CN101962630A - 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法 - Google Patents
诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101962630A CN101962630A CN 200910089765 CN200910089765A CN101962630A CN 101962630 A CN101962630 A CN 101962630A CN 200910089765 CN200910089765 CN 200910089765 CN 200910089765 A CN200910089765 A CN 200910089765A CN 101962630 A CN101962630 A CN 101962630A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- final concentration
- division culture
- human
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 60
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 title description 6
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 169
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical class [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 36
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 claims description 29
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 claims description 29
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 27
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims description 24
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims description 24
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 24
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 24
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 22
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 22
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 17
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 claims description 15
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 claims description 15
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 14
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 13
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 13
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 12
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 12
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 12
- 102000057308 human HGF Human genes 0.000 claims description 12
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 8
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims description 4
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003969 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 101100454433 Biomphalaria glabrata BG01 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100454434 Biomphalaria glabrata BG04 gene Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 98
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 30
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000006160 differential media Substances 0.000 abstract 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract 2
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000031142 liver development Effects 0.000 abstract 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 abstract 1
- 208000020673 hypertrichosis-acromegaloid facial appearance syndrome Diseases 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 11
- 102000018329 Keratin-18 Human genes 0.000 description 11
- 108010066327 Keratin-18 Proteins 0.000 description 11
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 101150058750 ALB gene Proteins 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 6
- 102000004328 Cytochrome P-450 CYP3A Human genes 0.000 description 6
- 108010081668 Cytochrome P-450 CYP3A Proteins 0.000 description 6
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 6
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 6
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 5
- 102100023972 Keratin, type II cytoskeletal 8 Human genes 0.000 description 5
- 108010070511 Keratin-8 Proteins 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- 244000050510 Cunninghamia lanceolata Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 4
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 3
- 102100022054 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Human genes 0.000 description 3
- 101001045740 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 2
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 2
- 241000594182 Sarcophaga sigma Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036774 Afamin Human genes 0.000 description 1
- 101710149366 Afamin Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010066302 Keratin-19 Proteins 0.000 description 1
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229940121849 Mitotic inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002788 crimping Methods 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种诱导形成的多潜能干细胞分化成肝细胞的方法，该方法是将诱导形成的多潜能干细胞在分化培养基I中培养，然后再转入含有胰岛素-转铁蛋白-硒盐的分化培养基I中培养，最后在含有成纤维细胞生长因子和骨形态形成蛋白的肝细胞培养基中培养获得肝脏前体细胞，促进所述肝细胞成熟，获得肝细胞；所述分化培养基I为含有活化素A的基础细胞培养基。用本发明的诱导形成的多潜能干细胞分化成肝细胞的方法诱导人iPS细胞向肝脏细胞分化具有周期短、分化效率高、安全稳定的优点，分化获得的肝细胞可用于细胞移植治疗肝病、人工肝脏和药物的毒性测试等，此外整个分化过程也可用于人类早期胚胎肝脏发育的研究，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法及其专用培养基。
背景技术
诱导形成的多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞)和胚胎干细胞(embryonic stem cells)性质非常类似，具有在体外分化成为各种细胞的潜能。这类细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小或者扩增，也可以进一步分化为各种特异的细胞类型。第一株哺乳动物iPS细胞建立于2006年8月，日本Yamanaka教授实验室报道，通过4个基因(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的转导，可以使小鼠体细胞转变成“诱导形成的多潜能干细胞(iPS细胞)”(Takahashi，K.Cell 2006；126，663-676.)。经证明，这些诱导形成的多潜能干细胞(iPS细胞)能够整合入胚泡，参与正常的胚胎发育和组织器官的形成，而且在特定的条件下还能形成嵌合体小鼠。2007年，Thomson实验室和Yamanaka实验室又几乎同时报道了人iPS细胞系的建立(Yu J，et al.Science 2007；318：1917-1920，Takahashi K.Cell 2007；131：861-872.)，这种细胞具有和胚胎干细胞类似的性质，在特定的诱导条件下可向内、中、外三个胚层分化，并可以形成畸胎瘤。到目前为止，已有多个国家和地区的研究人员建立了人iPS细胞系。
由于iPS细胞可以在体外无限扩增，并维持向多个方向分化的潜能，因此通过iPS细胞的定向分化，就可以获得足够数量的细胞，用于细胞移植治疗和基因治疗。如果能够通过获得病人的体细胞并建立与患者具有相同遗传背景的iPS细胞系，诱导其分化为病人所需的细胞类型，最后再植回患者体内进行治疗；这样就可以避免由外源移植导致的免疫排斥。这种治疗性克隆方法的实现将为许多目前难以治愈的疾病，如糖尿病、白血病以及心血管疾病等提供一条新的治疗途径。另外，人iPS细胞的研究将有助于为药物筛选、药理分析及毒性评估等提供动物模型无法比拟的实验平台。研究证明，人iPS细胞可以在体外分化为多种细胞类型，如神经细胞(Dimos JT.Science 2008；321：1218-1221；Chambers SM.Nat Biotechnol2009；27：275-280；Karumbayaram S.Stem Cells 2009；27：806-811；Hirami Y.Neurosci Lett 2009；458：126-131.)，成骨细胞(Karner E.J Cell Physiol2009；218：323-333.)，心肌细胞(Zhang J.Circ Res 2009；104：e30-41.)，脂肪细胞(Taura D.FEBS Lett 2009；583：1029-1033.)，胰腺细胞(Tateishi K.JBiol Chem 2008；283：31601-31607；Zhang D.Cell Res 2009；19：429-438.)，和造血系统细胞(Taura D.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009；Choi KD.Stem Cells 2009；27：559-567.)。
如何有效地将iPS细胞分化为特定组织的细胞，是实现治疗性克隆的重要环节。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的培养基。
本发明所提供的用于诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的培养基，它由分化培养基I-1、分化培养基I-2、分化培养基I-3、分化培养基II、分化培养基III、分化培养基IV和分化培养基V组成；
所述分化培养基I-1是在基础细胞培养基中添加人活化素A得到的培养基，分化培养基I-1中，人活化素A的终浓度为10-500ng/ml；
所述分化培养基I-2是在基础细胞培养基中添加人活化素A和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液得到的培养基，分化培养基I-2中，人活化素A的终浓度为10-500ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为0.01％-0.5％(体积百分含量)；
所述分化培养基I-3是在基础细胞培养基中添加人活化素A和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液得到的培养基，分化培养基I-3中，人活化素A的终浓度为10-500ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为0.5％-20％(体积百分含量)；
所述分化培养基II是在肝细胞培养基中添加人成纤维细胞生长因子和人骨形态形成蛋白得到的培养基，分化培养基II中，人成纤维细胞生长因子的终浓度为5-100ng/ml，人骨形态形成蛋白的终浓度为5-100ng/ml；
所述分化培养基III是在肝细胞培养基中添加人肝细胞生长因子和人角化细胞生长因子得到的培养基；分化培养基III中，人肝细胞生长因子的终浓度为5-100ng/ml；人角化细胞生长因子的终浓度为5-100ng/ml；
分化培养基IV是在肝细胞培养基中添加制瘤素M和地塞米松得到的培养基；其中，制瘤素M的终浓度为1-100ng/ml；地塞米松的终浓度为0.05-1μM；
分化培养基V在基础细胞培养基中添加N2，B27，谷氨酰胺，非必需氨基酸，β-巯基乙醇，制瘤素M和地塞米松得到的培养基；分化培养基V中，N2的终浓度为0.1％-10％(体积百分含量)；B27的终浓度为0.1％-20％(体积百分含量)；谷氨酰胺的终浓度为0.5-2mM；非必需氨基酸的终浓度为0.1％-10％(体积百分含量)；β-巯基乙醇的终浓度为0.05-0.2mM；制瘤素M的终浓度为1-100ng/ml；地塞米松的终浓度为0.05-1μM。
上述用于诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的培养基中，所述分化培养基I-1、分化培养基I-2和分化培养基I-3中，所述人活化素A的终浓度均可为10、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500ng/ml；所述分化培养基I-2中，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度可为0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％；所述分化培养基I-3中，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度可为0.5％、1％、5％、10％、15％、20％；
所述分化培养基II中，所述人成纤维细胞生长因子的终浓度为5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；所述人骨形态形成蛋白的终浓度为5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；
所述分化培养基III中，人肝细胞生长因子的终浓度为5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；所述人角化细胞生长因子的终浓度为5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；
所述分化培养基IV中，制瘤素M的终浓度为1、5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；地塞米松的终浓度为0.05、0.08、0.1、0.15、0.3、0.5、0.6、0.8或1.0μM；
所述分化培养基V中，N2的终浓度为0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、2.0％、3％、5％、8％或10％；B27的终浓度为0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、2.0％、3％、5％、8％、10％、15％或20％；谷氨酰胺的终浓度为0.5mM、0.8mM、1mM、1.5mM或2mM；非必需氨基酸的终浓度为0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、2.0％、3％、5％、8％或10％；β-巯基乙醇的终浓度为0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18或0.2mM；制瘤素M的终浓度为1、5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；地塞米松的终浓度为0.05、0.08、0.1、0.15、0.3、0.5、0.6、0.8或1.0μM。
上述用于诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的培养基中，所述分化培养基I-1、分化培养基I-2和分化培养基I-3中，所述人活化素A的终浓度均为可为50-200ng/ml；所述分化培养基I-2中，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度还可为0.05％-0.1％；所述分化培养基I-3中，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度还可为1％-5％；
所述分化培养基II中，所述人成纤维细胞生长因子的终浓度为20-40ng/ml；所述人成纤维细胞生长因子为酸性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子2或成纤维细胞生长因子4；所述人骨形态形成蛋白的终浓度为为10-30ng/ml；所述人骨形态形成蛋白为人骨形态形成蛋白-2或人骨形态形成蛋白-4；
所述分化培养基III中，人肝细胞生长因子的终浓度为10-30ng/ml；所述人角化细胞生长因子的终浓度为10-30ng/ml；
所述分化培养基IV中，制瘤素M的终浓度为5-15ng/ml；地塞米松的终浓度为0.08-0.15μM；
所述分化培养基V中，N2的终浓度为0.8％-2.0％；B27的终浓度为0.8％-3.0％；谷氨酰胺的终浓度为0.8-1.5mM；非必需氨基酸的终浓度为0.8％-2.0％；β-巯基乙醇的终浓度为0.08-0.15mM；制瘤素M的终浓度为5-15ng/ml；地塞米松的终浓度为0.08-0.15μM。
上述分化培养基I、分化培养基II、分化培养基III、分化培养基IV和分化培养基V的pH均可为7.2-7.6。
上述用于诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的培养基中，所述基础细胞培养基可为MEM、DMEM、BME、DMEM/F12、RPMI1640或Fischers。
本发明的第二个目的是提供采用上述任一种用于诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的培养基诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞分化成肝细胞的方法。
该方法包括以下步骤：
1)是将人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞在上述任一种分化培养基I-1中培养；
2)再转入上述任一种分化培养基I-2中培养；
3)再转入上述任一种分化培养基I-3中培养；
4)再转入上述任一种分化培养基II中培养；
5)再转入上述任一种分化培养基III中培养；
6)再转入上述任一种分化培养基IV中培养；
7)再转入上述任一种分化培养基V中培养，获得人肝细胞。
所述人胚胎干细胞具体可为表1所示的可从商业途径得到的人胚胎干细胞系，如表1。
表1.人胚胎干细胞系
所述人诱导形成的多潜能干细胞(人ips)也可为细胞系，如hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3。
所述步骤1)的培养条件可为37℃培养24-48小时，优选为24小时；
所述步骤2)的培养条件可为37℃培养24-48小时，优选为24小时；
所述步骤3)的培养条件可为37℃培养24-48小时，优选为24小时；
所述步骤4)的培养条件可为37℃培养3-6天，优选为4天；
所述步骤5)的培养条件可为37℃培养5-8天，优选为6天；
所述步骤6)的培养条件可为37℃培养3-6天，优选为5天；
所述步骤7)的培养条件可为37℃培养3-5天，优选为3天。
上述方法获得的表达正常肝细胞标记分子如AFP，Alb，CK18，AAT，CYP3A4等或具有正常肝细胞功能如糖原合成与贮存，尿素合成，分泌白蛋白等的肝细胞也属于本发明的保护范围。
本发明诱导形成的多潜能干细胞分化成肝细胞的方法中，用活化素A诱导人iPS细胞向定形内胚层细胞高效分化，然后在成纤维细胞生长因子和骨形态形成蛋白的共同作用下进一步分化为表达白蛋白的早期肝细胞，在肝细胞生长因子和角化细胞生长因子的共同作用下可促进分化的早期肝细胞继续扩增，在OSM，Dex和N2，B27的共同作用下可促进分化的早期肝细胞进一步成熟。所获得的分化细胞具有比较典型的肝脏细胞的形态，并有约60％以上的细胞表达有早期肝细胞的标记蛋白CK8、Alb、CK18和AFP。同时，iPS细胞分化的肝细胞也表达成熟肝细胞标记分子AAT和CYP3A4，整个分化过程与肝脏的早期发育十分相似，而且通过本方法得到的肝细胞具有可诱导的CYP450酶的活性，能够响应药物的诱导。用本发明对诱导形成的多潜能干细胞(iPS细胞)分化成肝细胞的方法具有周期短、分化效率高、安全稳定的优点，分化获得的肝细胞可用于细胞移植治疗肝病、人工肝脏和药物的毒性测试等，此外整个分化过程也可用于人类早期胚胎肝脏发育的研究，应用前景广阔。
附图说明
图1为人胚胎干细胞和iPS细胞向肝细胞初始分化的免疫荧光和RT-PCR检测结果。
图2为对分化细胞进行成熟肝细胞标记分子AAT和CYP3A4的检测结果。
图3为分化细胞的糖原合成功能的检测结果。
a人肝脏细胞；b，c，d分别为分化21天的ES细胞H1，hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3；e为饲养层细胞；f，g，h分别为不添加细胞因子自发分化的ES细胞H1，hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3细胞。
图4为分化21天的细胞对合成尿素功能的检测结果
图5为分化细胞对分泌白蛋白功能的检测结果。
对照：人肝脏细胞；18：分化18天的细胞；21：分化21天的细胞。
图6为分化21天的细胞可诱导CYP450酶活的检测结果
对照：没有经药物处理的人肝脏细胞和分化的人ES细胞与iPS细胞；给药：200μg/ml苯巴比妥钠。
具体实施方式
本发明的诱导人IPS细胞或人ES细胞向肝脏细胞分化的方法，包括以下步骤：
1)向定形内胚层细胞的诱导：将在MEF饲养层上的人iPS细胞或人ES细胞，弃去培养基，用PBS洗2遍，加入分化培养基I-1，置于37℃细胞培养箱中培养24-48小时，优选24小时，弃去培养基，更换为分化培养基I-2，在相同条件下培养24-48小时，优选24小时，弃去培养基，更换为分化培养基I-3，在相同条件下培养24-48小时，优选24小时；
其中，分化培养基I-1：是在RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)中添加人活化素A(Activin A)得到的培养基。分化培养基I-1中，人活化素A的终浓度可为10-500ng/ml，如10、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/ml，优选为50-200ng/ml，尤其优选为100ng/ml。分化培养基I-1的pH可为7.2-7.6。
分化培养基I-2：是在RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)中添加人活化素A(Activin A)和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液(美国Invitrogen公司，51300-044)得到的培养基。分化培养基I-2中，人活化素A的终浓度可为10-500ng/ml，如10、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/ml，优选为50-200ng/ml，尤其优选为100ng/ml；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度可为0.01％-0.5％(体积百分含量)，如0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％，优选为0.05％-0.1％，尤其优选为0.1％(体积百分含量)。分化培养基I-2的pH 7.2-7.6。
分化培养基I-3：是在RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)中添加人活化素A(Activin A)和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液(美国Invitrogen公司，51300-044)得到的培养基。分化培养基I-3中，人活化素A的终浓度可为10-500ng/ml，如10、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/ml，优选为50-200ng/ml，尤其优选为100ng/ml；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度可为0.5％-20％(体积百分含量)，如0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、优选为1％-5％，尤其优选为1％(体积百分含量)。分化培养基I-3的pH 7.2-7.6。
2)肝细胞分化的起始：弃去培养基，用PBS洗1遍，加入分化培养基II，置于37℃细胞培养箱中培养3-6天，优选4天，每天换液1次，获得分化的人IPS细胞或人ES细胞；
其中，分化培养基II：是在肝细胞培养基(HCM)(购自Cambrex公司)中添加人成纤维细胞生长因子(FGF)和人骨形态形成蛋白(BMP)(美国Peprotech公司)得到的培养基。分化培养基II中，人成纤维细胞生长因子可为酸性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子2或成纤维细胞生长因子4，人成纤维细胞生长因子的终浓度可为5-100ng/ml，如5、10、15、20、30、35、40、50、70、80、100ng/ml，优选为20-40ng/ml，尤其优选为30ng/ml；人骨形态形成蛋白为人骨形态形成蛋白-2或人骨形态形成蛋白-4，人骨形态形成蛋白的终浓度可为5-100ng/ml，如5、10、15、20、30、35、40、50、70、80、100ng/ml，优选为10-30ng/ml，尤其优选为20ng/ml。分化培养基II的pH为7.2-7.6。
3)分化的人IPS细胞或人ES细胞的扩增：弃去培养基，用PBS洗1遍，加入分化培养基III，置于37℃细胞培养箱中培养5-天，优选6天，每天换液1次；
分化培养基III：是在肝细胞培养基(HCM)(购自Cambrex公司)中添加人肝细胞生长因子(HGF)和人角化细胞生长因子(KGF)得到的培养基。分化培养基III中，人肝细胞生长因子的终浓度可为5-100ng/ml，如5、10、15、20、30、35、40、50、70、80、100ng/ml，优选为10-30ng/ml，尤其优选为20ng/ml；人角化细胞生长因子的终浓度可为5-100ng/ml，如5、10、15、20、30、35、40、50、70、80、100ng/ml，优选为10-30ng/ml，尤其优选为20ng/ml。分化培养基III的pH为7.2-7.6。
4)促进分化的人IPS细胞或人ES细胞成熟：弃去培养基，用PBS洗1遍，加入分化培养基IV，置于37℃细胞培养箱中培养3-6天，优选5天，每天换液1次；弃去培养基，用PBS洗1遍，加入分化培养基V，置于37℃细胞培养箱中培养3-5天，优选3天，每天换液1次，获得人肝细胞。
分化培养基IV：是在肝细胞培养基(HCM)(购自Cambrex公司)中添加制瘤素M(OSM)(美国R&D公司)和地塞米松(Dex)得到的培养基。分化培养基IV中，制瘤素M的终浓度可为1-100ng/ml，如1、5、10、15、20、30、35、40、50、70、80、100ng/ml，优选为5-15ng/ml，尤其优选为10ng/ml；地塞米松的终浓度可为0.05-1μM，如0.05、0.08、0.1、0.15、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0μM，优选为0.08-0.15μM，尤其优选为0.1μM。分化培养基IV的pH 7.2-7.6。
分化培养基V：是在DMEM培养基中添加N2(美国Gibco公司，17502-048)，B27(美国Gibco公司，12587-010)，谷氨酰胺(美国Gibco公司，35050)，非必需氨基酸(美国Gibco公司，11140)，β-巯基乙醇，制瘤素M(OSM)和地塞米松(Dex)得到的培养基。分化培养基V中，N2的终浓度可为0.1％-10％(体积百分含量)，如0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、2.0％、3％、5％、8％、10％，优选为0.8％-2.0％，尤其优选为1％；B27的终浓度可为0.1％-20％(体积百分含量)，如0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、2.0％、3％、5％、8％、10％、15％、20％，优选为0.8％-3.0％，尤其优选为2％；谷氨酰胺的终浓度可为0.5-2mM，如0.5mM、0.8mM、1mM、1.5mM、2mM，优选为0.8-1.5mM，尤其优选为1mM；非必需氨基酸的终浓度可为0.1％-10％(体积百分含量)，如0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、2.0％、3％、5％、8％、10％，优选为0.8％-2.0％，尤其优选为1％；β-巯基乙醇的终浓度可为0.05-0.2mM，如0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2mM，优选为0.08-0.15mM，尤其优选为0.1mM；制瘤素M的终浓度可为1-100ng/ml，如1、5、10、15、20、30、35、40、50、70、80、100ng/ml，优选为5-15ng/ml，尤其优选为10ng/ml；地塞米松的终浓度可为0.05-1μM，如0.05、0.08、0.1、0.15、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0μM，优选为0.08-0.15μM，尤其优选为0.1μM。分化培养基V的pH 7.2-7.6。
下面结合实施例，详细阐明本发明的由人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞分化成肝细胞的方法。
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
实施实例、诱导人ES细胞或人iPS细胞向肝脏细胞分化和检测
一、人ES细胞或iPS细胞的常规培养
(1)试剂
PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，加ddH2O定容至1000mL，用HCl调节溶液pH值至7.4。
2Mβ-巯基乙醇(20000×)：取1mL 14.3M的β-巯基乙醇，加6.15mL PBS稀释，过滤除菌。
人iPS细胞培养基(HESM)：20％血清替代物(Knock-out SerumReplacement，KSR，美国Gibco公司，10828)，1mM谷氨酰胺(美国Gibco公司)，0.1mM β-巯基乙醇，1％非必需氨基酸(Non-essential AminoAcids，美国Gibco公司，11140)，10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，用DMEM/F12(美国Invitrogen公司)定容至1000mL。
0.5mg/mL Dispase：称取Dispase 10mg粉末，溶解于20mL DMEM/F12培养基中，过滤除菌。
1mg/mL胶原酶IV：称取胶原酶IV粉末20mg，溶解于20mL DMEM/F12培养基中，过滤除菌。
MEF培养基：含10％胎牛血清的DMEM(美国Gibco公司)。
丝裂霉素C工作液：将2mg丝裂霉素C溶于200mL含10％胎牛血清的DMEM中，使其终浓度为10ug/mL，过滤除菌。
0.1％明胶：称取0.1g明胶粉末，溶解于100mL双蒸水中，高压灭菌。
(2)饲养层(feeder)的获得
用下述方法对小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)进行处理，以作为培养人iPS细胞的饲养层：
1)取生长状态良好的贴壁MEF细胞，弃去MEF培养基，加入含10ug/mL丝裂霉素C的丝裂霉素C工作液；
2)在37℃下培养3个小时，培养期间用0.1％明胶处理将要接种MEF细胞的培养皿，室温放置2小时以上(或37℃放置30分钟以上)，用前吸掉明胶溶液即可；
3)取出MEF细胞，弃去含丝裂霉素C工作液，用PBS洗5遍，以便彻底洗掉残存的丝裂霉素(因为丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，可能对IPS细胞有毒性)；
4)加入胰酶-EDTA(美国Gibco公司)进行消化，然后用MEF培养基终止反应；
5)1000rpm离心5分钟，弃上清，用MEF培养基重悬细胞沉淀并计数；
6)按照1.6×105个细胞/3.5cm培养皿的密度将经上述步骤处理的MEF细胞接种至包被有0.1％明胶的培养皿中，置于37℃培养箱中培养12-24小时，得到用于培养人iPS细胞的饲养层。
(3)人ES细胞或iPS细胞的常规培养
在步骤1获得的MEF饲养层上用人iPS细胞培养基(HESM)对人ES细胞H1(NIH的编号为WA01)或人iPS细胞系hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3(赵扬，Two supporting factors greatly improve the efficiency of human iPSC generation.Cell Stem Cell，2008；3：475-479.)(北京大学)进行培养，具体培养方法包括以下步骤：
1)从4℃冰箱中取出培养所需试剂及培养基，室温预热15分钟左右；
2)取出细胞，吸去HESM，将细胞用PBS洗一遍；
3)加入0.5mg/mL Dispase(或1mg/mL胶原酶IV)进行消化(1mL/3.5cm培养皿)，置于37℃培养箱中孵育10-15分钟，然后取出细胞在相差显微镜下观察，若克隆边缘出现卷边，则可终止消化；否则放回培养箱，延长消化时间，随时取出观察，以防止因消化过度导致克隆脱落；
4)消化结束后，吸掉Dispase或胶原酶IV，用PBS和DMEM/F12培养基分别洗一遍后，加入适量DMEM/F12培养基(2mL/3.5cm培养皿)；
5)用无菌直头或弯头玻璃滴管轻柔地将所有细胞克隆从培养皿底部刮下，并转移至无菌的15mL锥形底离心管中，用滴管温和地吹吸若干次，使细胞克隆变成大小较为均一小的细胞团；
6)1000rpm离心3-4分钟，小心吸掉上清，用玻璃滴管吸新鲜的HESM培养基重悬沉淀；
7)取出步骤1获得的MEF饲养层，用PBS洗三遍，将细胞的小团块接种于MEF饲养层上，置于37℃细胞培养箱中培养12-24小时，细胞贴壁后可更换新鲜的HESM培养基。每天更换一次培养基，通常5-7天传代一次。若出现以下情况之一时则需及时进行传代：(1)MEF饲养层的放置时间达到两周；(2)细胞克隆过于致密或面积过大；(3)细胞出现明显的自发分化。
二、人ES细胞或iPS细胞向肝脏细胞的诱导分化
分化培养基I-1：是在RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)中添加人活化素A(Activin A)(美国Peprotech公司，120-14)得到的培养基。分化培养基I-1中，人活化素A的终浓度为100ng/ml。分化培养基I-1的pH 7.2-7.6。
分化培养基I-2：是在RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)中添加人活化素A(Activin A)(美国Peprotech公司，120-14)和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液(美国Invitrogen公司，51300-044)得到的培养基。分化培养基I-2中，人活化素A的终浓度为100ng/ml、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为0.1％(体积百分含量)。分化培养基I-2的pH 7.2-7.6。
分化培养基I-3：是在RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)中添加人活化素A(Activin A)(美国Peprotech公司，120-14)和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液(美国Invitrogen公司，51300-044)得到的培养基。分化培养基I-3中，人活化素A的终浓度为100ng/ml、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为1％(体积百分含量)。分化培养基I-3的pH 7.2-7.6。
分化培养基II：是在肝细胞培养基(HCM)(购自Cambrex公司，CC-3199和CC-4182)中添加人成纤维细胞生长因子-4(FGF4)(美国Peprotech公司，100-31)和人骨形态形成蛋白-2(BMP2)(美国Peprotech公司，120-02)得到的培养基。分化培养基II中，人成纤维细胞生长因子-4的终浓度为30ng/ml、人骨形态形成蛋白-2的终浓度为20ng/ml。分化培养基II的pH为7.2-7.6。
分化培养基III：是在肝细胞培养基(HCM)(购自Cambrex公司，CC-3199和CC-4182)中添加人肝细胞生长因子(HGF)(美国Peprotech公司，100-39)和人角化细胞生长因子(KGF)(美国Peprotech公司，100-19)得到的培养基。分化培养基III中，人肝细胞生长因子的终浓度为20ng/ml，人角化细胞生长因子的终浓度为20ng/ml。分化培养基III的pH为7.2-7.6。
分化培养基IV：是在肝细胞培养基(HCM)(购自Cambrex公司，CC-3199和CC-4182)中添加制瘤素M(OSM)(美国R&D公司，295-OM)和地塞米松(Dex)得到的培养基。分化培养基IV中，制瘤素M的终浓度为10ng/ml，地塞米松的终浓度为0.1μM。分化培养基IV的pH 7.2-7.6。
分化培养基V：是在DMEM培养基中添加N2(美国Gibco公司，17502-048)，B27(美国Gibco公司，12587-010)，谷氨酰胺(美国Gibco公司，35050)，非必需氨基酸(美国Gibco公司，11140)，β-巯基乙醇，制瘤素M(OSM)和地塞米松(Dex)得到的培养基。分化培养基V中，N2的终浓度为1％(体积百分含量)，B27的终浓度为2％(体积百分含量)，谷氨酰胺的终浓度为1mM，非必需氨基酸的终浓度为1％(体积百分含量)，β-巯基乙醇的终浓度为0.1mM，制瘤素M的终浓度为10ng/ml，地塞米松的终浓度为0.1μM。分化培养基V的pH 7.2-7.6。
诱导人IPS细胞或人ES细胞向肝脏细胞分化，包括以下步骤：
1)向定形内胚层细胞的诱导：取步骤一培养在MEF饲养层上的人iPS细胞系hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3或人ES细胞系H1，弃去培养基，用PBS洗2遍，加入分化培养基I-1，置于37℃细胞培养箱中培养1天(24小时)，弃去培养基，更换为分化培养基I-2，在相同条件下培养1天，弃去培养基，更换为分化培养基I-3，在相同条件下培养1天；
2)肝细胞分化的起始：弃去培养基，用PBS洗1遍，加入分化培养基II，置于37℃细胞培养箱中培养4天，每天换液1次，获得分化的人IPS细胞或人ES细胞；
3)分化的人IPS细胞或人ES细胞的扩增：弃去培养基，用PBS洗1遍，加入分化培养基III，置于37℃细胞培养箱中培养6天，每天换液1次；
4)促进分化的人IPS细胞或人ES细胞成熟：弃去培养基，用PBS洗1遍，加入分化培养基IV，置于37℃细胞培养箱中培养5天，每天换液1次；弃去培养基，用PBS洗1遍，加入分化培养基V，置于37℃细胞培养箱中培养3天，每天换液1次，获得人肝细胞。
三、IPS细胞或ES细胞向肝细胞初始分化的检测
(1)免疫荧光染色检测
PBST：含0.2％(体积百分比)Triton X100的PBS溶液。
封闭液：含2％山羊血清(或马血清)的PBST溶液。
二抗稀释液(0.1％BSA溶液)：称取0.1g牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，溶于100mL PBS中。
诱导分化7天的ES和iPS细胞表达早期肝脏细胞标记分子AFP、Alb和CK18。
用免疫荧光染色的方法对步骤二2)中获得的细胞的分化状态进行检测，检测方法包括以下步骤：
1)取出细胞，弃培养基，用PBS洗2遍；
2)加入4％多聚甲醛室温固定15分钟(或加入无水甲醇室温固定5-10分钟)；3)用PBS洗3遍，每遍5分钟；
4)用PBST溶液进行透化，室温10分钟；
4)用PBS洗1遍，5分钟；
6)加入封闭液，室温封闭30-60分钟；
7)弃封闭液，加入一抗(Polyclonal Rabbit Anti-Human Alb，购自DAKO公司)、鼠抗人α-Fetoprotein(AFP)单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)、鼠抗人细胞角蛋白18(CK18)单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)、兔抗人AAT单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)或兔抗人CYP3A4多克隆抗体(购自Serotec公司)，4℃放置12-24小时(或37℃孵育2小时)，上述抗体按1∶50的比例用封闭液进行稀释；
8)用PBS洗3遍，每遍5分钟；
9)加入二抗(FITC或TRITC标记羊抗小鼠IgG或TRITC标记羊抗兔IgG)(北京中杉金桥生物技术有限公司)(用前先将二抗按1∶50-150比例稀释于二抗稀释液中)，避光4℃放置12小时(或37℃避光放置1小时)；
10)用PBS洗3遍，每遍5分钟；
11)加入终浓度为1mg/mL的DAPI溶液(美国Roche公司)，室温放置5分钟；
12)用PBS洗3遍，每遍5分钟；
13)加入500ul PBS(或PBS∶甘油(1∶1))，在荧光显微镜下观察、拍照。
(2)RT-PCR检测
Trizol(美国invitrogen公司)处理分化7天的iPS细胞和ES细胞，提取样品总RNA，反转录获得cDNA(美国promega公司反转录试剂盒)，以该cDNA为模板进行PCR鉴定。引物序列如下：
AFP正义引物：TTTTGGGACCCGAACTTTCC(序列1)；
AFP反义引物：CTCCTGGTATCCTTTAGCAACTCT(序列2)。
Alb正义引物：GGTGTTGATTGCCTTTGCTC；
Alb反义引物：CCCTTCATCCCGAAGTTCAT。
CK8正义引物：GGAGGCATCACCGCAGTAC；
CK8反义引物：TCAGCCCTTCCAGGCGAGAC。
CK18正义引物：GGTCTGGCAGGAATGGGAGG；
CK18反义引物：GGCAATCTGGGCTTGTAGGC。
HNF4α正义引物：CCACGGGCAAACACTACGG；
HNF4α反义引物：GGCAGGCTGCTGTCCTCAT。
GAPDH正义引物：AATCCCATCACCATCTTCC；
GAPDH反义引物：CATCACGCCACAGTTTCC。
分化的iPS和ES细胞表达肝脏细胞的标记分子甲胎蛋白(AFP)，白蛋白(AlB，Alb)，细胞角蛋白18(CK18)，α1-抗胰蛋白酶(AAT)和细胞色素P4503A4(CYP3A4)，RT-PCR检测结果也表明，分化7天的iPS和ES细胞表达肝脏细胞的标记分子甲胎蛋白(AFP)，白蛋白(AlB，Alb)，CK8(细胞角蛋白8)，CK18(细胞角蛋白18)，CK19(细胞角蛋白19)，HNF4α(肝细胞核因子4α)(图1和2)。图1和图2中，3U1和3U2：诱导多潜能干细胞系hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3。
四、肝脏细胞糖原合成功能的检测
通过PAS染色对步骤二4)中获得的人肝细胞的糖原合成功能进行检测，实施步骤参见说明书(美国Sigma公司)。
分化的iPS和ES细胞具有与肝脏细胞类似的糖原合成和贮存的功能(图3)。
五、肝脏细胞尿素合成功能的检测
通过尿素氮检测试剂盒对步骤二4)中获得的人肝细胞的尿素合成功能进行检测，实施步骤参见说明书(美国STANBIO公司)。
分化的iPS和ES细胞具有与肝脏细胞类似的尿素合成的功能(图4)。图4中，3U1和3U2：诱导多潜能干细胞系hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3。
六、肝脏细胞白蛋白分泌功能的检测
通过ELISA试剂盒对步骤二4)中获得的人肝细胞进行白蛋白分泌功能的检测，实施步骤参见说明书(美国Bethyl公司)。
分化的iPS和ES细胞具有与肝脏细胞类似的分泌白蛋白的功能(图5)。
七、肝脏细胞CYP450酶活的检测
通过CYP450荧光检测试剂盒对步骤二4)中获得的人肝细胞进行CYP450酶活的检测，实施步骤参见说明书(美国Sigma公司)。
分化的iPS和ES细胞具有与肝脏细胞类似的响应药物诱导的P450酶的活性(图6)。图6中，3U1和3U2：诱导多潜能干细胞系hAFF-4U-M-iPS-1和hAFF-4U-M-iPS-3。
上述结果表明人iPS细胞和人ES细胞均诱导分化为肝脏细胞。
序列表
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ttttgggacc cgaactttcc 20
<210>2
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
ctcctggtat cctttagcaa ctct 24
Claims (10)
1.用于诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的培养基，它由分化培养基I-1、分化培养基I-2、分化培养基I-3、分化培养基II、分化培养基III、分化培养基IV和分化培养基V组成；
所述分化培养基I-1是在基础细胞培养基中添加人活化素A得到的培养基，分化培养基I-1中，人活化素A的终浓度为10-500ng/ml；
所述分化培养基I-2是在基础细胞培养基中添加人活化素A和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液得到的培养基，分化培养基I-2中，人活化素A的终浓度为10-500ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为0.01％-0.5％(体积百分含量)；
所述分化培养基I-3是在基础细胞培养基中添加人活化素A和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液得到的培养基，分化培养基I-3中，人活化素A的终浓度为10-500ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为0.5％-20％(体积百分含量)；
所述分化培养基II是在肝细胞培养基中添加人成纤维细胞生长因子和人骨形态形成蛋白得到的培养基，分化培养基II中，人成纤维细胞生长因子的终浓度为5-100ng/ml，人骨形态形成蛋白的终浓度为5-100ng/ml；
所述分化培养基III是在肝细胞培养基中添加人肝细胞生长因子和人角化细胞生长因子得到的培养基；分化培养基III中，人肝细胞生长因子的终浓度为5-100ng/ml；人角化细胞生长因子的终浓度为5-100ng/ml；
分化培养基IV是在肝细胞培养基中添加制瘤素M和地塞米松得到的培养基；其中，制瘤素M的终浓度为1-100ng/ml；地塞米松的终浓度为0.05-1μM；
分化培养基V是在基础细胞培养基中添加N2，B27，谷氨酰胺，非必需氨基酸，β-巯基乙醇，制瘤素M和地塞米松得到的培养基；分化培养基V中，N2的终浓度为0.1％-10％(体积百分含量)；B27的终浓度为0.1％-20％(体积百分含量)；谷氨酰胺的终浓度为0.5-2mM；非必需氨基酸的终浓度为0.1％-10％(体积百分含量)；β-巯基乙醇的终浓度为0.05-0.2mM；制瘤素M的终浓度为1-100ng/ml；地塞米松的终浓度为0.05-1μM。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述分化培养基I-1、分化培养基I-2和分化培养基I-3中，所述人活化素A的终浓度均为10、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500ng/ml；所述分化培养基I-2中，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％；所述分化培养基I-3中，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为0.5％、1％、5％、10％、15％、20％；
所述分化培养基II中，所述人成纤维细胞生长因子的终浓度为5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；所述人骨形态形成蛋白的终浓度为5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；
所述分化培养基III中，人肝细胞生长因子的终浓度为5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；所述人角化细胞生长因子的终浓度为5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；
所述分化培养基IV中，制瘤素M的终浓度为1、5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；地塞米松的终浓度为0.05、0.08、0.1、0.15、0.3、0.5、0.6、0.8或1.0μM；
所述分化培养基V中，N2的终浓度为0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、2.0％、3％、5％、8％或10％；B27的终浓度为0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、2.0％、3％、5％、8％、10％、15％或20％；谷氨酰胺的终浓度为0.5mM、0.8mM、1mM、1.5mM或2mM；非必需氨基酸的终浓度为0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、2.0％、3％、5％、8％或10％；β-巯基乙醇的终浓度为0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18或0.2mM；制瘤素M的终浓度为1、5、10、15、20、30、35、40、50、70、80或100ng/ml；地塞米松的终浓度为0.05、0.08、0.1、0.15、0.3、0.5、0.6、0.8或1.0μM。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述分化培养基I-1、分化培养基I-2和分化培养基I-3中，所述人活化素A的终浓度均为50-200ng/ml；所述分化培养基I-2中，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为0.05％-0.1％；所述分化培养基I-3中，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的终浓度为1％-5％；
所述分化培养基II中，所述人成纤维细胞生长因子的终浓度为20-40ng/ml；所述人成纤维细胞生长因子为酸性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子2或成纤维细胞生长因子4；所述人骨形态形成蛋白的终浓度为为10-30ng/ml；所述人骨形态形成蛋白为人骨形态形成蛋白-2或人骨形态形成蛋白-4；
所述分化培养基III中，人肝细胞生长因子的终浓度为10-30ng/ml；所述人角化细胞生长因子的终浓度为10-30ng/ml；
所述分化培养基IV中，制瘤素M的终浓度为5-15ng/ml；地塞米松的终浓度为0.08-0.15μM；
所述分化培养基V中，N2的终浓度为0.8％-2.0％；B27的终浓度为0.8％-3.0％；谷氨酰胺的终浓度为0.8-1.5mM；非必需氨基酸的终浓度为0.8％-2.0％；β-巯基乙醇的终浓度为0.08-0.15mM；制瘤素M的终浓度为5-15ng/ml；地塞米松的终浓度为0.08-0.15μM。
4.根据权利要求1、2或3所述的培养基，其特征在于：分化培养基I、分化培养基II、分化培养基III、分化培养基IV和分化培养基V的pH均为7.2-7.6。
5.根据权利要求1至4任意所述的培养基，其特征在于：所述基础细胞培养基为MEM、DMEM、BME、DMEM/F12、RPMI1640或Fischers。
6.由人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞分化成肝细胞的方法，其特征在于：所述方法采用权利要求1-5中任一所述的用于诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的培养基诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化，它包括以下步骤：
1)是将人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞在权利要求1-5中任一所述的分化培养基I-1中培养；
2)再转入权利要求1-5中任一所述的分化培养基I-2中培养；
3)再转入权利要求1-5中任一所述的分化培养基I-3中培养；
4)再转入权利要求1-5中任一所述的分化培养基II中培养；
5)再转入权利要求1-5中任一所述的分化培养基III中培养；
6)再转入权利要求1-5中任一所述的分化培养基IV中培养；
7)再转入权利要求1-5中任一所述的分化培养基V中培养，获得人肝细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述人胚胎干细胞或诱导形成的多潜能干细胞均为细胞系。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述人胚胎干细胞为下述任一种细胞系：BG01，BG02，BG03，BG04，SA01，SA02，SA03，ES01，ES02，ES03，ES04，ES05，ES06，TE03，TE32，TE33，TE04，TE06，TE62，TE07，TE72，UC01，UC06，WA01，WA07，WA09，WA13和WA14；所述编号为NIH的编号。
9.根据权利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的培养条件为37℃培养24-48小时，优选为24小时；
所述步骤2)的培养条件为37℃培养24-48小时，优选为24小时；
所述步骤3)的培养条件为37℃培养24-48小时，优选为24小时；
所述步骤4)的培养条件为37℃培养3-6天，优选为4天；
所述步骤5)的培养条件为37℃培养5-8天，优选为6天；
所述步骤6)的培养条件为37℃培养3-6天，优选为5天；
所述步骤7)的培养条件为37℃培养3-5天，优选为3天。
10.权利要求6至8中任一所述的方法获得的肝脏细胞。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200910089765 CN101962630B (zh) | 2009-07-23 | 2009-07-23 | 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法 |
| JP2012520888A JP2012533310A (ja) | 2009-07-23 | 2010-07-23 | 分化誘導による肝細胞、肝内胚葉細胞及び肝前駆細胞を得る方法 |
| PCT/CN2010/001118 WO2011009294A1 (zh) | 2009-07-23 | 2010-07-23 | 通过诱导分化获得肝脏细胞、肝脏内胚层细胞和肝脏前体细胞的方法 |
| EP10801854.0A EP2457998A4 (en) | 2009-07-23 | 2010-07-23 | METHODS FOR OBTAINING HEPATIC CELLS, HEPATIC ENDODERM CELLS, AND HEPATIC PRECURSOR CELLS BY INDUCING THE DIFFERENTIATION |
| US13/386,373 US20120190059A1 (en) | 2009-07-23 | 2010-07-23 | Methods for obtaining hepatocytes, hepatic endoderm cells and hepatic progenitor cells by induced differentiation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200910089765 CN101962630B (zh) | 2009-07-23 | 2009-07-23 | 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101962630A true CN101962630A (zh) | 2011-02-02 |
| CN101962630B CN101962630B (zh) | 2013-04-10 |
Family
ID=43515685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200910089765 Active CN101962630B (zh) | 2009-07-23 | 2009-07-23 | 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101962630B (zh) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103374546A (zh) * | 2012-04-12 | 2013-10-30 | 北京大学 | 肝实质细胞及其制备、鉴定与应用方法 |
| CN104911141A (zh) * | 2015-06-02 | 2015-09-16 | 深圳市第二人民医院 | 一种诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法 |
| CN105115951A (zh) * | 2015-08-10 | 2015-12-02 | 山东省科学院生物研究所 | 一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法 |
| CN105420193A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-03-23 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 分化培养基及其在制备神经干细胞中的用途 |
| CN105543175A (zh) * | 2016-01-06 | 2016-05-04 | 中山大学附属第一医院 | 一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法 |
| CN106244527A (zh) * | 2016-08-29 | 2016-12-21 | 广东依浦赛生物科技有限公司 | 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法 |
| CN107904207A (zh) * | 2017-11-13 | 2018-04-13 | 广东艾时代生物科技有限责任公司 | 一种利用三维培养系统诱导人诱导性多能干细胞获得成熟肝细胞的方法 |
| CN110373380A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-10-25 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用 |
| CN111235112A (zh) * | 2018-11-28 | 2020-06-05 | 中山大学 | 一种体外诱导iPS细胞向乳腺方向分化的方法及其专用培养基 |
| CN112553143A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-03-26 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种肝脏模型及其制备方法和用途 |
| CN113201480A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-08-03 | 弗元(上海)生物科技有限公司 | 干细胞分化诱导为肝细胞的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0380646B1 (en) * | 1988-08-04 | 1999-01-20 | Amrad Corporation Limited | Use of leukaemia inhibitory factor (lif) for the (in vitro) propagation of embryonic stem cells |
| CN100425694C (zh) * | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
| CN100465268C (zh) * | 2006-05-17 | 2009-03-04 | 北京大学 | 人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基 |
| CN1884494B (zh) * | 2006-06-16 | 2012-05-23 | 北京大学 | 诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法及其专用培养基 |
-
2009
- 2009-07-23 CN CN 200910089765 patent/CN101962630B/zh active Active
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103374546B (zh) * | 2012-04-12 | 2018-05-18 | 北京大学 | 肝实质细胞及其制备、鉴定与应用方法 |
| CN103374546A (zh) * | 2012-04-12 | 2013-10-30 | 北京大学 | 肝实质细胞及其制备、鉴定与应用方法 |
| CN104911141A (zh) * | 2015-06-02 | 2015-09-16 | 深圳市第二人民医院 | 一种诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法 |
| CN105115951A (zh) * | 2015-08-10 | 2015-12-02 | 山东省科学院生物研究所 | 一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法 |
| CN105420193A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-03-23 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 分化培养基及其在制备神经干细胞中的用途 |
| CN105420193B (zh) * | 2015-12-07 | 2019-04-09 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 分化培养基及其在制备神经干细胞中的用途 |
| CN105543175A (zh) * | 2016-01-06 | 2016-05-04 | 中山大学附属第一医院 | 一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法 |
| CN105543175B (zh) * | 2016-01-06 | 2020-07-03 | 中山大学附属第一医院 | 一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法 |
| CN106244527A (zh) * | 2016-08-29 | 2016-12-21 | 广东依浦赛生物科技有限公司 | 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法 |
| CN106244527B (zh) * | 2016-08-29 | 2019-10-08 | 广东依浦赛生物科技有限公司 | 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法 |
| CN107904207A (zh) * | 2017-11-13 | 2018-04-13 | 广东艾时代生物科技有限责任公司 | 一种利用三维培养系统诱导人诱导性多能干细胞获得成熟肝细胞的方法 |
| CN111235112A (zh) * | 2018-11-28 | 2020-06-05 | 中山大学 | 一种体外诱导iPS细胞向乳腺方向分化的方法及其专用培养基 |
| CN111235112B (zh) * | 2018-11-28 | 2022-12-27 | 中山大学 | 一种体外诱导iPS细胞向乳腺方向分化的方法及其专用培养基 |
| CN110373380A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-10-25 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用 |
| CN110373380B (zh) * | 2019-06-14 | 2022-01-28 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用 |
| CN112553143A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-03-26 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种肝脏模型及其制备方法和用途 |
| CN113201480A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-08-03 | 弗元(上海)生物科技有限公司 | 干细胞分化诱导为肝细胞的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101962630B (zh) | 2013-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101962630B (zh) | 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法 | |
| Sullivan et al. | Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells | |
| Takayama et al. | Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes | |
| EP2457998A9 (en) | Methods for obtaining hepatic cells, hepatic endoderm cells and hepatic precursor cells by inducing the differentiation | |
| CN101962629B (zh) | 肝脏前体细胞及其制备方法与应用 | |
| WO2016021734A1 (ja) | 膵前駆細胞の増殖方法 | |
| Tarle et al. | Development of a serum‐free system to expand dental‐derived stem cells: PDLSCs and SHEDs | |
| Cao et al. | Osteogenic differentiation within intact human embryoid bodies result in a marked increase in osteocalcin secretion after 12 days of in vitro culture, and formation of morphologically distinct nodule-like structures | |
| CN104364263B (zh) | 含有层粘连蛋白和钙粘蛋白的细胞培养基底 | |
| WO2015180636A1 (zh) | 人肝细胞长期维持和增殖传代培养的专用培养基和培养方法 | |
| CN100465268C (zh) | 人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基 | |
| WO2009116893A1 (ru) | Способ получения эндотелиальных клеток (варианты) | |
| KR20200015898A (ko) | 간 유사 장기 조성물 및 이를 제조 및 사용하는 방법 | |
| CN104603262A (zh) | 使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞 | |
| JP2016528908A (ja) | 小分子を用いるヒト多能性幹細胞からの内分泌始原細胞の作製 | |
| CN103374546A (zh) | 肝实质细胞及其制备、鉴定与应用方法 | |
| CN1884494B (zh) | 诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法及其专用培养基 | |
| KR20180038227A (ko) | 인간 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 간세포 | |
| CN106350521A (zh) | 一种als患者特异性运动神经元的制备方法 | |
| CN103834613A (zh) | 制备多能心血管前体细胞及维持其心血管分化能力的方法 | |
| CN101962628A (zh) | 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法 | |
| KR101025880B1 (ko) | 성체 줄기세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법 | |
| CN105189738A (zh) | 肝母细胞样细胞的培养方法及其培养物 | |
| Saito et al. | Promoted differentiation of cynomolgus monkey ES cells into hepatocyte-like cells by co-culture with mouse fetal liver-derived cells | |
| Wei et al. | Derivation of endothelial cells from porcine induced pluripotent stem cells by optimized single layer culture system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BEIJING WEITONGDA BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: BEIJING HUAYUAN BOCHUANG TECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20130906 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130906 Address after: 100871 Haidian District the Summer Palace Road,, No. 5, Peking University Patentee after: Peking University Patentee after: Beijing Weitongda Biotechnology Co., Ltd. Address before: 100871 Haidian District the Summer Palace Road,, No. 5, Peking University Patentee before: Peking University Patentee before: Beijing Huayuan Bochuang Technology Co., Ltd. |