KR20210068488A - 동물 세포의 배양용 첨가물, 배양용 배지 및 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 함유하는 동물 세포의 배양용 첨가물, 배지 성분에 더해서, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 추가로 함유하는 동물 세포의 배양용 배지, 및 상기 배지를 사용하여 동물 세포를 배양하는 것, 혹은 상기 첨가물을 배양물에 첨가하는 것을 포함하는, 동물 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 특히 무혈청 배지나 저알부민 배지를 사용하여 동물 세포의 배양을 행할 때에, 동물 세포의 증식성을 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은, 동물 세포의 증식성을 향상시킬 수 있는 동물 세포의 배양용 첨가물, 배양용 배지, 및 배양 방법에 관한 것이다.
배아 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포 등의 줄기세포를 비롯해, 많은 동물 세포는, 매트리젤이나, 비트로넥틴, 라미닌 등의 인간형 리컴비넌트의 매트릭스 등을 족장(足場; scaffold) 재료로서 사용한 접착 배양에 의해, 증식 유지되어 왔다.
그러나, 동물 세포를 연구, 물질 생산, 의료 등에 응용하기 위해, 효율적으로 증식시키고, 대량으로 배양하는 방법으로서는, 상기한 접착 배양이 아니고, 세포괴(細胞塊)의 상태에서 부유 배양하는 방법이 사용되고 있다.
동물 세포의 배양에 있어서는, 일반적으로, 증식 인자 등의 성분을 보충하기 위해, 배양액 중에 5(w/v)% 내지 20(w/v)% 정도의 혈청을 첨가할 필요가 있다.
그러나, 혈청은 고가이며, 혈청 중에는 미지의 성분을 포함하는 500종 이상의 단백질이 포함되기 때문에, 세포에 작용하는 인자의 분자 레벨에서의 연구나, 세포로부터 생산된 물질의 단리·정제가 곤란해지는 경우가 많다. 또한, 혈청에는, 프리온이나 바이러스 등이 포함될 가능성이 있다. 그러므로, 동물 세포의 배양에는, 혈청을 함유하지 않는 무혈청 배지나, 알부민 함유량이 저감된 저(低)알부민 배지가 사용되는 경우도 많다. 무혈청 배지나 저알부민 배지를 사용하여 동물 세포를 배양할 때, 세포의 증식성을 향상시키기 위해, 트랜스페린 등의 단백질, 각종 증식 인자, 인슐린 등의 호르몬 등이 첨가된다.
그러나, 배양되는 동물 세포의 종류에 따라, 증식에 필요한 증식 인자, 호르몬 등의 종류 및 조합이 상이하여, 여러 가지 동물 세포의 증식을 촉진할 수 있는 첨가물을 저비용으로 얻는 것은 곤란했다.
그러므로, 여러 가지 동물 세포의 증식을 효율적으로 촉진할 수 있는 동물 세포의 배양용 첨가물이 요구되고 있다.
그래서, 본 발명은, 특히 무혈청 배지나 저알부민 배지를 사용하여 동물 세포의 배양을 행할 때에, 동물 세포의 증식성을 향상시킬 수 있는 배양용 첨가물, 및 배양용 배지 및 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌 등의 아미노산 혹은 글루코오스를 첨가함으로써, 또는 상기 아미노산 및 글루코오스를 첨가함으로써, 동물 세포의 증식성이 향상되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 함유하는, 동물 세포의 배양용 첨가물.
[2] 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [1]에 기재된 첨가물.
[3] 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [1]에 기재된 첨가물.
[4] 동물 세포가 줄기세포인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 첨가물.
[5] 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [4]에 기재된 첨가물.
[6] 동물 세포의 부유 배양용 첨가물인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 첨가물.
[7] 동물 세포의 부유 배양이, 세포괴의 상태에서의 부유 배양인, [6]에 기재된 첨가물.
[8] 동물 세포의 접착 배양용 첨가물인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 첨가물.
[9] 배지 성분에 더해서, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 추가로 함유하는, 동물 세포의 배양용 배지.
[10] 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [9]에 기재된 배지.
[11] 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [9]에 기재된 배지.
[12] pH가 7 이상인, [9] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[13] 동물 세포가 줄기세포인, [9] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[14] 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [13]에 기재된 배지.
[15] 동물 세포의 부유 배양용 배지인, [9] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[16] 동물 세포의 부유 배양이, 세포괴의 상태에서의 부유 배양인, [15]에 기재된 배지.
[17] 동물 세포의 접착 배양용 배지인, [9] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[18] 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스가 첨가된 동물 세포의 배양용 배지에서 동물 세포를 배양하는 것, 혹은 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 동물 세포의 배양물에 첨가하는 것을 포함하는, 동물 세포의 배양 방법.
[19] 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [18]에 기재된 배양 방법.
[20] 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [18]에 기재된 배양 방법.
[21] 동물 세포가 줄기세포인, [18] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
[22] 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [21]에 기재된 배양 방법.
[23] 동물 세포의 부유 배양 방법인, [18] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
[24] 세포괴를 형성시켜 동물 세포를 부유 배양하는, [23]에 기재된 배양 방법.
[25] 동물 세포의 접착 배양 방법인, [18] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
본 발명에 의해, 동물 세포, 특히 줄기세포의 증식성을 적합하게 향상시킬 수 있는 동물 세포의 배양용 첨가물을 제공할 수 있고, 동물 세포의 증식을 적합하게 향상시킬 수 있는 동물 세포의 배양용 배지, 및 동물 세포의 배양 방법을 제공할 수 있다.
[도 1] 시험예 1에 있어서, 본 발명의 배양용 첨가물이 인간 인공 다능성 줄기세포 1210B2주의 부유 배양에서의 증식성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 2] 시험예 2에 있어서, 본 발명의 배지가 인간 인공 다능성 줄기세포 1210B2주의 접착 배양에서의 증식성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 3] 시험예 2에 있어서, 본 발명의 배지가 인간 인공 다능성 줄기세포 201B7주의 접착 배양에서의 증식성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 4] 시험예 3에 있어서, 본 발명의 배양 방법이 인간 인공 다능성 줄기세포 1210B2주의 부유 배양에서의 증식성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 5] 시험예 3에 있어서, 본 발명의 배양 방법이 인간 인공 다능성 줄기세포 1231A3주의 부유 배양에서의 증식성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 2] 시험예 2에 있어서, 본 발명의 배지가 인간 인공 다능성 줄기세포 1210B2주의 접착 배양에서의 증식성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 3] 시험예 2에 있어서, 본 발명의 배지가 인간 인공 다능성 줄기세포 201B7주의 접착 배양에서의 증식성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 4] 시험예 3에 있어서, 본 발명의 배양 방법이 인간 인공 다능성 줄기세포 1210B2주의 부유 배양에서의 증식성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 5] 시험예 3에 있어서, 본 발명의 배양 방법이 인간 인공 다능성 줄기세포 1231A3주의 부유 배양에서의 증식성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
본 발명은, 동물 세포의 배양용 첨가물(이하, 본 명세서에 있어서 「본 발명의 첨가물」이라고도 칭함)을 제공한다.
여기에서, 「동물 세포의 배양용 첨가물」이란, 동물 세포 배양에 적합한 첨가물을 말하며, 동물 세포의 배양시에 배지 또는 배양물에 첨가되는 첨가물을 말한다.
본 발명에 있어서, 동물 세포로서는, 포유 동물 유래의 정상 세포, 줄기세포 및 전구 세포를 들 수 있다.
포유 동물 유래의 정상 세포로서는, 정자, 난자 등의 생식 세포나, 생체를 구성하는 체세포를 들 수 있다.
생체를 구성하는 체세포의 예로서는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, 섬유아세포, 골수세포, B 림프구, T 림프구, 호중구, 적혈구, 혈소판, 매크로파지, 단구(單球), 골세포, 주피세포, 수상세포, 지방세포, 간엽세포, 상피세포, 표피세포(예를 들면, 각화세포(케라티노사이트), 각질세포 등), 내피세포, 혈관 내피세포, 간실질세포, 연골세포, 난구세포, 신경세포, 글리아세포, 올리고덴드로사이트(희돌기교세포), 마이크로글리아(소교세포), 아스트로사이트(성상교세포), 심장 세포, 식도 세포, 근육 세포(예를 들어, 평활근 세포, 골격근 세포), 췌장 베타 세포, 멜라닌 세포 및 단핵세포 등을 들 수 있다.
당해 체세포에는, 예를 들어 피부, 신장, 비장, 부신, 간장, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 방광, 전립선, 정소, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 혈액(제대혈을 포함함), 골수, 심장, 눈, 뇌 또는 신경 조직 등의 임의의 조직으로부터 채취되는 세포가 포함된다.
줄기세포란, 자기 복제능과, 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 가지고, 제한없이 증식할 수 있는 세포를 말한다.
예를 들어, 조혈 줄기세포, 위성 세포, 신경 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 유선 줄기세포, 후점막 줄기세포, 신경관(神經冠) 줄기세포, 간 줄기세포, 췌(膵) 줄기세포, 근 줄기세포, 생식 줄기세포, 장관(腸管) 줄기세포, 모포(毛包) 줄기세포 등의 성체 줄기세포; 배아 줄기세포(ES 세포), 배아 종양 세포, 배아 생식 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 등의 다능성 줄기세포; 암 줄기세포 등을 들 수 있다.
전구 세포란, 상기 줄기세포에서 특정의 체세포나 생식 세포로 분화하는 도중의 단계에 있는 세포이며, 위성 세포, 췌전구(膵前驅) 세포, 혈관 전구 세포, 혈관 내피 전구 세포, 조혈 전구 세포(제대혈 유래의 CD34 양성세포 등) 등을 들 수 있다.
본 발명의 첨가물은, 바람직하게는 줄기세포의 배양용 첨가물로서 제공되며, 보다 바람직하게는 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양용 첨가물로서 제공되며, 더욱 바람직하게는 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양용 첨가물로서 제공된다.
본 발명의 첨가물은, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 함유한다.
본 발명의 첨가물에 함유되는 아미노산은, 아미노기 및 카복실기를 갖는 양성의 유기 화합물이지만, 바람직하게는, 생체의 단백질의 구성 단위가 되는 α-아미노산이며, 알킬기를 갖는 중성 아미노산(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신), 하이드록시기를 갖는 아미노산(세린, 트레오닌), 황을 함유하는 아미노산(메티오닌, 시스테인), 아미드기를 갖는 아미노산(아스파라긴, 글루타민), 이미노기를 갖는 아미노산(프롤린), 방향족기를 갖는 아미노산(페닐알라닌, 티로신, 트립토판), 산성 아미노산(아스파라긴산, 글루타민산), 염기성 아미노산(아르기닌, 리신, 히스티딘) 등을 들 수 있다.
또한, 시스테인의 2량체인 시스틴도, 배지나 배양물에 첨가되면 환원되어 시스테인이 되기 때문에, 시스테인과 마찬가지로 사용할 수 있다.
본 발명의 첨가물에는, 아미노산은 1종을 단독으로 함유시켜도 좋고, 2종 이상을 조합하여 함유시켜도 좋다.
동물 세포의 증식성 향상 효과의 관점에서는, 아미노산으로서, 트립토판(2-아미노-3-(인돌릴)프로피온산), 세린(2-아미노-3-하이드록시프로피온산), 시스테인(2-아미노-3-술파닐프로피온산), 시스틴(3,3'-디티오비스(2-아미노프로피온산)), 메티오닌((S)-4-(메틸티오)-2-아미노부티르산) 및 아르기닌(2-아미노-5-구아니디노펜탄산)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 함유시키는 것이 보다 바람직하고, 트립토판, 세린, 시스테인 혹은 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌의 5종의 아미노산을 함유시키는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 동물 세포의 증식성 향상 효과의 관점에서, 상기 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌에 더해서, 히스티딘(2-아미노-3-(1H-이미다졸-4-일)프로피온산), 이소류신(2-아미노-3-메틸펜탄산), 류신(2-아미노-4-메틸펜탄산), 리신(2,6-디아미노헥산산), 페닐알라닌(2-아미노-3-페닐프로판산), 발린(2-아미노-3-메틸부탄산)도 바람직한 아미노산으로서 들 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 형태에 있어서는, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 함유시키는 것이 보다 바람직하고, 트립토판, 세린, 시스테인 혹은 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린의 11종의 아미노산을 함유시키는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 첨가물에 함유되는 아미노산으로서는, L-체, D-체, DL-체 중 어느 것도 사용할 수 있지만, 바람직하게는, L-체 및 DL-체이며, 더욱 바람직하게는, L-체이다.
또한, 상기 아미노산은, 유리체뿐만 아니라, 염의 형태로도 사용할 수 있다. 본 명세서에서의 「아미노산」, 「트립토판」, 「세린」, 「시스테인」, 「시스틴」, 「메티오닌」, 「아르기닌」, 「히스티딘」, 「이소류신」, 「류신」, 「리신」, 「페닐알라닌」 및 「발린」이라는 말은, 각각 염도 포함하는 개념이다. 염의 형태로서는, 산 부가염이나 염기와의 염 등을 들 수 있고, 약리학상 허용되는 염을 선택하는 것이 바람직하다.
상기 아미노산의 염으로서는, 구체적으로는 무기 염기, 유기 염기, 무기산, 유기산과의 염 및 아미노산과의 염 등을 들 수 있다. 무기염기와의 염으로서는, 예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속과의 염, 마그네슘, 칼슘 등의 알칼리 토류 금속과의 염, 암모늄염 등을 들 수 있다. 유기 염기와의 염으로서는, 예를 들어 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 등의 알칸올아민과의 염, 모르폴린, 피페리딘 등의 복소환식 아민과의 염 등을 들 수 있다. 무기산과의 염으로서는, 예를 들어, 할로겐화 수소산(염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등), 황산, 질산, 인산 등과의 염 등을 들 수 있다. 유기산과의 염으로서는, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 프로판산 등의 모노카복실산과의 염; 옥살산, 말론산, 사과산, 숙신산 등의 포화 디카복실산과의 염; 말레산, 푸마르산 등의 불포화 디카복실산과의 염; 시트르산 등의 트리카복실산과의 염; α-케토글루타르산 등의 케톤산과의 염 등을 들 수 있다. 아미노산과의 염으로서는, 글리신, 알라닌 등의 지방족 아미노산과의 염; 페닐알라닌 등의 방향족 아미노산과의 염; 아르기닌, 리신 등의 염기성 아미노산과의 염; 아스파라긴산, 글루타민산 등의 산성 아미노산과의 염; 피로글루타민산 등의 락탐을 형성한 아미노산과의 염 등을 들 수 있다.
본 발명의 목적에는, 상기 아미노산으로서는 유리체가 바람직하다. 또한, 염산염도 바람직하게 사용된다.
본 발명에 있어서, 유리체 및 염의 형태의 상기 아미노산은, 천연에 존재하는 동식물 등으로부터 추출하여 정제한 것, 혹은, 화학 합성법, 발효법, 효소법 또는 유전자 변형 등에 의해 얻어지는 것 중 어느 것을 사용해도 좋지만, 각 사로부터 제공되고 있는 시판의 제품을 이용해도 좋다.
본 발명의 첨가물에서의 아미노산의 함유량은, 아미노산의 전량으로 하여 통상 0.01중량% 내지 100중량%이고, 바람직하게는 0.1중량% 내지 100중량%이다.
또한, 본 발명의 첨가물에 함유되는 아미노산 중에, 염의 형태로 함유되는 아미노산이 존재하는 경우는, 당해 아미노산에 대해서는 유리체로 환산한 함유량으로, 상기한 아미노산의 함유량이 산출된다.
본 발명의 첨가물이, 트립토판, 세린, 시스테인 혹은 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌의 5종의 아미노산을 함유하는 경우, 이들은, 각각 유리체로 환산한 함유량의 중량비(트립토판:세린:시스테인(시스틴이 사용되는 경우, 환원되어 생성되는 시스테인으로 환산한 양으로 표시함):메티오닌:아르기닌)가, 1:0.01 내지 100:0.01 내지 100:0.01 내지 100:0.01 내지 100이 되도록 함유되는 것이 바람직하고, 1:0.1 내지 10:0.1 내지 10:0.1 내지 10:0.1 내지 10이 되도록 함유되는 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 첨가물이, 트립토판, 세린, 시스테인 혹은 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린의 11종의 아미노산을 함유하는 경우, 이들은, 각각 유리체로 환산한 함유량의 중량비(트립토판:세린:시스테인(시스틴이 사용되는 경우, 환원되어 생성되는 시스테인으로 환산한 양으로 표시함):메티오닌:아르기닌:히스티딘:이소류신:류신:리신:페닐알라닌:발린)가 1:0.01 내지 100:0.01 내지 100:0.01 내지 100:0.01 내지 100:0.01 내지 100:0.01 내지 100:0.01 내지 100:0.01 내지 100:0.01 내지 100:0.01 내지 100이 되도록 함유되는 것이 바람직하고, 1:0.1 내지 10:0.1 내지 10:0.1 내지 10:0.1 내지 10:0.1 내지 10:0.1 내지 10:0.1 내지 10:0.1 내지 10:0.1 내지 10:0.1 내지 10이 되도록 함유되는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 첨가물에 함유되는 글루코오스는, 과일이나 꿀 중에 유리되어 존재하는 알도헥소오스이며, 동물 세포의 배양에 있어서, 탄소원으로서 이용된다.
본 발명에 있어서, 글루코오스로서는, 과일이나 꿀 등으로부터 단리 정제하고, 또한 전분의 가수 분해 등에 의해 제조하여 사용해도 좋지만, 각 사로부터 제공되고 있는 시판의 제품을 이용해도 좋다.
본 발명의 첨가물에서의 글루코오스의 함유량은, 통상 1중량% 내지 100중량%이고, 바람직하게는 10중량% 내지 100중량%이다.
본 발명의 첨가물에는, 아미노산과 글루코오스 중 어느 하나를 함유시켜도 좋고, 양자를 모두 함유시켜도 좋다.
동물 세포의 증식성 향상 효과의 관점에서는, 아미노산과 글루코오스의 쌍방을 함유시키는 것이 바람직하고, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상과 글루코오스를 함유시키는 것이 보다 바람직하고, 트립토판, 세린, 시스테인 혹은 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌과 글루코오스를 함유시키는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 다른 형태에 있어서, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상과 글루코오스를 함유시키는 것이 보다 바람직하고, 트립토판, 세린, 시스테인 혹은 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린과 글루코오스를 함유시키는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 첨가물에 있어서, 아미노산과 글루코오스는, 아미노산의 전량(유리체로 환산한 양)과 글루코오스의 중량비[아미노산의 전량(유리체로 환산한 양):글루코오스]가 1:1 내지 1:500이 되도록 함유되는 것이 바람직하고, 1:5 내지 1:50이 되도록 함유되는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 그대로 본 발명의 첨가물로 해도 좋고, 또한, 물, 다가 알코올 등의 용매에 용해 혹은 분산하여, 수용액, 분산액 등의 액상의 형태, 혹은 부형제, 결합제 등의 일반적으로 제제화에 사용되는 첨가물과 혼합하여, 분말상, 과립상, 정제상 등의 고형상의 첨가물로 해도 좋다.
또한, 상기한 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를, 탄수화물, 무기염 등의 이하에 서술하는 배지 성분의 일부와 혼합하여, 본 발명의 첨가물로서 조제해도 좋다.
동물 세포의 배양용 배지에의 첨가가 간편하고, 배지와의 혼화(混和)도 용이하다는 관점에서, 본 발명의 첨가물은, 바람직하게는 액상, 분말상, 과립상, 정제상 등의 형태로 제공된다.
본 발명의 첨가물은, 멸균 처리하여 조제하는 것이 바람직하다. 멸균 처리 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 121℃에서 20분간의 오토클레이브 멸균, 방사선 멸균, 에틸렌옥사이드 가스 멸균, 필터 여과 멸균 등을 들 수 있으며, 본 발명의 첨가물의 형태 등에 따라, 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 첨가물은, 후술하는 동물 세포의 배양용 배지의 성분에 첨가하여, 동물 세포의 배양용 배지의 조제에 사용할 수 있으며, 또한, 후술하는 동물 세포의 배양용 배지에 첨가하여 사용할 수 있다. 혹은, 본 발명의 첨가물은, 동물 세포의 배양물에 첨가하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 첨가물은, 동물 세포의 배양용 배지 또는 동물 세포의 배양물에 대하여, 아미노산의 농도(유리체의 아미노산으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 900000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 10000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 600mg/L/일, 글루코오스의 농도로 하여 통상 0.1g/L/일 내지 900g/L/일, 바람직하게는 1g/L/일 내지 200g/L/일, 보다 바람직하게는 1g/L/일 내지 20g/L/일가 되도록 첨가된다.
또한, 본 발명의 첨가물이, 아미노산으로서 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 함유하는 경우, 본 발명의 첨가물은, 동물 세포의 배양용 배지 또는 동물 세포의 배양물에 대하여, 트립토판의 농도(유리체의 트립토판으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 11000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 세린의 농도(유리체의 세린으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 425000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 시스테인 혹은 시스틴의 농도(유리체의 시스테인으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 280000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 메티오닌의 농도(유리체의 메티오닌으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 55000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 아르기닌의 농도(유리체의 아르기닌으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 150000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 2000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 200mg/L/일가 되도록 첨가된다.
또한, 본 발명의 첨가물이, 아미노산으로서 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 함유하는 경우, 본 발명의 첨가물은, 동물 세포의 배양용 배지 또는 동물 세포의 배양물에 대하여, 트립토판의 농도(유리체의 트립토판으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 11000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 세린의 농도(유리체의 세린으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 425000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 시스테인 혹은 시스틴의 농도(유리체의 시스테인으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 280000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 메티오닌의 농도(유리체의 메티오닌으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 55000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 아르기닌의 농도(유리체의 아르기닌으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 150000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 2000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 200mg/L/일, 히스티딘의 농도(유리체의 히스티딘으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 41900mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 이소류신의 농도(유리체의 이소류신으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 41200mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 류신의 농도(유리체의 류신으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 22400mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 리신의 농도(유리체의 리신으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 900000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 페닐알라닌의 농도(유리체의 페닐알라닌으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 29600mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 발린의 농도(유리체의 발린으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 85000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일가 되도록 첨가된다.
본 발명의 첨가물이 첨가되는 동물 세포의 배양용 배지는, 통상, 탄소원으로서, 글루코오스, 수크로오스, 말토오스 등의 당이나 전분 등의 탄수화물을 함유하고, 또한 질소원으로서, 아미노산, 펩티드, 단백질을 함유한다.
따라서, 본 발명의 첨가물이 첨가되는 동물 세포의 배양용 배지는, 원래 아미노산이나 글루코오스를 함유하는 것이라도 좋고, 당해 배지에서의 아미노산의 당초의 함유 농도(유리체의 아미노산으로 환산한 농도)는, 통상 0.1mg/L 내지 5g/L 정도이며, 당해 배지에서의 글루코오스의 당초의 함유 농도는, 통상 0.1g/L 내지 10g/L 정도이다.
본 발명의 첨가물을 첨가하여 조제한 동물 세포의 배양용 배지를 사용하여, 또한, 본 발명의 첨가물을 동물 세포의 배양용 배지에 첨가하여 동물 세포를 배양하거나, 혹은 동물 세포의 배양물에 본 발명의 첨가물을 첨가함으로써, 동물 세포의 증식성을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 첨가물은, 특히, 무혈청 배지 또는 저알부민 배지에 의해 동물 세포를 배양할 때에, 동물 세포의 증식성을 향상시키는 데에 적합하다.
본 발명의 첨가물은, 동물 세포를 배지 중에 부유시켜 증식시키는 부유 배양, 및 동물 세포를 배양 용기에 부착시켜 증식시키는 접착 배양 중 어느 배양에도 사용할 수 있다.
본 발명의 첨가물을 사용하여 동물 세포의 부유 배양을 행할 경우, 크기가 제어된 세포괴를 형성시킬 수 있고, 세포괴의 상태에서 부유 배양을 행할 수 있다.
본 발명은 또한, 동물 세포의 배양용 배지(이하, 본 명세서에서 「본 발명의 배지」라고도 칭함)를 제공한다.
「동물 세포」에 대해서는, 본 발명의 첨가물에 대하여 상기한 바와 같다.
또한, 본 발명의 배지는, 바람직하게는 줄기세포의 배양용 배지로서 제공되며, 보다 바람직하게는 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양용 배지로서 제공되며, 더욱 바람직하게는 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양용 배지로서 제공된다.
본 발명의 배지는, 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지 성분에 더하여, 추가로 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 함유한다.
본 발명의 배지에 추가로 함유되는 아미노산 및 글루코오스에 대해서는, 본 발명의 첨가물에 대해 상기한 바와 같다.
본 발명에 있어서는, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스는, 상기한 본 발명의 첨가물로서 조제된 상태로, 상기 배지 성분과 함께 함유되어도 좋고, 또는 배지 성분에 대하여 직접 첨가되어도 좋다.
본 발명의 배지에 있어서, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스는, 본 발명의 첨가물에 대하여 상기한 농도로 배지 성분에 첨가된다.
본 발명의 배지에 함유시킬 수 있는 배지 성분으로서는, 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지 성분을 들 수 있으며, 예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등의 당; 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민, 글루타민산 등의 아미노산; 알부민, 트랜스페린 등의 단백질; 글리실글리실글리신, 대두 펩티드 등의 펩티드; 혈청; 비타민 A, 비타민 B군(티아민, 리보플라빈, 피리독신, 시아노코발라민, 비오틴, 엽산, 판토텐산, 니코틴아미드 등), 비타민 C, 비타민 E 등의 비타민; 올레인산, 아라키돈산, 리놀산 등의 지방산; 콜레스테롤 등의 지질; 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 인산이수소나트륨 등의 무기염; 아연, 구리, 셀렌 등의 미량 원소; N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES)), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신(N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글라이신(트리신(Tricine)) 등의 완충제; 암포테리신 B, 카나마이신, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 페니실린 등의 항생물질; Type I 콜라겐, Type II 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신 등의 세포 접착 인자 및 세포 외 매트릭스 성분; 인터류킨, 섬유아세포 증식 인자(FGF), 간세포 증식 인자(HGF), 트랜스포밍 증식 인자(TGF)-α, 트랜스포밍 증식 인자(TGF)-β, 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 액티빈 A 등의 사이토카인 및 증식 인자; 덱사메타손, 하이드로코르티손, 에스트라디올, 프로게스테론, 글루카곤, 인슐린 등의 호르몬 등을 들 수 있고, 배양하는 동물 세포의 종류에 따라 적절한 성분을 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 혈청에는 미지의 인자나 프리온, 바이러스 등이 포함될 가능성이 있기 때문에, 본 발명의 배지는, 배지 성분으로서 혈청을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 배지가, 인간의 세포의 배양용 배지로서 조제되는 경우에는, 인간 이외의 동물 유래 성분을 함유하지 않는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서는, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스는, 상기한 포유 동물 유래의 정상 세포, 줄기세포 및 전구 세포 등의 동물 세포의 배양용으로서 범용되는 배지에 첨가하여, 본 발명의 배지로 해도 좋다.
포유 동물 세포 유래의 정상 세포의 배양에 사용되는 배지로서는, 둘베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM), 햄 F12 배지(Ham's Nutrient Mixture F12), DMEM/F12 배지, 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A medium), 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium)(MEM), 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM), α개변형 이글 최소 필수 배지(alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium)(αMEM), 로즈웰 파크 기념 연구소(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI) 1640 배지, 이스코프 개변 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM), MCDB131 배지, 윌리엄 배지 E(William's Medium E), 피셔 배지(Fischer's Medium) 등을 들 수 있다.
줄기세포의 배양에 사용되는 배지로서는, STEMPRO(등록 상표) hESC SFM 배지(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)사), mTeSR1 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), TeSR2 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), TeSR-E8 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), Essential 8 배지(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)사), HEScGRO(상표) Serum-Free Medium for hES cells(밀리포어(Millipore)사), PluriSTEM(상표) Human ES/iPS Medium(이엠디 밀리포어(EMD Millipore)사), NutriStem(등록 상표) hESC XF 배지(바이올로지컬 인더스트리즈 이스라엘 베이트-하에멕(Biological Industries Israel Beit-Haemek) 가부시키가이샤), NutriStem(상표) XF/FF Culture Medium(스템젠트(Stemgent)사), AF NutriStem(등록 상표) hESC XF 배지(바이올로지컬 인더스트리즈 이스라엘 베이트-하에멕(Biological Industries Israel Beit-Haemek) 가부시키가이샤), S-medium(DS 파마 바이오 메디컬 가부시키가이샤), StemFit(등록 상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤), hESF9 배지, hESF-FX 배지, CDM 배지, DEF-CS 500 Xeno-Free 3D Spheroid Culture Medium(셀라티스(Cellartis)사), StemFlex 배지(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사) 등을 들 수 있다.
전구 세포의 배양에 사용되는 배지로서는, HPGM(상표)(캠브렉스사), QBSF-60(퀄리티바이올로지컬사) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스는, 줄기세포의 배양용 배지에 첨가되는 것이 바람직하고, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양용 배지에 첨가되는 것이 보다 바람직하고, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양용 배지에 첨가되는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 목적에는, 무혈청 배지 또는 저알부민 배지를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 또한 인간의 세포의 배양용 배지에 사용하기에는, 인간 이외의 동물 유래 성분을 함유하지 않는 것(제노프리 배지)이 바람직하다.
또한, 본 발명의 배지는, 원래 배지 성분으로서, 글루코오스나 아미노산을 함유하는 것이어도 좋다. 이러한 경우에서의 배지 중의 아미노산의 당초의 함유 농도(유리체의 아미노산으로 환산한 농도)는, 통상 0.1mg/L 내지 5g/L 정도이며, 글루코오스의 당초의 함유 농도는, 통상 0.1g/L 내지 10g/L 정도이다.
또한, 동물 세포의 부유 배양에도 사용한다는 관점에서는, 본 발명의 배지는, 용액, 분산액 등의 액상의 형태로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 배지에 있어서, 동물 세포의 배양에 제공될 때의 pH를 7 이상으로 제어하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지의 pH는, 본 발명의 배지에 함유되는 배지 성분, 또는 본 발명의 배지에 첨가되는 본 발명의 첨가물에, pH 조정제나 완충제를 첨가함으로써 조정될 수 있다.
이러한 pH 조정제 또는 완충제로서는, 본 발명의 배지의 pH를 7 이상으로 제어할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 인산, 인산이수소나트륨, 인산일수소나트륨, 인산이수소칼륨, 인산일수소칼륨, 트리스하이드록시메틸아미노메탄 등을 들 수 있고, 배지 중의 함유 성분에 따라, 적절히 선택하여 사용된다.
또한, 본 발명의 배지의 pH는, 배양 온도에서, 통상의 방법에 의해 측정된다. 예를 들어, 액상의 배지이면, 유리 전극법에 의해 측정할 수 있고, 고형상의 배지이면, 플랫 타입의 전극을 사용하거나, 또는 반유동 상태로 하는 등의 전처리를 행한 후에, 통상의 유리 전극을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 배지는, 공지의 조성에 따라, 상기한 배지 성분으로부터 적절히 선택되는 성분과, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 물 등의 용매에 첨가하여, 용해 또는 분산하여 조제할 수 있다.
또한, 본 발명의 배지는, 각 사·각 기관으로부터 제공되고 있는 상기한 동물 세포 배양용 배지에, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 첨가하여 용해 또는 분산하여 조제할 수 있다.
또한, 본 발명의 배지는, 사용시의 농도보다도 농축된 상태나, 동결 건조된 분말상의 상태로 조제하여, 사용시에 물 등의 용매로 희석하거나, 또는 물 등의 용매에 용해 또는 분산하여 사용하는 형태로 할 수도 있다.
본 발명의 배지는, 상기한 바와 같은 멸균 처리를 실시하여 조제되는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지는, 동물 세포의 부유 배양 및 접착 배양 중 어느 것에도 사용할 수 있다. 본 발명의 배지를 동물 세포의 부유 배양에 사용하는 경우는, 크기가 제어된 세포괴의 형성이 가능하며, 세포괴의 상태에서의 부유 배양을 행하는 데에 적합하다.
본 발명의 배지를 사용함으로써, 부유 배양, 접착 배양 중 어느 것에 있어서도, 동물 세포의 증식성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 배지는, 바람직하게는 줄기세포의 배양에 사용되며, 보다 바람직하게는 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양에 사용되고, 더욱 바람직하게는 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양에 사용된다.
또한, 본 발명은, 동물 세포의 배양 방법(이하, 본 명세서에서 「본 발명의 배양 방법」이라고도 칭함)을 제공한다.
본 발명의 배양 방법은, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스가 첨가된 동물 세포의 배양용 배지에서, 동물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 혹은, 본 발명의 배양 방법은, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를, 동물 세포의 배양물에 첨가하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명에 있어서는, 동물 세포의 부유 배양 및 접착 배양 중 어느 것도 행할 수 있다. 본 발명의 배양 방법은, 특히, 크기가 제어된 세포괴를 형성시킬 수 있고, 세포괴의 상태에서 부유 배양하는 데에 적합하다.
「아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스가 첨가된 동물 세포의 배양용 배지」에 대해서는, 본 발명의 첨가물 및 본 발명의 배지에 관하여 상기한 바와 같고, 본 발명에 있어서, 동물 세포의 배양용 배지에 첨가되는 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스는, 상기한 본 발명의 첨가물로서 조제되어 첨가된 것이라도 좋고, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스가 동물 세포의 배양용 배지에 직접 첨가된 것이어도 좋다.
또한, 본 발명의 배양 방법에 있어서, 아미노산 및 글루코오스는, 각각 본 발명의 첨가물에 있어서 상기한 농도로, 동물 세포의 배양용 배지 또는 배양물에 첨가된다.
또한, 동물 세포의 접착 배양을 행하는 경우는, 족장 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 족장 재료로서는, 동물 세포의 접착 배양에 통상 사용되는 족장 재료를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 매트리젤 등의 기저막 매트릭스, 비트로넥틴, 라미닌 등의 인간형 리컴비넌트의 매트릭스를 사용할 수 있다.
동물 세포에 대해서는, 본 발명의 첨가물에 있어서 상기한 바와 같다.
본 발명의 배양 방법에 있어서, 동물 세포 배양은, 통상의 부유 배양 또는 접착 배양의 방법에 따라 행할 수 있다.
즉, 배양의 형태(부유 배양 또는 접착 배양) 및 배양 스케일에 따라, 적절히 세포 배양용 플레이트, 세포 배양 플라스크, 바이오리액터 등의 배양 용기 또는 배양 장치를 사용하여, 상기한 본 발명의 배지 또는 본 발명의 첨가물을 첨가한 동물 세포의 배양용 배지에 동물 세포를 파종하고, 통상 25℃ 내지 39℃, 바람직하게는 33℃ 내지 39℃에서, 통상 4체적% 내지 10체적%, 바람직하게는 4체적% 내지 6체적%의 이산화탄소 존재 하, 또한 통상 1체적% 내지 25체적%, 바람직하게는 4체적% 내지 20체적%의 산소 존재 하에서, 통상 1일간 내지 30일간, 바람직하게는 2일간 내지 14일간 배양을 행한다. 또한, 2 내지 3일간마다, 또는 1일 1회 또는 복수회 배지 교환을 행한다.
배지 교환은, 부유 배양의 경우는, 원심 분리나 여과에 의해 동물 세포와 배지를 분리한 후, 새로운 배지를 동물 세포에 첨가하거나, 혹은, 원심 분리나 여과를 행함으로써 동물 세포를 적절히 농축한 후, 새로운 배지를 농축 세포액에 첨가함으로써 행한다.
상기 원심 분리시의 중력 가속도(G)는, 통상 50G 내지 1,000G, 바람직하게는, 100G 내지 500G이며, 여과에 사용하는 필터의 세공(細孔)의 크기(직경)는, 통상 10μm 내지 200μm이다.
접착 배양의 경우의 배지 교환은, 배지를 흡인 등 하여 제거하고, 새로운 배지를 동물 세포에 첨가하여 행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 동물 세포의 부유 배양은, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등을 행하여 실시할 수 있다.
교반은, 바이오리액터, 교반 날개 부착 배양조 등을 사용하여 행할 수 있고, 통상 10rpm 내지 2,000rpm, 바람직하게는 40rpm 내지 1,000rpm의 교반 속도로 행한다.
진탕은, 진탕기나 진탕 배양기를 사용하여 행할 수 있고, 통상 10rpm 내지 500rpm, 바람직하게는 50rpm 내지 250rpm의 진탕 속도로 행한다.
환류는, 페리스탈틱 펌프, 튜빙 펌프 등을 사용하여 행할 수 있고, 통상 10μL/min 내지 1,000mL/분, 바람직하게는 1mL/분 내지 100mL/분의 유속으로 행한다. 환류용 튜브로서는, 실리콘, 네오프렌(클로로프렌고무), 마프렌(폴리프로필렌·에틸렌프로필렌고무)제 등의 페리스탈틱 펌프용 튜브, 튜빙 펌프용 튜브 등을 사용한다.
기체 통기는, 마이크로 스파저, 필터 스파저 등, 각종 스파저를 사용하여 행할 수 있고, 통상 1mL/분 내지 1,000mL/분, 바람직하게는 50mL/분 내지 200mL/분의 통기량으로 행할 수 있다.
크기가 제어된 세포괴를 효율적으로 얻기 위해서는, 동물 세포의 부유 배양은, 교반 또는 진탕을 행하여 실시하는 것이 바람직하다.
부유 배양에 의해 배양된 동물 세포는, 원심 분리 또는 필터를 사용한 여과에 의해 회수할 수 있다.
원심 분리는, 50G 내지 1,000G, 바람직하게는 100G 내지 500G에서 1분간 내지 10분간 정도 행한다.
또한, 여과는, 직경이 10μm 내지 200μm 정도의 세공을 갖는 필터를 사용하여 행할 수 있다.
접착 배양에 의해 배양된 동물 세포는, 배지를 흡인 제거하고, 예를 들어, 트립신 용액 또는 트립신 및 에틸렌디아민4아세트산(EDTA) 용액을 사용하여 처리함으로써, 배양 용기로부터 박리한 후, 원심 분리 또는 필터를 사용한 여과에 의해 회수할 수 있다.
배양되고, 회수된 동물 세포는, 스템-셀뱅커(STEM-CELLBANKER)(니혼 젠야쿠 코교 가부시키가이샤) 등의 동결 보호제를 함유하는 동결용 배지를 사용하여, 액체 질소 중에서 보존하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 방법에 의해, 부유 배양, 접착 배양 중 어느 것에 있어서도, 동물 세포의 증식성을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 배양 방법은, 줄기세포의 배양에 있어서 바람직하게 사용되며, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양에 의해 바람직하게 사용할 수 있고, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양에 더욱 바람직하게 사용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
[실시예 1] 동물 세포의 배양용 첨가물
D-글루코오스(나카라이 테스크 가부시키가이샤; 16806-25)를, 그대로 본 발명의 첨가물(실시예 1)로 했다.
[실시예 2] 동물 세포의 배양용 첨가물
L-트립토판(아지노모토 가부시키가이샤), L-세린(아지노모토 가부시키가이샤), L-시스테인(니혼 프로테인 가부시키가이샤), L-메티오닌(아지노모토 가부시키가이샤) 및 L-아르기닌(아지노모토 가부시키가이샤)을, 1:1:1:1:2의 중량비(L-트립토판:L-세린:L-시스테인:L-메티오닌:L-아르기닌)로 혼합하여, 본 발명의 첨가물(실시예 2)로 했다.
[실시예 3] 동물 세포의 배양용 첨가물
L-트립토판(아지노모토 가부시키가이샤), L-세린(아지노모토 가부시키가이샤), L-시스테인(니혼 프로테인 가부시키가이샤), L-메티오닌(아지노모토 가부시키가이샤), L-아르기닌(아지노모토 가부시키가이샤) 및 D-글루코오스(나카라이 테스크 가부시키가이샤; 16806-25)를, 1:1:1:1:2:100의 중량비(L-트립토판:L-세린:L-시스테인:L-메티오닌:L-아르기닌:D-글루코오스)로 혼합하여, 본 발명의 첨가물(실시예 3)로 했다.
[시험예 1] 인간 인공 다능성 줄기세포(iPS)의 부유 배양에서의 본 발명의 첨가물의 효과의 평가
마이크로 바이오리액터(ambr15(싸토리우스(sartorius)사; 001-0881)를 사용하여, 10μM의 Rho 결합 키나아제 저해제(Y-27632)(후지 필름 와코 쥰야쿠 가부시키가이샤; 034-24024)를 함유하는 스템핏(StemFit)(등록 상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤) 14mL에, iPS 세포 1210B2주(iPS 아카데미아 재팬 가부시키가이샤)를 2×105 세포/mL의 세포 밀도로 파종하고, 37℃, pH=7.2, 이산화탄소 농도=5 체적%, 용존 산소 농도=20체적%, 교반 속도=300rpm의 조건 하에서 교반 배양했다.
파종 2일째 이후에 매일 7할의 배지를 스템핏(StemFit)(등록 상표) AK03N 배지로 교환하고, 실시예 1의 본 발명의 첨가물을, D-글루코오스의 농도로 하여 2g/L/일, 실시예 2의 본 발명의 첨가물을, L-트립토판, L-세린, L-시스테인 및 L-메티오닌에 대해서는 각각 20mg/L/일, L-아르기닌에 대해서는 40mg/L/일, 실시예 3의 본 발명의 첨가물을, L-트립토판, L-세린, L-시스테인 및 L-메티오닌에 대해서는 각각 20mg/L/일, L-아르기닌에 대해서는 40mg/L/일, D-글루코오스에 대해서는 2g/L/일의 농도로, 각각 첨가하여, 배양을 계속했다.
또한, 대조군으로서, 어떤 첨가물도 첨가하지 않고, 마찬가지로 배지 교환을 행하여 배양을 계속했다.
실시예 1 내지 3의 각 첨가물을 첨가하여 배양한 경우, 및 대조군에 대하여, 배양 6일째에 생세포 수를 생사 세포 오토 애널라이저(Vi-CELL(등록 상표) XR(벡크만쿨터 가부시키가이샤))를 사용하여 측정했다. 측정 결과를 도 1에 나타냈다.
도 1에 나타내어지는 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 첨가물을 각각 iPS 세포의 배양물에 첨가한 경우에는, 대조군에 비해 생세포 수의 증가가 확인되었다.
따라서, 5종의 아미노산(L-트립토판, L-세린, L-시스테인, L-메티오닌 및 L-아르기닌) 혹은 글루코오스의 첨가에 의해, iPS 세포의 증식성이 향상되는 것이 확인되었다.
또한, 5종의 아미노산과 글루코오스의 쌍방을 첨가함으로써, 상가적(相加的)인 iPS 세포의 증식성 향상 효과를 얻을 수 있는 것이 확인되었다.
[실시예 4] 동물 세포의 배양용 배지
스템핏(StemFit)(등록 상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤)에, D-글루코오스(와코 쥰야쿠 코교 가부시키가이샤; 045-31167)를 2g/L의 농도로 첨가하여, 실시예 4의 동물 세포의 배양용 배지로 했다.
[실시예 5] 동물 세포의 배양용 배지
스템핏(StemFit)(등록 상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤)에, L-트립토판(아지노모토 가부시키가이샤), L-세린(아지노모토 가부시키가이샤), L-시스테인(니혼 프로테인 가부시키가이샤) 및 L-메티오닌(아지노모토 가부시키가이샤)을 각 20mg/L, 및 L-아르기닌(아지노모토 가부시키가이샤)을 40mg/L의 농도로 첨가하여, 실시예 5의 동물 세포의 배양용 배지로 했다.
[실시예 6] 동물 세포의 배양용 배지
스템핏(StemFit)(등록 상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤)에, L-트립토판(아지노모토 가부시키가이샤), L-세린(아지노모토 가부시키가이샤), L-시스테인(니혼 프로테인 가부시키가이샤) 및 L-메티오닌(아지노모토 가부시키가이샤)을 각 20mg/L, L-아르기닌(아지노모토 가부시키가이샤)을 40mg/L, 및 D-글루코오스(와코 쥰야쿠 코교 가부시키가이샤; 045-31167)를 2g/L의 농도로 첨가하여, 실시예 6의 동물 세포의 배양용 배지로 했다.
[시험예 2] iPS 세포의 접착 배양에서의 본 발명의 배지의 효과의 평가
iPS 세포로서, 1210B2주 및 201B7주(iPS 아카데미아 재팬 가부시키가이샤)를 사용하고, 1210B2주에 대해서는 실시예 5 및 6의 각 배지에서, 201B7주에 대해서는 실시예 4 내지 6의 각 배지에서 접착 배양을 행했다.
기저막 매트릭스(iMatrix-511(가부시키가이샤 닛피; 892012))를 코트한 12웰 플레이트를 준비하고, 1웰당 실시예 4 내지 6의 각 배지 1mL를 첨가하여, 10,000개의 세포를 단일 세포의 상태로 파종하고, 37℃, 이산화탄소 농도=5체적%, 산소 농도=20체적%의 조건 하에 7일간 배양했다. 각 배지에는, 최종 농도=10μM의 Rho 결합 키나아제 저해제(Y-27632)(후지 필름 와코 쥰야쿠 가부시키가이샤; 034-24024)를 추가했다. 배양 1, 2, 5 및 6일째에, 전량 배지 교환을 행했다.
또한, 대조군으로서, 스템핏(StemFit)(등록 상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤)를 사용하여 마찬가지로 iPS 세포 1210B2주 및 201B7주의 접착 배양을 행했다.
배양 7일째에 인큐사이트(IncuCyte)(에센 바이오 사이언스 가부시키가이샤)로 세포 피복률을 측정했다. 각 배지를 사용한 접착 배양 및 세포 피복률의 측정은, 각각 3회 행하고, 측정 결과는 평균값으로 도 2, 3에 나타냈다.
도 2에 나타내어지는 바와 같이, 1210B2주의 접착 배양에 있어서는, 본 발명의 실시예 5 및 6의 각 배지를 사용한 경우에, 대조군에 비해 세포 증식성의 향상이 확인되었다.
또한, 도 3에 나타내어지는 바와 같이, 201B7주의 접착 배양에 있어서는, 본 발명의 실시예 4 내지 6의 각 배지를 사용함으로써, 세포 증식성의 향상이 확인되었다.
시험예 2의 상기 결과로부터, iPS 세포의 접착 배양에 있어서도, 5종의 아미노산(L-트립토판, L-세린, L-시스테인, L-메티오닌 및 L-아르기닌) 혹은 글루코오스, 또는 상기 5종의 아미노산 및 글루코오스의 첨가에 의해, 세포 증식성이 향상되는 것이 시사되었다.
[실시예 7, 8] iPS 세포의 부유 배양
iPS 세포용 30mL 싱글 유즈 바이오리액터(에이블(ABLE)사: BWV-S03A)를 사용하여, 10μM의 Rho 결합 키나아제 저해제(Y-27632)(후지 필름 와코 쥰야쿠 가부시키가이샤; 034-24024)를 더한 스템핏(StemFit)(등록 상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤)에, iPS 세포 1210B2주 및 1231A3주(iPS 아카데미아 재팬 가부시키가이샤)를 6×105 세포/mL의 세포 밀도로 파종하고, CO2 인큐베이터 내에서 교반 배양했다(37℃, 산소 농도=20체적%, 이산화탄소 농도=5체적%). 파종 후 2일째에 배지의 70%를 스템핏(StemFit)(등록 상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤)로 교환했다. 파종 후 3일째에 세포 현탁액 10mL를 신선한 스템핏(StemFit)(등록 상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤) 10mL에 재현탁하고(1210B2주에 대해서는 세포 밀도=0.806×106 세포/mL, 1231A3주에 대해서는 세포 밀도=0.481×106 세포/mL), 마이크로 바이오리액터(ambr15(싸토리우스(sartorius)사: 001-0881)로 옮겨, 37℃, pH=7.2, 용존 산소 농도=20체적%, 이산화탄소 농도=5체적%, 교반 속도=300rpm의 조건 하에서 교반 배양을 계속하여, 1일 1회, 배지의 70%를 교환했다.
그때, 한쪽의 군에는, L-트립토판(아지노모토 가부시키가이샤)(40mg/L/일), L-세린(아지노모토 가부시키가이샤)(40mg/L/일), L-시스테인염산염(니혼 프로테인 가부시키가이샤)(40mg/L/일), L-메티오닌(아지노모토 가부시키가이샤)(40mg/L/일), L-아르기닌(아지노모토 가부시키가이샤)(160mg/L/일), D-글루코오스(나카라이 테스크 가부시키가이샤; 16806-25)(4g/L/일)를 첨가하고(실시예 7), 다른 한쪽의 군에는 상기의 5종의 아미노산 및 글루코오스에 더해서, L-히스티딘(아지노모토 가부시키가이샤)(18.6mg/L/일), L-이소류신(아지노모토 가부시키가이샤)(43.7mg/L/일), L-류신(아지노모토 가부시키가이샤)(43.7mg/L/일), L-리신염산염(아지노모토 가부시키가이샤)(73.1mg/L/일), L-페닐알라닌(아지노모토 가부시키가이샤)(28.4mg/L/일) 및 L-발린(아지노모토 가부시키가이샤)(42.3mg/L/일)을 첨가하여 배양했다(실시예 8).
[시험예 3] iPS 세포의 부유 배양에서의 본 발명의 배양 방법의 효과의 평가
1210B2주에 대해서는 배양 8일째에, 1231A3주에 대해서는 배양 7일째에, 생세포 수를 생사 세포 오토 애널라이저(Vi-CELL(등록 상표) XR(벡크만쿨터 가부시키가이샤)를 사용하여 측정했다.
1210B2주 및 1231A3주에 대하여, 생세포 수의 측정 결과를 도 4 및 5에 각각 나타냈다.
도 4 및 5에 나타내어지는 바와 같이, 5종류의 아미노산(L-트립토판, L-세린, L-시스테인염산염, L-메티오닌 및 L-아르기닌)과 글루코오스를 첨가하여 배양한 경우(실시예 7) 및 11종류의 아미노산(L-트립토판, L-세린, L-시스테인염산염, L-메티오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신염산염, L-페닐알라닌 및 L-발린)과 글루코오스를 첨가하여 배양한 경우(실시예 8) 중 어느 것에 있어서도, 1210B2주 및 1231A3주의 쌍방에 있어서, 재현탁시에 비해 생세포 수의 증가가 확인되고, 세포 증식이 촉진되었으나, 11종류의 아미노산과 글루코오스를 첨가한 경우(실시예 8)에 있어서, 보다 큰 세포 증식 촉진 효과가 확인되었다.
[산업 상의 이용 가능성]
이상 상술(詳述)한 바와 같이, 본 발명에 의해, 동물 세포, 특히 줄기세포의 증식성을 적합하게 향상시킬 수 있는 동물 세포의 배양용 첨가물을 제공할 수 있고, 동물 세포의 증식성을 적합하게 향상시킬 수 있는 동물 세포의 배양용 배지, 및 동물 세포의 배양 방법을 제공할 수 있다.
본원은, 일본에서 출원된 특허출원 2018-184352를 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.
Claims (25)
- 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 함유하는, 동물 세포의 배양용 첨가물.
- 제1항에 있어서, 상기 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 첨가물.
- 제1항에 있어서, 상기 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 첨가물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물 세포가 줄기세포인, 첨가물.
- 제4항에 있어서, 상기 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 첨가물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물 세포의 부유 배양용 첨가물인, 첨가물.
- 제6항에 있어서, 상기 동물 세포의 부유 배양이, 세포괴의 상태에서의 부유 배양인, 첨가물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물 세포의 접착 배양용 첨가물인, 첨가물.
- 배지 성분에 더해서, 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 추가로 함유하는, 동물 세포의 배양용 배지.
- 제9항에 있어서, 상기 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배지.
- 제9항에 있어서, 상기 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배지.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 7 이상인, 배지.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물 세포가 줄기세포인, 배지.
- 제13항에 있어서, 상기 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배지.
- 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물 세포의 부유 배양용 배지인, 배지.
- 제15항에 있어서, 상기 동물 세포의 부유 배양이, 세포괴의 상태에서의 부유 배양인, 배지.
- 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물 세포의 접착 배양용 배지인, 배지.
- 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스가 첨가된 동물 세포의 배양용 배지에서 동물 세포를 배양하는 것, 혹은 아미노산 혹은 글루코오스, 또는 아미노산 및 글루코오스를 동물 세포의 배양물에 첨가하는 것을 포함하는, 동물 세포의 배양 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 및 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배양 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 아미노산이, 트립토판, 세린, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배양 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물 세포가 줄기세포인, 배양 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배양 방법.
- 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물 세포의 부유 배양 방법인, 배양 방법.
- 제23항에 있어서, 세포괴를 형성시켜 동물 세포를 부유 배양하는, 배양 방법.
- 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물 세포의 접착 배양 방법인, 배양 방법.
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