CN113201480A - 干细胞分化诱导为肝细胞的方法 - Google Patents

干细胞分化诱导为肝细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113201480A
CN113201480A CN202110339043.2A CN202110339043A CN113201480A CN 113201480 A CN113201480 A CN 113201480A CN 202110339043 A CN202110339043 A CN 202110339043A CN 113201480 A CN113201480 A CN 113201480A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
cells
cell
culture solution
less
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110339043.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113201480B (zh
Inventor
董永聘
陈勇
冯荣
桑伟建
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuyuan Shanghai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Fuyuan Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuyuan Shanghai Biotechnology Co ltd filed Critical Fuyuan Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110339043.2A priority Critical patent/CN113201480B/zh
Publication of CN113201480A publication Critical patent/CN113201480A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113201480B publication Critical patent/CN113201480B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本申请公开了一种干细胞分化诱导为肝细胞的方法。本申请中，方法包括步骤：步骤(1)，在添加有Activin A和Wnt信号通路激动剂的第一培养基中培养干细胞，收集细胞；和步骤(2)，在添加有BMP2和FGF4的第二培养基中培养步骤(1)所得的细胞，收集细胞；和步骤(3)，在添加有HGF和KGF的第三培养基中培养步骤(2)所得的细胞，收集细胞；和步骤(4)，在添加有Vc、EGF和胰岛素的第四培养基中培养步骤(3)所得的细胞，收集细胞，获得所述肝细胞，本发明提供的干细胞分化诱导为肝细胞的方法，通过加入特定的细胞因子和小分子化合物的组合可成功实现诱导干细胞分化为肝细胞。

Description

干细胞分化诱导为肝细胞的方法
技术领域
本发明实施例涉及生物医药领域，特别涉及干细胞分化诱导为肝细胞的方法。
背景技术
获得肝细胞是构建人工肝、临床前药物代谢与肝毒性评估、肝再生医学种子细胞规模生产的技术的关键，然而人体来源的肝细胞受限于供体数量有限、体外扩增能力弱以及容易去分化丢失功能等缺陷难以满足对肝细胞日益扩大需求。
多能干细胞具备体外无限增殖及分化为人肝细胞的能力，现有技术中，多能干细胞分化诱导肝细胞的方法主要为单层贴璧生长法。然而单层贴壁状态下的干细胞缺乏细胞间立体广泛的联系，分化获得的肝细胞功能较弱，且分化限制于培养板面积难以收获大量细胞，不适于肝细胞的规模制备。因此，寻找一种可规模化的、稳定的、简便且低成本的干细胞分化诱导为肝细胞的方法成为解决人体来源肝细胞供应不足问题的关键。
发明内容
如本发明所用，术语“诱导性多能干细胞”指的是获得分化多能性的细胞，即通过对体细胞转入赋予分化多能性的几种转录因子基因而获得与胚胎干细胞同等分化多能性的细胞。
本发明实施方式的目的在于提供一种可规模化的、稳定的、简便且低成本的干细胞分化诱导为肝细胞的方法。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种干细胞分化诱导为肝细胞的方法，所述方法包括步骤：
步骤(1)，在添加有Activin A和Wnt信号通路激动剂的第一培养基中培养干细胞，收集细胞；和
步骤(2)，在添加有BMP2和FGF4的第二培养基中培养步骤(1)所得的细胞，收集细胞；和
步骤(3)，在添加有HGF和KGF的第三培养基中培养步骤(2)所得的细胞，收集细胞；和
步骤(4)，在添加有Vc、EGF和胰岛素的第四培养基中培养步骤(3)所得的细胞，收集细胞，获得所述肝细胞。
在一些优选的方案中，在所述第一培养基中，所述Activin A的含量不小于10ng/mL，更优选为不小于30ng/mL，进一步优选为80～120ng/mL，最优选为90～110ng/mL，例如100ng/mL；
在所述第一培养基中，所述Wnt信号通路激动剂的含量不小于0.1μM，更优选为不小于1μM，进一步优选为1～4μM，例如2μM；
在所述第二培养基中，所述BMP2的含量不小于1ng/mL，更优选为不小于5ng/mL，进一步优选为5～30ng/mL，最优选为10～20ng/mL，例如20ng/mL；
在所述第二培养基中，所述FGF4的含量不小于1ng/mL，更优选为不小于10ng/mL，进一步优选为10～40ng/mL，最优选为20～35ng/mL，例如30ng/mL；
在所述第三培养基中，所述HGF的含量不小于1ng/mL，更优选为不小于5ng/mL，进一步优选为5～30ng/mL，最优选为10～20ng/mL，例如20ng/mL；
在所述第三培养基中，所述KGF的含量不小于1ng/mL，更优选为不小于5ng/mL，进一步优选为5～30ng/mL，最优选为10～20ng/mL，例如20ng/mL；
在所述第四培养基中，所述Vc的含量不小于1ng/mL，更优选为不小于20ng/mL，进一步优选为30～80ng/mL，最优选为40～60ng/mL，例如50μg/mL；
在所述第四培养基中，所述EGF的含量不小于1ng/mL，更优选为不小于5ng/mL，进一步优选为5～30ng/mL，最优选为10～20ng/mL，例如20ng/mL；
在所述第四培养基中，所述胰岛素的含量不小于0.1μg/mL，更优选为不小于0.5μg/mL，进一步优选为0.5～3μg/mL，最优选为1～2μg/mL，例如1.0μg/mL。
在一些优选的方案中，所述干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞；所述胚胎干细胞为源自哺乳动物的胚胎干细胞，优选为源自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、牛、马、山羊、猴或人的胚胎干细胞，更优选为人的胚胎干细胞。本发明中，胚胎干细胞和诱导多能干细胞可采用本领域通常使用的方法培养和维持。
在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述干细胞为处于指数生长期的干细胞。
在一些优选的方案中，所述处于指数生长期的干细胞由干细胞原液经复苏、培养和传代获得，所述复苏、培养和传代均可使用本领域常用的方法，例如本发明实施例一和实施例二所述。
在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述干细胞的生长汇合度为80～95％，例如90％。
在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述Wnt信号通路激动剂优选为CHIR。
在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述收集细胞的步骤具体包括用Accutase消化液消化培养所得的细胞。
在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述的培养为非悬浮培养。
在一些优选的方案中，步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，所述的培养为悬浮培养。
在一些优选的方案中，所述悬浮培养在细胞培养反应器中进行，所述细胞培养反应器包括容器本体和控制装置，进行悬浮培养时，将待培养的细胞置于容器本体中，通过所述控制装置控制所述容器本体通过预设的方式运动。
在一些优选的方案中，所述预设的方式为旋转、回旋、摇摆、振荡或其组合。
具体地，所述旋转为绕所述细胞培养反应器的中心轴线进行圆周运动；
所述回旋为绕偏离所述细胞培养反应器中心的轴线进行偏心回转；
所述摇摆为沿垂直于所述细胞培养反应器中心轴线的平面上的任一方向往复平移；
所述振荡为沿平行于所述细胞培养反应器中心轴线的任一方向往复平移。
在一些更优选的方案中，所述预设的方式为绕偏离所述细胞培养反应器中心的轴线进行偏心回转；所述偏心回转直径优选小于所述细胞培养反应器的半径，更优选为10～50mm，所述偏心回转转速优选为100～400转/分钟。
在一些优选的方案中，所述容器本体内设有低黏附培养板。
在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述第一培养基为定型内胚层诱导培养基；
步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，所述第二培养基、第三培养基以及第四培养基均为Advanced DMEM/F12培养基或DMEM/F12培养基。
在一些优选的方案中，步骤(1)所述的培养的时间为48～80小时，优选为65～75小时，例如72小时；
步骤(2)所述的培养的时间为48～110小时，优选为90～100小时，例如96小时；
步骤(3)所述的培养的时间为48～160小时，优选为130～150小时，例如144小时；
步骤(4)所述的培养的时间为48～210小时，优选为180～200小时，例如192小时。
在一些优选的方案中，步骤(1)中，每隔20～24小时更换培养液一次，所述更换培养液优选为将全部的培养液更换为与原培养液组成相同的新鲜培养液；
步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，每隔20～24小时更换培养液一次，所述更换培养液优选为将40～60％培养液更换为与原培养液组成相同的新鲜培养液。
在一些优选的方案中，步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，采用所述细胞培养反应器进行连续换液。
在一些优选的方案中，步骤(1)具体包括：将生长汇合度为80～95％的干细胞置于含有100ng/mL Activin A和1～2μM CHIR99021的第一培养基中培养60～80小时，每隔20～24小时更换培养液一次，收集细胞。
在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述收集细胞的步骤具体包括将用Accutase消化液消化培养所得的细胞3～5分钟，离心去上清收集细胞。
在一些优选的方案中，步骤(2)具体包括：将步骤(1)所得的细胞用含有20ng/mLBMP2和30ng/mL FGF4的第二培养基中悬浮培养80～110小时，每隔20～24小时更换培养液一次，每次更换40～60％培养液为与原培养液组成相同的新鲜培养液，收集细胞。
在一些优选的方案中，步骤(3)具体包括：将步骤(2)所得的细胞用含有20ng/mLHGF和20ng/mL KGF的第三培养基悬浮培养120～160小时，每隔20～24小时更换培养液一次，每次更换40～60％培养液为与原培养液组成相同的新鲜培养液，收集细胞。
在一些优选的方案中，步骤(4)具体包括：将步骤(3)所得的细胞用含有50μg/mLVc、20ng/mL EGF和1.0μg/mL胰岛素的第四培养基悬浮培养170～210小时，每隔20～24小时更换培养液一次，每次更换40～60％培养液为与原培养液组成相同的新鲜培养液，收集细胞。
本发明所述的方法中，除特别说明外，培养温度和湿度均参照本领域常规培养干细胞的温度和湿度。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用的定型内胚层诱导培养基可以是任一种用于定型内胚层阶段诱导分化的培养基。
其他的试剂和原料均市售可得。
本发明实施方式相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明提供的干细胞分化诱导为肝细胞的方法，通过加入特定的细胞因子和小分子化合物的组合可成功实现诱导干细胞分化为肝细胞；
(2)本发明提供的干细胞分化诱导为肝细胞的方法，克服贴壁培养干细胞缺乏细胞间立体广泛的联系的缺陷，采用悬浮培养的方式诱导干细胞分化，为细胞间建立各项维度的联系提供条件；
(3)本发明提供的干细胞分化诱导为肝细胞的方法，采用悬浮培养的方式分化诱导干细胞，无需培养板，待培养的干细胞直接悬浮于培养液中，使得分化不被培养板面积限制，可实现简便、低成本和大规模的制备肝细胞；
(4)本发明提供的干细胞分化诱导为肝细胞的方法，利用特定细胞培养反应器控制培养体系保持稳定的悬浮状态，使干细胞分化诱导的培养环境更加稳定，有利于规模化制备肝细胞。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例三中细胞培养反应器的结构示意图；
图2是根据本发明实施例三中人胚胎干细胞分化为肝球状体示意图；
图3是根据本发明实施例六中qRT-PCR测试检验肝球状体分化中相关基因表达示意图；
图4A是根据本发明实施例六中明场下显微镜拍摄肝球状体结合低密度脂蛋白示意图(比例尺：100μm)；
图4B是根据本发明实施例六中肝球状体中低密度脂蛋白表达结果示意图(比例尺：100μm)；
图4C是根据本发明实施例六中肝球状体DAPI染核结果示意图(比例尺：100μm)；
图4D是根据本发明实施例六中肝球状体PAS糖原染色结果示意图(比例尺：100μm)；
图4E是根据本发明实施例六中肝球状体中白蛋白(ALB)免疫荧光检测结果示意图(比例尺：100μm)；
图4F是根据本发明实施例六中肝球状体DAPI染色结果示意图(比例尺：100μm)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
实施例一、人胚胎干细胞(hESCs)的复苏
预先将Matrigel(原液分装)从-80℃取出，置于冰上融化，随后用预冷的DMEM/F12培养基稀释100倍，取1mL加入六孔板一个孔，轻柔摇匀，铺满孔板底部。六孔板置于37℃培养箱(约30分钟)，备用。mTesR1人胚胎干细胞培养基提前从4℃冷藏柜取出，室温放置约10分钟，75％乙醇清洁后移入超净台待用。从液氮冻存盒中取出H9细胞，快速移入37℃水浴锅中融化，轻柔晃动，融化至冻存管还剩小块冰即取出，75％乙醇清洁后移入超净台。小心将细胞转入15mL离心管，取约5mL mTesR1培养基由慢至快的加入，1000转/分钟离心5分钟，小心弃上清，加入含10μM Rock inhibitor的mTesR1培养基重悬细胞，细胞接种于基质胶包被的培养板，置于37℃培养箱中培养。次日，DMEM/F12轻柔洗一次，更换新鲜无Rockinhibitor的mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养。
实施例二、人胚胎干细胞的培养、传代及冻存
每天更换新鲜mTesR1培养基前应观察细胞状态，若发现大量死细胞漂浮于培养基(刚复苏的细胞状态较差)，弃去培养基，预热DMEM/F12轻柔洗细胞一次，弃去DMEM/F12，加入新鲜mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养。细胞约3～5天生长至80％汇合度，状态良好的人胚胎干细胞克隆明显，边缘光滑。
细胞传代，根据实验需要提前用Matrigel包被培养板(1：5至1：10比例传代)，同前包被Matrigel，摇匀后置于37℃培养箱备用。细胞用DMEM/F12洗2次，六孔板每孔加入1mLAccutase消化液，置于37℃培养箱中消化3～5分钟。每隔2分钟倒置显微镜观察，待克隆边缘发亮即小心弃去消化液，加入2mL含10μM Rock inhibitor的mTesR1培养基轻柔吹打细胞数次，收集细胞于15mL离心管，1000转/分钟离心5分钟。弃上清，加入含10μM Rockinhibitor的mTesR1培养基重悬细胞，转入基质胶包被的培养板，置于37℃培养箱中继续培养。过夜后更换新鲜无Rock inhibitor的mTesR1培养基，每天换液。
选取生长速度快，克隆形态好的细胞进行冻存。预先配制细胞冻存液：含5～10％二甲基亚砜(DMSO)的血清替代品(KOSR)，置于4℃备用。按照前述细胞传代的方法收集细胞，用细胞冻存液轻柔重悬细胞，转入冻存管，做好标记，置于冻存盒，-80℃过夜后转入液氮中长期保存。
实施例三、人胚胎干细胞分化为肝球状体(liver spheroid)
本实施例所用定型内胚层诱导培养基购自弗元(上海)生物科技有限公司，货号RC200123。
(1)在添加有Activin A和CHIR99021的定型内胚层诱导培养基中培养干细胞。
取生长至约90％汇合的对数生长的人胚胎干细胞进行分化诱导。生长至约90％汇合的人胚胎干细胞用预热RPMI1640基础培养基轻柔洗2次，加入含100ng/mL Activin A和1～2μM CHIR99021的定型内胚层诱导培养基，每天换液，共3天。第4天，细胞用AdvancedDMEM/F12培养基轻柔洗2次，加入适量Accutase消化液消化培养所得细胞3～5分钟，收集细胞，1000转/分离心5分钟，弃上清，收集细胞。
(2)在添加有BMP2和FGF4的Advanced DMEM/F12培养基中培养步骤(1)所得的细胞。
将收集的细胞加入新鲜的含20ng/mL BMP2和30ng/mL FGF4的Advanced DMEM/F12培养基中，并将培养基置于如图1所示的细胞培养反应器中进行悬浮培养，控制细胞培养反应器按照偏心回转直径为22mm，转速为100～400转/分钟进行偏心回转，每天半量换液，持续4天。
(3)在添加有HGF和KGF的Advanced DMEM/F12培养基中培养步骤(2)所得的细胞。
第8天，轻柔收集细胞团(避免反复吹打)，1000转/分离心5分钟，弃去原培养基，收集细胞，在细胞培养反应器中加入新鲜的含20ng/mL HGF和20ng/mL KGF的Advanced DMEM/F12培养基进行悬浮培养，控制细胞培养反应器按照偏心回转直径为22mm，转速为100～400转/分钟进行偏心回转，每天半量换液，持续6天。
(4)在添加有Vc、EGF和胰岛素的Advanced DMEM/F12培养基中培养步骤(3)所得的细胞。
第14天，轻柔收集细胞团(避免反复吹打)，1000转/分离心5分钟，弃去原培养基，收集细胞，在细胞培养反应器中加入含50μg/mL Vc、20ng/mL EGF和1.0μg/mL胰岛素的Advanced DMEM/F12培养基进行悬浮培养，控制细胞培养反应器按照偏心回转直径为22mm，转速为100～400转/分钟进行偏心回转，每天半量换液，持续8天，收集细胞，即获得立体的肝球状体，显微镜拍摄人胚胎干细胞分化为肝球状体过程图见图2，根据图2可知，经过21天的诱导分化，成功形成了立体的肝球状体。
优选地，上述步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，可采用连续换液的方式替代每天换液或每天半量换液，以此更及时提供干细胞诱导分化所需养分，提高干细胞分化为肝细胞的成功率。具体地，采用下述细胞培养反应器100培养干细胞可实现连续换液。
上述悬浮培养在如图1所示的细胞培养反应器100中进行，所述细胞培养反应器100包括容器1、第一过滤层2、第二过滤层3和控制装置，控制装置用于控制所述容器1通过预设的方式运动。容器1具有培养腔10，容器1内部设有低粘度培养板6，容器1的底部开设有进口4，容器1上还开设有出口5。进口4和出口5均与培养腔10相通，且出口5位于进口4上方。第一过滤层2封闭进口4，第二过滤层3封闭出口5。
第一通道7贯穿低粘度培养板6和第一过滤层2，且第一通道7可操作地与培养腔10相通，并通向容器1的外部。第一通道7可外接封闭阀，通过第一通道7可让细胞从培养腔10中排出至容器1的外部。
第二通道8与进口4相连通的，且第二通道8通向容器1的外部。通过第二通道8向低粘度培养板6和第一过滤层2之间持续的输送液体。
容器1内具有贯穿容器1且至少部分插入培养腔10中的出液通道9，其中出液通道9位于培养腔10中的部分上开设有出口5，从而让出液通道9可部分位于液体中，便于液体通过出液通道9排出。
此外，容器1的顶部还设置有接口14，通过接口14可调节容器1内的压力。
由于第一过滤层2封闭进口4，液体通过第一过滤层2过滤，再进入到培养腔10中，培养腔10中的液体通过第二过滤层3过滤从出口5排出，从而在培养细胞中，第一过滤层2和第二过滤层3将细胞阻隔在培养腔10中的同时，可连续对培养腔10中进行供液和换液，让氧气和养料供应更充足、代谢废物和细胞碎片能有效排出，细胞产品更稳定。且进口4设置在底部，通过液流升力使细胞悬浮，又可避免剪切力对细胞的损伤，实现细胞的悬浮培养。
控制装置通过控制容器1的按照预设的方式运动，可稳定的维持容器1内培养体系的悬浮状态，所述预设的方式根据所培养的细胞的性质不同而改变。在本实施例中，所述预设的方式为回旋，所述回旋为绕偏离所述细胞培养反应器中心的轴线进行偏心回转，其中偏心回转直径为22mm，转速为100～400转/分钟，控制容器1按照这种预设方式运动，使干细胞在充分培养保持悬浮状态的同时，不因过分振荡破坏细胞培养条件致使分化停止或细胞破碎。
实施例四、RNA提取
预先配制75％乙醇，置于冰上备用。取适量TRIzol充分裂解细胞(根据细胞量的不同)，加入约1/5体积三氯甲烷(相对于TRIzol体积)，剧烈涡旋15～30s，室温静置约3～5分钟，12000转/分钟，4℃离心15-20分钟。小心吸取上层水相液转入新EP管，加入等体积异丙醇，轻柔颠倒数次，室温静置约5-10分钟，12000转/分钟4℃离心15～20分钟。小心弃去上清(注意底部的沉淀)，加入1mL冷的75％乙醇轻柔洗涤，12000转/分钟，4℃离心10～15分钟。弃去上清，加入20～50μL水(根据沉淀大小)，盖紧EP管盖，65℃水浴约15分钟，取1～2μL测定浓度，RNA置于-80℃保存备用。
实施例五、逆转录反应
参照逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with Gdna Eraser的说明书进行逆转录反应，共2步。
第一步去除基因组DNA，在冰上配制如表1所示的反应体系：
表1
组分 加入量
5×gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Eraser 1μL
Total RNA 1μg
RNase free dH2O up to 10μL
反应条件：42℃，2分钟；16℃，holder。
第二步为逆转录反应，冰上配置如表2所示的反应体系：
表2
组分 加入量
第一步反应液 10μL
Prime ScriptRt Enzyme MIX 1μL
RT Primer MIX 1μL
5×Prime Script Buffer2 4μL
RNase free dH2O 4μL
Total 20μL
反应条件：37℃，15分钟；85℃，5S；16℃，holder。
实施例六、qRT-PCR检验肝球状体分化成功
人胚胎干细胞源肝球状体分化过程中，检测定型内胚层(DE，D3)阶段，肝芽(Liverbud，D13)阶段及相对成熟阶段(Liver spheroid，D21)相关基因表达变化。根据
Figure BDA0002998571350000092
Premix EX TaqTM的说明书进行实验。
反应体系如表3：
表3
Figure BDA0002998571350000091
Figure BDA0002998571350000101
每个样品做三个复孔，于
Figure BDA0002998571350000102
96实时荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件如表4：
表4
步骤 温度/℃ 时间 循环
1 95 30s -
2 95 5s -
3 60 34s 40cycles
4 60 1分钟 -
5 95 15s -
同样实验重复三次。采用相对定量法进行比较相关基因的mRNA表达差异：设置对照，以GAPDH为内参，ΔΔCt＝[样本组相关基因平均Ct值-样本组GAPDH平均Ct值]-[对照组相关基因平均Ct值-对照组GAPDH平均Ct值]，然后以2-ΔΔCt计算样本组与对照组中相关基因的倍数关系。qRT-PCR测试肝球状体分化中相关基因表达结果见图3。
结果表明：定型内胚层标志基因SOX17在第三天(D3)达到峰值，随着分化进行而下调。肝系相关基因随着分化的进行上调，包括CK18、CK19、HNF4α、AFP、ALB、CYP3A4、AAT及GGT1等，其中肝细胞成熟标志物ALB于分化晚期上调显著，以上结果提示人胚胎干细胞源肝球状体分化成功。
实施例七、人胚胎干细胞源肝球状体功能及标志物蛋白的检测
取实施例三所得的肝球状体，加入荧光标记的低密度脂蛋白(LDL-488)，37℃孵育30分钟，明场下显微镜拍摄见图4A，轻柔洗涤3次后加入4％多聚甲醛(PFA)固定5分钟，轻柔洗涤3次用细胞核标记染料DAPI染核，随后荧光显微镜检测绿色荧光，见图4B，后荧光显微镜检测蓝色荧光，见图4C。根据图4A，图4B和图4C，可知低密度脂蛋白已经在本发明所述方法制备的肝球状体中表达，因此本发明所述方法获得的肝球状体具备转运低密度脂蛋白的功能。
取实施例三所得的肝球状体进行PAS糖原染色，显微镜拍摄PAS糖原染色结果见图4D，图4D结果显示本方法获得的肝球状体PAS糖原染色阳性，表明本发明所述方法获得的肝球状体具有储存糖原的功能。
取实施例三所得的肝球状体进行标志物白蛋白(ALB)免疫荧光检测，显微镜拍摄白蛋白免疫荧光检测结果见图4E，轻柔洗涤3次后加入4％多聚甲醛(PFA)固定5分钟，轻柔洗涤3次用细胞核标记染料DAPI染核，后荧光显微镜检测蓝色荧光，见图4F。
图4E中肝球状体标记物白蛋白检测结果显示肝球状体白蛋白阳性(红色荧光)，表明本发明所述方法获得的肝球状体可分泌白蛋白(ALB)。
图4F中DAPI染色结果进一步证明上述表明肝球状体标记物白蛋白检测结果显示肝球状体白蛋白阳性结果是可靠的。
综上所述，本发明所述方法获得的肝球状体具备肝细胞功能。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (11)

1.一种干细胞分化诱导为肝细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
步骤(1)，在添加有Activin A和Wnt信号通路激动剂的第一培养基中培养干细胞，收集细胞；和
步骤(2)，在添加有BMP2和FGF4的第二培养基中培养步骤(1)所得的细胞，收集细胞；和
步骤(3)，在添加有HGF和KGF的第三培养基中培养步骤(2)所得的细胞，收集细胞；和
步骤(4)，在添加有Vc、EGF和胰岛素的第四培养基中培养步骤(3)所得的细胞，收集细胞，获得所述肝细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述第一培养基中，所述Activin A的含量不小于10ng/mL；
和/或，所述Wnt信号通路激动剂的含量不小于0.1μM；
和/或，所述BMP2的含量不小于1ng/mL；
和/或，所述FGF4的含量不小于1ng/mL；
和/或，所述HGF的含量不小于1ng/mL；
和/或，所述KGF的含量不小于1ng/mL；
和/或，所述Vc的含量不小于1ng/mL；
和/或，所述EGF的含量不小于1ng/mL；
和/或，所述胰岛素的含量不小于0.1μg/mL。
3.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，所述Wnt信号通路激动剂为CHIR。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，所述的培养为悬浮培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述悬浮培养在细胞培养反应器中进行，所述细胞培养反应器包括容器本体和控制装置，进行悬浮培养时，将待培养的细胞置于容器本体中，通过所述控制装置控制所述容器本体通过预设的方式运动。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述预设的方式为旋转、回旋、摇摆、振荡或其组合；
其中，所述旋转为绕所述细胞培养反应器的中心轴线进行圆周运动；
所述回旋为绕偏离所述细胞培养反应器中心的轴线进行偏心回转；
所述摇摆为沿垂直于所述细胞培养反应器中心轴线的平面上的任一方向往复平移；
所述振荡为沿平行于所述细胞培养反应器中心轴线的任一方向往复平移。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述预设的方式为绕偏离所述细胞培养反应器中心的轴线进行偏心回转。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一培养基为定型内胚层诱导培养基；
和/或，步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，所述第二培养基、第三培养基以及第四培养基均为Advanced DMEM/F12培养基或DMEM/F12培养基。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的培养的时间为24～80小时；
和/或，步骤(2)所述的培养的时间为48～110小时；
和/或，步骤(3)所述的培养的时间为48～160小时；
和/或，步骤(4)所述的培养的时间为48～210小时。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，每隔20～24小时更换培养液一次，所述更换培养液为将全部的培养液更换为与原培养液组成相同的新鲜培养液，步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，每隔20～24小时更换培养液一次，所述更换培养液优选为将40～60％培养液更换为与原培养液组成相同的新鲜培养液；
或者，步骤(1)中，每隔20～24小时更换培养液一次，所述更换培养液为将全部的培养液更换为与原培养液组成相同的新鲜培养液，步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，采用所述细胞培养反应器进行连续换液。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
CN202110339043.2A 2021-03-30 2021-03-30 干细胞分化诱导为肝细胞的方法 Active CN113201480B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110339043.2A CN113201480B (zh) 2021-03-30 2021-03-30 干细胞分化诱导为肝细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110339043.2A CN113201480B (zh) 2021-03-30 2021-03-30 干细胞分化诱导为肝细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113201480A true CN113201480A (zh) 2021-08-03
CN113201480B CN113201480B (zh) 2023-03-24

Family

ID=77025876

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110339043.2A Active CN113201480B (zh) 2021-03-30 2021-03-30 干细胞分化诱导为肝细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113201480B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101624473A (zh) * 2009-08-11 2010-01-13 南方医科大学珠江医院 一种规模化培养肝细胞的方法
CN101684454A (zh) * 2008-09-25 2010-03-31 中国科学院上海生命科学研究院 一种定型内胚层细胞的制备和分离方法
WO2011009294A1 (zh) * 2009-07-23 2011-01-27 北京华源博创科技有限公司 通过诱导分化获得肝脏细胞、肝脏内胚层细胞和肝脏前体细胞的方法
CN101962630A (zh) * 2009-07-23 2011-02-02 北京大学 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法
CN102199538A (zh) * 2011-03-14 2011-09-28 胡威 一种免搅拌生物反应器
CN106190951A (zh) * 2016-07-18 2016-12-07 中国人民解放军总医院 脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684454A (zh) * 2008-09-25 2010-03-31 中国科学院上海生命科学研究院 一种定型内胚层细胞的制备和分离方法
WO2011009294A1 (zh) * 2009-07-23 2011-01-27 北京华源博创科技有限公司 通过诱导分化获得肝脏细胞、肝脏内胚层细胞和肝脏前体细胞的方法
CN101962630A (zh) * 2009-07-23 2011-02-02 北京大学 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法
CN101624473A (zh) * 2009-08-11 2010-01-13 南方医科大学珠江医院 一种规模化培养肝细胞的方法
CN102199538A (zh) * 2011-03-14 2011-09-28 胡威 一种免搅拌生物反应器
CN106190951A (zh) * 2016-07-18 2016-12-07 中国人民解放军总医院 脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DI WU等: "Production of Functional Hepatobiliary Organoids from Human Pluripotent Stem Cells", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF STEM CELLS》 *
ZHIHUA SONG等: "Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells", 《CELL RESEARCH》 *
丁一等: "诱导性多能干细胞与肝样细胞分化", 《中国生物化学与分子生物学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113201480B (zh) 2023-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104560871B (zh) 经血间充质干细胞的培养方法
CN102307991B (zh) 微载体上的多能干细胞培养
CA2595137C (en) Scalable process for cultivating undifferentiated stem cells in suspension
CN112266898B (zh) 结直肠癌类器官的培养方法和培养液
US9102915B2 (en) In vitro expansion of postpartum-derived cells using microcarriers
JP2022523129A (ja) 幹細胞の大規模調製のための三次元培養方法
CN112226409B (zh) 胚胎干细胞向cd34+造血祖细胞的分化方法
CN114457006B (zh) 一种通过不连续分化制备肾脏足细胞的方法
CN114561335B (zh) 一种外周血单个核细胞制备肝脏类器官的方法
Sander et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells
CN114317415A (zh) 人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法
CN114395523B (zh) 一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用
CN116396922A (zh) 具有隐窝-绒毛轴结构的人源肠类器官及其制备方法、应用
CN117004572A (zh) 病人来源的移植瘤类器官模型pdxo的构建方法与应用
CN113201480B (zh) 干细胞分化诱导为肝细胞的方法
CN109722411B (zh) 一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法
CN114672455B (zh) 一种利用多能干细胞诱导骨髓基质细胞的方法
CN104745529B (zh) 瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途及其应用
CN115505646B (zh) 巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记、其筛选方法及应用
CN115261301B (zh) 一种视网膜色素上皮细胞体外诱导及培养方法
CN101735975B (zh) 一种利用单层培养技术制备和分离定型内胚层细胞的方法
CN113736737A (zh) 一种原代胶质瘤相关成纤维细胞培养方法
Pavlova et al. A high-efficiency method for the production of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Dash et al. Generation and encapsulation of human iPSC-derived vascular smooth muscle cells for proangiogenic therapy
CN116987670A (zh) 一种应用于药物筛选的acvrl1基因突变血管类器官模型及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant