CN114317415A - 人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法 - Google Patents
人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114317415A CN114317415A CN202210215178.2A CN202210215178A CN114317415A CN 114317415 A CN114317415 A CN 114317415A CN 202210215178 A CN202210215178 A CN 202210215178A CN 114317415 A CN114317415 A CN 114317415A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- differentiation
- medium
- additive
- large intestine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 title claims abstract description 47
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title claims abstract description 41
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 88
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 63
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 32
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 27
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 claims description 21
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 claims description 19
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 claims description 19
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 18
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 13
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 11
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 10
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000019044 Type I Bone Morphogenetic Protein Receptors Human genes 0.000 claims description 7
- 108010051765 Type I Bone Morphogenetic Protein Receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 4
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 claims description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 16
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 7
- 102100031671 Homeobox protein CDX-2 Human genes 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 102100032883 DNA-binding protein SATB2 Human genes 0.000 description 4
- 101000655236 Homo sapiens DNA-binding protein SATB2 Proteins 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 101000972276 Homo sapiens Mucin-5B Proteins 0.000 description 3
- 102100022494 Mucin-5B Human genes 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 description 2
- 102100022650 Homeobox protein Hox-A7 Human genes 0.000 description 2
- 101001062347 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 3-beta Proteins 0.000 description 2
- 101001045116 Homo sapiens Homeobox protein Hox-A7 Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- CZPRKINNVBONSF-UHFFFAOYSA-M zinc;dioxido(oxo)phosphanium Chemical compound [Zn+2].[O-][P+]([O-])=O CZPRKINNVBONSF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FPNZBYLXNYPRLR-UHFFFAOYSA-N 2-(4-carbamimidoylphenyl)-1h-indole-6-carboximidamide;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FPNZBYLXNYPRLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024633 Carbonic anhydrase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710167917 Carbonic anhydrase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024644 Carbonic anhydrase 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710167916 Carbonic anhydrase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000010792 Chromogranin A Human genes 0.000 description 1
- 108010038447 Chromogranin A Proteins 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 1
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000886562 Homo sapiens Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101001133081 Homo sapiens Mucin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 1
- 101000641959 Homo sapiens Villin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101150013773 Hoxa7 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034263 Mucin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010030201 Mucin-5B Proteins 0.000 description 1
- 102000005879 Mucin-5B Human genes 0.000 description 1
- 101100310648 Mus musculus Sox17 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 1
- 102100033419 Villin-1 Human genes 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000008143 early embryonic development Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000057231 human FGF4 Human genes 0.000 description 1
- 102000054677 human MSTN Human genes 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004412 neuroendocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L paraquat dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000270 postfertilization Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种人多能干细胞于体外定向分化为多谱系大肠类器官的方法，采用特定的培养基，依次实现定形内胚层的分化、2D（二维）细胞层的后肠管衍生物的分化、以及机械破碎后，大量多谱系大肠类器官的分化。相比于现有方法，本发明可提高诱导分化效率约15倍，极显著地降低成本、提高产能。诱导过程均采用成分明确的添加物（无血清），体系稳定、可重复性好；适合发育学、再生医学、病理学、药代动力学等领域的大范围研究与应用。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法。
背景技术
随近10年发育学与干细胞生物学的快速发展，人多能干细胞（Human pluripotentstem cells，hPSC）经体外向类器官定向分化的技术取得了一系列突破：hPSC来源的脑、肝、肺、肠等类器官系统分别被成功建立。这些类器官通过在体外精准模拟器官胚胎发育阶段的关键信号的刺激而诱导分化形成，往往具备多种细胞类型与复杂的3D结构，在体外呈现了许多关键的器官特异性的生理功能。与传统2D细胞模型相比，在生理相关性上的巨大优势使其在病理解析、药物筛选、毒性评价、发育研究等方面凸显重要价值，其逐渐成为新一代体外研究与应用模型。然而，与传统模型相比，现阶段的hPSC类器官模型系统面临着技术难度大、分化效率低下、诱导成本高昂等问题；极大限制了其广泛应用的潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法，以解决上述问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案实现方式如下：
一种人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法，该方法包括如下步骤：
S1、待hPSC汇合度达30-40%，诱导hPSC分化定形内胚层；
S2、诱导定形内胚层分化为后肠管衍生物，且得到的后肠管衍生物为高表达CDX2的2D细胞层；
S3、将得到的后肠管衍生物机械破碎后，诱导后肠管衍生物分化为多谱系大肠类器官。
进一步，S1中诱导培养基包括培养基A和培养基B，培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhGDF8、GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的RPMI-1640；
培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhGDF8，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的RPMI-1640。
进一步，培养基A中添加组分的含量为100ng/ml的rhGDF8、4μM的CHIR99021，CHIR99021为GSK-3抑制剂；培养基B中添加组分的含量为100 ng/ml的rhGDF8，且在培养基A和培养基B中均分化1天。
进一步，S2中诱导培养基包括培养基C和培养基D，培养基C包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhFGF4、WNT激活剂，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的Ad-F12；
培养基D包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：BMP激活剂、rhEGF、 GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的Ad-F12。
进一步，培养基C中添加组分的含量为500ng/ml的rhFGF4、250ng/ml的rhWnt3a，rhWnt3a为WNT激活剂；培养基D中添加组分的含量为200 nM的SJ000291942、100ng/ml的rhEGF、3μM的CHIR99021，CHIR99021为GSK-3抑制剂，SJ000291942为BMP激活剂，且在培养基C和培养基D中均分化3天。
进一步，S3中诱导培养基包括培养基E，培养基E包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhEGF、 BMP I型受体抑制剂、 GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的Ad-F12。
进一步，培养基E中添加组分的含量为100ng/ml的rhEGF、500nM的LDN193189、3μM的CHIR99021，LDN193189为BMP I型受体抑制剂，CHIR99021为GSK-3抑制剂，且在培养基E中分化30天。
进一步，机械破碎包括一级机械破碎与二级机械破碎；
一级破碎方法为：使用移液器吸头横纵向刮碎衍生物，并将其转移至无菌EP管中，形成悬液；
二级破碎方法为：使用注射器缓慢吹吸悬液3次，期间镜检，使其破碎为50-100μm的细胞团块；此后，使用Cultrex-Type2基质胶进行3D包被。
本发明还提供了一种用于人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的试剂盒，包括培养基A、培养基B、培养基C、培养基D和培养基E；
培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhGDF8、 GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的RPMI-1640；
培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhGDF8，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的RPMI-1640；
培养基C包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhFGF4、WNT激活剂，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的Ad-F12；
培养基D包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：BMP激活剂、rhEGF、 GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的Ad-F12；
培养基E包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhEGF、BMP I型受体抑制剂、GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的Ad-F12。
本发明还提供了一种如上述所述的试剂盒在诱导人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化上的应用。
相对于现有技术，本发明所述的人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法具有以下优势：
在本发明方法提供了一种不依赖血清的多谱系大肠类器官体外定向分化方法，无血清诱导分化体系，成分明确可控，受批次间差异影响小，被病原微生物污染的风险低；另外，本方法可提高诱导分化效率约15倍，可极显著地地降低成本、提高产能，继而推进多谱系大肠类器官在生物医学领域的大范围研究与应用。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为hPSC的多能性鉴定结果；a为hPSC明场图；b、c、d为免疫荧光鉴定结果；
图2为Day1分化前起始汇合度明场图；a为JOM方法，b为本发明方法；
图3为S1阶段定形内胚层明场图；a为JOM方法，b为本发明方法；c为JOM方法S1阶段分化结果局部放大图，d为本发明方法S1阶段分化结果局部放大图；
图4为使用Q-PCR比较JOM方法和本发明方法在定形内胚层阶段的标志物表达水平；生物学重复n=4，*，p＜0.05；**，p＜0.01；DE，definitive endoderm，定型内胚层；
图5为JOM方法和本发明方法分化至S2阶段后的明场图与免疫荧光图；生物学重复n=5；**，p＜0.01；a为JOM方法分化至S2阶段后的明场图，b为JOM方法分化至S2后的免疫荧光图，c为本发明方法分化至S2阶段后的明场图，d为本发明方法分化至S2阶段后的免疫荧光图；
图6为JOM方法和本发明方法分化至S2阶段的流式细胞术检测结果；
图7为JOM方法和本发明方法进入S3阶段前3D包被图；a为JOM方法，b为本发明方法；
图8为JOM方法和本发明方法产生后肠衍生物的数量比较（均来自于24孔板的单孔）；生物学重复n=4；
图9为JOM方法和本发明方法分化至S3（Day38）产生的类器官数量比；生物学重复n=4；
图10为本发明方法产生的Day38大肠特异性标志物表达水平的检测结果；生物学重复n=5；**，p＜0.01；a为标志物SATB2的检测结果，b为标志物CA2的检测结果，c为标志物CA4的检测结果，d为标志物LY6A的检测结果，e为标志物MUC5B的检测结果，f为标志物HOXA7的检测结果；
图11为本发明方法产生的Day38多谱系大肠类器官激光共聚焦鉴定结果。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
定形内胚层：指胚胎发育早期肝脏、小肠、大肠等内脏器官主要组成细胞的原始发育位点。
后肠管衍生物（或肠管前部衍生物）：肠管（gut tube）指胚胎发育早期由定形内胚层发育而来的条形组织。体内研究表明，其前端与后端由不同的祖细胞构成，分别可发育为不同的脏器；其中，结肠发育自肠管靠近后端的祖细胞群，发育学上称为后肠管或肠管后部。
多谱系大肠（结肠）类器官：指具备生理相关细胞类型的大肠（结肠）类器官。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例中用到的相关试剂示于表1和表2，引物序列示于表3，使用的相关抗体示于表4。
分化前，从细胞形态学与多能性标志物阳性率检验hPSC的高质量，以确认后续分化的成功率与高效率。待hPSC汇合度达30-40%，可启动分化。
如图1所示，a为hPSC明场图，b-d为免疫荧光鉴定结果，图1中a图中可以看出这些细胞形态圆润、连接紧实，整体呈克隆状，具备典型多能干细胞形态学特征；图1免疫荧光结果中，b图是将OCT4与SSEA4染色结果堆叠，以判断双阳性率；c图DAPI染色结果，用以表征细胞核；d图是OCT4+SSEA4+DAPI的染色堆叠，用以判断正确表达模式下的双阳性率（由于OCT4与SSEA4均定位于细胞核；因此双阳性的判断除二者的堆叠，还要看是否在细胞核上，即三者堆叠）。通过图1可以表明hPSC具备良好的分化潜能。
从图1可知，SSEA4与OCT4双阳性率≥95%；表明大部分具备向三胚层分化的潜能。
具体分化方法包括如下步骤：
S1：诱导hPSC分化定形内胚层（Day 1-2）
待hPSC汇合度达30%，如图2中的b图，依次加入2种分化培养基中进行诱导分化：
Day 1:将人多能干细胞在培养基A中培养1天，培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：100ng/ml的rhGDF8、4μM的CHIR99021，基础培养基为含有体积占比2%的SM1的RPMI-1640；
Day2:之后将上述细胞转移至培养基B中继续培养1天，培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：100 ng/ml的rhGDF8，基础培养基为含有体积占比2% 的SM1的RPMI-1640。
S2：诱导定形内胚层分化为后肠管衍生物（Day 3-8）
Day3-5：将S1分化成功的细胞继续在培养基C中培养3天，培养基C包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：500ng/ml的rhFGF4、250ng/ml的rhWnt3a，基础培养基为含有体积占比2% 的SM1的Ad-F12；
Day6-8：之后导入培养基D中继续培养3天，培养基D包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：200nM的SJ000291942、100ng/ml的rhEGF、3μM的CHIR99021，基础培养基为含有体积占比2% 的SM1的Ad-F12；
在培养期间，每24h更换新的分化培养基。
培养结束后，对获得的衍生物进行一级与二级机械破碎。
一级破碎方法为：使用1ml移液器吸头横纵向刮碎衍生物；并将其转移至5ml无菌EP管中，形成悬液；
二级破碎方法为：使用27G注射器缓慢吹吸悬液3次，期间镜检，使其破碎为50-100μm的细胞团块；此后，使用Cultrex（Type2）基质胶进行3D包被，并加入S3分化培养基。
S3：诱导后肠管衍生物为多谱系大肠类器官（Day 9-38）
Day 9-38：将破碎后的衍生物放入培养基E中继续培养30天，培养基E包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：100ng/ml的rhEGF、500nM的LDN193189、3μM的CHIR99021，基础培养基为含有体积占比2% 的SM1的Ad-F12；
在此期间，每72h更换新的分化培养基，每10-12天可进行传代；截至Day38，衍生完成谱系特化，形成多谱系大肠（结肠）类器官。
对比例：
与经典方案JO Múnera等人研发的方法（Múnera J O, Sundaram N, Rankin S A,et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoidsvia transient activation of BMP signaling[J]. Cell stem cell, 2017, 21(1):51-64. e6；Daoud A, Munera J O. Generation of human colonic organoids fromhuman pluripotent stem cells[J]. Methods in Cell Biology, 2020, 159: 201-227）作为对比例进行比较，可提高分化效率约500%，以下简称JO Múnera等人的方法为JOM方法。
具体方案为：
待hPSC汇合度达90%，如图2中的a图，加入分化培养基中进行诱导分化：
S1：分化内胚层（Day 1-3）
在含有100ng rhAct A的1640培养基中诱导分化3天；期间分别添加体积占比0%FBS、0.2%FBS、2%FBS。
S2：（Day 4-8）
培养基为：500ng/ml rhFGF4 + 3μM CHIR99021 in 2%（体积占比）FBS/1640
Day 8收集上层3D球状结构，以Matrigel进行3D包被后，使用S3阶段培养基继续诱导分化；
S3：（Day 8-38）
Day 8-11：
培养基为：100ng/ml EGF+100ng/ml BMP2 in 2%（体积占比）B27/1%（体积占比）N2/Ad-F12
Day 12-38：
培养基为：100ng/ml EGF in 2%（体积占比）B27/1%（体积占比）N2/Ad-F12。
结果分析：
1、分化阶段S1后，即JOM方法的Day3与本发明的Day2，如图3的a图和c图所示，JOM方法形成的细胞呈现较强异质性，残留大量未分化的细胞，其仍保留着hPSC的典型形态（箭头）。相比之下，如图3的b图和d图所示，本发明方法形成的细胞整体匀质，其具备扁平的鹅卵石或花瓣状形态表型，符合人胚胎发育过程中定型内胚层的典型特点（Yiangou L, RossADB, Goh KJ, et al. Human pluripotent stem cell-derived endoderm for modelingdevelopment and clinical applications[J]. Cell Stem Cell, 2018, 22(4): 485-499.）。
同样以Day0 hPSC的表达水平为基准，图4 Q-PCR检测结果表明：本发明方法产生的细胞，其定形内胚层标志物FOXA2与SOX17表达水平显著更高。
2、分化阶段S2后，JOM方法产生的衍生物包括2D细胞层与3D球状结构，如图5所示；与之相比，本发明方法仅产生2D细胞层。
胚胎发育过程中，内胚层在E9.5天（受精后第9.5天）形成肠管结构，其前段部分以SOX2highCDX2low为特异性分子表征；随后分别发育为肺、肝、胆、胰等器官；而其中后段部分以CDX2highCDXlow为特异性分子表征；可发育为小肠、大肠等器官。由此，我们通过CDX2这一关键表征分子，用以判断此分化阶段的衍生物是否具备向大肠分化的潜力。
图5免疫荧光结果表明，如同该研究组先前的报导（Spence J R , Mayhew C N ,Rankin S A , et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cellsinto intestinal tissue in vitro[J]. Nature, 2011, 470(7332):105-109；McCrackenK W , Howell J C , Wells J M , et al. Generating human intestinal tissue frompluripotent stem cells in vitro[J]. Nature Protocols, 2011, 6(12):1920-1928），JOM方法中，上层的3D球状结构为CDX2全阳性，故适合继续向大肠分化；而对于下层的2D细胞，其CDX2阳性率较低，远不及本方法。图6全样本水平的流式细胞术分析则进一步确认了该结果，JOM方法中2D细胞CDX2阳性率60.5%±8.0%，而本发明方法得到的2D细胞CDX2阳性率93.8%±9.4%。不同于JOM方法仅取上层球状结构继续分化，本方法基于CDX2的整体高阳性率，将衍生物全部机械破碎，成为细胞团；如图7，整体3D包被后，全部向大肠类器官分化，此时本发明方法与JOM方法的数量比为18:1（1672±377与92±38）（图8）。
3、至分化阶段S3结束（Day38），本方法与JOM方法形成的大肠类器官数量比约为15:1（6369±665与413±62）（图9）。
本方法产生的Day38类器官表达多种大肠特异性标志物，如图10所示，包括SATB2（特殊富含AT序列结合蛋白2，大肠上皮细胞特异性标志物）、CA2（碳酸酐酶2，大肠上皮细胞特异性标志物）、CA4（碳酸酐酶4，大肠上皮细胞特异性标志物）、LY6A（淋巴细胞抗原6A，大肠上皮干细胞细胞特异性标志物）、MUC5B（黏蛋白5B，结肠特有杯状细胞标志物）、HOXA7（同源盒基因A7，大肠上皮细胞特异性标志物）等。
Day38类器官结构致密，呈现多重弯曲的上皮样结构（图11-a）；免疫染色后，使用激光共聚焦成像的结果表明：类器官维持了CDX2（中后肠管及其衍生物标志物）的表达，高表达SATB2+大肠上皮关键标志物（图11-c），具备VIL1+纤毛结构（图11-d），且包含MUC2+杯状细胞（图11-e）以及CHGA+神经内分泌细胞（图11-f）。这些结果表明：该类器官具备多种大肠生理相关的细胞类型，证实了多谱系大肠类器官的形成。
综上，在实现多谱系大肠类器官体外诱导分化的前提下，本方法提高了诱导分化效率约15倍，极显著地降低了成本、提高了产能；此外，本发明方法采用了无血清诱导分化体系，成分明确可控，受批次间差异影响小；因此体系稳定，可重复性好。尤其适合大范围的研究与应用。
表1 试剂列表
| 试剂耗材名称 | 公司（货号） |
| mTeSR Plus | STEMCELL (100-0276) |
| Y-27632 | TOCRIS (TB1254) |
| RPMI 1640 | Sigma (R8758) |
| Ad-F12 | Gibco (12634010) |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D (3533-010-02) |
| rhGDF8 | R&D (788-G8) |
| rhWnt3a | R&D (5036-WN) |
| rhFGF4 | R&D (235-F4) |
| rhEGF | R&D (236-GMP) |
| CHIR99021 | TOCRIS (TB4423) |
| LDN193189 | TOCRIS (TB6053) |
| SJ000291942 | Sigma (SJ000291942) |
| SM1 | STEMCELL (05711) |
| DAPI | MCE (HY-D0814) |
| Trizol | Invitrogen (15596018) |
| Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR | AG (AG11705) |
| SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit (Rox Plus) | AG (AG11718) |
| Normal Donkey Serum | Jacksonlab (017-000-121) |
| hPSC | Wisconsin Cell Research Institute (ES01) |
表2 试剂对应名称
| Y-27632 | ROCK抑制剂 |
| Ad-F12 | 改良型DMEM/F12基础培养基 |
| rhGDF8 | 重组人肌肉抑制素8 |
| rhFGF4 | 重组人成纤维细胞生长因子4 |
| rhEGF | 重组人上皮生长因子 |
| SM1 | SM1型神经营养添加剂 |
| CHIR99021 | GSK-3抑制剂 |
| SJ000291942 | BMP激活剂 |
| LDN193189 | BMP I型受体抑制剂 |
表3 引物列表
| 基因 | 引物（5’→3’） | |
| <i>GAPDH</i> | Forward: ACATCGCTCAGACACCATG | Seq ID No:1 |
| <i></i> | Reverse: TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG | Seq ID No:2 |
| <i>FOXA2</i> | Forward: ACTCGCTCTCCTTCAACGAC | Seq ID No:3 |
| <i></i> | Reverse: CCCGAGTTGAGCCTGTGAGG | Seq ID No:4 |
| <i>SOX17</i> | Forward: TTCGTGTGCAAGCCTGAGAT | Seq ID No:5 |
| <i></i> | Reverse: TAATATACCGCGGAGCTGGC | Seq ID No:6 |
| <i>SATB2</i> | Forward: GCCTCCCCCAGTGAAGGT | Seq ID No:7 |
| <i></i> | Reverse: CTCGGCGTGTTCTTCTCTGT | Seq ID No:8 |
| <i>CA2</i> | Forward: AGGAAGTCGGTGAAGAACGG | Seq ID No:9 |
| Reverse: AAGTCGATAGGGGGCTGTCT | Seq ID No:10 | |
| <i>CA4</i> | Forward: CATCGGCCAGTGCAGAGTC | Seq ID No:11 |
| <i></i> | Reverse: TTGTCCACCTTTGCCTTGGT | Seq ID No:12 |
| <i>MUC5B</i> | Forward: GGCTGTTTCAGCACACACTG | Seq ID No:13 |
| <i></i> | Reverse: TGCCTTCAAAGCTGTAGCGA | Seq ID No:14 |
| <i>LY6A</i> | Forward: CAGCCTGAGCAAGACCTGTT | Seq ID No:15 |
| <i></i> | Reverse: CATCGGCCGCACTGAAATTG | Seq ID No:16 |
| <i>HOXA7</i> | Forward: TGAGGCCAATTTCCGCATCT | Seq ID No:17 |
| Reverse: TCGGACCTTCGTCCTTATGC | Seq ID No:18 |
表4 抗体列表
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天九再生医学（天津）科技有限公司
<120> 人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法
<130> 2022.1.17
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
acatcgctca gacaccatg 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtagttgag gtcaatgaag gg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
actcgctctc cttcaacgac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 4
cccgagttga gcctgtgagg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcgtgtgca agcctgagat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 6
taatataccg cggagctggc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 7
gcctccccca gtgaaggt 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcggcgtgt tcttctctgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 9
aggaagtcgg tgaagaacgg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 10
aagtcgatag ggggctgtct 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 11
catcggccag tgcagagtc 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgtccacct ttgccttggt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 13
ggctgtttca gcacacactg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 14
tgccttcaaa gctgtagcga 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 15
cagcctgagc aagacctgtt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 16
catcggccgc actgaaattg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 17
tgaggccaat ttccgcatct 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 18
tcggaccttc gtccttatgc 20
Claims (10)
1.一种人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S1、待hPSC汇合度达30-40%，诱导hPSC分化定形内胚层；
S2、诱导定形内胚层分化为后肠管衍生物，且得到的后肠管衍生物为高表达CDX2的2D细胞层；
S3、将得到的后肠管衍生物机械破碎后，诱导后肠管衍生物分化为多谱系大肠类器官。
2.根据权利要求1所述的人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法，其特征在于：S1中诱导培养基包括培养基A和培养基B，培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhGDF8、GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2% 的SM 1型神经营养添加剂的RPMI-1640；
培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhGDF8，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的RPMI-1640。
3.根据权利要求2所述的人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法，其特征在于：培养基A中添加组分的含量为100ng/ml的rhGDF8、4μM的CHIR99021，CHIR99021为GSK-3抑制剂；培养基B中添加组分的含量为100 ng/ml的rhGDF8，且在培养基A和培养基B中均分化1天。
4.根据权利要求1所述的人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法，其特征在于：S2中诱导培养基包括培养基C和培养基D，培养基C包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhFGF4、WNT激活剂，基础培养基为含有体积占比2% 的SM1型神经营养添加剂的Ad-F12；
培养基D包括基础培养基及添加组分，添加组分包括： BMP激活剂、rhEGF、 GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2%的 SM1型神经营养添加剂的Ad-F12。
5.根据权利要求4所述的人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法，其特征在于：培养基C中添加组分的含量为500ng/ml的rhFGF4、250ng/ml的rhWnt3a，rhWnt3a为WNT激活剂；培养基D中添加组分的含量为200 nM的SJ000291942、100ng/ml的rhEGF、3μM的CHIR99021，CHIR99021为GSK-3抑制剂，SJ000291942为BMP激活剂，且在培养基C和培养基D中均分化3天。
6.根据权利要求1所述的人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法，其特征在于：S3中诱导培养基包括培养基E，培养基E包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhEGF、BMP I型受体抑制剂、GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2% 的SM1型神经营养添加剂的Ad-F12。
7.根据权利要求6所述的人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法，其特征在于：培养基E中添加组分的含量为100ng/ml的rhEGF、500nM的LDN193189、3μM的CHIR99021，LDN193189为BMP I型受体抑制剂，CHIR99021为GSK-3抑制剂，且在培养基E中分化30天。
8.根据权利要求1所述的人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法，其特征在于：机械破碎包括一级机械破碎与二级机械破碎；
一级破碎方法为：使用移液器吸头横纵向刮碎衍生物，并将其转移至无菌EP管中，形成悬液；
二级破碎方法为：使用注射器缓慢吹吸悬液3次，期间镜检，使其破碎为50-100μm的细胞团块；此后，使用Cultrex-Type2基质胶进行3D包被。
9.一种用于人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的试剂盒，其特征在于：包括培养基A、培养基B、培养基C、培养基D和培养基E；
培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhGDF8、GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2% 的SM1型神经营养添加剂的RPMI-1640；
培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhGDF8，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的RPMI-1640；
培养基C包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhFGF4、WNT激活剂，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的Ad-F12；
培养基D包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：BMP激活剂、rhEGF、GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2%的SM1型神经营养添加剂的Ad-F12；
培养基E包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：rhEGF、BMP I型受体抑制剂、GSK-3抑制剂，基础培养基为含有体积占比2%的 SM1型神经营养添加剂的Ad-F12。
10.一种如权利要求9所述的试剂盒在诱导人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化上的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210215178.2A CN114317415B (zh) | 2022-03-07 | 2022-03-07 | 人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210215178.2A CN114317415B (zh) | 2022-03-07 | 2022-03-07 | 人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114317415A true CN114317415A (zh) | 2022-04-12 |
| CN114317415B CN114317415B (zh) | 2022-06-03 |
Family
ID=81029876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210215178.2A Active CN114317415B (zh) | 2022-03-07 | 2022-03-07 | 人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114317415B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110691845A (zh) * | 2017-05-09 | 2020-01-14 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 由多能干细胞制作肠道类器官的方法 |
| WO2020054659A1 (ja) * | 2018-09-10 | 2020-03-19 | 国立大学法人東京工業大学 | 多能性幹細胞から腸細胞の作製方法 |
| WO2021030373A1 (en) * | 2019-08-13 | 2021-02-18 | Children's Hospital Medical Center | Improved methods for making organoid compositions |
| CN113388572A (zh) * | 2021-08-17 | 2021-09-14 | 天九再生医学(天津)科技有限公司 | 高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法 |
-
2022
- 2022-03-07 CN CN202210215178.2A patent/CN114317415B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110691845A (zh) * | 2017-05-09 | 2020-01-14 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 由多能干细胞制作肠道类器官的方法 |
| WO2020054659A1 (ja) * | 2018-09-10 | 2020-03-19 | 国立大学法人東京工業大学 | 多能性幹細胞から腸細胞の作製方法 |
| WO2021030373A1 (en) * | 2019-08-13 | 2021-02-18 | Children's Hospital Medical Center | Improved methods for making organoid compositions |
| CN113388572A (zh) * | 2021-08-17 | 2021-09-14 | 天九再生医学(天津)科技有限公司 | 高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ABDELKADER DAOUD等: "Generation of human colonic organoids from human pluripotent stem cells", 《METHODS CELL BIOL》 * |
| 李向阳等: "诱导型多能干细胞在体外三维环境中诱导分化出肠道类器官", 《中国组织工程研究》 * |
| 董毅等: "人类胚胎干细胞分化与功能研究进展", 《生物学杂志》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114317415B (zh) | 2022-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2002302089B2 (en) | Somatic Pluripotent Cells | |
| US10081792B2 (en) | Derivation of human microglia from pluripotent stem cells | |
| Xia et al. | Identification of a cell-of-origin for fibroblasts comprising the fibrotic reticulum in idiopathic pulmonary fibrosis | |
| KR102368751B1 (ko) | 모양체 주연부 간세포의 제조 방법 | |
| KR102221230B1 (ko) | 인간 줄기세포 유래 폐포 대식세포를 포함하는 3차원 폐 오가노이드의 제조방법 | |
| CN107254432B (zh) | 一种同时分离尿源性干细胞两种亚群的培养基、分离方法及应用 | |
| Schwach et al. | Generation and purification of human stem cell-derived cardiomyocytes | |
| US20210348120A1 (en) | Polarised Three-Dimensional Cellular Aggregates | |
| Zhang et al. | The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation | |
| US20210348121A1 (en) | Human Polarised Three-Dimensional Cellular Aggregates | |
| US20240166994A1 (en) | Oligodendrocyte progenitor cell compositions | |
| Dewi et al. | A simplified method for producing human lens epithelial cells and light-focusing micro-lenses from pluripotent stem cells | |
| Cui et al. | Establishment of Trophoblast‐Like Tissue Model from Human Pluripotent Stem Cells in Three‐Dimensional Culture System | |
| CN115011553A (zh) | 一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法及用途 | |
| Hirata et al. | Coexpression of platelet-derived growth factor receptor alpha and fetal liver kinase 1 enhances cardiogenic potential in embryonic stem cell differentiation in vitro | |
| CN101684454A (zh) | 一种定型内胚层细胞的制备和分离方法 | |
| CN113583947B (zh) | 间充质干细胞和造血干细胞体外培养方法和系统 | |
| CN114317415B (zh) | 人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法 | |
| JP6786077B2 (ja) | 胚様体の評価方法 | |
| TW202113062A (zh) | 腎間質細胞的製造方法 | |
| KR101760239B1 (ko) | 세포배양 삽입체를 이용한 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포의 분리방법 | |
| KR101916902B1 (ko) | Cd71 표면 표지인자를 마커로 하여 인간 배아줄기세포로부터 응수축성 심근세포를 제조하는 방법 | |
| CN116376808A (zh) | 呼吸道类器官的体外诱导及其应用 | |
| WO2023216104A1 (zh) | 子宫内膜修复相关制剂、子宫内膜细胞及制备方法和应用 | |
| WO2022188395A1 (zh) | 一种多能干细胞的培养方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220623 Address after: 300457 906, building 22, Green Valley Health Industrial Park, No. 59, Kangtai Avenue, Binhai Science Park, Binhai New Area, Tianjin Patentee after: Tianjin exosome Technology Co.,Ltd. Address before: 300450 building 20, Green Valley Health Industrial Park, No. 59, Kangtai Avenue, Binhai Science Park, Binhai high tech Zone, Binhai New Area, Tianjin Patentee before: Tianjiu regenerative medicine (Tianjin) Technology Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240314 Address after: Room 915-30, 9th Floor, Zhongxin Ecological Building, No. 2 Keying Road, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province, 215000 Patentee after: Qijia Technology (Suzhou) Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 300457 906, building 22, Green Valley Health Industrial Park, No. 59, Kangtai Avenue, Binhai Science Park, Binhai New Area, Tianjin Patentee before: Tianjin exosome Technology Co.,Ltd. Country or region before: China |