KR101916902B1 - Cd71 표면 표지인자를 마커로 하여 인간 배아줄기세포로부터 응수축성 심근세포를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전분화능 줄기세포로부터 심근세포로 분화를 유도한 후, CD71 표면 표지인자를 마커로 하여 응수축성 심근세포만을 분리하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 상기 응수축성 심근세포를 효소 처리 방법이 아닌 물리적 분리 방법을 통해 단일 세포 단위로 분리하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 따르면, 줄기세포로부터 심근세포를 분화한 후 CD71 양성 세포만을 선별하여 응수축 심근세포를 분리할 수 있으므로, 이를 심독성 약물 평가 대상의 세포 또는 심부전 세포 치료제 등에 사용할 수 있어 유용하다.

Description

CD71 표면 표지인자를 마커로 하여 인간 배아줄기세포로부터 응수축성 심근세포를 제조하는 방법{The method of production for beating cardiomyocyte from human embryonic stem cell using CD71 cell surface marker}

본 발명은 인간 배아줄기세포로부터 심근세포로 분화를 유도한 후, CD71 표면 표지인자를 마커로 하여 응수축성 심근세포만을 분리하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 상기 응수축성 심근세포를 물리적 분리 방법을 통해 단일 세포 단위 RNA 시퀀스 분석을 통하여 분석된 표면 표지인자를 이용하여 분리하는 것을 특징으로 한다.

인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell, hESCs) 유래의 심근세포(cardiomyocyte, CM)는 심혈관계 심장 질환의 재생학적 치료에 사용될 수 있어, 효과적으로 심근세포를 분화 유도하는 방법 및 분화된 심근세포를 효율적으로 분리 및 수득하는 방법이 개발되고 있다. 성숙한 심근세포는 심혈관 심장질한의 치료제로서 사용될 수 있으나, 이미 분화되어 성숙한 심근세포의 증식은 제한적이기 때문에, 이를 세포 치료제로 사용하거나 치료제 개발을 위한 연구에 사용하기 위해서는 충분한 양의 심근세포를 수득하는 것 또한 중요한 변수가 될 수 있다.

그러나, 줄기세포에서 심근세포로 분화 유도 및 획득하는 과정에서 낮은 수율로 인해 실제적인 적용에 제한이 될 수 있다. 먼저 줄기세포로부터 응수축성이 있는 배아체(human embryoid bodies, hEBs)를 형성한 다음, 이로부터 마이크로 절개하여 심근세포를 분리할 수 있다. 일반적으로 hEB를 형성하는 것는 배아 줄기세포로부터 응수축성을 가지는 심근세포로 분화되도록 유도하는 과정의 중간 단계가 될 수 있는데, 이러한 방법을 통해서 심근세포를 제조하는 것에는 몇 가지 단점이 존재한다: 먼저, hEB는 3 차원 배양에서 3 배엽의 특이한 분할패턴을 나타내지 않으며, 분화된 세포들이 다른 계열의 세포와 혼재하여 있어 이를 분리 정제하는 것이 용이하지 않아, 심근세포만을 분리하는 것이 쉽지 않다.

이에, 많은 연구들은 기계학적인 분리, 퍼콜 밀도 기울기 침전 및 KDR, CD15와 CD16를 이용하는 방법 등을 개발하여, 높은 효율 및 간편한 방법을 통해 많은 양의 심근세포를 분리하고자 노력하였다. 그러나, 이러한 방법으로는 여전히 심근세포를 순수하게 분리하는 것에 제한점을 가지기 때문에 따라서 실제 임상에 적용하기 어렵다. 또한, 기존의 배양 방법을 통해 심근세포를 배양한 이후 이를 특이적으로 선별할 수 있는 마커에 대한 연구가 아직 부족하여, 심근세포 분리에 적용하는 것이 어려운 실정이기 때문에, 재조합 렌티 바이러스 벡터 시스템을 사용하는 방법 등이 개발되었다. 그러나, 이를 임상 단계에 적용하였을 때 바이러스 DNA가 체내 DNA와 통합될 수 있어 제한적으로 사용될 수 밖에 없다. 또한, 마이크로 절개에 의해 응수축성 hEB로부터 심근세포를 분리하는 방법이 사용될 수 있으나, 심근세포는 외배엽 세포가 아닌 내배엽 세포와 함께 존재하는 특성으로 인해, 내배엽 계열의 다른 세포와 심근세포가 혼재할 수 있다.

이 외에도 종래 기술에서, 심근세포의 효율적인 분화 및 정제를 위해, 심근세포의 증식 및/또는 분화에 영향을 미치는 성장인자 또는 배양 지지세포를 제공하는 기술이 사용되고 있으며, 예를 들어, 배양 지지세포로서 내배엽주 세포인 END-2 세포주를 이용하는 END-2 동시 배양 시스템 등 다양한 분화 방법이 개발되었다. 그러나, 이러한 종래 방법의 경우, 성장인자를 사용하는 것에서 경제적으로 불리하다는 점, 및 END-2 세포를 사용하여 동시 배양한 세포로부터 심근세포만을 다시 분리해야한다는 점 등의 단점이 존재한다. 따라서, 세포-기반의 치료를 위해 심근세포를 사용하기 위해, 높은 효율 및 산출량을 제공하기 위한 생산 및 분리 방법이 요구된다.

이에, 인간 배아줄기세포 유래의 심근세포를 정제하는 방법으로서, 무혈청 배지에서 배아체 또는 심근세포를 배양하여, 배양액의 조성을 이용한 기술이 공지된 바 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1). 상기 공지된 연구에 따르면, 정제된 심근세포는 다시 응수축(beating) 심근세포 및 비-응수축(non-beating) 심근세포로 나눌 수 있는 것으로 확인되었다. 응수축 심근세포의 경우, 약물의 반응에 따른 응수축 능력 수준의 변화를 분석할 수 있기 때문에, 신약후보 물질의 심독성 약물 평가와 같이 심근세포를 이용한 연구 과정에서 응수축 심근세포 만을 분리하여 사용하는 것이 바람직하며, 이를 통해 응수축 심근세포를 이용한 심부전 세포 치료제로서도 적용할 수 있기 때문에, 분화된 심근세포 중 응수축 심근세포 및 비-응수축 심근세포를 구분하여 분리하는 과정 또한 중요하게 작용할 수 있다. 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 심근세포의 표면 표지인자를 발굴하고자 하는 연구가 진행됨에 따라, 지금까지 밝혀진 세포 표면 표지인자(cell surface marker)를 밝혀 심근세포에서 특이적으로 발현되는 마커를 탐색한 바 있으며, 이 중 대표적인 것이 myeloid cell CD177a로서, CD42의 수용체로서 기능하는 표지 인자를 심근세포 표면 표지인자인 “SIRPA”로 제시된 바 있다(비특허문헌 2). 그러나, SIRPA는 심근세포의 마커로 사용될 뿐, 응수축과 비응수축의 구분은 가능하지 않아, 이를 구분하기 위한 마커의 개발이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 줄기세포로부터 심근세포로 분화를 유도한 후 응수축 심근세포만을 특이적으로 분리하기 위한 특이적인 마커를 발굴하고자 노력한 결과, 응수축 심근세포에서 특이적으로 발현되는 표면 표지인자로서 CD71을 선별하였고, 심근세포 중 CD71 양성 세포만을 물리적인 방법으로 분리하였을 때 효과적으로 단일 세포 단위의 응수축 심근세포만을 분리할 수 있음을 확인하여, 본 발명의 방법은 줄기세포로부터 응수축 심근세포 만을 선별하기에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

KR 10-1364965 B1 (2014.02.18).

Park, Soon-Jung, et al. "Modification of a purification and expansion method for human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes." Cardiology 124.3 (2013): 139-150. Dubois, Nicole C., et al. "SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells." Nature biotechnology 29.11 (2011): 1011-1018.

상술한 바와 같이, 심독성 약물 평가 또는 심부전 세포치료제와 같이 심근세포를 임상 또는 연구에 사용하기 위한 수요가 지속적으로 있음에도 불구하고, 줄기세포로부터 분화된 심근세포를 효과적으로 정제 및 수득하는 것에는 한계가 있으며, 특히 응수축 심근세포만을 분리하기 위한 표면 마커에 대하여 공지된 바 없어, 한계를 가질 수 있다.

이에, 본 발명의 목적은 인간 배아줄기세포로부터 분화된 응수축성 심근세포를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는, 줄기세포로부터 응수축성 심근세포를 제조하는 방법을 제공한다:

i) 전분화능 줄기세포로부터 심근세포(cardiomyocyte)로의 분화를 유도하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 분화 유도된 심근세포에서, CD71 표면 표지인자의 발현을 확인하는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 CD71 양성 세포를 세포 수준으로 분리하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 i)의 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs) 중 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 ii)에서 CD71 표면 표지인자의 발현을 확인한 결과, CD71 음성 세포는 미분화된 줄기세포 또는 배아체이거나, 비-응수축 심근세포인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 iii)의 분리는, 응수축성 심근세포를 마이크로글래스 파이펫(microglass pipett)을 사용하여 물리적으로 분리하는 것 또는 항체를 이용한 응수축성 심근세포를 분리하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 응수축성 심근세포의 용도를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 응수축성 심근세포를 유효성분으로 포함하는, 심혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계 i) 및 ii)를 포함하는, 심혈관계 질환 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다:

i) 본 발명의 방법으로 제조된 응수축성 심근세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및

ii) 상기 단계 i)의 처리된 응수축성 심근세포의 세포 사멸을 확인하는 단계.

또한, 본 발명은 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는, 심독성 물질 선별 방법을 제공한다:

i) 제 1항의 방법으로 제조된 응수축성 심근세포에 독성 물질을 처리하는 단계; 및

ii) 상기 단계 i)의 처리된 응수축성 심근세포의 세포 사멸을 확인하는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 결과, 독성 물질 미처리의 응수축 심근세포 대조군에 비해 세포 사멸을 나타내는 독성 물질을 선별하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 심혈관질환은 심부전증, 심근경색증, 협심증 및 허혈성 심장질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명은 인간 배아줄기세포로부터 심근세포를 분석하는 방법에 있어서, 마이크로글래스 파이펫을 이용해 물리적으로 응수축 심근세포를 분리 후 단일세포 단위의 RNA 시퀀스 분석을 통하여 표면 표지인자 발현을 분석하였다.

본 발명의 방법에 따르면, 인간 배아줄기세포로부터 심근세포를 분화한 후 CD71 표면 표지인자를 마커로서 사용하여 CD71 양성 세포만을 선별하여 응수축 심근세포를 구분 및 분리할 수 있는 방법을 제공함으로써, 이를 심독성 약물 평가 대상의 세포 또는 심부전 세포 치료제 등에 사용할 수 있어 유용하다.

도 1은 본 발명에서 사용한 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포의 분화 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 인간 전분화능 줄기세포 유래의 심근세포 중 응수축 심근세포와 비-응수축 심근세포를 글래스파이펫을 이용한 물리적 방법으로 분리하는 과정을 나타낸다.
도 3은 응수축 심근세포 특이적인 마커를 선별하기 위한 과정을 나타낸다:
도 3a는 미분화, 응수축 심근세포 및 비응수축 심근세포의 유전체 분석을 하기 위한 과정을 나타내며;
도 3b는 미분화, 응수축 심근세포 및 비응수축 심근세포에 대한 유전체 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 응수축 심근세포와 비-응수축 심근세포 간의 특성을 분석한 결과이다:
도 4a는 심근세포 발생과 관련된 유전자 군에서 응수축 심근세포와 비-응수축 심근세포 간의 유전자 발현 수준을 비교한 결과이며,
도 4b는 심실근 세포 발생과 관련된 유전자 군에서 응수축 심근세포와 비-응수축 심근세포 간의 유전자 발현 수준을 비교한 결과이고, 및
도 4c는 심방근 세포 발생과 관련된 유전자 군에서 응수축 심근세포와 비-응수축 심근세포 간의 유전자 발현 수준을 비교한 결과이다.
도 5는 응수축 심근세포에 특이적인 표면 표지인자로서, TFRC(CD71)을 선별하였음을 나타내는 결과이다.
도 6은 응수축 심근세포의 표면 표지인자로서 CD71을 사용한 결과를 나타낸다:
도 6a는 분화된 심근세포에서 CD71 염색을 통해 응수축 심근세포만을 특이적으로 표지할 수 있음을 확인한 결과이며;
도 6b 및 도 6c는 CD71 표지 세포 및 대조군인 SIRPA 표지 세포를 유세포분석한 결과를 보여준다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는, 줄기세포로부터 응수축성 심근세포를 제조하는 방법을 제공한다:

i) 전분화능 줄기세포로부터 심근세포(cardiomyocyte)로의 분화를 유도하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 분화 유도된 심근세포에서, CD71 표면 표지인자의 발현을 확인하는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 CD71 양성 세포를 세포 수준으로 분리하는 단계.

본 발명의 “방법”에 있어서, 상기 단계 i)의 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs), 배아생식세포(embryonic germ cells) 또는 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 중 어느 하나인 것일 수 있으며, 구체적으로 배아줄기세포를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 전분화능 줄기세포는 인간 또는 포유류 유래의 것을 제한없이 사용할 수 있으나, 본 발명의 방법에 따라 제조된 응수축 심근세포를 약독성 실험 또는 세포 치료제로서 사용하고자 하는 관점에서, 인간 유래의 전분화능 줄기세포를 사용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 “방법”에 있어서, 상기 단계 i)의 전분화능 줄기세포로부터 심근세포로의 분화를 유도하기 위한 방법은, 종래 기술에 따라 심근세포 분화 유도에 채택할 수 있는 방법이라면 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 심근세포로의 분화를 유도하기 위해, 대한민국 등록특허 제 10-1364965호(특허문헌 1)에 개시된 방법과 같이, 무혈청 배지를 사용하여 줄기세포로부터 심근세포로 분화를 유도하는 것이 바람직하다. 상기 무혈청 배지를 사용하는 방법은, 구체적으로 하기 단계 (a) 및 (b)를 포함할 수 있다:

(a) 줄기세포를 배양하여 응수축성 배아체를 수득하는 단계; 및

(b) 상기 응수축성 배아체에 포함된 심근세포를 정제하기 위하여, 배아체를 무혈청 배지에서 배양하는 단계.

본 발명의 “방법”에 있어서, CD71은 응수축 심근세포에서 특이적으로 발현되는 표면 표지인자로 사용될 수 있다. 따라서, CD71 마커로 심근세포를 염색하였을 때, CD71을 발현하지 않는 세포, 즉 CD71 음성 세포는 미분화된 줄기세포 또는 배아체이거나, 비-응수축 심근세포일 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 줄기세포로부터 심근세포로의 분화가 유도되지 않은 경우; 및/또는 줄기세포로부터 심근세포로 분화되었으나 응수축의 특징을 나타내지 않는 비-응수축 심근세포로 분화된 경우는 간편하게 배재할 수 있다.

본 발명의 “방법”에 있어서, 상기 단계 iii)의 분리는, 응수축성 심근세포를 마이크로글래스 파이펫(microglass pipett)을 사용하여 물리적으로 분리하는 것이 바람직하다. 종래 기술에 따르면 상기 분리를 위해서는 트립신-EDTA를 처리하여, 배아체로부터 분리된 단일 세포 단위의 심근세포를 수득하나, 이러한 기존의 효소 처리 기법을 이용하면 세포의 표면이 손상됨에 따라 세포의 이용이 제한될 수 있다. 따라서, 플레이트 상에서 CD71 표면 표지인자가 염색된 세포를 육안으로 구분하면서 선별하여 분리 정제하는 것을 통해, 보다 효과적인 응수축 심근세포의 분리가 가능하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 먼저 hPSC로부터 심근세포로 분화를 유도하였다(도 1). 이 때, hPSC로부터 배아체를 형성하여 이를 무혈청 배지에서 배양하면서 심근세포로 분화를 유도하였고, 분화된 심근세포는 마이크로글래스 파이펫을 사용하여 물리적으로 분리하여 단일 세포 단위로 분리한 심근세포를 수득하였다(도 2).

또한, 본 발명자들은 분리한 심근세포를 응수축 심근세포와 비응수축 심근세포로 구분하고, 미분화 줄기세포를 대상으로 유전체 분석 결과를 수행하여 미분화 줄기세포, 응수축 심근세포 및 비-응수축 심근세포에서 RNA 발현 수준의 차이를 나타내는 유전자를 확인하였다(도 3 및 도 4). 이에 따라, 응수축 심근세포에 대한 특이적인 표면 표지인자로서, CD71을 선별하였다(도 5).

또한, 본 발명자들은 hPSC로부터 분화 유도된 심근세포를 대상으로 CD71 염색하여 관찰하였을 때, 미분화 줄기세포와 비-응수축 심근세포에서는 CD71가 발현되지 않으며, 응수축 심근세포에서 특이적으로 CD71이 염색됨을 확인하였다(도 6).

따라서, 본 발명은 줄기세포로부터 심근세포를 제조하는 방법에 있어서, CD71 표면 표지인자를 마커로서 사용해 응수축성 심근세포만을 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 줄기세포로부터 심근세포를 분화한 후 CD71 양성 세포만을 선별하여 응수축 심근세포를 구분할 수 있고, 이를 마이크로글래스 파이펫을 이용해 물리적으로 세포를 분리하는 것을 통해, 세포 단위의 응수축 심근세포를 분리할 수 있으므로, 이를 심독성 약물 평가 대상의 세포 또는 심부전 세포 치료제 등에 사용할 수 있어 유용하다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 응수축성 심근세포의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 응수축성 심근세포를 유효성분으로 포함하는, 심혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계 i) 및 ii)를 포함하는, 심혈관계 질환 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다:

i) 본 발명의 방법으로 제조된 응수축성 심근세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및

ii) 상기 단계 i)의 처리된 응수축성 심근세포의 세포 사멸을 확인하는 단계.

또한, 본 발명은 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는, 심독성 물질 선별 방법을 제공한다:

i) 제 1항의 방법으로 제조된 응수축성 심근세포에 독성 물질을 처리하는 단계; 및

ii) 상기 단계 i)의 처리된 응수축성 심근세포의 세포 사멸을 확인하는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 결과, 독성 물질 미처리의 응수축 심근세포 대조군에 비해 세포 사멸을 나타내는 독성 물질을 선별하는 단계.

본 발명의 방법으로 제조된 응수축성 심근세포의 용도에 있어서, 상기 심혈관질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질병으로서 당업계에 알려진 범위를 모두 포함할 수 있으나, 본 발명에서 응수축성 심근세포를 세포 치료제로 사용하는 용도를 제공한다는 점에서 상기 심혈관질환은 심부전증, 심근경색증, 협심증 및 허혈성 심장질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

인간 전분화능 줄기세포(human Pluripotent Stem Cell, hPSC)로부터 심근세포로의 분화 유도

<1-1> hPSC로부터 hEB로의 분화 유도

본 발명에서 대상으로 사용하기 위해 분화된 심근세포를 수득하기 위해, 공지된 기술을 이용하여 도 1의 과정에 따라 hPSC로부터 심근세포로의 분화를 유도하였다(특허문헌 1, 비특허문헌 1).

구체적으로, 미분화된 hPSC를 구입하여, 공급자 세포로서 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 상에 부착 배양하였다. 이 때의 배양 배지로는 1Mm L-글루타민(Gibco), 1% 비필수적인 아미노산(Gibco), 100 mM 베타-머캅토에탄올(Gibco), 및 4 ng/mL bFGF(Invitrogen, Grand Island, NY)를 포함하는 기본 hES 배지를 사용하였다. hPSC가 MEF 상에서 안정적으로 배양됨을 확인한 후, 상기 분화 유도된 배아체(embryoid body, hEB)를 형성하기 위해, 디스파제(Gibco)를 이용하여 hPSC를 공급자 세포로부터 분리하고, 초저부착성 플레이트로 이동시킨 후, hFGF를 포함하지 않는 hESC 배양 배지에서 2 일 동안 부유 배양하면서, 형성된 hEB를 수득하였다.

그런 다음, hEB를 다시 MEF 상에 부착 배양하여 응수축성의 hEB로 분화 유도하였다. 이 때의 배양 배지로는 20% FBS 및 고농도의 포도당을 포함하는 DMEM 배지를 hEB 분화 유도 배지로서 사용하였다. hEB를 배양하면서, 24 시간 마다 새로운 배지로 교체하였고, 5 내지 7일 간격으로 새로운 MEF 위로 옮기면서 총 13일 내지 15일 간 배양하여 응수축성의 hEB로 분화를 유도하였다.

<1-2> 무혈청 조건에서 응수축성 hEB로부터 심근세포(cardiomyocyte, CM)으로의 분화 유도

상기 실시예 <1-1>에서 수득한 hEB를 CM으로 분화 유도하기 위해, 먼저 hEB를 0.1% 젤라틴 코팅 플레이트에 접촉시키고, 5 일 동안 10% FBS 포함 DMEM 배지에서 배양하였다. 그런 다음, 응수축성의 덩어리 영역 세포를 미세분리하여 분리하고, 마이크로글라스 파이펫(microglass pipet)을 이용하여 단일 세포 단위로 분리하였다. 분리한 세포는 2% FBS 포함 DMEM 배지에서 배양하여 분화된 CM을 수득하였다. 분화된 CM은 혈청을 포함하지 않고 N2(Gibco)를 보충한 DMEM 배지에서 무혈청 조건으로 배양해, 응수축성 심근세포를 분리 및 정제하였다(도 2).

응수축(beating) 및 비-응수축(non-beating) 심근세포를 판별하기 위한 RNA 단위 유전자 분석

<2-1> 심근세포의 종류에 따른 단일 세포 단위의 RNA 서열 분석

분화된 심근세포를 응수축 심근세포 및 비-응수축 심근세포로 분류하고, 이러한 특성에 영향을 미치도록 하는 유전자를 분석하고자 하였다.

구체적으로, 상기 [실시예 1]에서 hPSC로부터 심근세포로의 분화를 유도한 다음, 이를 물리적으로 분리할 때 응수축 심근세포, 비-응수축 심근세포 및 미분화된 세포로 나누어, 단일 세포 단위로 각각의 세포를 수득하였다. 그런 다음, 각각의 세포를 분해(lysis)하여 세포 추출물을 수득하고, 이에 포함된 mRNA의 발현 수준을 확인하기 위해 전체 전사체 분석(global transcriptome assay)을 수행하였다. 전체 전사체 분석 결과로부터, 평균연관 (average linkage) 및 피어슨 편차 (Pearson distance)를 이용해 전체 유전자 발현 프로파일의 위계적 군집 (Hierarchical clustering) 분석 결과를 도출하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 미분화된 hPSC와 비교하였을 때 심근세포에서 발현되는 유전자의 발현 프로파일은 다른 양상으로 그룹화될 수 있음을 확인하였다. 이에 비해 응수축 심근세포 및 비-응수축 심근세포는 유전자 발현 프로파일이 유사한 수준을 나타내는 것으로 확인하였다.

<2-2> 응수축 심근세포 및 비-응수축 심근세포 간의 특성의 비교 분석

응수축 심근세포와 비-응수축 심근세포가 유사한 양상의 유전자 발현 프로파일을 나타내나, 이 중 서로 다른 발현 수준을 나타내는 유전자가 심근세포에서 응수축 여부에 영향을 미치는 요인으로 작용할 수 있어, 이를 응수축 심근세포를 위한 마커 유전자로서 사용할 수 있을 것으로 기대하였다. 이에, 응수축 심근세포와 비-응수축 심근세포간의 유전자 발현 양상을 유전자 온톨로지(Gene Ontology, GO) 분석을 통해 확인하였다. 유전자 온톨로지 분석의 대상 유전자군으로는, 심근세포 발생(cardiac muscle cell development)과 관련된 유전자, 심실근 세포 발생(ventricular cardiac muscle cell development)과 관련된 유전자, 및 심방근 세포 발생(atrial cardiac muscle cell development)과 관련된 유전자군을 대상으로 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 응수축 및 비-응수축의 심근세포가 모두 심근세포 발생과 관련된 유전자 및 심장을 구성하는 세포에 특이적인 유전자의 발현 수준이 높은 것으로 확인하였다. 따라서, 물리적인 방법을 사용하여 단일 세포 단위로 분리한 응수축 심근세포 및 비-응수축 심근세포가 모두 심근세포의 특성을 잘 유지하고 있으며, 이를 이용하여 표면 표지인자를 선별하는데 대상 세포로서 사용할 수 있을 것으로 확인하였다.

응수축 심근세포에 특이적인 표면 표지인자의 발굴

응수축 심근세포와 비-응수축 심근세포를 구별할 수 있는 표면 표지인자를 선별하기 위해, 먼저 상기 실시예 <2-1>에서 분석한 GO 분석 결과로부터 응수축 심근세포와 비-응수축 심근세포 간에 발현 수준 차이를 나타내는 유전자 중 세포 표면 표지인자(CD)를 암호화하는 유전자를 비교 분석하였다. 공지된 문헌(비특허문헌 2)을 통해 심근세포에서 특이적으로 발현이 높은 유전자로서 TFRC 유전자가 개시되어 있는 것을 확인하고, 이를 근거로 하여 응수축 심근세포에 특이적인 표면 표지인자의 후보로 TFRC(CD71)을 선택하였다(도 5).

이에, hPSC로부터 분화된 심근세포 중 응수축 세포 만을 특이적으로 선별하기 위한 마커로서 CD71을 사용할 수 있는지 확인하고자 하였다. 상기 [실시예 1]의 과정을 통해 hPSC로부터 심근세포로의 분화를 유도하고, 세포에 항-CD71 항체를 처리하여 세포를 염색하였다. 그런 다음, 항-CD71 항체를 발색하여 현미경으로 관찰하였다. 또한, CD71이 유의적인 표면 표지 마커로서 사용할 수 있는지 확인하기 위해, 심근세포 판별 마커로서 사용될 수 있음이 공지된 SIRPA(비특허문헌 3) 또는 CD71로 심근세포를 표지하여 유세포분석기(FACS)에서 형광 발색 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 응수축 심근세포와 비-응수축 심근세포에서 CD71 유전자의 발현 수준에서 차이를 나타내는 것을 확인하였다. hPSC로부터 분화 유도된 심근세포를 CD71 표지하였을 때, 도 6에서 나타난 바와 같이 CD71이 응수축 심근세포에 대한 특이적인 표면 마커로서 사용할 수 있음을 확인하였으며(도 6a), 유세포 분석 결과 심근세포 표면 인자인 SIRPA 표면 마커와 유사한 패턴을 나타내는 것을 확인하였다(도 6b 및 도 6c). SIRPA의 경우, 응수축 또는 비-응수축을 구분하지 않고 심근세포에 대한 특이적인 인자로서 알려져 있는 바, 본 발명에서 선별한 CD71을 사용하여 응수축 심근세포만을 특이적으로 선별할 수 있을 것으로 확인하였다.

Claims (7)

1. i) 전분화능 줄기세포로부터 심근세포(cardiomyocyte)로의 분화를 유도하는 단계;
   ii) 상기 단계 i)에서 분화 유도된 심근세포에서, CD71 표면 표지인자의 발현을 확인하는 단계; 및
   iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 CD71 양성 세포를 세포 수준으로 분리하는 단계;를 포함하는,
   줄기세포로부터 응수축성 심근세포를 제조하는 방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 줄기세포로부터 응수축성 심근세포를 제조하는 방법.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)에서 CD71 표면 표지인자의 발현을 확인한 결과, CD71 음성 세포는 미분화된 줄기세포 또는 배아체이거나, 비-응수축 심근세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포로부터 응수축성 심근세포를 제조하는 방법.
   
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