粒徑為約60-87μm而密度為約1.04g/cm3(在25℃下)。在一替代實施例中，本發明之方法與套組使用多孔性微載體。這些多孔性微載體之粒徑為約200-280μm，有效表面積為約1.1m2/g dry而平均開孔直徑為約30μm。在其他實施例中，本發明之方法與套組使用具有經胺處理表面之微載體。在較佳實施例中，該些具有經胺處理表面之微載體的粒徑為約160-200μm，相對密度在約1.090-1.150的範圍，表面積為約515cm2/g。此類微載體可用含有5.5×105微載體/g的溶液來提供。
該些載體粒子亦可含有一生物活性劑。該載體粒子亦可含有一可調控細胞生長或功能或者組織環境(tissue milieu)的生物活性劑或因子。合適因子包括但不限於纖維母細胞生長因子、紅血球生成素、血管內 皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、骨形態發生蛋白(bone morphogenic protein)、轉變生長因子、腫瘤壞死因子、表皮生長因子與類胰島素生長因子。因而可使用完整的因子、仿劑或活性片段。
D.方法
一般而言，本發明之方法包含在本發明之培養基中培養(例如擴增)細胞，並且該培養基已補充血清(例如FBS)。在該些細胞已生長至所欲之密度後(例如經過一段約3-4日的期間)，將該無血清營養溶液加入。該些細胞可為固著依賴性細胞，可將其接種於一微載體上。該培養可在一旋轉瓶或攪拌培養瓶培養系統中進行。較佳的是，當將該些固著依賴性細胞接種於一微載體上時，則使用一攪拌培養瓶培養系統。所欲之該段時間係由諸如下列參數來決定：例如所欲之族群密度、所欲之族群倍增數或時間。在某些實施例中，該些細胞係用該無血清營養培養基來培養4至7日，該無血清營養培養基在約第3日加入。在其他實施例中，使該些細胞生長1-2次族群倍增或直至達到所欲之初始族群密度(在該無血清營養溶液加入前)。如上所討論者，該些方法能夠生長該些細胞(例如hUTC)而無須更換培養基。
1.培養經分離固著依賴性細胞之方法
本發明的一個實施例為一種用於培養(例如擴增)固著依賴性細胞之方法。該方法包含在一本發明培養基(已用血清補充)中培養經分離之固著依賴性細胞(接種於組織瓶表面或較佳為微載體上)，以及在該些細胞已經生長一段足夠時間以達所欲之初始族群密度後將一無血清營養溶液加入。在一個實施例中，在加入該無血清營養溶液前，使該些細胞生長介於約3與約7日間，或者介於約3與約5日，或者介於約4日與約5日。在一個實施例中，在加入該無血清營養溶液前，使該些細胞生長約3日。在另一實施例中，在加入該無血清營養溶液前，使該些細胞生長至達一或兩次族群倍增。在一較佳實施例中，將該些細胞接種於任何本說明書所揭露之微載體上並且使其在上述條件下在攪拌培養瓶中生長。在一個實施例中，該方法包含解凍一含這些細胞之細胞庫小瓶並且擴增該些細胞以 接種一製造容器。另一個實施例包含先分離該些細胞接著接種該些經分離細胞。
如所討論者，該培養基(包括用於這些方法中之培養基)可補充約2%至約20%的血清(例如FBS)。在一個實施例中，該培養基在其製備期間係補充血清(例如FBS)。在另一實施例中，該培養基係在使用前不久補充(例如經由加入一含血清(例如FBS)溶液)。在另一個實施例中，該培養基較佳係補充約2至15%(v/v)的FBS，或者約2至約10%，或者約3至約12%，或者約5至約15%，或者約4%至約10%。在所選擇的實施例中，該培養基係補充約7.5%、約10%或約15%(v/v)的FBS。
在另一實施例中，該方法亦涵括接種該些固著依賴性細胞。雖然目標接種密度可有變化，但在某些實施例中，為約5,000至約8,000，或者約5,500至約7,500，或者約6,000至約8,000，或者約6,500至約7,500活細胞/cm2，並且在微載體濃度為約12至約30，或者為約12至20，或者為約18至約25，或者為約15至約23g/L下接種。
2.接種經分離臍帶組織衍生細胞之方法
本發明的一個實施例為一種培養臍帶組織衍生細胞之方法。雖然此方法通常包含上述培養經分離固著依賴性細胞方法之步驟，但可能會有某些變化。因此，本發明的一個實施例為一種在懸浮培養中在攪拌培養瓶中培養經分離固著依賴性hUTC(附著於微載體上)至高細胞密度之方法，並且此係藉由用一無血清營養溶液來滋養該生長培養基。此方法最佳會免去培養基更換(例如在第3日)以一致的生長細胞>20,000細胞/cm2的需求。再者，此方法會改善hUTC傳代的穩健性(robustness)。此方法會利用本發明之培養基與無血清營養溶液。
該方法包含在本發明培養基中培養經分離hUTC(接種於一微載體上)一段足夠時間以讓該些細胞達到所欲之初始族群密度，並且本發明培養基係補充血清(例如FBS)。在某些實施例中，使用培養基實施例A、B或C。在某些實施例中，將該些細胞在一旋轉瓶中培養並且其培養係在一旋轉瓶系統中進行。在較佳實施例中，將該些細胞接種於微載體上、 在攪拌培養瓶中培養並且其培養係在該攪拌培養瓶系統中進行。在一個實施例中，將細胞在約37℃下在10% CO2氣氛中接種。
在另一實施例中，使該些培養瓶以約55至約65rpm的速率旋轉，或者約55rpm至約60rpm，或者約58rpm至約61rpm。在另一實施例中，使該些培養瓶以約35rpm至約45rpm的速率旋轉，或者約38rpm至約42rpm，或者約40rpm至約43rpm，或者約36rpm至約45rpm。在另一實施例中，該培養基中之微載體密度為約11.0至約13.0g/L。
在一個實施例中，將該hUTC在約37℃下在10% CO2氣氛中在125ml培養瓶中培養，使該培養瓶在約55rpm至約65rpm的rpm範圍(較佳為約60rpm)旋轉。在又一個實施例中，將該hUTC在約37℃下在10% CO2氣氛中在500ml培養瓶中培養，使該培養瓶在約55rpm至約65rpm的rpm範圍(較佳為約60rpm)旋轉。在又一個實施例中，將該hUTC在約37℃下在10% CO2氣氛中在500ml培養瓶中培養，使該培養瓶在約35rpm至約45rpm的rpm範圍(較佳為約40rpm)旋轉。在又一個實施例中，將該hUTC在約37℃下在10% CO2氣氛中在3l瓶中培養，使該培養瓶在約35rpm至約45rpm的rpm範圍(較佳為約40rpm)下旋轉。在這些實施例中，該些培養瓶可含有約11.0至約13.0g/L的微載體在該培養基中(較佳為約12g/L)。
如果要最大化族群密度，將該經填充與接種之培養瓶或旋轉瓶(含有hUTC瓶)旋轉並孵養至少約5至7日，而約5至約6日的孵養時間為較佳者。在孵養的半程點(即在約2.5至約3.5日(較佳為3日)後)時或者在該些細胞已達到所欲之初始細胞密度時，將本無血清營養溶液加至該hUTC培養中。在某些實施例中，使用無血清營養溶液實施例A、B或C。
在一較佳實施例中，該些細胞係生長一段足夠時間以讓該些細胞達到所欲之初始族群密度(在添加該無血清營養溶液前)。
因此，在一個實施例中，該方法包含使臍帶組織衍生細胞(接種在微載體上)在一本發明培養基中生長一段足夠時間以讓該些細胞達到所欲之初始族群密度；在該些細胞已達到所欲之初始族群密度後加入一無 血清營養溶液；以及使該些細胞生長一段足夠時間以讓該些細胞達到所欲之最終族群密度。
在另一實施例中，使用培養基實施例A與無血清營養溶液實施例A。在另一實施例中，使用培養基實施例B與無血清營養溶液實施例B。在一個實施例中，使用培養基實施例C與無血清營養溶液實施例C。
在一個實施例中，該方法包含在培養前用hUTC接種微載體。該些微載體可為以上提及之微載體的任一者。在某些實施例中，該些微載體具有一經胺處理表面。在較佳實施例中，該些具有經胺處理表面之微載體的粒徑為約160-200μm，相對密度在約1.090-1.150的範圍，表面積為約515cm2/g。在一個實施例中，該些微載體為Hillex® II Ultra。
雖然目標接種密度可有變化，但在某些實施例中，為約5,000至約8,000，或者約5,500至約7,500，或者約6,000至約8,000，或者約6,500至約7,500活細胞/cm2，並且在微載體濃度為約15至約30，或者為約18至約25，或者為約15至約23g/L下接種。將該些接種之細胞加至一培養瓶。或者，該接種係在一培養瓶中進行。在一個實施例中，該接種包含解凍經凍存之hTUC。在一個實施例中，該方法進一步包含解凍經凍存之hTUC以及在接種該微載體前擴增該些細胞。在一個實施例中，該些細胞之擴增係在一微載體上進行。
在一個實施例中，用於該方法中以生長hUTC之培養基係補充約2%至約20%的血清(例如FBS)。在一個實施例中，培養基在其製備期間係補充血清(例如FBS)。在另一實施例中，該培養基係在使用前不久補充(例如經由加入一含血清(例如FBS)溶液)。在一個實施例中，該培養基較佳係補充約2至15%(v/v)的FBS，或者約2至約10%，或者約3至約12%，或者約5至約15%，或者約4%至約10%，或者約8%至約15%，或者約10%至約15%。在所選用的實施例中，該培養基係補充約7.5%、約10%或約15%(v/v)的FBS。
3.本發明方法之其他特徵
本發明方法中之獨立變項(可用來最大化攪拌培養瓶或旋轉瓶培養中之族群倍增數且無須更換培養基者)為旋轉速度、將細胞接種至 瓶中的密度、微載體數量、孵養時間、培養基種類、無血清營養溶液種類與瓶中所置放之培養基體積。熟悉該項技藝人士將會理解到，測試範圍以外的其他值可使用相同方法來進行常規測試，並且這些值可證實會在族群倍增數上提供增量得利。相依變項之最大反應(此處即所達到之族群倍增數)係以這些參數之函數來量度，並且將本說明書中未例示之實施例預想為本揭露之一部分。
依據所提供之方法來培養的細胞(例如hUTC)具有下列特徵，即實質上具有與起始細胞相同之細胞表面標記圖譜或基因表現圖譜。在一個實施例中，依據所提供之方法來培養的細胞具有下列特徵，即具有與起始細胞實質相同之細胞表面標記圖譜或基因表現圖譜。針對許多基於細胞之療法的應用而言，重要的是在擴大培養條件規模以增加數量時，細胞特徵不會改變。例如，形態學而言，有助於區別或表示該治療細胞之表面標記與特徵基因(hallmark gene)表現就算不完全相同，實質上應沒有改變。依據本發明與其中之方法所提供的細胞相較於在實驗室條件與規模下生長的細胞，在此類特徵方面實質上沒有改變或較佳為相同。
V.包含該培養基與無血清營養溶液之套組
本發明之另一實施例為一種用於生長細胞的套組，其包含本發明之培養基與該無血清營養溶液。在一個實施例中，該套組進一步包含將該些細胞接種於該些微載體上。在一個較佳實施例中，該套組包含人類臍帶組織衍生細胞。該套組亦可進一步包含使用說明。可選擇地，該套組進一步包含微載體與血清如胎牛血清。在一替代實施例中，該套組亦可包含一旋轉瓶系統。
即使在未有進一步說明下，據信該項技術領域中具有通常知識者可使用前述說明與下列說明性實例來製造與利用本發明並且實施所請求之方法。下列操作實例因此具體指出本發明之較佳實施例，並且不將其解讀為以任何方式對本揭露之其他部分造成限制。
實例 實例1 在帶有滋養培養基之攪拌培養瓶中生長與採獲微載體上之hUTC
在此實例中，對於在帶有各種滋養培養基之攪拌培養瓶中生長與採獲微載體上hUTC方面進行研究。針對此實例中之研究，臍帶組織衍生細胞係擴增自一接種體，然後在各種不同之生長條件(條件1-9)下生長，上述各者使用如下所描述之不同培養基。
用於該些研究中之微載體為Hillex® Ultra(Solohill Engineering,Ann Arbor,MI)，其表面積為515cm2/g。
如此實例中所用者，用語「傳代」係定義為使用來自一不同容器之匯合(confluent)微載體來接種一含有新鮮微載體之容器。再者，如此實例中所用者，用語「族群倍增」係定義為細胞群在經過一段給定時間已倍增的次數，並且係計算如下：
細胞計數程序
許多狀況下會要求進行細胞計數，而細胞計數係透過下列程序來進行。將10ml樣本自該培養中無菌取出然後轉移至15ml錐形管中。接著將該樣本在1600 RPM下離心5分鐘。將上層液小心取出並確保沒有取出任何微載體。接著將5至10ml的TrypLETM Select(Gibco®)(預熱至37℃)加至微載體中然後在旋轉器上搖動15至30分鐘。接著將離心管之內容物轉移至50ml錐形管中並通過40-μm濾器以移除微載體，並且只讓剝離之細胞通過。透過濾器執行兩次清洗(以1×PBS)。接著將50ml錐形管在1600 RPM下離心5分鐘。將上層液小心取出並且不擾動細胞沉澱物，直到約1至2ml的上層液尚留在管中。使用吸量管測量此殘留體積並使細胞再懸浮於此體積中。使用CEDEX(Innovatis)細胞計數設備來計數所 生成之細胞懸浮液，該設備使用台盼藍(Trypan Blue)排除法。基於CEDEX細胞計數結果，培養容器中之細胞濃度係計算如下：
細胞培養程序
將冷凍hUTC之小瓶解凍然後用新鮮培養基來清洗。將細胞懸浮液轉移至125ml玻璃攪拌培養瓶(含培養基與微載體)中。將這些解凍之細胞用來準備接種體。
準備接種體細胞
將接種體在對照培養基(由DMEM與15% v/v的FBS並具有12g/L微載體濃度構成)中擴增經過數次傳代，並且擴增係在不同尺寸(125ml、500ml與3L)之玻璃攪拌培養瓶(Corning,NY)中進行。接種體中之細胞的累積族群倍增數係小於35。接種體擴增期間針對傳代與培養條件的標準係列示於下表中。在傳代的目標日會執行細胞計數，並且如果達到傳代的目標密度，即會根據新容器中的目標接種密度，將細胞傳代至新容器中。如果未達到傳代的目標密度，則會進行80%培養基更換並在隔日計數細胞。關於培養基更換，將該容器靜置於攪拌平台一旁並讓微載體重力沉澱5分鐘，然後無菌取出80%的培養基(在未取出該些微載體下)並將等量新鮮培養基加入，然後將該容器置回孵養器中的攪拌台平上。
接種體製備的連續傳代期間所用的生長條件與參數係描述於表1-1中。
此實例中所用的各種生長條件
針對各條件1至9，將孵養日視為第0日。亦針對各該些條件，執行接種體的細胞計數。
條件1(對照組)：此條件的目標接種密度為~6000活細胞/cm2(在微載體濃度為~18g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~9g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由DMEM與15%(v/v)的FBS所構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在60 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，使用DMEM+15% FBS進行80%培養基更換。使用 上述程序定期執行細胞計數。在第3與5日，分別將3ml與2.5ml的葡萄糖加至培養瓶。在第3日將2.5ml的200mM L-麩醯胺酸加入。
條件2：此條件的目標接種密度為~6000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M5基礎培養基與15%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在60 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F5加入。未執行培養基更換。此外，在第3日，將2.5ml的葡萄糖加入。如細胞計數段落中所釋明者執行定期細胞計數。在第5日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
條件3：此條件的目標接種密度為~7000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M1基礎培養基與15%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在45 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F1加入。未執行培養基更換。如細胞計數段落中所釋明者執行定期細胞計數。在第3日將2.5ml的葡萄糖加入。在第4日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
條件4：此條件的目標接種密度為~7000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M2基礎培養基與15%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在45 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F2加入。未執行培養基更換。如細胞計數段落中 所釋明者執行定期細胞計數。在第3日將2.5ml的葡萄糖(220g/L的右旋糖單水合物水溶液)加入。在第4日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
條件5：此條件的目標接種密度為~7000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M3基礎培養基與15%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在45 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F3加入。未執行培養基更換。如細胞計數段落中所釋明者執行定期細胞計數。在第3日將2.5ml的葡萄糖(220g/L的右旋糖單水合物水溶液)加入。在第4日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
條件6：此條件的目標接種密度為~7000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M4基礎培養基與15%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在45 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F4加入。未執行培養基更換。如細胞計數段落中所釋明者執行定期細胞計數。在第3日將2.5ml的葡萄糖(220g/L的右旋糖單水合物水溶液)加入。在第4日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
條件7：此條件的目標接種密度為~7000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M5基礎培 養基與15%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在45 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F5加入。未執行培養基更換。如細胞計數段落中所釋明者執行定期細胞計數。在第3日將2.5ml的葡萄糖(220g/L的右旋糖單水合物水溶液)加入。在第4日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
條件8：此條件的目標接種密度為~7000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加inoculum入至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M6基礎培養基與15%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在45 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F6加入。未執行培養基更換。如細胞計數段落中所釋明者執行定期細胞計數。在第3日將2.5ml的葡萄糖(220g/L的右旋糖單水合物水溶液)加入。在第4日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
條件9：此條件的目標接種密度為~7000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M7基礎培養基與15%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在45 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F7加入。未執行培養基更換。如細胞計數段落中所釋明者執行定期細胞計數。在第3日將2.5ml的葡萄糖(220g/L的右旋糖單水合物水溶液)加入。在第4日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
採獲
在第6日，採獲所有培養瓶。關於採獲，讓微載體重力沉澱然後將培養基儘可能移除(在不取出任何微載體下)。將250-300ml的TrypLETM(在37℃下預熱)加至培養瓶並且置於攪拌平台(在37℃下的孵養器中)上。在30分鐘後，使攪拌停止然後自培養瓶中取出25ml樣本並且通過40μm濾器過濾。將持留在濾器上的微載體拋棄，然後藉由將樣本直接在CEDEX上運行來執行樣本的細胞計數。根據加入的TrypLETM體積與所得的細胞計數結果，計算得到容器中的總細胞數與細胞密度(細胞/cm2)。
細胞培養基的組成
DMEM(具有1g/L葡萄糖、4mM L-麩醯胺酸與3.7g/L碳酸氫鈉且無丙酮酸鈉與酚紅)為用於條件1(對照)的基礎培養基。
亦測試數種其他基礎培養基以找出一些對於免除培養基更換(藉以降低血清消耗)而言極為重要的組分。用於配方中的其中一個組分為牛血清白蛋白，其提供形式為市售可得之AlbuMAX® I(GibcoTM Cell Culture,Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，其為富含脂質之牛血清白蛋白。表1-2提供基礎培養基(M1-M7)之配方。基礎培養基與飼養料培養基皆含有市售之細胞膜穩定劑與抗發泡劑Pluronic® F68。
如上所描述者，在第3日，條件1中會進行80%培養基更換。關於其餘條件，則將飼養料加入以免除培養基更換。不同之飼養料配方係示於表1-3。表1-3所示之用量代表當將該飼養料加入時，每升(L)培養體積的該組分之重量(g)增加。
條件1至9中所用的培養基全都有FBS加至其中。FBS的組分係如下所示：
結果
不同條件下的細胞計數結果係示於下表1-5。該些結果可分成兩部分來分析。透過比較條件1與2的結果，明顯可看出組合M5培養基與第3日的F5飼養料會免除培養基更換的需求。此點相當重要，因為這會大幅降低血清濃度達超過44%。透過比較條件3至9的結果，明顯可看出下列三種條件相較於其他者有最低的表現：條件6，M4基礎培養基+15% FBS以及在第3日使用F4飼養料；條件8，M6基礎培養基+15% FBS以及在第3日使用F6飼養料；與條件9，M7基礎培養基+15% FBS以及在第3日使用F7飼養料。進一步分析該些配方會發現這三種條件皆未含有核酸衍生物在其培養基或飼養料中。因此，亦可推斷核酸衍生物對於hUTC生長極為重要。此實例展示藉由滋養培養基以及在第3日補充額外培養基組分使hUTC可在未進行培養基更換下生長6日，並且核酸衍生物對於要維持細胞有類似之生長而言極為重要。
實例2 微載體上之HUTC在含有滋養培養基之攪拌培養瓶中的生長與連續傳代
附著於微載體上之人類臍組織細胞(hUTC)在攪拌培養瓶內之懸浮培養中的連續傳代，如果在第3日細胞未達>20,000細胞/cm2的預定最佳細胞密度，則需要進行培養基更換。此培養基更換會使過程增加額外操作並使得預測細胞傳代時程更加困難。因此，此傳代細胞程序在商業上並非理想者。hUTC可藉由更換含15%胎牛血清之細胞生長培養基來生長至高細胞密度。此實例研究在商業上更為理想之其他傳代hUTC方法。附著於微載體上之hUTC係藉由用無血清營養素滋養生長培養基，而在攪拌培養瓶內之懸浮培養中生長至高細胞密度。此方法會免去在第3日進行培養基更換的需求以一致的生長細胞>20,000細胞/cm2。此方法會改善hUTC傳代的過程穩健性。
下列係用於此研究中：使用DMEM(具有2g/L葡萄糖、4mM L-麩醯胺酸與3.7g/L碳酸氫鈉且無丙酮酸鈉與酚紅)、胎牛血清(15% v/v)、M5基礎培養基(請參見以上實例1)、F5飼養料(請參見以上實例1)、與Hillex® Ultra(Solohill Engineering,Ann Arbor,MI)微載體。
表面標記分析方法：使用達爾伯克磷酸鹽緩衝液(DPBS)中的3% FBS(無Ca或Mg)作為染色緩衝液。使用六種抗體來識別表面標記並且使用兩種抗體作為對照。用於本檢定之抗體及其在染色緩衝液中之稀釋係列示於下表2-1。
方法：執行樣本的細胞計數並且將2.5×106細胞再懸浮於10ml的DMEM+15% FBS培養基中。接著將細胞離心、移除上層液然後再懸浮於染色緩衝液中以獲得1×106細胞/ml的細胞濃度。接著將此細胞懸浮液分配至不同管中而使各管收到20000細胞。接著如表2-1中所示將適當量的經稀釋抗體與染色緩衝液加入。接著在2-8℃下孵養樣本30分鐘。在孵養後，將3ml的DPBS加入並將樣本離心。將上層液移除並將細胞沉澱物再懸浮於500μl的DPBS中。接著使樣本在Guava® PCATM儀器(Millipore,MD,USA)上運行。在六種表面標記中，三種為陽性標記(CD13,CD90,HLA-ABC)而三種為陰性標記(CD34,CD117,HLA-DR)。
培養條件
hUTC之培養與連續傳代方法係釋明於實例1中。如所提及者，此連續傳代使用DMEM以及15% FBS作為培養基並且常需要進行培養基更換以符合傳代標準。在此實例中，吾人嘗試在連續傳代期間免去頻繁進行培養基更換之需求。此係藉由使用改良M5培養基(具有2g/L的葡萄糖而非1g/L)與15% FBS(v/v)來達成。利用此改良M5培養基以及15% FBS，可將傳代日固定並且經過六次傳代仍未執行培養基更換。培養條件與標準係呈現於下表2-2中。
細胞經過六次傳代有強健的生長，如下表2-3所示。在僅使用DMEM+15% FBS的過程中，細胞常需要在傳代前一天進行培養基更換以達到1.5的族群倍增，藉由將傳代期間多延長一日。利用滋養培養基，細胞在3日內會一貫具有至少超過1.5次族群倍增(距小瓶解凍4日)並且不需要進行任何培養基更換。細胞在此培養基中經過七次傳代後仍保有其身份(identity)，接著在此培養基中使這些細胞生長6日(在此6日培養的第3日使用F5飼養料)。這些細胞的表面標記分析結果係示於下表2-4。
實例3 微載體上hUTC在血清減量培養基中在攪拌培養瓶中的生長
人類臍組織細胞(hUTC)在藉由在試驗第3日更換含15% FBS細胞生長培養基而生長至高細胞密度。培養基中有高血清濃度以及進行培養基更換從商業角度來看皆為不理想者，因為此會造成高血清成本、製造時需使用高量血清並且需要額外操作調控。此實例揭露一種使附著於微載體上之hUTC生長的方法，hUTC係在血清減量生長培養基中生長並且無須進行培養基更換，同時又能達到高細胞密度。
實例中所用之培養基為M5基礎培養基(請參見以上)，其具有2g/L D-葡萄糖而非1g/L D-葡萄糖，並且加入胎牛血清。使用F5飼養料培養基。以220g/L的右旋糖單水合物水溶液來提供葡萄糖。以200mM溶液來提供麩醯胺酸。在此實例中會研究不同之生長條件。這些條件係描述如下。如這些條件中所用者，將接種日視為第0日。再者，各條件中皆使用Hillex® Ultra(Solohill Engineering,Ann Arbor,MI)微載體。
條件1(15% FBS)：執行接種體的細胞計數。此條件的目標接種密度為~6000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M5基礎培養基與15%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在60 RPM下)並且攪拌 平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F5加入。未執行培養基更換。如細胞計數段落中所釋明者執行定期細胞計數。在第3與5日將2.5ml的葡萄糖加入。在第4日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
條件2(10% FBS)：執行接種體的細胞計數。此條件的目標接種密度為~6000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M5基礎培養基與10%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在60 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F5加入。未執行培養基更換。如細胞計數段落中所釋明者執行定期細胞計數。在第3與5日將2.5ml的葡萄糖加入。在第4日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
條件3(7.5% FBS)：執行接種體的細胞計數。此條件的目標接種密度為~6000活細胞/cm2(在微載體濃度為~20g/L下)。根據接種體的細胞計數，將所欲之接種體體積加至經高壓蒸氣滅菌的新500ml玻璃攪拌培養瓶。讓微載體重力沉澱。自接種體取出培養基直到剩下~100ml在培養瓶中。接著將新鮮微載體加入，從而導致培養瓶中有~10g的最終微載體重量。將新鮮培養基(由M5基礎培養基與7.5%(v/v)的FBS構成)加入以將體積增加至500ml。將培養瓶置於攪拌平台上(在60 RPM下)並且攪拌平台係置於37℃與10% CO2孵養器中。在第3日，將飼養料F5加入。未執行培養基更換。如細胞計數段落中所釋明者執行定期細胞計數。在第3與5日將2.5ml的葡萄糖加入。在第4日，將5ml的200mM L-麩醯胺酸加至培養瓶。
採獲：在第6日，採獲該些培養瓶。關於採獲，讓微載體重力沉澱然後將培養基儘可能取出(在不取出任何微載體下)。將300ml的TrypLETM(在37℃下預熱)加至培養瓶並且置於攪拌平台(在37℃下的孵養器中)上。在30分鐘後，使攪拌停止然後自培養瓶中取出25ml並且通 過40μm濾器過濾。將持留在濾器上的微載體拋棄，然後藉由將樣本直接在CEDEX上運行來執行樣本的細胞計數。根據加入的TrypLETM體積與所得的細胞計數結果，計算得到容器中的總細胞數與細胞密度(細胞/cm2)。
結果：三種條件(各具有不同FBS濃度)下的細胞計數結果係示於下表中。除了此實例的結果外，亦包括來自實例1條件1(DMEM+15% FBS並且在第3日進行培養基更換)的結果以供比較。因此，滋養培養基不僅免去培養基更換的需求，且亦可降低培養基中的血清濃度，從而進一步將培養中的血清用量減至最低。
實例4 細胞分離
臍細胞分離。臍帶係得自國家疾病研究資訊交換中心(National Disease Research Interchange,NDRI,Philadelphia,PA)。組織係在正常分娩後獲得。細胞分離規程係在層流櫃(laminar flow hood)中無菌執行。為了要去除血與碎屑，在磷酸鹽緩衝液(PBS；Invitrogen,Carlsbad,CA)中並且於100U/ml的青黴素、100mg/ml的鏈黴素與0.25μg/ml的雙性殺黴素B(Invitrogen Carlsbad,CA)存在下清洗臍帶。接著在150cm2組織培養盤上並且於50ml的培養基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖；Invitrogen)存在下解離組織，直到將組織切碎為細泥。將切碎的組織轉移至50ml錐形瓶(每瓶約5g的組織)。
接著在DMEM-低葡萄糖培養基或DMEM-高葡萄糖培養基中消化組織，各培養基皆含有100U/ml的青黴素、100mg/ml的鏈黴素、 0.25μg/ml的雙性殺黴素B與消化酶。在一些實驗中，使用膠原蛋白酶與分散酶的酶混合物(「C：D」)(膠原蛋白酶(Sigma,St Louis,MO)，500U/ml；與分散酶(Invitrogen)，50U/ml，在DMEM-低葡萄糖培養基中)。在其他實驗中，使用膠原蛋白酶、分散酶與玻尿酸酶的混合物(「C：D：H」)(C：D：H=膠原蛋白酶，500U/ml；分散酶，50U/ml；與玻尿酸酶(Sigma)，5U/ml，在DMEM-低葡萄糖中)。使含有組織、培養基與消化酶的錐形瓶在37℃下在迴轉式振盪器(Environ,Brooklyn,NY)中以225rpm孵養2小時。
在消化後，將組織以150×g離心5分鐘，將上層液吸出。將沉澱物再懸浮於20ml的生長培養基(DMEM：低葡萄糖(Invitrogen)、15%(v/v)胎牛血清(FBS；合成胎牛血清(defined fetal bovine serum)；Lot #AND18475；Hyclone,Logan,UT)、0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma)、100U/ml的青黴素、100μg/ml的鏈黴素與0.25μg/ml的雙性殺黴素B(各皆來自Invitrogen,Carlsbad,CA))中。使細胞懸浮液通過70μm耐綸BD FALCON細胞濾器(BD Biosciences,San Jose,CA)過濾。使額外5ml含生長培養基的潤洗液通過濾器。接著使細胞懸浮液通過40-μm的耐綸細胞濾器(BD Biosciences,San Jose,CA)然後用額外5ml的生長培養基潤洗來趕出。
將濾液再懸浮於生長培養基(總體積50ml)中然後以150×g離心5分鐘。將上層液吸出然後將細胞再懸浮於50ml的新鮮生長培養基中。將此過程再重複兩次。
在最終離心後，將上層液吸出然後將細胞沉澱物再懸浮於5ml的新鮮生長培養基中。使用台盼藍染色來測定活細胞數目。接著在標準條件下培養細胞。
將分離自臍帶組織的細胞以5,000細胞/cm2接種於經明膠塗覆T-75培養瓶(Corning Inc.,Corning,NY)上並且於生長培養基中。在兩日後，將已耗盡的培養基與未貼附的細胞自培養瓶中吸出。用PBS清洗貼附細胞三次以去除碎屑與血衍生細胞。接著用生長培養基補養細胞並讓其生長至匯合(自傳代0至傳代1約10日)。在後續傳代時(自傳代1至2等等)，細胞會在4-5日後達到次匯合(75-85%匯合)。針對這些後續傳代，以5,000細胞/cm2接種細胞。使細胞在加濕孵養器(具有5%二氧化碳在37℃下)生長。
在一些實驗中，細胞係在DMEM-低葡萄糖培養基中由產後組織分離，在此之前先用LIBERASE(2.5mg/ml,Blendzyme 3；Roche Applied Sciences,Indianapolis,IN)與玻尿酸酶(5U/ml,Sigma)消化。組織消化與細胞分離係針對以上之其他蛋白酶消化而描述，然而，使用的是LIBERASE/玻尿酸酶混合物而非C：D或C：D：H酶混合物。用LIBERASE消化組織會使來自產後組織迅速擴增的細胞族群得以分離出來。
對於使用不同酶組合以自臍帶分離出細胞的程序進行比較。用於消化比較之酶包括：i)膠原蛋白酶；ii)分散酶；iii)玻尿酸酶；iv)膠原蛋白酶：分散酶混合物(C：D)；v)膠原蛋白酶：玻尿酸酶混合物(C：H)；vi)分散酶：玻尿酸酶混合物(D：H)；與vii)膠原蛋白酶：分散酶：玻尿酸酶混合物(C：D：H)。觀察利用這些不同酶消化條件所得之細胞分離效果差異(請參見表4-1)。
藉由不同方法對自臍帶分離出細胞池進行其他嘗試。在一個例子中，將臍帶切片然後用生長培養基清洗以排出血塊與凝膠狀材料。收集血、凝膠狀材料與生長培養基然後以150×g離心。將沉澱物再懸浮並接種於經明膠塗覆培養瓶上並於生長培養基中。透過這些實驗，即會分離出會迅速擴增的細胞群。
亦已將細胞自臍帶血樣本(得自NDRI)分離出來。所用之分離規程係Ho et al.之國際專利申請案PCT/US2002/029971中者。將臍帶血(NDRI,Philadelphia PA)樣本(分別為50ml與10.5ml)與裂解緩衝液(經濾器消毒之155mM氯化銨、10毫莫耳碳酸氫鉀、緩衝至pH 7.2之0.1mM EDTA(所有組分皆來自Sigma,St.Louis,MO))混合。使細胞以1：20臍帶血對裂解緩衝液的比例溶解。使所生成的細胞懸浮液渦動5秒鐘，然後在環境溫度下孵養2分鐘。將溶解產物離心(以200×g離心10分鐘)。將細胞沉澱物再懸浮於完全最低必需培養基(Complete Minimal Essential Medium,Gibco,Carlsbad CA)中，該培養基中含有10%胎牛血清(Hyclone,Logan UT)、4mM麩醯胺酸(Mediatech Herndon,VA)、100U/ml青黴素與100μg/ml鏈黴素(Gibco,Carlsbad,CA)。將再懸浮之細胞離心(以200×g離心10分鐘)、將上層液吸出然後在完全培養基中清洗細胞沉澱物。將細胞直接接種 至T75培養瓶(Corning,NY)、T75經層黏蛋白塗覆培養瓶或T175經纖連蛋白素塗覆培養瓶(both Becton Dickinson,Bedford,MA)。
為了要判定細胞群是否可在不同條件下分離並且在分離後是否可立即在各種條件下擴增，根據以上提供之程序使用C：D：H的酶組合，將細胞在含有或未含0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma,St.Louis,MO)的生長培養基中消化。所有細胞皆於100U/ml青黴素與100μg/ml鏈黴素存在下生長。在所有測試條件下，細胞皆在傳代0與1間良好附著與擴增(表4-2)。條件5-8與13-16中之細胞皆顯示在接種後能夠增生多達4次傳代，將這些細胞在此時點凍存。
C：D：H組合會提供最佳分離後細胞產率，並且比起其他條件能夠在培養中產生擴增更多代的細胞(表4-1)。單獨使用膠原蛋白酶或玻尿酸酶無法獲得可擴增的細胞群。未試圖判定此結果是否專屬於所測試之膠原蛋白酶。
在所有針對酶消化與生長所測試的條件下，細胞皆在傳代0與1間良好附著與擴增(表4-2)。條件5-8與13-16中之細胞皆在接種後能夠良好增生多達四次傳代，將這些細胞在此時點凍存。所有細胞皆經凍存以備進一步分析。
已成核之細胞會迅速附著與生長。以流動式細胞測量術分析這些細胞，而這些細胞與透過酶消化所得之細胞相似。
製品含有紅血球與血小板。在前3個星期期間沒有已成核之細胞附著與分裂。在接種後3個星期更換培養基但仍未觀察到附著與生長。
可使用膠原蛋白酶(金屬蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)與玻尿酸酶(會裂解玻尿酸之黏液分解酶)的酶組合來將細胞群自臍組織有效率分離出來。亦可使用LIBERASE，其為膠原蛋白酶與中性蛋白酶之摻合物。亦可使用Blendzyme 3並搭配玻尿酸酶來分離細胞，Blendzyme 3為膠原蛋白酶(4 Wunsch U/g)與嗜熱菌蛋白酶(1714酪蛋白U/g)。當在有生長擴增培養基的明膠塗覆之塑膠上生長時，這些細胞會迅速擴增經過許多次傳代。
亦會自臍帶中的殘餘血分離出細胞，但非自臍帶血。自組織洗出的血塊中之所以存在細胞(在所用之條件下會貼附與生長)，可能是因為細胞在解剖過程期間釋出。
實例5 細胞的核型分析
細胞療法中所用之細胞系較佳為具有同質性並且不含任何汙染細胞型。細胞療法所用之人類細胞應擁有正常數目(46)的具有正常結構染色體。為了要識別出具有同質性且不含來自非臍組織來源之臍衍生細胞系，對於細胞樣本之核型進行分析。
在生長培養基中培養來自男新生兒之產後組織的UTC。選用來自男新生兒(X,Y)的產後組織以能夠區別新生兒衍生細胞與母體衍生細胞(X,X)。將細胞以每平方公分5,000細胞接種於T25培養瓶(Corning,Corning,NY)內的培養基中並且擴增至80%匯合。將含有細胞之T25培養瓶用生長培養基填充至頸部。由快遞員將樣本送至臨床細胞遺傳學實驗室(估計實驗室至實驗室交通時間為一小時)。染色體分析係由人類分子遺傳學中心(Center for Human & Molecular Genetics，位於New Jersey Medical School,Newark,NJ)來執行。在中期(metaphase)期間分析細胞，此時染色體係為最佳可視化。在所計數之二十個處於中期的細胞中，有五個分析出具有正常同質性核型數目(兩個)。如果觀察到兩個核型，即將細胞樣本歸類為具有同質性。如果觀察到超過兩個核型，即將細胞樣本歸類為具有異質性。當識別出異質性核型數目(四個)時，即計數額外中期細胞並加以分析。
所有送交染色體分析的細胞樣本皆由細胞遺傳學實驗室人員判讀為展現正常外觀。十六個細胞系中的三個分析出展現異質性表型(XX與XY)，從而指示存在有同時衍生自新生兒與母體來源的細胞(表5-1)。細胞樣本各皆歸類為具有同質性。(表5-1)。
染色體分析會識別出核型顯現為正常(由臨床細胞遺傳學實驗室判讀)的臍衍生UTC。核型分析亦會識別出不含母體細胞的細胞系，此係由同質性核型來判定。
實例6 細胞表面標記的流動式細胞測量術評估
藉由流動式細胞測量術來特徵化細胞表面蛋白質或「標記」可用來判定細胞系的身份(identity)。可由多個捐贈者來判定表現的一致性，並且可判定在暴露於不同處理與培養條件的細胞中的表現一致性。自臍分離出的產後細胞系係以流動式細胞測量術來特徵化，從而提供用於識別這些細胞系的圖譜。
使細胞在生長介質中、在經電漿處理之T75、T150與T225組織培養瓶(Corning,Corning,NY)中培養直到匯合。培養瓶的生長表面係經明膠塗覆，其塗覆係藉由在室溫下孵養2%(w/v)明膠(Sigma,St.Louis,MO)歷時20分鐘。
將培養瓶中的貼附細胞在磷酸鹽緩衝液(PBS)中清洗；(Gibco,Carlsbad,MO)並且用胰蛋白酶/EDTA(Gibco)剝離。將細胞採穫、離心，然後以1×107/ml的細胞濃度再懸浮於PBS中的3%(v/v)FBS中。根據製造商規範，將感興趣細胞表面標記之抗體(請見後文)加至100μl的細胞懸浮液然後將混合物在黑暗中在4℃下孵養30分鐘。在孵養後，用PBS清洗細胞然後將其離心以去除未結合抗體。將細胞再懸浮於500μl PBS中然後以流動式細胞測量術分析。流動式細胞測量術分析係用FACS calibur儀器(Becton Dickinson,San Jose,CA)來執行。
使用下列細胞表面標記之抗體。
在傳代8、15、20時分析臍衍生細胞。
為了要比較捐贈者間的差異，對於來自不同捐贈者的臍帶組織衍生細胞進行互相比較。在經明膠塗覆培養瓶上培養的臍衍生細胞亦與在未經塗覆培養瓶上培養的臍衍生細胞進行比較。
對於四種用於分離與準備細胞的處理進行比較。衍生自產後組織的細胞係用下列來進行處理：1)膠原蛋白酶；2)膠原蛋白酶/分散酶；3)膠原蛋白酶/玻尿酸酶；與4)膠原蛋白酶/玻尿酸酶/分散酶，並對於這些細胞進行比較。
在傳代8、15與20時之臍帶衍生細胞(以流動式細胞測量術分析)皆表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-alpha與HLA-A,B,C，此係由相對於IgG對照組的螢光值增加來指示。這些細胞對於CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ為陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。
分離自不同捐贈者的臍帶衍生細胞(以流動式細胞測量術分析)各對於CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-alpha與HLA-A,B,C的製造顯示為陽性，此係反映在相對於IgG對照組的螢光值增加。這些細胞對於CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ，的製造為陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。
在經明膠塗覆與未經塗覆培養瓶上擴增的臍帶衍生細胞(以流動式細胞測量術分析)皆對於CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-alpha與HLA-A,B,C的製造顯示為陽性，其相對於IgG對照組具有 增加的螢光值。這些細胞對於CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ，的製造為陰性，其具有與IgG對照組一致的螢光值。
臍帶衍生細胞的流動式細胞測量術分析結果已建立這些細胞系的身份。這些臍帶衍生細胞對於CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha與HLA-A,B,C為陽性；而對於CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ為陰性。此身份在多種變項的變異間皆為一致，包括捐贈者、傳代、培養容器表面塗層、消化酶與胎盤層。觀察到在螢光值直方圖曲線平均值與範圍上有某種變異，但在全部所測試條件下的所有陽性曲線皆為正常並且表現出大於IgG對照組的螢光值，因而確認該些細胞包含具有該些標記之陽性表現的同質性族群。
實例7 以寡核苷酸陣列進行細胞分析
寡核苷酸陣列係用來比較臍衍生與胎盤衍生細胞與纖維母細胞、人類間葉幹細胞與另一個衍生自人類骨髓之細胞系的基因表現圖譜。此分析會提供產後衍生細胞之特徵化並識別這些細胞的獨特分子標記。
產後組織衍生細胞。人類臍帶與胎盤係得自國家疾病研究資訊交換中心(NDRI,Philadelphia,PA)，來自正常足月分娩並且獲得患者同意。在用C：D：H混合物進行消化後，即依實例5中所述收取組織並分離細胞。將細胞在生長培養基中在經明膠塗覆塑膠組織培養瓶上培養。培養物係在37℃下以5% CO2孵養。
纖維母細胞。人類皮膚纖維母細胞係購自Cambrex Incorporated(Walkersville,MD；Lot number 9F0844)與ATCC CRL-1501(CCD39SK)。將兩個細胞系在DMEM/F12培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培養，培養基含有10%(v/v)胎牛血清(Hyclone)與青黴素/鏈黴素(Invitrogen)。使細胞生長於標準組織處理塑膠上。
人類間葉幹細胞(hMSC)。hMSC係購自Cambrex Incorporated(Walkersville,MD；批號2F1655、2F1656與2F1657)並根據製造商規範在MSCGM Media(Cambrex)中培養。使細胞在37℃下以5% CO2生長於標準組織培養塑膠上。
人類髂骨崤骨髓細胞(ICBM)。人類髂骨崤骨髓係接受自NDRI並獲得患者同意。骨髓係根據Ho,et al.(WO03/025149)所概述之方法來加工。將骨髓與裂解緩衝液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3與0.1mMEDTA(pH 7.2))混合，並且混合比例為1份骨髓對20份裂解緩衝液。使細胞懸浮液渦動、在環境溫度下培養2分鐘然後以500×g離心10分鐘。將上層液拋棄並將細胞沉澱物再懸浮於最低必需培養基α(Minimal Essential Medium-alpha,Invitrogen)，並且培養基係補充10%(v/v)胎牛血清與4mM麩醯胺酸。將細胞再度離心然後將細胞沉澱物再懸浮於新鮮培養基中。使用台盼藍排除法(Sigma,St.Louis,MO)來計數活單核細胞。將單核細胞以5×104細胞/cm2接種於塑膠組織培養瓶中。將細胞在37℃下以5% CO2培養，並且在標準大氣O2或在5% O2下培養。將細胞培養5日並且未進行培養基更換。在5日的培養後將培養基與非貼附細胞移除。將貼附細胞維持於培養中。
將細胞的活躍生長培養物用細胞刮杓自培養瓶中取出並置於冷磷酸鹽緩衝液(PBS)中。將細胞以300×g離心5分鐘。將上層液移除然後將細胞再懸浮於新鮮PBS並再度離心。將上層液移除然後立即將細胞沉澱物冷凍並儲存在-80℃下。將細胞mRNA萃取出來然後轉譯為cDNA。接著將cDNA轉譯為cRNA然後進行生物素標記。使經生物素標記之cRNA與Affymetrix GENECHIP HG-U133A寡核苷酸陣列(Affymetrix,Santa Clara,CA)雜交。雜交與數據收集係根據製造商規範來執行。數據分析係使用「Significance Analysis of Microarrays」(SAM)第1.21版電腦軟體(Tusher,V.G.et al.,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：5116-5121)來執行。該分析軟體之授權可透過技術授權辦公室(Office of Technology Licensing,Stanford University)來獲得，並且更多資訊可在全球資訊網上於Tibshirani教授之網站(位於Dep’t of Statistics,Stanford University)上取得。
此研究中分析了十四個不同細胞群。細胞連同傳代資訊、培養基材與培養基係列於表7-1。細胞系係依其識別碼列出，並列出分析當時之傳代、細胞生長基材與生長培養基。
如上所述使用SAM軟體以主成分分析(principle component analysis)來評估數據。分析結果顯示，所測細胞中有290個以不同相對量表現之基因。此分析提供族群間的相對比較。
表7-2顯示計算用於細胞對比較之歐幾里德距離(Euclidean distance)。歐幾里德距離係根據基於290個基因的細胞比較結果，這些基因在細胞型間有不同之表現。歐幾里德距離係與290個基因之表現間的相似性成反比。歐幾里德距離係針對細胞型而計算出來，並且使用這290個在細胞型間有不同表現的基因。細胞間之相似性係與歐幾里德距離成反比。
表7-3、7-4與7-5顯示，基因表現在胎盤衍生細胞中會增加(表7-3)、在臍帶衍生細胞中會增加(表7-4)而在臍帶與胎盤衍生細胞中會減少(表7-5)。
表7-6、7-7與7-8顯示，基因表現在人類纖維母細胞(表7-6)、ICBM細胞(表7-7)與MSC(表7-8)中會增加。
此實例係為了提供衍生自臍帶與胎盤之細胞的分子特徵化而執行。此分析包括衍生自三種不同臍帶與三種不同胎盤的細胞。此研究亦包括兩種皮膚纖維母細胞系、三種間葉幹細胞系與三種髂骨崤骨髓細胞系。這些細胞所表現之mRNA係在GENECHIP寡核苷酸陣列上分析，該陣列含有22,000個基因的寡核苷酸探針。
該分析揭示，290個基因之轉錄在這五個不同細胞型上係以不同量出現。這些基因包括十個專門在胎盤衍生細胞中會增加的基因，以及七個專門在臍帶衍生細胞中會增加的基因。發現有四十四個基因專門在胎盤衍生與臍帶組織衍生細胞中有較低的表現水準。
實例8 細胞表型的免疫組織化學特徵化
人類臍帶組織中所發現的細胞表型係以免疫組織化學法來分析。
採獲人類臍帶組織並將其在4℃下於4%(w/v)聚甲醛中沉浸固定整夜。使用針對下列抗原決定區的抗體來執行免疫組織化學法(請參見表8-1)：波形蛋白(1：500；Sigma,St.Louis,MO)、肌間線蛋白(desmin， 1：150，對抗兔而生成；Sigma；或1：300，對抗小鼠而生成；Chemicon,Temecula,CA)，α-平滑肌肌動蛋白(SMA；1：400；Sigma)，细胞角蛋白18(CK18；1：400；Sigma)，凡威列勃氏因子(vWF；1：200；Sigma)與CD34(人類CD34 Class III；1：100；DAKOCytomation,Carpinteria,CA)。此外，測試下列標記：抗人類GROalpha-PE(1：100；Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、抗人類GCP-2(1：100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA)、抗人類氧化LDL受體1(ox-LDL R1；1：100；Santa Cruz Biotech)與抗人類NOGO-A(1：100；Santa Cruz Biotech)。用解剖刀修剪經固定之試樣，然後將其置於內嵌OCT化合物(Tissue-Tek OCT；Sakura,Torrance,CA)內並置於含乙醇之乾冰浴。接著使用標準極冷恒溫器(Leica Microsystems)將冷凍之團塊分切(10μm厚)然後固定於玻片上以備染色。
以類似先前研究之方式來執行免疫組織化學法。(例如Messina et al.,Exper.Neurol.,2003；184：816-829)。用磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗組織切片然後將其暴露於含PBS、4%(v/v)羊血清(Chemicon,Temecula,CA)與0.3%(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白質阻斷液中1小時以獲取細胞內抗原。在感興趣抗原決定區會位於細胞表面(CD34,ox-LDL R1)上的情況中，該程序的所有步驟中皆會省略triton以避免抗原決定區流失。再者，在一級抗體係對抗山羊(GCP-2,ox-LDL R1,NOGO-A)而生成的情況中，整個程序中會使用3%(v/v)驢血清來取代山羊血清。接著在室溫下將一級抗體(稀釋於阻斷液中)施用於切片歷時4小時。將一級抗體溶液移除，然後在施用二級抗體溶液(在室溫下1小時)前用PBS清洗培養物，該二級抗體溶液含有阻斷劑以及羊抗小鼠IgG-Texas Red(1：250；Molecular Probes,Eugene,OR)及/或羊抗兔IgG-Alexa 488(1：250；Molecular Probes)或驢抗羊IgG-FITC(1：150；Santa Cruz Biotech)。清洗培養物，然後施用10微莫耳DAPI(Molecular Probes)10分鐘以可視化細胞核。
在免疫染色後，在Olympus倒立螢光顯微鏡(Olympus,Melville,NY)上使用適當螢光濾光片來可視化螢光。超出對照組染色的螢光信號即代表陽性染色。使用數位彩色攝影機與ImagePro軟體(Media Cybernetics,Carlsbad,CA)來擷取代表影像。針對三重染色的樣本，一次僅 使用一個發射濾光片來擷取各影像。接著使用Adobe Photoshop軟體(Adobe,San Jose,CA)來製備分層合成影像(Layered montage)。
臍帶內發現之細胞亞群中會表現波形蛋白、肌間線蛋白、SMA、CK18、vWF與CD34標記(數據未顯示)。特定而言，vWF與CD34表現皆限制於臍帶內所含之血管。CD34+細胞係位於最內層(內腔側)上。整個臍帶基質與血管中皆發現有波形蛋白表現。SMA限於基質與動靜脈外壁，但血管本身內則不含。僅在血管內觀察到CK18與肌間線蛋白，且肌間線蛋白限於中外層。
在臍帶內皆未觀察到這些標記(數據未顯示)。
人類臍帶內的細胞中皆會表現波形蛋白、肌間線蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、细胞角蛋白18、凡威列勃氏因子與CD 34。根據體外特徵化研究顯示，僅會表現波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白，此數據表示目前的臍帶衍生細胞分離過程會採獲細胞亞群或者分離之細胞會改變標記表現而表現波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白。
實例9 營養因子的分泌
對於來自UTC之所選營養因子的分泌進行測量。所選的因子具有血管生成活性(angiogenic activity)，例如肝細胞生長因子(HGF) (Rosen et al.,Ciba Found.Symp.,1997；212：215-26)；單核球趨化蛋白質1(MCP-1)(Salcedo et al.,Blood,2000；96；34-40)；介白素-8(IL-8)(Li et al.,J.Immunol.,2003；170：3369-76)；角質細胞生長因子(KGF)；基本纖維母細胞生長因子(bFGF)；血管內皮生長因子(VEGF)(Hughes et al.,Ann.Thorac.Surg.2004；77：812-8)；基質金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP1)；血管生成素2(ANG2)；血小板衍生生長因子(PDGFbb)；血小板生成素(TPO)；肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)；基質衍生因素1α(SDF-1alpha)、神經滋養/神經保護活性(腦衍生神經滋養因子(BDNF)(Cheng et al.,Dev.Biol.,2003；258；319-33)；介白素-6(IL-6)；顆粒性細胞趨化蛋白質-2(GCP-2)；轉變生長因子β2(TGFbeta2))；或趨化激素活性物(巨噬細胞發炎蛋白質1α(MIP1alpha)；巨噬細胞發炎蛋白質1β(MIP1beta)；單核球化學吸引因子-1(MCP-1)；Rantes(調控活化、正常T細胞表現與分泌)；I309；胸腺與活化調控趨化激素(TARC)；嗜酸粒細胞趨化蛋白(Eotaxin)；巨噬細胞衍生趨化激素(MDC)；與(IL-8)。
將衍生自臍帶之細胞，以及衍生自人類包皮之人類纖維母細胞在生長培養基中在經明膠塗覆T75培養瓶上培養。將細胞在傳代11時凍存並儲存於液態氮中。在解凍後，將生長培養基加至細胞，接著轉移至15ml離心管中然後以150×g離心細胞5分鐘。將細胞沉澱物再懸浮於4ml生長培養基中，然後計數細胞。將細胞以5,000細胞/cm2接種於T75培養瓶中，各培養瓶皆含有15ml的生長培養基，然後培養24小時。將培養基更換為無血清培養基(DMEM-低葡萄糖(Gibco)、0.1%(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、青黴素(50U/ml)與鏈黴素(50μg/ml,Gibco))歷時8小時。在孵養結束時藉由以14,000×g離心5分鐘來收集條件無血清培養基，然後在-20℃下儲存。
為了要評估各培養瓶中的細胞數目，用磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗細胞然後使用2ml胰蛋白酶/EDTA(Gibco)剝離。藉由加入8ml生長培養基來抑制胰蛋白酶活性。將細胞以150×g離心5分鐘。將上層液移除然後將細胞再懸浮於1ml的生長培養基中。以血球計評估細胞數目。
使細胞在37℃下在5% CO2中與大氣氧中生長。各細胞樣本所製造之MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1alpha、GCP-2、IL-8與TGF-beta2 量係以ELISA(R&D Systems,Minneapolis,Mn.)來測定。所有檢定皆依據製造商指示來執行。所呈現的數值皆為每百萬細胞的皮克數(n=2,sem)。
趨化激素(MIP1alpha、MIP1beta、MCP-1、Rantes、I309、TARC、Eotaxin、MDC、IL8)、BDNF與血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGFbb、TPO、HB-EGF)皆使用SearchLight Proteome Arrays(Pierce Biotechnology Inc.)來測定。Proteome Arrays為多工三明治法ELISA，用於進行每孔二至十六種蛋白質的定量測量。藉由將四至十六種不同捕捉抗體(capture antibody)的2×2、3×3或4×4圖案點樣至96孔盤的各孔中而產生陣列。在進行三明治法ELISA程序後，製作整個盤的影像以捕捉盤上各孔內之各點樣處所產生的化學發光信號。在各點樣處所產生的信號係正比於原始標準品或樣本中的目標蛋白質量。
MCP-1與IL-6係由臍衍生PPDC與皮膚纖維母細胞所分泌(表9-1)。SDF-1alpha與GCP-2係由纖維母細胞所分泌。GCP-2與IL-8係由臍衍生PPDC所分泌。TGF-beta2未自任一細胞型偵測出來(以ELISA)。
SearchlightTM Multiplexed ELISA檢定。TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1beta、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC與IL-8皆分泌自臍衍生PPDC(表9-2與9-3)。未偵測到No Ang2、VEGF或PDGFbb。
臍衍生細胞會分泌多種營養因子。部分這些營養因子(例如HGF、bFGF、MCP-1與IL-8)會在血管生成中扮演重要角色。其他營養因子(例如BDNF與IL-6)則在神經再生或保護上具有重要角色。
實例10 端粒酶活性檢定
端粒酶的功能是合成端粒重複序列(telomere repeat)，端粒重複序列用來保護染色體完整性並延長細胞的複製壽命(Liu,K,et al.,PNAS,1999；96：5147-5152)。端粒酶由兩個組分所組成，即端粒酶RNA模板(hTER)與端粒酶反轉錄酶(hTERT)。端粒酶的調控係由hTERT而非hTER的轉錄來決定。hTERT mRNA的即時聚合酶連鎖反應(PCR)因而是一種已獲認可的細胞端粒酶活性測定方法。
細胞分離
執行即時PCR實驗以測定人類臍帶組織衍生細胞的端粒酶製造。人類臍帶組織衍生細胞係根據以上實例與美國專利第7,510,873號所提出的實例而準備。一般而言，得自國家疾病研究資訊交換中心(Philadelphia,Pa.)的臍帶在正常分娩後會經過清洗以去除血與碎屑然後進行機械解離。接著將組織用消化酶(包括膠原蛋白酶、分散酶與玻尿酸酶)在培養基中在37℃下孵養。將人類臍帶組織衍生細胞依據‘012申請案之實例中所提出的方法來培養。間葉幹細胞與正常皮膚纖維母細胞(cc-2509 lot # 9F0844)係得 自Cambrex,Walkersville,Md。多能性人類睪丸胚胎性癌(畸胎瘤)細胞系nTera-2細胞(NTERA-2 cl.Dl)(See,Plaia et al.,Stem Cells,2006；24(3)：531-546)係購自ATCC(Manassas,Va.)並且將其依據美國專利第7,510,873號中所提出之方法來培養。
總RNA分離
使用RNeasy®套組(Qiagen,Valencia,Ca.)將RNA自細胞萃取出來。用50μl經DEPC處理水將RNA洗脫出來然後儲存於-80℃下。使用隨機六聚物以TaqMan®反轉錄試劑(Applied Biosystems,Foster City,Ca.)來反轉錄RNA，反轉錄在25℃下歷時10分鐘、在37℃下歷時60分鐘以及在95℃下歷時10分鐘。將樣本儲存在-20℃下。
即時PCR
使用Applied Biosystems Assays-On-DemandTM(亦已知為TaqMan® Gene Expression Assays)根據製造商規範(Applied Biosystems)在cDNA樣本上執行PCR。此商用套組廣泛用來檢定人類細胞中的端粒酶。簡言之，使用7000序列偵測系統(搭載ABI prism 7000 SDS軟體(Applied Biosystems))將hTert(人類端粒酶基因)(Hs00162669)與人類GAPDH(內部對照組)與cDNA及TaqMan® Universal PCR master mix混合。熱循環條件初始為50℃歷時2分鐘然後95℃歷時10分鐘，接著進行40次95℃歷時15秒鐘然後60℃歷時1分鐘的循環。依據製造商規範來分析PCR數據。
人類臍帶組織衍生細胞(ATCC存取號PTA-6067)、纖維母細胞與間葉幹細胞係針對hTert與18S RNA來檢定。如表10-1中所示，hTert因而端粒酶皆未在人類臍帶組織衍生細胞中偵測到。
人類臍帶組織衍生細胞(分離物022803，ATCC存取號PTA-6067)與nTera-2細胞皆經檢定，而結果顯示在兩批類臍帶組織衍生細胞中皆沒有端粒酶表現，然而畸胎瘤細胞系則顯示有高度表現(表10-2)。
因此，可推斷出本發明之人類臍組織衍生細胞不會表現端粒酶。
實例11 微載體上之UTC在葉輪式攪拌培養瓶反應器中的生長 材料和方法
細胞。將來自CBAT lot# 050604B傳代8細胞的細胞解凍並在T225培養瓶中擴增一個傳代。
微載體。使Cytodex® 3(GE Healthcare Life Sciences,cat.no,17-0485)微載體珠體在PBS中水合至少3小時然後進行高壓蒸氣滅菌。
攪拌培養瓶。具有內部頂置軸承葉輪組合件的攪拌培養瓶，100ml與250ml(Bellco,Inc.)。
匯合。匯合係定義為，在代表性顯微法視野中觀察到約90%的微載體其大於約60%的表面積受到細胞覆蓋。
傳代。傳代係定義為，用得自一不同攪拌培養瓶培養物之匯合微載體等分試樣來接種一含有新鮮微載體之攪拌培養瓶。
接種與培養。將細胞以胰蛋白酶自T225培養瓶採獲然後將4.0E+06細胞等分試樣加至330mg的微載體珠體(置於含40ml培養基的100ml葉輪或玻棒攪拌培養瓶中)。在孵養前將培養瓶用5% CO2氣體沖洗1分鐘。接種體速度頻率為30rpm持續2分鐘(每30分鐘)歷時8小時。 在第八小時時，將培養基體積增加至100ml，並且將攪拌速度設定為45-rpm連續旋轉然後在37℃下培養。
傳代。傳代1-(100ml至250ml培養瓶)將細胞培養八天。收集所有來自100ml培養瓶的微載體然後以重力使其與培養基分離。將培養基吸出然後將微載體再懸浮於10ml新鮮培養基中。在進行吸量混合(pipetting)以確保均勻分布後，將5ml含有微載體的培養基取出然後傳送至250ml攪拌培養瓶中。亦將約660mg的新鮮經水合與高壓蒸氣滅菌Cytodex® 3微載體與培養基加至培養瓶。在孵養前將培養基體積增加至200ml然後用5% CO2氣體沖洗培養瓶1分鐘。將攪拌速度設定為45-rpm連續旋轉然後在37℃下孵養。以胰酶消化法採獲其餘細胞然後使用Guava PCA儀器(Guava Technologies,Hayward,CA)計數。
傳代2-(250ml至250ml培養瓶)將細胞培養六天。收集所有來自250ml培養瓶的微載體然後以重力使其與培養基分離。將培養基吸出然後將微載體再懸浮於25ml新鮮培養基中。在進行吸量混合以確保均勻分布後，將5ml含有微載體的培養基取出然後傳送至250ml攪拌培養瓶中。亦將約660mg的新鮮經水合與高壓蒸氣滅菌Cytodex® 3微載體與培養基加至培養瓶。在孵養前將培養基體積增加至200ml然後用5% CO2氣體沖洗培養瓶1分鐘。將攪拌速度設定為45-rpm連續旋轉然後在37℃下孵養。以胰酶消化法採獲其餘細胞然後使用Guava PCA儀器計數。
培養基更換。將攪拌培養瓶自培養取出然後讓微載體重力沉降至培養瓶底部。將約一半培養基體積以吸出法移除然後用等量新鮮培養基置換。將培養瓶用5% CO2氣體沖洗1分鐘然後回到培養。在第1日與第4日執行培養基更換。
存活率染色。將1ml等分試樣自培養瓶取出然後讓微載體重力沉降。將培養基以吸出法移除並且用1ml Live/Dead染色液(Molecular Probes cat.no.L3224)置換然後在37℃下孵養15分鐘。在孵養後，將20微升等分試樣施用於顯微鏡玻片然後以螢光顯微法觀察。活細胞染為綠色，死細胞染為紅色。手動分析顯微視野以評估貼附於微載體上之活與死細胞的分布與比例。至少評估三個顯微視野並且計數約略的活細胞百分比。
細胞採獲。將微載體自攪拌培養瓶收集、在PBS中清洗三次然後平均分配在兩個50ml錐形管間。將各管用25ml胰蛋白酶在37℃下孵養10分鐘。將錐形管用PBS增至50ml體積然後讓微載體重力沉降。以吸出法收集含細胞上層液然後轉移至預填充2.5ml的FBS之50ml錐形管(產生5% FBS溶液以非活化胰蛋白酶)。用分開收集的各份重複此過程四次。將所有採獲之細胞離心、再懸浮於含生長培養基的血清中然後使用Guava PCA儀器計數細胞。
靜態T-培養瓶培養。將自T225培養瓶採獲之細胞等分試樣用來接種兩個T225培養瓶，然後使用美國專利申請案第10/877012號中所述之方法來孵養四天。採獲細胞並以流動式細胞測量術分析分析。
流動式細胞測量術。使用Becton-Dickinson FACSCaliburTM儀(Becton Dickinson,San Jose,CA)以流動式細胞測量術分析所採獲之細胞來測定細胞表面標記圖譜。所有抗體皆購自BD PharMingen(San Diego,CA)。
結果
細胞採獲。表11-1顯示每傳代的採獲份數、細胞產率與存活率，傳代係來自由傳代九擴增至傳代十一的UTC細胞系050604B，其係在Cytodex® 3微載體上在攪拌培養瓶培養中傳代。
細胞動力學。表11-2顯示由傳代九擴增至傳代十一的UTC細胞系050604B之生長動力學，其係在Cytodex® 3微載體上在攪拌培養瓶培養中傳代。該表顯示總倍增數為7.48，而每次倍增的平均時數為69.53(±17.52)小時。
活/死染色。經活/死染色之微載體等分試樣的分析結果顯示，大部分的微載體表面皆覆蓋有染綠色(活)細胞並帶有稀少數點的染紅色核(死)。細胞展現與在靜態條件中所培養之細胞類似的形態。
流動式細胞測量術分析。表11-3顯示在攪拌培養瓶中之微載體珠體上採獲的人類臍組織衍生細胞(hUTC)所表現的細胞表面標記結果(「+」為陽性而「-」為陰性)，並且對照自靜態T培養瓶採獲的hUTC。該表顯示，兩種方法所製造之細胞表現的標記為一致。
結論：將人類臍組織衍生細胞(hUTC)在Cytodex® 3微載體上在葉輪式攪拌培養瓶生物反應器中培養。細胞在二十天內會達到7.48的 族群倍增數並且具有平均69小時的族群倍增時間。每次傳代的細胞存活率在94.4%至99.7%的範圍。在微載體上培養之hUTC上的十三個細胞表面標記之表現分析結果，與在細胞培養T培養瓶中培養之hUTC的細胞表面標記之表現一致。此實例代表微載體可用來在生物反應器系統中接種、擴增與採獲hUTC。
實例12 經擴增hUTC在經膠原蛋白塗覆之MGSA與PLGA上的生長攪拌培養瓶中的微載體
對於hUTC附著於經膠原蛋白塗覆之合成可再吸收生物材料所製成之材料上的能力進行研究，包括在攪拌培養瓶培養中維持存活率的能力，以及一經再接種至靜態培養中後的增生能力。將經擴增hUTC接種至經膠原蛋白塗覆或未經塗覆的聚-(D,L-乳酸交酯-共-乙交酯)(PLGA)與聚(單硬脂醯甘油酯共-琥珀酸)(MGSA)微載體上。將帶有細胞之微載體在攪拌培養瓶中培養五天、以胰酶消化法採獲然後再接種至靜態培養中。
微載體準備。微載體潤濕-將約各1g的MGSA與PLGA微載體無菌懸浮於25ml 70%乙醇中歷時30分鐘以潤濕微載體。將乙醇以吸出法移除接著將微載體用PBS潤洗，然後再懸浮於25ml的達爾伯克磷酸鹽緩衝液(PBS)中。
膠原蛋白塗覆。將潤濕之微載體(PBS)以離心沉澱、將PBS以吸出法移除然後將微載體再懸浮於2.9%膠原蛋白溶液(Vitrogen 1000,Cohesion,Inc.Palo Alto,CA)中。將微載體在膠原蛋白中孵養30分鐘。將殘餘膠原蛋白以吸出法移除然後將經膠原蛋白塗覆之微粒用PBS清洗三次。
接種與培養實例11中所用之材料、細胞型、生長培養基、攪拌培養瓶、接種與培養條件、培養基更換、存活率染色與細胞採獲皆使用於此實例中。
結果
採獲細細胞再接種。將自經MGSA及PLGA塗覆與未經塗覆微載體採獲的細胞以約5,000細胞/cm2再接種至T225。於再接種後四天，將自兩種材料採獲的細胞增生至超過50%匯合。
將經擴增之hUTC接種至經膠原蛋白塗覆PLGA與MGSA微載體上、在攪拌培養瓶中培養五天、以胰酶消化法採獲然後再接種至靜態培養中。自合成微載體採獲的細胞係超過90%存活。再接種之細胞會於四天內在靜態培養中擴增，從而展現其保持增生能力。此實例展現合成生物材料作為攪拌培養瓶培養之微載體使用的能力。
實例13 微載體上之hUTC在連續攪拌培養瓶培養中的擴增
此研究的目標在於在攪拌培養瓶中使貼附於商用微載體上之經擴增hUTC連續培養經過數次族群倍增。使微載體上之hUTC擴增經過數次族群倍增的能力將適用於待擴大規模的模擬系統，以用於細胞療法 應用的hUTC大規模製造。對於兩種hUTC分離物(120304-在研究條件下分離、擴增與凍存，以及CNTO 2476-在GMP條件下分離、擴增與凍存)進行評估。亦對於商用微載體Cytodex® 1或Hillex® II進行評估。將凍存之細胞解凍並立即用來接種攪拌培養瓶培養。將細胞連續培養經過數次傳代，直到細胞達到約族群倍增30。亦將hUTC在T225培養瓶中靜態培養而作為對照組。
能夠將hUTC分離物120304(在族群倍增12.8時凍存)解凍，然後分別在Cytodex® 1與Hillex® II微載體上擴增至族群倍增28.6與28.7。每次倍增的時數在傳代間為一致，表示穩定的對數生長並且與T培養瓶生長動力學一致。能夠將hUTC分離物CNTO 2476(在族群倍增22.6時凍存)解凍，然後分別在Cytodex® 1與Hillex® II微載體上擴增至族群倍增33.2與31.0。每次倍增的時數在傳代間為一致，表示穩定的對數生長並且亦與T培養瓶生長動力學一致。所有每次族群倍增之時數數據點的統計分析結果(以單向ANOA)顯示所有經測試條件的hUTC生長動力學沒有明顯差異。(p=0.988)。所有經測試條件下最後採獲時的細胞表面蛋白質表現皆維持一致。
此實例展現hUTC能夠以穩定、一致的方式在微載體上擴增至約30次族群倍增，而會維持細胞表面蛋白質表型。
材料和方法
細胞。使用經凍存擴增之hUTC分離物12034族群倍增(PD)12與hUTC分離物CNTO 2476 lot 25126078 PD 22。
生長培養基。達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)-低葡萄糖(Gibco-Grand Island,NY)、15% FBS(HyClone-Logan UT)、青黴素/鏈黴素(P/S)(Gibco-Grand Island,NY)、β巰基乙醇(BME)(Sigma-St.Louis,MO)
微載體。將Cytodex® 1(GE Health Sciences-Piscataway,NJ)微載體在PBS中水合至少3小時然後高壓蒸氣滅菌。所用的Cytodex® 1微載體濃度為3g/L。將Hillex® II(SoloHill Engineering,Inc.,Ann Arbor,MI)微載體在去離子水中水合至少30分鐘然後高壓蒸氣滅菌。所用的Hillex® II微載體濃度為12g/L。
攪拌培養瓶。使用100ml與500ml單次使用、拋棄式攪拌培養瓶(Corning,Inc.-Corning,NY)。
在100ml攪拌培養瓶中進行接種與培養。將凍存之hUTC小瓶解凍、清洗然後再懸浮於生長培養基中。將6.6×106 hUTC加至3000mg的Cytodex® 1(5.0×103細胞每cm2)(在含100ml培養基之100ml攪拌培養瓶中)然後置於37℃組織培養孵養器上並孵養三至四日。將攪拌盤設定為60-rpm連續旋轉。將3.1×106 hUTC加至1.2g的Hillex® II(每cm2有5.0×103細胞)(在含100ml培養基之100ml攪拌培養瓶中)然後置於設定為60-rpm連續旋轉的攪拌盤上。將攪拌盤置於5% CO2中。
自一個100ml攪拌培養瓶培養傳代至一個500ml攪拌培養瓶。將100ml攪拌培養瓶自攪拌盤取下然後讓微載體沉降。將培養基上層液以吸出法移除。將其餘填充有貼附細胞的微載體再懸浮於20ml新鮮生長培養基中。接著將帶有貼附細胞之微載體以吸量管無菌轉移至500ml攪拌培養瓶，瓶中含有480ml新鮮生長培養基與4.8g Hillex® II(6g最終微載體含量)或1.2g Cytodex® 1(1.5g最終微載體含量)。接著將攪拌培養瓶置於設定為60-rpm連續旋轉的攪拌盤上。將攪拌盤置於5% CO2、37℃組織培養孵養器中然後孵養三至四天。
自一個500ml攪拌培養瓶培養傳代至五個500ml攪拌培養瓶。將500ml攪拌培養瓶自攪拌盤取下然後讓微載體沉降。將培養基上層液以吸出法移除。將其餘填充有貼附細胞的微載體再懸浮於50ml新鮮生長培養基中。接著將五份帶有貼附細胞之微載體的分開10ml等分試樣以吸量管無菌轉移至五個分開之500ml攪拌培養瓶，各瓶中含有490ml新鮮生長培養基與4.8g Hillex® II(6g最終微載體含量)或1.2g Cytodex® 1(1.5g最終微載體含量)。接著將攪拌培養瓶置於設定為60-rpm連續旋轉的攪拌盤上。將攪拌盤置於5% CO2、37℃組織培養孵養器中然後孵養三至四天。
貼附於Cytodex® 1微載體之細胞的採獲。將500ml攪拌培養瓶自攪拌盤取下然後讓帶有貼附細胞之微載體重力沉降。將培養基上層液以吸出法移除。將500ml的PBS加至攪拌培養瓶然後讓微載體重力沉降。將PBS上層液以吸出法移除。將500ml的DMEM-低葡萄糖加至攪拌培養瓶。接著將攪拌培養瓶在攪拌盤上以60rpm孵養20分鐘。將攪拌培養 瓶自攪拌盤取下然後讓微載體重力沉降。將DMEM-低葡萄糖上層液以吸出法移除。將500ml的PBS加至攪拌培養瓶。接著將攪拌培養瓶在攪拌盤上以60rpm孵養20分鐘。將攪拌培養瓶自攪拌盤取下然後讓微載體重力沉降。將PBS上層液以吸出法移除。將250ml TrypLE選擇劑加至攪拌培養瓶。接著將攪拌培養瓶在攪拌盤上以60rpm孵養10分鐘。將攪拌培養瓶自攪拌盤取下然後讓微載體重力沉降。使用50m血清吸量管，將微載體-TrypLETM選擇液藉由上下吸量~10次來攪動，以將殘餘貼附細胞自微載體解離出來。接著將250ml的PBS加至攪拌培養瓶然後讓微載體重力沉降。藉由重複吸量收集含細胞上層液，然後將其轉移至多個錐形管(預載有5ml FBS與插在管開口中的100μm濾器單元)。將錐形管以300 rcf離心5分鐘、倒出上層液然後使細胞再懸浮於生長培養基中。
貼附於Hillex® II微載體之細胞的採獲。將500ml攪拌培養瓶自攪拌盤取下然後讓帶有貼附細胞之微載體重力沉降。將培養基上層液以吸出法移除。將500ml的PBS加至攪拌培養瓶然後讓微載體重力沉降。將100ml TMTrypLE選擇劑加至攪拌培養瓶。接著將攪拌培養瓶在攪拌盤上以60rpm孵養10分鐘。將攪拌培養瓶自攪拌盤取下然後讓微載體重力沉降。使用25m血清吸量管，將微載體-TrypLETM選擇液藉由上下吸量~10次來攪動，以將殘餘貼附細胞自微載體解離出來。藉由重複吸量收集含細胞上層液，然後將其轉移至多個錐形管(預載有5ml FBS與插在管開口中的100-μm濾器單元)。將錐形管以300 rcf離心5分鐘、倒出上層液然後使細胞再懸浮於生長培養基中。
存活率染色。將培養基與微載體的1ml等分試樣轉移至15ml錐形管然後讓微載體重力沉降。將培養基以吸出法移除然後用1ml Live/Dead染色液(Molecular Probes cat.no.L3224)然後在37℃下孵養15分鐘。在孵養後，將20-μl等分試樣施用於顯微鏡玻片然後以螢光顯微法觀察。活細胞染為綠色。手動分析顯微視野以評估貼附於微載體上之存活細胞的分布。至少評估三個顯微視野並且計數約略的活細胞百分比。
培養中細胞計數-核 出檢定。將均質微載體懸浮液的5ml(100ml攪拌培養瓶)或10ml(500ml攪拌培養瓶)等分試樣自攪拌培養瓶容器取出然後轉移至15ml管。讓微載體重力分離然後將上層液以吸出法 移除。將微載體用10ml PBS清洗一次、讓微載體重力分離然後將PBS上層液以吸出法移除。將微載體在37℃下在核出液(0.1M檸檬酸(Sigma-St.Louis,MO)且含0.1% w/v結晶紫(Sigma-St.Louis,MO))孵養一個小時。在孵養後，將含微載體之核釋出液的100μl等分試樣加至100μl PBS。接著將此液的10μl等分試樣裝載至血球計中然後計數釋出之核。
培養中細胞計數-TrypLE TM 檢定。將均質微載體懸浮液的5ml(100ml攪拌培養瓶)或10ml(500ml攪拌培養瓶)等分試樣自攪拌培養瓶容器取出然後轉移至15ml管。讓微載體重力分離然後將上層液以吸出法移除。將微載體用10ml PBS清洗一次、讓微載體重力分離然後將PBS上層液以吸出法移除。將微載體在37℃下在TrypLETM選擇劑中孵養十分鐘。在孵養後，將5ml的PBS加入然後讓微載體重力分離。藉由重複吸量收集含細胞上層液，然後將其轉移至多個錐形管(預載有1ml FBS)。將管以300 rcf離心5分鐘、將上層液倒出、將細胞再懸浮於生長培養基中，然後使用等分試樣利用Guava PCA儀器(Guava Technologies,Haywood,CA)來測定細胞計數。
靜態T-培養瓶培養。將凍存之hUTC小瓶解凍、清洗然後再懸浮於生長培養基中。使用US2004877012A所述之方法將細胞在T225中靜態培養經過多次傳代。
流動式細胞測量術。將採獲之hUTC以流動式細胞測量術使用Becton-Dickinson FACSCaliburTM儀器(Becton Dickinson,San Jose,CA)來分析，以使用US2004877012A中所述之方法來測定細胞表面標記圖譜。所有抗體皆購自BD PharMingen(San Diego,CA)。
結果
能夠將hUTC分離物120304(在族群倍增12.8時凍存)解凍，然後分別在Cytodex® 1與Hillex® II微載體上擴增至族群倍增28.6與28.7。每次倍增的時數在傳代間為一致，表示穩定的對數生長並且與T培養瓶生長動力學一致。能夠將hUTC分離物CNTO 2476(在族群倍增22.6時凍存)解凍，然後分別在Cytodex® 1與Hillex® II微載體上擴增至族群倍增33.2與31.0。每次倍增的時數在傳代間為一致，表示穩定的對數生長並且亦與T培養瓶生長動力學一致。所有每族群倍增之時數數據點的統計分析結果(以單向ANOA)顯示所有經測試條件的hUTC生長動力學沒有明顯差異。(p=0.988)。此外，所有經測試條件之最後採獲時的細胞表面蛋白質表現皆維持一致。此數據展現hUTC能夠以穩定、一致的方式在微載體上擴增至約30次族群倍增，而會維持細胞表面蛋白質表型。
雖然本說明書中已藉由提及各種特定材料、程序與實例來描述並說明本發明，但會理解到本發明不限於針對此目的所選用的特定材料與程序組合。此類細節的許多變化型式可為默示者並且將為熟悉該項技術領域者所理解。所意欲者為僅將說明書與實例視為例示性，並且本發明之 真正範疇與精神係由下列申請專利範圍所指示。所有本說明書中所參照之參考文獻、專利與專利申請案皆以引用方式全文併入於本說明書中。

Claims (18)

  1. 一種培養經分離之臍帶組織衍生細胞的方法，其包含：a.使接種於微載體上的臍帶組織衍生細胞在一培養基中生長，該培養基包含胺基酸、維生素、鹽類、核苷、類脂酸/硫辛酸、乙醇胺、胰島素、轉鐵蛋白、硒化鈉，其中該培養基係補充血清，並且使細胞生長一段足夠時間以讓該些細胞達到所欲之初始族群密度；b.在該些細胞已達到所欲之初始族群密度後加入一無血清營養溶液，其中該無血清營養溶液包含胺基酸、維生素、鹽類、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、類脂酸/硫辛酸、硒化鈉；以及c.使該些細胞生長一段足夠時間以讓該些細胞達到所欲之最終族群密度；其中該些臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不帶血之人類臍帶組織、能夠在培養中自我新生與擴增、具有分化之潛能、會表現CD13、CD90、HLA-ABC並且不會表現CD34、CD117與HLA-DR，且其中該核苷為胸苷、腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法進一步包含將該些細胞接種於該些微載體上。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法進一步包含在步驟c後分離該些細胞。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法不需要進行培養基更換。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法係在一攪拌培養瓶培養系統中進行。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該些細胞之特徵在培養前與後實質相同。
  7. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該些細胞之特徵在培養前與後相同。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中所欲之初始族群密度係在3至4日後達到。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該些微載體具有一經胺處理表面。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基包含：下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸、與L-牛磺酸；下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；下列鹽：氯化鈣、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉與一或多種磷酸鈉鹽；以及胰島素；轉鐵蛋白；類脂酸/硫辛酸；乙醇胺；亞硒酸鈉；與一或多種能量基質。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該一或多種能量基質為D-葡萄糖與丙酮酸鈉。
  12. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該培養基包含：至少約0.05g/L的L-精胺酸；至少約0.02g/L的L-胱胺酸；至少約0.2g/L的L-麩醯胺酸；至少約0.01g/L甘胺酸；至少約0.02g/L的L-組胺酸；至少約0.09g/L的L-異白胺酸；至少約0.09g/L的L-白胺酸；至少約0.09g/L的L-離胺酸；至少約0.02g/L的L-甲硫胺酸；至少約0.05g/L的L-苯丙胺酸；至少約0.03g/L的L-絲胺酸；至少約0.08g/L的L-蘇胺酸；至少約0.009g/L的L-色胺酸；至少約0.08g/L的L-酪胺酸；至少約0.08g/L的L-纈胺酸；至少約0.005g/L L-半胱胺酸；至少約0.0004g/L的L-丙胺酸；至少約0.01g/L的L-天冬醯胺酸；至少約0.006g/L的L-天冬胺酸；至少0.03g/L的L-麩胺酸；至少約0.005g/L的L-脯胺酸；與至少約0.0003g/L的L-牛磺酸；約5×10-6g/L至約0.015g/L的各維生素； 至少約0.05g/L的無水氯化鈣、至少約0.1g/L的氯化鉀；至少約0.2g/L的硫酸鎂、至少約0.08g/L的磷酸二氫鈉單水合物、與至少約0.0005g/L的磷酸氫二鈉七水合物(Na2HPO4.7H2O)；至少約0.0001g/L的胸苷與至少約0.005g/L的各腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；以及至少0.003g/L的胰島素、至少0.05g/L的轉鐵蛋白、至少約5×10-6g/L的類脂酸/硫辛酸、至少0.05g/L的乙醇胺與至少約0.00004g/L的亞硒酸鈉。
  13. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該培養基係補充2至20%的FBS。
  14. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該培養基係補充約7.5%、約10%或約15%的FBS。
  15. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該培養基進一步包含腐胺、一穩定劑及/或一抗發泡劑。
  16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該無血清營養溶液包含：下列胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-半胱胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-脯胺酸與L-牛磺酸；下列維生素：D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、I-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、核黃素、噻胺、d-生物素、吡哆醇、與維生素B12(氰鈷胺)；下列鹽：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉七水合物；下列微量礦物質：硫酸銅(II)五水合物(CuSO4.5H2O)、硫酸鋅七水合物(ZnSO4.7H2O)；下列核苷：腺苷、胞苷、尿苷與鳥苷；以及胰島素；轉鐵蛋白；乙醇胺；類脂酸/硫辛酸；與亞硒酸鈉。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該無血清溶液進一步包含腐胺、一穩定劑及/或一抗發泡劑。
  18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該無血清營養溶液缺少能量基質。
TW102146011A 2012-12-14 2013-12-13 用於ｈＵＴＣ生長之營養滋養培養基 TWI620818B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/715,532 2012-12-14
US13/715,532 US20140170748A1 (en) 2012-12-14 2012-12-14 Nutrient Enriched Media for hUTC Growth

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201439321A TW201439321A (zh) 2014-10-16
TWI620818B true TWI620818B (zh) 2018-04-11

Family

ID=49881127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102146011A TWI620818B (zh) 2012-12-14 2013-12-13 用於ｈＵＴＣ生長之營養滋養培養基

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20140170748A1 (zh)
EP (2) EP2931875B1 (zh)
JP (2) JP6404227B2 (zh)
KR (2) KR101948237B1 (zh)
CN (2) CN105026551B (zh)
AR (2) AR093985A1 (zh)
AU (2) AU2013359265B2 (zh)
BR (1) BR112015013685A8 (zh)
CA (1) CA2895079C (zh)
ES (1) ES2667573T3 (zh)
HK (1) HK1215050A1 (zh)
MX (2) MX364731B (zh)
PH (1) PH12015501310A1 (zh)
PL (1) PL2931875T3 (zh)
RU (2) RU2684306C2 (zh)
SG (2) SG11201504547SA (zh)
TW (1) TWI620818B (zh)
WO (1) WO2014093598A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10791730B2 (en) * 2016-01-14 2020-10-06 DePuy Synthes Products, Inc. Composition and methods for cryopreservation of hUTC
US11111480B2 (en) 2016-04-29 2021-09-07 Hope Biosctences, Llc Culture media for multipotent stem cells
US10894947B1 (en) * 2016-04-29 2021-01-19 Hope Biosciences, Llc Method for generating protein rich conditioned medium
CN106434532A (zh) * 2016-12-22 2017-02-22 叶宗耀 一种培养肝细胞的培养基及其制备方法
CN106957815B (zh) * 2017-03-16 2021-05-07 杨涛 一种用于人类多潜能干细胞的无血清培养基的配方
EP3604503A4 (en) * 2017-03-28 2020-12-30 Ajinomoto Co., Inc. ADDITIVE FOR DE-DIFFERENTIATION SUPPORT MEDIUM
CN107119017B (zh) * 2017-05-25 2020-05-26 山东省医药生物技术研究中心 一种骨肉瘤细胞的无血清培养基及其制备方法
JPWO2020067502A1 (ja) * 2018-09-28 2021-08-30 味の素株式会社 動物細胞の培養用添加物、培養用培地および培養方法
JP7474520B2 (ja) * 2019-04-05 2024-04-25 ザ・ユニバーシティ・オブ・ホンコン 哺乳類の拡大ポテンシャル幹細胞のための培地、その組成物および方法
CN114058573B (zh) * 2020-08-03 2024-04-05 上海原天生物科技有限公司 一种含有生物素的培养基
CN112608892B (zh) * 2020-12-25 2023-11-14 深圳博雅感知药业有限公司 血小板裂解物用于无血清分离和传代培养脐带间充质干细胞的方法
KR20220104321A (ko) 2021-01-18 2022-07-26 주식회사 엑소코바이오 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 내지는 생산성 향상 방법
US11735303B2 (en) 2021-06-22 2023-08-22 David Haase Apparatus and method for determining a composition of a replacement therapy treatment

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060094113A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-04 David Epstein Chemically defined media compositions
CN101182490A (zh) * 2007-11-27 2008-05-21 天津百若克医药生物技术有限责任公司 一种用于Vero细胞的培养基及其培养方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA776251B (en) * 1976-11-11 1978-07-26 Massachusetts Inst Technology Improved cell culture microcarriers
CA2074363C (en) * 1990-01-22 2004-11-09 David Thomas Vistica Co2-independent growth medium for maintenance and propagation of cells
JP2993614B2 (ja) * 1990-11-20 1999-12-20 有限会社野々川商事 新規化粧料、グルコサミノグリカン生成促進剤および美白剤
US7556958B1 (en) 1997-04-08 2009-07-07 The Rockefeller University Enzyme derived from thermophilic organisms that functions as a chromosomal replicase, and preparation and uses thereof
WO2002066603A2 (en) * 2001-02-15 2002-08-29 Centocor, Inc. Chemically defined medium for cultured mammalian cells
US9969980B2 (en) 2001-09-21 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
WO2003057865A1 (es) * 2002-01-09 2003-07-17 Derbiotek, S.L. Composicion y procedimiento para crear, regenerar y reparar tejidos mediante implante biologico portador de celulas y enriquecido con concentrado de plaquetas mas suplementos.
US8518390B2 (en) * 2003-06-27 2013-08-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells
PL1641914T3 (pl) * 2003-06-27 2017-01-31 DePuy Synthes Products, Inc. Komórki pochodzące z poporodowej tkanki łożyska oraz sposoby uzyskiwania i zastosowania tych komórek
WO2005007863A2 (en) 2003-07-10 2005-01-27 National Corn Growers Association Distillers solubles as the primary constituent in protein blocks for livestock
EP1682075A4 (en) * 2003-11-07 2009-12-09 Univ Florida CULTURE AND DIFFERENTIATION OF NEURONAL PRECURSOR CELLS
ES2621847T3 (es) * 2004-12-23 2017-07-05 DePuy Synthes Products, Inc. Células posparto derivadas de tejido de cordón umbilical, y métodos de elaboración y uso de las mismas
US8741638B2 (en) 2005-12-19 2014-06-03 DePuy Synthes Products, LLC In vitro expansion of postpartum-derived cells in roller bottles
WO2008004990A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Es Cell International Pte Ltd Method for stem cell culture and cells derived therefrom
ES2524443T3 (es) * 2006-11-13 2014-12-09 DePuy Synthes Products, LLC Expansión in vitro de células postparto usando microportadores
WO2008082525A1 (en) * 2006-12-19 2008-07-10 National Stem Cell Inc Umbilical cord stem cell secreted product derived topical compositions and methods of use thereof
EP2028268A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-25 Université Libre De Bruxelles Generation of neuronal cells from pluripotent stem cells
US10179900B2 (en) * 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
WO2011017050A1 (en) * 2009-07-28 2011-02-10 Corning Incorporated Synthetic microcarriers for culturing cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060094113A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-04 David Epstein Chemically defined media compositions
CN101182490A (zh) * 2007-11-27 2008-05-21 天津百若克医药生物技术有限责任公司 一种用于Vero细胞的培养基及其培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
TW201439321A (zh) 2014-10-16
EP3382007A1 (en) 2018-10-03
SG11201504547SA (en) 2015-07-30
EP2931875B1 (en) 2018-03-21
JP2016501026A (ja) 2016-01-18
AR118040A2 (es) 2021-09-15
KR20190016612A (ko) 2019-02-18
US20140170748A1 (en) 2014-06-19
PL2931875T3 (pl) 2018-08-31
AR093985A1 (es) 2015-07-01
AU2013359265A1 (en) 2015-07-16
RU2015128276A (ru) 2017-01-23
RU2653449C2 (ru) 2018-05-08
RU2018112452A (ru) 2019-03-01
PH12015501310B1 (en) 2015-09-02
AU2013359265B2 (en) 2019-01-31
KR102151588B1 (ko) 2020-09-04
SG10201801924VA (en) 2018-05-30
JP6595061B2 (ja) 2019-10-23
CN105026551B (zh) 2020-07-03
EP2931875A1 (en) 2015-10-21
JP6404227B2 (ja) 2018-10-10
CN111690602A (zh) 2020-09-22
CA2895079A1 (en) 2014-06-19
KR101948237B1 (ko) 2019-02-14
MX2018013469A (es) 2020-11-12
RU2018112452A3 (zh) 2019-03-01
BR112015013685A8 (pt) 2019-11-05
WO2014093598A1 (en) 2014-06-19
RU2684306C2 (ru) 2019-04-05
JP2018183195A (ja) 2018-11-22
BR112015013685A2 (pt) 2017-07-11
PH12015501310A1 (en) 2015-09-02
CN105026551A (zh) 2015-11-04
ES2667573T3 (es) 2018-05-11
AU2019202191A1 (en) 2019-04-18
HK1215050A1 (zh) 2016-08-12
AU2019202191B2 (en) 2021-01-21
CA2895079C (en) 2021-06-29
MX364731B (es) 2019-05-06
KR20150094760A (ko) 2015-08-19
MX2015007594A (es) 2016-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI620818B (zh) 用於ｈＵＴＣ生長之營養滋養培養基
KR102211270B1 (ko) Hutc의 동결보존을 위한 조성물 및 방법
EP1641913B1 (en) Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making and using the same
US10179900B2 (en) Conditioned media and methods of making a conditioned media
JP6301263B2 (ja) ヒト臍帯組織由来細胞の検出

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees