CN112553143A - 一种肝脏模型及其制备方法和用途 - Google Patents

一种肝脏模型及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112553143A
CN112553143A CN202011528400.1A CN202011528400A CN112553143A CN 112553143 A CN112553143 A CN 112553143A CN 202011528400 A CN202011528400 A CN 202011528400A CN 112553143 A CN112553143 A CN 112553143A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
culture solution
liver
medium
artificial sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011528400.1A
Other languages
English (en)
Inventor
王艳
程薇
李潇岚
杨守飞
冯艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Original Assignee
Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine filed Critical Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority to CN202011528400.1A priority Critical patent/CN112553143A/zh
Publication of CN112553143A publication Critical patent/CN112553143A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/237—Oncostatin M [OSM]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种肝脏模型及其制备方法和用途，所述肝脏模型通过将所述类肝细胞在垂直旋转培养装置中培养获得，类肝细胞为依次用第一培养液、第二培养液、第三培养液、第四培养液诱导胚胎干细胞系而得到。本发明的肝脏模型有益于个性化医疗、化合物肝脏毒性等领域的研究，具备常规细胞模型的一般特性，在使用相对较少的人力情况下也可高效地获得在体外构建具有肝脏特征的三维肝脏模型；肝脏模型的制备耗时短，效率高，可重复性强，可满足肝脏毒性测试用生物供体的持续提供需求，满足个性化医疗、化合物肝脏毒性等生物医药领域的研究。

Description

一种肝脏模型及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种肝脏模型及其制备方法和用途。
背景技术
肝脏是人体内化合物的重要代谢器官，经肝脏代谢后，化合物的毒性可发生变化，因此，肝脏是化合物毒性最主要的靶器官之一。目前我们日常生活中接触的化合物数量已超过30000种，包括药物、食品添加剂、保健品等。其中，明确可诱导肝损伤的化合物超过1000种，所以外源性化合物诱导的肝损伤无疑是化合物风险评估和管理中的一个重要指标。然而，随着工业化程度的快速进行，每年新的化合物数目剧增，而传统的化合物毒性测试却因耗时长、耗资高、耗人时人力等客观因素制约，测试的效率和速率明显落后于化合物数目的增长，因此产生了巨大的毒性信息的缺口，也凸显出对化合物毒性的准确评价是保障人类健康的重要前提。因此，开发精准、快速、高通量的毒性测试体系和方法的任务迫在眉睫。
肝脏是具有显著种属差异性的器官之一，因代谢特征存在明显的种属间差异，因此利用实验动物开展的肝毒性研究既不能准确反映人类基因型的响应方式，亦不能准确地体现出化合物导致肝脏损伤的疾病或者有害效应表型。
另外，目前肝脏毒性的体外实验多以二维培养的肝细胞为实验材料。但是目前许多研究报道中以二维培养的肝细胞由于缺少合理的细胞间或者细胞外基质的联系，用于反映化学品肝脏毒性时是存在缺陷的；而经三维细胞培养体系，可获得更贴近器官特性的组织。
由于人的原代细胞较难获得，且因供体不同而存在着较大的批次和来源间差异，故虽可作为人源细胞的来源，但其不稳定性无疑限制了原代细胞在化合物毒性测试及毒理学机制研究中的使用；而目前实验室研究中常用的肝脏细胞系多为肿瘤来源的(如HepG2，Huh-7等)，故在某些关键的效应特征上与正常的肝脏细胞系存在一定的差异(如代谢酶的缺失等)。因此，借鉴替代方法的思路，高效地建立可准确反映人类生物学特征的体外肝脏模型，用于个性医疗、化合物毒性测试等领域，对保障人类的健康具有非常重大的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种肝脏模型及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种培养基，所述培养基包括第一培养液，以第一培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure BDA0002851504440000021
本发明还提供所述培养基在体外诱导胚胎干细胞系分化为类肝细胞中的用途。
本发明还提供一种体外诱导胚胎干细胞系分化为类肝细胞的方法，所述方法包括如下步骤：依次用第一培养液、第二培养液、第三培养液、第四培养液诱导胚胎干细胞系。
本发明还提供一种肝脏模型，所述肝脏模型为通过将所述方法获得的类肝细胞经垂直旋转培养装置自组装形成的细胞团。
本发明还提供所述肝脏模型在阐明制备生物人工肝、肝脏疾病机制研究、肝脏疾病药物的开发、筛选、药理毒理学评价、或化合物肝脏毒性测试中的用途。
本发明还提供所述肝脏模型的制备方法，所述方法包括将上述方法获得的类肝细胞在垂直旋转培养装置中培养。
如上所述，本发明的一种肝脏模型及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
1.利用胚胎干细胞系建立体外诱导分化为类肝细胞的方法，可作为人源肝脏细胞的稳定来源；
2.利用生物反应器进行三维培养，可在体外高效地构建具有肝脏特征的三维肝脏模型，有益于个性化医疗、化合物肝脏毒性等领域的研究，可进行商品化的毒性预测系统和/或试剂盒类产品的开发，方便使用；
3.本发明具备常规细胞模型的一般特性，在使用相对较少的人力情况下也可高效地获得在体外构建具有肝脏特征的三维细胞模型。
4.肝脏模型的制备耗时短，效率高，可重复性强，可满足肝脏毒性测试用生物供体的持续提供需求，满足个性化医疗、化合物肝脏毒性等生物医药领域的研究。
附图说明
图1显示为人胚胎干细胞在体外诱导分化为类肝脏细胞；
其中，(A)诱导分化方案示意图及分化各时间段细胞镜下形态。标尺＝200μm。诱导分化开始记为Day0；分化至定型内胚层的ES记为Day3；ES诱导分化的成类肝细胞(Day8)。Day14起为未未成熟类肝细胞逐渐成熟。
(B)ES诱导分化过程中，分化各阶段标志物mRNA的表达水平。
(C)为分化过程中ELISA法检测的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和葡萄糖醛酸转移酶(UGT)的表达水平。
图2显示为类肝细胞能较好地维持肝脏特异性生物学特征。
图3显示为利用垂直旋转式生物反应器进行肝脏细胞的三维培养，
其中，A)用于细胞培养的垂直旋转式生物反应器例图。
(B)人胚胎干细胞诱导分化的类肝细胞在垂直旋转式培养装置中以30转/分的条件培养120小时后获得的三维细胞，
(C)人胚胎干细胞诱导分化的类肝细胞在垂直旋转式培养装置中以60转/分的条件培养120小时后获得的三维细胞。
(D)为30转/分的条件下培养获得的三维细胞模型中肝脏特异性标志物及代谢相关酶的mRNA表达谱。
(E)为60转/分条件下培养获得的三维细胞模型中肝脏特异性标志物及代谢相关酶的mRNA表达谱。(mRNA表达谱下方字母及其代表的基因见图片右下角)。
图4显示为体外肝脏模型对对乙酰氨基酚诱导肝脏毒性效应的验证。
图5显示为体外肝脏模型对钴胺素诱导肝脏毒性效应的验证。
具体实施方式
本发明首先提供一种培养基，所述培养基包括第一培养液，以第一培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure BDA0002851504440000031
所述基础培养液选自DMEM、DMEM/F12、RPMI1640中的一种或几种。在一较佳实施例中所述基础培养液为RPMI1640。
所述基础培养液的终体积比例＝100％—血清替代物的终体积比例—无胰岛素B27补充剂的终体积比例—MEM非必需氨基酸的终体积比例—胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的终体积比例。
所述血清替代物为商业化试剂，其中含有细胞生长必不可少的维生素、激素、黏附因子等。在一种实施方式中，所述血清替代物的终体积选自以下范围中的一个：5～8％、8～13％、13～15％。
所述无胰岛素B27补充剂为商业化试剂。在一种实施方式中，所述无胰岛素B27补充剂的终体积选自以下范围中的一个：0.5～1.5％、1.5～2.5％、2.5～3.5％、3.5～4.5％、4.5～5％。
所述MEM非必需氨基酸为商业化试剂，包括甲硫氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸8种必需氨基酸，和精氨酸、组氨酸2种半必需氨基酸，以及酪氨酸、胱氨酸2种非必需氨基酸。在一种实施方式中，所述MEM非必需氨基酸的终体积选自以下范围中的一个：0.5～1.5％、1.5～2.5％、2.5～3.5％、3.5～4.5％、4.5～5％。
所述激活素A(Activin A)的终浓度选自以下范围中的一个：60～70ng/ml、70～80ng/ml、80～90ng/ml、90～100ng/ml。
所述抗坏血酸的终浓度选自以下范围中的一个：200～220μg/ml、220～240μg/ml、240～260μg/ml、260～280μg/ml、280～300μg/ml。
所述胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂(ITS)为商业化试剂。在一种实施方式中，所述胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的终体积选自以下范围中的一个：0.5～1.5％、1.5～2.5％、2.5～3.5％、3.5～4.5％、4.5～5％。
所述第一培养液用于人胚胎干细胞(hES)的第一阶段诱导分化(定型内胚层诱导)。
所述培养基还包括第二培养液，以第二培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure BDA0002851504440000041
所述基础培养液选自DMEM、DMEM/F12、RPMI1640中的一种或几种。在一较佳实施例中所述基础培养液为RPMI1640。
所述基础培养液的终体积比例＝100％—血清替代物的终体积比例—MEM非必需氨基酸的终体积比例—胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的终体积比例。
所述血清替代物为商业化试剂，其中含有细胞生长必不可少的维生素、激素、黏附因子等。在一种实施方式中，所述血清替代物的终体积选自以下范围中的一个：5～8％、8～13％、13～15％。
所述MEM非必需氨基酸为商业化试剂，包括甲硫氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸8种必需氨基酸，和精氨酸、组氨酸2种半必需氨基酸，以及酪氨酸、胱氨酸2种非必需氨基酸。在一种实施方式中，所述MEM非必需氨基酸的终体积选自以下范围中的一个：0.5～1.5％、1.5～2.5％、2.5～3.5％、3.5～4.5％、4.5～5％。
所述骨形态发生蛋白(BMP)选自BMP-2、BMP-4中的一种或几种。
在一种实施方式中，所述骨形态发生蛋白的终浓度选自以下范围中的一个：40～45ng/ml、45～50ng/ml、50～55ng/ml、55～60ng/ml。
在一种实施方式中，所述人成纤维细胞生长因子4的终浓度选自以下范围中的一个：40～45ng/ml、45～50ng/ml、50～55ng/ml、55～60ng/ml。
所述第二培养液用于hES的第二阶段诱导分化(肝脏系特化hepaticspecification)
所述培养基还包括第三培养液，以第三培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure BDA0002851504440000051
所述基础培养液选自DMEM、DMEM/F12、RPMI1640中的一种或几种。在一较佳实施例中所述基础培养液为RPMI1640。
所述基础培养液的终体积比例＝100％—血清替代物的终体积比例—MEM非必需氨基酸的终体积比例—胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的终体积比例。
在一种实施方式中，所述血清替代物的终体积选自以下范围中的一个：5～8％、8～13％、13～15％。
在一种实施方式中，所述MEM非必需氨基酸的终体积选自以下范围中的一个：0.5～1.5％、1.5～2.5％、2.5～3.5％、3.5～4.5％、4.5～5％。
在一种实施方式中，所述胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的终体积选自以下范围中的一个：0.5～1.5％、1.5～2.5％、2.5～3.5％、3.5～4.5％、4.5～5％。
在一种实施方式中，所述人胰岛素的终浓度选自以下范围中的一个：5～8ng/ml、8～11ng/ml、11～15ng/ml。
所述骨形态发生蛋白(BMP)为BMP-2。
在一种实施方式中，所述肝细胞生长因子的终浓度选自以下范围中的一个：30～40ng/ml、40～50ng/ml、50～60ng/ml、60～70ng/ml。
所述第三培养液用于hES的第三阶段诱导分化(hepatoblasts expansion)。
所述培养基还包括第四培养液，以第四培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure BDA0002851504440000061
所述基础培养液选自MEM、DMEM、DMEM/F12、RPMI1640或F12中的一种或几种。在一较佳实施例中所述基础培养液为DMEM。
所述基础培养液的终体积比例＝100％—血清替代物的终体积比例—B27补充剂的终体积比例—MEM非必需氨基酸的终体积比例—胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的终体积比例。
在一种实施方式中，所述血清替代物的终体积选自以下范围中的一个：10～12％、12～14％、14～16％、16～18％、18～20％。
在一种实施方式中，所述B27补充剂或MEM非必需氨基酸的终体积选自以下范围中的一个：0.5～1.5％、1.5～2.5％、2.5～3.5％、3.5～4.5％、4.5～5％。
在一种实施方式中，所述人胰岛素的终浓度选自以下范围中的一个：5～8ng/ml、8～11ng/ml、11～15ng/ml。
在一种实施方式中，所述胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的终浓度选自以下范围中的一个：0.2～0.4％、0.4～0.6％、0.6～0.8％。
在一种实施方式中，所述抑瘤素M的终浓度选自以下范围中的一个：5～8ng/ml、8～11ng/ml、11～15ng/ml。
所述第四培养液用于hES的第四阶段诱导分化(肝脏成熟阶段hepaticmaturation)。
所述培养基还包括第五培养液，以第五培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure BDA0002851504440000071
所述基础培养液选自MEM、DMEM、DMEM/F12、RPMI1640或F12中的一种或几种。在一较佳实施例中所述基础培养液为RPMI1640。
所述基础培养液的终体积比例＝100％—血清替代物的终体积比例—MEM非必需氨基酸的终体积比例—胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的终体积比例。
在一种实施方式中，所述血清替代物的终体积选自以下范围中的一个：5～8％、8～13％、13～15％。
所述MEM非必需氨基酸为商业化试剂，包括甲硫氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸8种必需氨基酸，和精氨酸、组氨酸2种半必需氨基酸，以及酪氨酸、胱氨酸2种非必需氨基酸。
在一种实施方式中，所述MEM非必需氨基酸的终体积选自以下范围中的一个：0.5～1.5％、1.5～2.5％、2.5～3.5％、3.5～4.5％、4.5～5％。
在一种实施方式中，所述胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的终体积选自以下范围中的一个：0.2～0.4％、0.4～0.6％、0.6～0.7％。
所述第五培养液用于诱导分化结束后的类肝细胞普通培养。
所述培养基还包括第六培养液，所述第六培养液以第六培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure BDA0002851504440000072
所述基础培养液选自DMEM、DMEM/F12、RPMI1640中的一种或几种。在一较佳实施例中所述基础培养液为DMEM/F12。
所述基础培养液的终体积比例＝100％—KO SR的终体积比例—MEM非必需氨基酸的终体积比例。
所述KO SR为商品化试剂。在一种实施方式中，所述KO SR的终体积选自以下范围中的一个：5～8％、8～13％、13～15％。
在一种实施方式中，所述MEM非必需氨基酸的终体积选自以下范围中的一个：0.5～1.5％、1.5～2.5％、2.5～3.5％、3.5～4.5％、4.5～5％。
在一种实施方式中，所述碱性成纤维生长因子的终体积选自以下范围中的一个：40～50ng/ml、50～60ng/ml、60～70ng/ml、70～80ng/ml。
所述第六培养液用于人胚胎干细胞系(hES)的常规传代培养。
所述第一培养液、第二培养液、第三培养液、第四培养液、第五培养液、第六培养液为相互独立的培养液，分别在细胞培养的不同阶段使用。其中第一培养液、第二培养液、第三培养液、第四培养液用于诱导分化，第五培养液和第六培养液分别用于诱导后的类肝细胞和诱导前的胚胎干细胞系的常规培养。
本发明还提供所述培养基在体外诱导胚胎干细胞系分化为类肝细胞中的用途。
在一种实施方式中，所述胚胎干细胞系为人胚胎干细胞系。本发明中的所述胚胎干细胞系为通过商业途径购买得到，例如从上海埃泽思生物科技有限公司。
本发明还提供一种体外诱导胚胎干细胞系分化为类肝细胞的方法，所述方法包括如下步骤：依次用第一培养液、第二培养液、第三培养液、第四培养液诱导胚胎干细胞系。
具体的，将正常培养的胚胎干细胞系中的培养液换成第一培养液时，记为第0天。在一种实施方式中，在第2～3天时换用第二培养液。在一种实施方式中，在第7～9天时换用第三培养液。在一种实施方式中，在第13～15天时换用第四培养液，直至第19～21天时诱导结束。
诱导过程中细胞的培养条件不做特殊限制，用常规的温度、湿度等培养条件即可。
在一种实施方式中，诱导前，所述胚胎干细胞系传代时使用IV型胶原酶使细胞分离。诱导前，所述胚胎干细胞系的常规培养使用第六培养液。
在一种实施方式中，诱导分化时细胞密度保持正常传代培养的细胞密度。
本发明还提供一种体外分离的类肝细胞，所述类肝细胞为经过上述方法获得的类肝细胞。
所述类肝细胞即人胚胎干细胞诱导分化所得，具备肝脏细胞的基本生物学功能的细胞。所述类肝细胞可表达肝细胞特异性标志物HNF4A，C/EBPα，以及肝细胞特异性的代谢酶，例如乙酰辅酶A羧化酶和葡萄糖醛酸转移酶。
在一种实施方式中，所述类肝细胞传代时使用中性蛋白酶使细胞分离。诱导分化结束后的类肝细胞使用所述第五培养液常规培养。
本发明还提供一种类肝细胞的用途，所述类肝细胞在阐明肝细胞体内外死亡、增殖机制、肝细胞疗法、肝细胞移植、制备生物人工肝、肝脏疾病机制研究、肝脏疾病药物的开发、筛选、药理毒理学评价中的用途。
本发明还提供一种肝脏模型，所述肝脏模型为通过将所述类肝细胞经垂直旋转培养装置自组装形成的细胞团。
在一种实施方式中，所述垂直旋转培养装置为垂直旋转式生物反应器。该装置可从商业途径获得本专利中使用德国PFEIFFER公司四单元细胞旋转培养装置(货号183015)，具备可在每分钟5至60转之间自由调节转速的技术参数即可。
所述肝脏模型具备肝脏的生物学特征。例如可表达肝脏特异性标志物、代谢相关酶及成熟肝脏细胞标志物白蛋白ALB。
本发明还提供所述肝脏模型在阐明制备生物人工肝、肝脏疾病机制研究、肝脏疾病药物的开发、筛选、药理毒理学评价、或化合物肝脏毒性测试中的用途。
所述肝脏模型可作为化合物肝脏毒性测试用生物供体，且可持续提供需求，满足个性化医疗。
本发明还提供所述肝脏模型的制备方法，所述方法包括将所述类肝细胞在垂直旋转培养装置中培养。
在一种实施方式中，垂直旋转培养时细胞密度为105～106个/ml。所述细胞密度选自以下范围中的一个：1×105～5×105个/ml、5×105～1×106个/ml、1×106～5×106、5×106～9.5×106、个/ml。优选的，为7.5×105～1×106个/ml。
在一种实施方式中，垂直旋转培养时的转速为20～60转/分钟。例如选自20～30转/分钟，30～40转/分钟，40～50转/分钟，50～60转/分钟中的一个。优选的，转速为20～40转/分钟。
在一种实施方式中，培养的时间为96～144小时。优选的，培养110～130小时。
在一较佳实施方式中，垂直旋转培养时的细胞密度为7.5×105个/ml或1×106个/ml，转速为30转/分钟，培养120小时。整个培养过程无需更换培养液即可以获得较多三维球状的、具备肝脏生物学特征的体外肝脏模型。
所述方法耗时短，效率高，可重复性强。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明所用细胞材料、试剂和实验仪器说明如下：
1.人胚胎干细胞系(human embryonic stem cell,hES)
本发明中所使用的人胚胎干细胞系H1是从商业途径获得细胞系。
2.培养液及试剂
本发明中所使用的培养液为DMEM/F12(Dubecco’s Modified Eagle’s Medium)，KO DMEM(KnockOut Dubecco’s Modified Eagle’s Medium)，这些培养基的配方是本领域公知的，不仅在普通教科书和试验手册中有详细描述，而且还可直接以成品的形式从公司商购获得(如美国ThermoFisher公司等)。
作为补充物的成分是任何维持或促进细胞生长的成分，例如，它们可包括但不限于：氨基酸、维生素、蛋白、微量元素、糖、脂类等等。优选的，补充物选自胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂，维生素C，商品化B27补充剂、无胰岛素B27补充剂。
用于hES培养和诱导分化的细胞因子BMP-4重组人蛋白，Activin A重组人蛋白和bFGF重组人蛋白均购自美国ThermoFisher公司。
本发明中所用细胞培养液如下：
1)细胞分离液A：
5mg/ml IV型胶原酶
2)细胞分离液B：
用50mmol/L HEPES配置的中性蛋白酶，母液浓度为5mg/ml，使用前用PBS稀释至10μg/ml，即工作液，现用现配。
2)第六培养液：用于hES的常规培养。成分如下：
83％DMEM/F12培养液+10％KO SR+1％非必需氨基酸+2mM L-谷氨酰胺+60ng/ml碱性成纤维生长因子bFGF。
3)第一培养液：用于hES的第一阶段诱导分化(定型内胚层诱导)。成分如下：
87％RPMI 1640培养基+10％血清替代物+1％无胰岛素B27补充剂+1％MEM非必需氨基酸+80ng/ml激活素A+250μg/ml抗坏血酸+1％ITS。
4)第二培养液：用于hES的第二阶段诱导分化(肝脏系特化hepaticspecification)。成分如下：
88％RPMI 1640培养基+10％血清替代物+1％非必需氨基酸+1％胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂+50ng/ml骨形态发生蛋白2+50ng/ml人成纤维细胞生长因子4。
5)第三培养液：用于hES的第三阶段诱导分化(hepatoblasts expansion)。成分如下：
83％RPMI1640培养基+15％血清替代物+1％非必需氨基酸+10ng/ml人胰岛素+20ng/ml骨形态蛋白2+1％胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂+50ng/ml肝细胞生长因子。
6)第四培养液：用于hES的第四阶段诱导分化(肝脏成熟阶段hepaticmaturation)。成分如下：
82.5％DMEM培养基+15％血清替代物+1％B27补充剂+1％非必需氨基酸+10ng/ml人胰岛素+0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂+10ng/ml抑瘤素M。
7)第五培养液：用于诱导分化结束后的类肝细胞普通培养。成分如下：
88.5％RPMI 1640培养基+10％血清替代物+1％非必需氨基酸+0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂。
本发明中使用的倒置显微镜和酶标仪均为实验室常见仪器。生物反应器是从商业途径获得，具备可在每分钟5至60转之间自由调节转速的技术参数即可。
实施例1人胚胎干细胞的培养
复苏后正常生长的hES，使用第六培养液进行培养。
(1)hES的传代：使用细胞分离液A对细胞进行传代。
细胞将以团块的形式接种至Matrigel预包被(自备，1:20稀释)的培养皿中。
吸出拟传代的细胞中培养基，用D-PBS清洗2次后，向培养皿中加入3ml细胞分离液A，室温下作用3-5分钟左右取出，可观察到克隆结构明显松散，克隆外缘出现卷曲，轻拍后以小细胞团的形式脱落时，加入6ml第五培养液终止消化，将所获得的细胞团块移液至离心管中，800转/min，室温离心5分钟后，吸除上清液，根据细胞量以1:5-1:10的比例，传代至预包被Matrigel的培养皿中，用适量第六培养液进行培养。
2)在hES传代后2-3天，在培养皿中的融合度达到70％以上时，选择生长状态良好的克隆状细胞进行后续培养及诱导分化。
实施例2.人胚胎干细胞诱导分化为类肝细胞
1)去除第六培养液，换用第一培养液开始进入诱导分化阶段。换用第一培养液时记为第0天。
2)第3天时去除第一培养液，换用第二培养液。
3)第8天时去除第二培养液，换用第三培养液。
4)第14天时去除第三培养液，换用第四培养液，直至第20天结束培养。
实施例3.人胚胎干细胞来源类肝细胞生物学表征
在第0、3、8、14、20天分别收集培养液上清及细胞，分别利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法及实时定量PCR技术对分化各个阶段的细胞中肝脏特异性标志物的表达水平进行检测，明确经上述诱导方法获得的细胞为肝脏细胞。其中，ELISA法检测的指标为乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和葡萄糖醛酸转移酶(UGT)，PCR法检测的指标为未分化阶段多能性标志物OCT4，定型内胚层阶段标志物SOX17，前肠上皮阶段标志物HNF4A，成肝细胞标志物AFP，成熟肝细胞标志物ALB。
由图1中可见，随着诱导分化的进行，hES的形态逐渐发生变化。相应地，干细胞多能性标志物OCT-4和NANOG的表达呈降低趋势；细胞在Day3高表达SOX17，而后逐渐降低；细胞在Day3即表达HNF4A和C/EBPα，且随着分化时间的延长逐步增加；AFP自Day3可观察到表达，且随着分化时间的延长，表达水平亦迅速增长。由此可见，所采用诱导分化操作方案可将ES诱导为表达肝细胞特异性标志物的细胞类型。在Day20时，肝细胞特异性标志物HNF4A，C/EBPα的mRNA表达水平达到最高。自Day0至Day20，乙酰辅酶A羧化酶和葡萄糖醛酸转移酶表达丰度的升高与肝细胞特异性标志物表达水平的变化趋势一致，即干细胞来源的类肝细胞在分化过程中逐渐表达肝细胞特异性的代谢酶。
实施例4.类肝细胞能较好地维持肝脏特异性生物学特征
人胚胎干细胞诱导分化获得的类肝细胞可通过常规方法传代。由图2可见，将人胚胎干细胞经诱导分化获得的类肝细胞记为第0代，经5次传代后，细胞分泌的白蛋白水平在40-50ng/ml间，与第1代相比无显著差异；细胞分泌的胆固醇调节元件结合蛋白水平在13-22ng/ml，除第5代外，其余代次与第1代相比无显著性差异。同时，细胞裂解液中细胞色素P450中的CYP3A4水平自第2代后均显著高于第1代。此外，与第0代相比，第1至第5代细胞中多能性标志物OCT4的mRNA表达水平显著降低，而肝脏特异性转录因子HNF4A及肝脏特异性代谢酶肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT1A)的mRNA表达水平显著升高。数据提示经传代操作的类肝细胞能较好地维持肝脏特异性生物学特征。
实施例5.人胚胎干细胞来源类肝细胞在垂直旋转培养装置中的三维培养
将实施例2中获得的类肝细胞用细胞分离液B工作液在室温环境中处理5分钟，分散成单细胞后，经离心机以每分钟1000转的条件离心5分钟，弃上清后，用第五培养液重悬细胞，并调节细胞密度。分别设置不同的细胞密度和转速，观察培养垂直旋转培养装置中培养120小时后自组装形成的细胞团生长状况。细胞毒性采用乳酸脱氢酶释放水平进行表征，乳酸脱氢酶检测试剂盒可从商业途径获得，且检测方法可根据试剂盒中说明书进行操作。
由表1数据可见，除10号试验条件显著影响细胞活性外，所采用的其余培养条件均不会导致细胞损伤程度的显著增加。特别地，采用3号试验条件可显著增加细胞活性。
表1.垂直旋转培养装置中培养时细胞密度与培养结束时细胞生长情况
Figure BDA0002851504440000131
*与非三维培养状态下的人胚胎干细胞来源的肝脏细胞相比。
#p<0.0001,与非三维培养状态下的人胚胎干细胞来源的肝脏细胞相比，提示具有显著性差异。
此外，由图3中可见，当人胚胎干细胞来源的肝脏细胞在生物反应器中培养120小时后，30转/分钟转速条件下，自组装形成的三维肝脏模型中的肝脏特异性标志物及代谢相关酶的mRNA表达水平高于60转/分钟。特别的，在30转/分钟的转速条件下，成熟肝脏细胞标志物白蛋白ALB表达水平显著高于60转/分钟的转速条件，且在细胞密度为1×106个/ml及7.5×105个/ml时分别具有最高、第二高的表达丰度。
综合实施例5中表1和图3所示结果，采用垂直旋转培养装置将人胚胎干细胞来源的肝脏细胞构建为体外肝脏模型的最优条件为：将垂直旋转培养瓶中细胞密度调整为7.5×105个/ml或1×106个/ml时，设置培养条件为30转/分钟，培养120小时，可在不更换培养液的前提下，可以获得较多三维球状的、具备肝脏生物学特征的体外肝脏模型。
实施例6.化合物的毒性测试
分别利用已知具有肝脏毒性的化合物对乙酰氨基酚和无肝脏毒性的化合物钴胺素，对所获得的体外肝脏模型对化合物诱导肝脏毒性效应进行验证。
由图4可见，人胚胎干细胞诱导分化的类肝细胞经三维培养后，可识别乙酰氨基酚(APAP)药物作用下的急性肝损伤效应。APAP是一种已知可诱导急性肝脏毒性的药物。经MTT法检测2D培养的类肝细胞在不同浓度APAP作用下细胞活性呈现出剂量依赖式改变，计算获得APAP对类肝细胞的细胞活性的半数抑制剂量IC50为19.68mM，而经活细胞/死细胞染色联合图像分析法计算获得APAP对3D肝脏模型中细胞活性的半数抑制剂量IC50为9.94Mm。在此数据基础上，选择10mM剂量的APAP作用48小时后，与对照组相比，培养上清中乳酸脱氢酶LDH释放量及天门冬氨酸氨基转移酶水平均大幅升高。结果提示3D肝脏模型可灵敏地识别肝脏毒性化合物诱导的毒性效应。
由附图5可见，在无肝脏毒性的化合物钴胺素(即维生素B12)作用下，MTT法检测2D培养的类肝细胞在不同浓度VB12作用下均未观察到细胞活性的显著降低，且在10mM及100mM剂量VB12作用下，细胞活性显著增加。经活细胞/死细胞染色联合图像分析法观察到VB12不影响3D肝脏模型中细胞活性，且在10mM剂量作用下细胞活性显著增加。实验所用最大剂量500mM VB12在2D和3D模型中均不影响类肝细胞活性。在此数据基础上，选择500mM剂量的VB12作用48小时后，与对照组相比，培养上清中乳酸脱氢酶LDH释放量及天门冬氨酸氨基转移酶水平均无显著变化。结果提示无肝脏毒性化合物作用于3D肝脏模型时不会出现肝脏损伤效应。
本发明中检测各基因用到的引物如表2所示：
表2引物序列表
Figure BDA0002851504440000141
Figure BDA0002851504440000151
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院
<120> 一种肝脏模型及其制备方法和用途
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtgaggaca aactattggc ct 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaccagggt ttactggagt c 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcacacctga agaccttaaa gcc 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcccacact gcttgtactg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatcgggacc cataagcctt t 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggaatacga tggttgtcca ttt 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtatccgca aactctacat gaa 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccacttcgac gaatctcttt ga 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcaactctt cgtgaaacct atg 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acatcaacct ctggtctcac c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagaacagc aacgagtacc g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtcactggtc aactccagca c 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cttcagcccg tacctggag 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggagaggaag tcgtggtgc 19
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atcaatcgga ctctggaaac gg 22
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcagggagta gcgcatggt 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcggccacgg agtttcttc 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtcagcatg tgcccaatca 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tattgcggcc aatgtctttg c 21
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cactggagtg atagactcaa cca 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaggacctgt ctaggtttga tgc 23
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggcttcata ggtgacttcc a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggagcagcta ctatgcagag c 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgtgttcatg ccgttcatcc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttgaggtcaa tgaaggggtc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaaggtgaag gtcggagtca 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaaggtgaag gtcggagtca 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
caggtgagtg ggagcaatct 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggctgctgtc ctcatagctt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gcaggctcaa gaaatgcttc 20
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tactgtcggt ttcagaaatg cc 22
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtcagcggac tctggattca g 21
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tctgcctcct ccacgaag 18
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cagaatccag acctgcacaa 20
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agcgaacgca catcaagac 19
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctgtaggcga tctgttgggg 20
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cggaaccatc ttggcaacag t 21
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgcttctcaa tggcgttgt 19
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cttgaatccc gaatggaaag gg 22
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gtgtatatcc cagggtgatc ctc 23

Claims (10)

1.一种培养基，其特征在于，所述培养基包括第一培养液，以第一培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure FDA0002851504430000011
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，还包括下列特征中的一项或多项：
1)所述培养基还包括第二培养液，以第二培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure FDA0002851504430000012
2)所述培养基还包括第三培养液，以第三培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure FDA0002851504430000013
3)所述培养基还包括第四培养液，以第四培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure FDA0002851504430000014
Figure FDA0002851504430000021
4)所述培养基还包括第五培养液，以第五培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure FDA0002851504430000022
5)所述培养基还包括第六培养液，所述第六培养液以第六培养液总体积为基础计，包括以下成分：
Figure FDA0002851504430000023
3.根据权利要求1-2任一所述的培养基，其特征在于，所述基础培养液选自MEM、DMEM、DMEM/F12、RPMI1640或F12中的一种或几种。
4.权利要求1所述的培养基在体外诱导胚胎干细胞系分化为类肝细胞中的用途。
5.一种体外诱导胚胎干细胞系分化为类肝细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：依次用所述第一培养液、第二培养液、第三培养液、第四培养液培养胚胎干细胞系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将培养的胚胎干细胞系中的培养液换成第一培养液时，记为第0天，所述方法还包括以下特征中的一项或几项：
1)在第2～3天时换用第二培养液；
2)在第7～9天时换用第三培养液；
3)在第13～15天时换用第四培养液，直至第19～21天时诱导结束。
7.一种肝脏模型，其特征在于，所述肝脏模型为通过将权利要求5所述的方法得到的类肝细胞经垂直旋转培养装置自组装获得。
8.权利要求7所述的肝脏模型在阐明制备生物人工肝、肝脏疾病机制研究、肝脏疾病药物的开发、筛选、药理毒理学评价、或化合物肝脏毒性测试中的用途。
9.一种肝脏模型的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求5所述的方法得到的类肝细胞在垂直旋转培养装置中培养即获得肝脏模型。
10.根据要求9所述的制备方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或几项：
1)垂直旋转培养时细胞密度为105～106个/ml；
2)垂直旋转培养时的转速为20～60转/分钟；
3)培养的时间为96～144小时。
CN202011528400.1A 2020-12-22 2020-12-22 一种肝脏模型及其制备方法和用途 Pending CN112553143A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011528400.1A CN112553143A (zh) 2020-12-22 2020-12-22 一种肝脏模型及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011528400.1A CN112553143A (zh) 2020-12-22 2020-12-22 一种肝脏模型及其制备方法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112553143A true CN112553143A (zh) 2021-03-26

Family

ID=75031295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011528400.1A Pending CN112553143A (zh) 2020-12-22 2020-12-22 一种肝脏模型及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112553143A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113293217A (zh) * 2021-05-27 2021-08-24 山西医科大学 一种鉴定血痕遗留时间的方法及其mRNA组合

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011009294A1 (zh) * 2009-07-23 2011-01-27 北京华源博创科技有限公司 通过诱导分化获得肝脏细胞、肝脏内胚层细胞和肝脏前体细胞的方法
CN101962630A (zh) * 2009-07-23 2011-02-02 北京大学 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法
CN101962628A (zh) * 2009-07-24 2011-02-02 北京大学 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法
CN110208516A (zh) * 2019-06-03 2019-09-06 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种化学品发育毒性检测方法
CN110373380A (zh) * 2019-06-14 2019-10-25 中国科学院生态环境研究中心 一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用
CN111004770A (zh) * 2019-09-25 2020-04-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 功能性肝细胞诱导方法及其专用三维诱导培养基和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011009294A1 (zh) * 2009-07-23 2011-01-27 北京华源博创科技有限公司 通过诱导分化获得肝脏细胞、肝脏内胚层细胞和肝脏前体细胞的方法
CN101962630A (zh) * 2009-07-23 2011-02-02 北京大学 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法
CN101962628A (zh) * 2009-07-24 2011-02-02 北京大学 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法
CN110208516A (zh) * 2019-06-03 2019-09-06 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种化学品发育毒性检测方法
CN110373380A (zh) * 2019-06-14 2019-10-25 中国科学院生态环境研究中心 一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用
CN111004770A (zh) * 2019-09-25 2020-04-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 功能性肝细胞诱导方法及其专用三维诱导培养基和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周庆军等: "胚胎干细胞分化为肝细胞的研究进展", 《生物工程学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113293217A (zh) * 2021-05-27 2021-08-24 山西医科大学 一种鉴定血痕遗留时间的方法及其mRNA组合

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Asai et al. Paracrine signals regulate human liver organoid maturation from induced pluripotent stem cells
Snykers et al. In vitro differentiation of embryonic and adult stem cells into hepatocytes: state of the art
EP2172542B1 (en) Method for constructing mass of myocardial cells and use of the myocardial cell mass
WO2015180636A1 (zh) 人肝细胞长期维持和增殖传代培养的专用培养基和培养方法
Li et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells
JP6694512B2 (ja) 幹細胞由来ヒト肝細胞を使用した微小組織形成
US20190194607A1 (en) Highly functional liver cells derived from pluripotent stem cells, method for producing same, and method for testing metabolism/toxicity of drug
Shariati et al. Organoid technology: Current standing and future perspectives
JP2005521405A (ja) 単球を起源に持つ、脱分化したプログラム可能な幹細胞およびそれらの製造と使用
CN113151149B (zh) 一种诱导肺类器官的方法及实验模型的建立
TW201522638A (zh) 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法
Afflerbach et al. Mesenchymal stem cells as a promising cell source for integration in novel in vitro models
Yang et al. Pleiotrophin is involved in the amniotic epithelial cell-induced differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into dopaminergic neuron-like cells
CN107916248A (zh) 来源于人类干细胞的肝细胞分化方法及肝细胞
Thakur et al. Scaffold-free 3D culturing enhance pluripotency, immunomodulatory factors, and differentiation potential of Wharton’s jelly-mesenchymal stem cells
CN112553143A (zh) 一种肝脏模型及其制备方法和用途
CN114807034A (zh) 一种人多能干细胞来源的Müller细胞的制备方法
CN115109740A (zh) 肝细胞调控制剂及其制备方法和应用
EP2690174B1 (en) Method for producing epithelial stem cells
Jiang et al. Differentiation of E14 mouse embryonic stem cells into thyrocytes in vitro
WO2023279826A1 (zh) 体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物
Vazirzadeh et al. Galactosylation of rat natural scaffold for MSC differentiation into hepatocyte-like cells: A comparative analysis of 2D vs. 3D cell culture techniques
RU2631005C1 (ru) Способ культивирования клеток слюнной железы человека
Sanchez-Maldonado et al. Spheroids spontaneously generated in vitro from sheep ovarian cortical cells contain integrating cells that exhibit hallmarks of neural stem/progenitor cells
Mantri et al. In-vitro behavior of human umbilical cord blood stem cells towards serum based minimal cytokine growth conditions

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210326

RJ01 Rejection of invention patent application after publication