JP6694512B2 - 幹細胞由来ヒト肝細胞を使用した微小組織形成 - Google Patents

幹細胞由来ヒト肝細胞を使用した微小組織形成 Download PDF

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Description

本願は、２０１５年１２月３０日出願の米国仮出願シリアル番号６２／２７３，３９５号の優先権を主張するものであり、その内容全体を参照としてここに援用する。
本発明は、分子生物学分野及び医学分野全般に関連する。特に、３次元（３Ｄ）微小組織の作成方法に関する。
現在、肝臓毒性に対する通常の臨床前薬物の安全性評価では、予測可能モデルとして、細胞ベースの動物モデルを採用する。具体的には、インビトロモデルに注目すると、多数の癌由来細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７）を肝毒性査定に採用可能であるが、これらの細胞は、その薬物代謝機能（Ｃｌａｙｔｏｎら、２００５年）の点で限定的である。この機能的負荷により、これらの株は、毒性代謝形成に関して、正常且つ健全な肝細胞の薬物感受性に対する予測可能な性質であるかという点で疑わしい。分離された初代ヒト肝細胞の形態の初代ヒト肝組織へのアクセスは、初代分離株を安定的に凍結保存する方法（ＬｅＣｌｕｙｓｅら、２００５年）の出現で著しく改善された。しかしながら、これらの細胞は、インビトロセッティングから一旦取り外されると、経時的に組織培養環境によく適合しなくなる。また、静的な２次元（２Ｄ）培養における初代肝細胞は、細胞外基質たんぱく質重層が生存を続け、それでもそのシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）機能を急速に低下させることを必要とする（Ｓｗｉｆｔａら、２０１０年）。
肝細胞を含む特定の系列に誘導型多能性幹細胞及び胚性幹細胞等のヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）の分化を仕向ける能力により、疾患のスペクトルに対する新たな治療の開発、薬物発見及び予測中毒学の確立、及び疾患のインビトロモデルの作成を含む、広域に亘る適用を行うために、無限の数のヒト肝細胞へのアクセスを提供する。しかしながら、現在のインビトロモデル及びインビボの毒性モデルと母集団全体に対するヒトの転帰との間に総合的且つ予測可能な相関が欠如しているため、依然として高度に予測可能なインビトロのヒト毒性モデルが欠如している。これは毒性予測及び機械的研究に関連するので、このような懸念に対処し、肝細胞由来組織を使用して薬物の安全性へのよりよい臨床開発の道を切り開くことは、研究関心の集中する領域であった。
従って、多能性幹細胞由来肝細胞は、安定性及び一貫性を備えた予測可能なインビトロモデルに開発される潜在性がある。しかしながら、予測可能な肝毒性にも適用されるため、このモデルシステムには未だ改善の余地がある。従って、より完全な肝臓様環境及び分子キューを提供し、引いてはその予測可能な力を増大させるための治療及び研究用途のためにＰＳＣ由来肝細胞から３Ｄ組織を作成する方法のニーズがある。
本開示の実施形態は、３次元（３Ｄ）微小組織を作成する方法及び組成を提供するものである。第１実施形態において、多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞から微小組織を作成するインビトロ法であって、微小組織を得るための原則的に細胞非付着性の底部を有する培養容器内において、１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントの存在下で、ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液を培養することを備える方法を提供する。ある態様において、この方法は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞の細胞浮遊液を得ることをさらに備える。いくつかの態様において、この方法は、細胞浮遊液に１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを補給することをさらに備える。
いくつかの態様において、この方法は、ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液にＰＳＣ−由来マクロファージを補給することをさらに備える。ある態様において、この方法は、ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液にＰＳＣ−由来内皮細胞を補給することをさらに備える。いくつかの態様において、この方法は、ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液にＰＳＣ−由来マクロファージ及びＰＳＣ−由来内皮細胞を補給することをさらに備える。
いくつかの態様において、ステップ（ｃ）の培養は、約２４時間〜約４８時間実施される。ある態様において、ＰＳＣ由来肝細胞は、無血清培地又は血清限定培地において培養される。いくつかの態様において、微小組織は、少なくとも５０μｍの直径を有する。
ある態様において、培養コンテナは、超低接着プレートである。いくつかの態様において、培養コンテナは、足場又は基質の重層を備えない。ある態様において、細胞浮遊液は、粘着性でない。いくつかの態様において、培養コンテナの底部は、凹状である。
いくつかの態様において、多能性幹細胞は、ヒトである。ある態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。他の態様において、多能性幹細胞は、誘導型多能性幹細胞である。
ある態様において、１つ以上の細胞外基質たんぱく質は、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチン、基質細胞外リン糖たんぱく質（ＭＥＰＥ）、ニドゲン−１、Ｆ−スポンジン、Ｒ−スポンジン、テネイシン、テスティカン、ビトロネクチン、及びデコリンからなる群より選択される。いくつかの態様において、１つ以上の細胞外基質たんぱく質は、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチン、及びヘパリン硫酸プロテオグリカンである。特定の態様において、１つ以上の細胞外基質たんぱく質は、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）である。いくつかの態様において、１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントは、Ｉ型コラーゲン組換ペプチドである。例えば、Ｉ型コラーゲン組換ペプチドは、ＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）である。いくつかの態様において、１つ以上の細胞外基質たんぱく質は、組換体である。
いくつかの実施形態において、細胞浮遊液は、約５％〜約３０％の１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを含有する。ある態様において、細胞浮遊液は、約１０％〜約２０％の１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを含有する。いくつかの実施形態において、細胞浮遊液は、約０．００５ｍｇ／ｍＬ〜約０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度の１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを含有する。ある態様において、細胞浮遊液は、約０．０２ｍｇ／ｍＬ〜約０．０４ｍｇ／ｍＬの濃度の１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを含有する。
ある態様において、ＰＳＣ由来肝細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｂ２７補給、デキサメタゾン、及びゲンタマイシンを含有する培地において培養される。特定の態様において、培地は、ＬＣＡＡ又はフェノールレッドを含有しない。
ある態様において、ステップ（ａ）は、（ｉ）凍結保存ＰＳＣ由来肝細胞を解凍することと、（ｉｉ）２次元（２Ｄ）培養でＰＳＣ由来肝細胞を培養することと、（ｉｉｉ）ＰＳＣ由来肝細胞を細胞分離試薬で分離して細胞浮遊液を得ることとを備える。いくつかの態様において、２Ｄ培養は、接着面上で実施される。ある態様において、接着面は、基質である。いくつかの態様において、基質は、少なくとも１つの細胞外基質たんぱく質を含有する。例えば、少なくとも１つの細胞外基質たんぱく質は、コラーゲン、ラミニン、又はフィブロネクチンである。いくつかの態様において、細胞分離試薬は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）である。ある態様において、ＰＳＣ由来肝細胞は、原則的に単一の細胞に分離されない。いくつかの態様において、分離は、細胞のクラスタを中断させない。
いくつかの態様において、微小組織は、薬物誘導型シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）活性を有する。例えば、ＣＹＰ活性は、ＣＹＰ１Ａ２及び／又はＣＹＰ３Ａ４誘導によって判定される。いくつかの態様において、微小組織の薬物誘導型ＣＹＰ活性は、ＰＳＣ由来肝細胞の２Ｄ培養に比して増大させられる。いくつかの態様において、薬物誘導型ＣＹＰ活性の増大は、少なくとも１．５倍である。
ある態様において、この方法は、微小組織のサイズを調整することをさらに備える。いくつかの態様において、調整することは、（ｉ）細胞浮遊液の細胞密度を判定することと、（ｉｉ）細胞を約５，０００個／ｃｍ2〜約２５０，０００個／ｃｍ2の細胞密度で播種することにより、約１００μｍ〜約８００μｍの直径の微小組織を得ることとを備える。いくつかの態様において、調整することにより、非調整微小組織に比して、微小組織の肝特異的機能を増大させる。ある態様において、肝特異的機能は、薬物誘導型ＣＹＰ活性によって測定される。いくつかの態様において、調整することにより、非調整微小組織に比して、内在ＰＳＣ由来肝細胞の細胞死を低減させる。ある態様において、調整することにより、非調整微小組織に比して、細胞生存率を上昇させる。例えば、細胞生存率は、ＡＴＰの測定によって定量化される。
他の実施形態において、３Ｄ微小組織であって、１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを補給されたＰＳＣ由来肝細胞の凝集物を含有する３Ｄ微小組織を提供する。いくつかの態様において、微小組織は、本明細書において提供される方法によって作成される。いくつかの態様において、微小組織は、約１００μｍ〜約８００μｍの直径を有する。ある態様において、微小組織は、安定的誘導の可能なＣＹＰ発現を有する。
さらに他の実施形態において、医薬品組成であって、本明細書において提供される方法で作成された機能性微小組織を含有する医薬品組成を提供する。
さらに他の実施形態において、キットであって、１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを補給されたＰＳＣ由来肝細胞の凝集物を含有する３Ｄ微小組織を含有するキットを提供する。いくつかの態様において、微小組織は、本明細書において提供される方法によって作成される。ある態様において、微小組織は、培養コンテナ上に提供される。例えば、培養コンテナは、超低接着（ＵＬＡ）プレートである。
以下の詳細な説明により、本発明の他の目的、特徴、及び効果が明らかとなるであろう。しかしながら、この詳細な説明から当業者には本発明の主旨及び範囲内での種々の変更及び修正が明らかとなるため、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好適な実施形態を示しているものの、単なる例示であることを理解されなければならない。
添付の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図面のうちの１つ以上を、本明細書に記載の特定の実施形態の詳細な説明とともに参照することにより、よりよく理解されるであろう。
図１は、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０（幹細胞由来ヒト肝細胞）を使用した３Ｄ微小組織形成の概略図である。
図２Ａは、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０（１００倍の倍率）の融合性２Ｄ培養の画像であり、図２Ｂは、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０（２５倍の倍率）から作成された微小組織の３Ｄ培養の画像である。
図３Ａは、細胞間の接着を促進するために、指定のパーセンテージの細胞外基質補給で微小組織を形成するためのスクリーニングを示す。図３Ｂ及び図３Ｃにおいて、細胞外基質の補給は、Ｃｏｒｎｉｎｇ丸底ＵＬＡプレート（Ｂ）又はＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレート（Ｃ）における、解凍された幹細胞由来ヒト肝細胞を使用した微小組織の形成を促進する。図３Ｄにおいて、細胞外基質補給は、２Ｄ形態に事前プレーティングされた細胞の分離に続く微小組織の形成もサポートする。本例において、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０の１２日目の培養がＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で分離された後、指定の細胞外基質を補給し、これが２日後にはスフェロイドを形成した。図３Ｅは、補給する他の材料の評価を示している。 図３Ａは、細胞間の接着を促進するために、指定のパーセンテージの細胞外基質補給で微小組織を形成するためのスクリーニングを示す。図３Ｂ及び図３Ｃにおいて、細胞外基質の補給は、Ｃｏｒｎｉｎｇ丸底ＵＬＡプレート（Ｂ）又はＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレート（Ｃ）における、解凍された幹細胞由来ヒト肝細胞を使用した微小組織の形成を促進する。図３Ｄにおいて、細胞外基質補給は、２Ｄ形態に事前プレーティングされた細胞の分離に続く微小組織の形成もサポートする。本例において、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０の１２日目の培養がＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で分離された後、指定の細胞外基質を補給し、これが２日後にはスフェロイドを形成した。図３Ｅは、補給する他の材料の評価を示している。 図３Ａは、細胞間の接着を促進するために、指定のパーセンテージの細胞外基質補給で微小組織を形成するためのスクリーニングを示す。図３Ｂ及び図３Ｃにおいて、細胞外基質の補給は、Ｃｏｒｎｉｎｇ丸底ＵＬＡプレート（Ｂ）又はＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレート（Ｃ）における、解凍された幹細胞由来ヒト肝細胞を使用した微小組織の形成を促進する。図３Ｄにおいて、細胞外基質補給は、２Ｄ形態に事前プレーティングされた細胞の分離に続く微小組織の形成もサポートする。本例において、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０の１２日目の培養がＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で分離された後、指定の細胞外基質を補給し、これが２日後にはスフェロイドを形成した。図３Ｅは、補給する他の材料の評価を示している。 図３Ａは、細胞間の接着を促進するために、指定のパーセンテージの細胞外基質補給で微小組織を形成するためのスクリーニングを示す。図３Ｂ及び図３Ｃにおいて、細胞外基質の補給は、Ｃｏｒｎｉｎｇ丸底ＵＬＡプレート（Ｂ）又はＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレート（Ｃ）における、解凍された幹細胞由来ヒト肝細胞を使用した微小組織の形成を促進する。図３Ｄにおいて、細胞外基質補給は、２Ｄ形態に事前プレーティングされた細胞の分離に続く微小組織の形成もサポートする。本例において、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０の１２日目の培養がＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で分離された後、指定の細胞外基質を補給し、これが２日後にはスフェロイドを形成した。図３Ｅは、補給する他の材料の評価を示している。 図３Ａは、細胞間の接着を促進するために、指定のパーセンテージの細胞外基質補給で微小組織を形成するためのスクリーニングを示す。図３Ｂ及び図３Ｃにおいて、細胞外基質の補給は、Ｃｏｒｎｉｎｇ丸底ＵＬＡプレート（Ｂ）又はＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレート（Ｃ）における、解凍された幹細胞由来ヒト肝細胞を使用した微小組織の形成を促進する。図３Ｄにおいて、細胞外基質補給は、２Ｄ形態に事前プレーティングされた細胞の分離に続く微小組織の形成もサポートする。本例において、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０の１２日目の培養がＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で分離された後、指定の細胞外基質を補給し、これが２日後にはスフェロイドを形成した。図３Ｅは、補給する他の材料の評価を示している。
図４Ａ〜図４Ｃにおいて、最適な培養タイミングと分離条件とのスクリーニングが細胞外基質の補給と組み合わせられることにより、効率的な微小組織の形成を促進する。図４Ａは、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（頂上部）又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（底部）で分離された、事前プレーティングされたｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０培養から調製された３Ｄ培養の画像であり、３Ｄ培養開始後、約４８時間の時点で撮影したものである。（ＤＩＶ＝インビトロの日数であり、解凍された細胞が、３Ｄ培養調製のための穏やかな分離に先立って、従来の２Ｄ培養形態で事前プレーティングされた日数）。図４Ｂは、インビトロで異なる日数、４つの試薬のうちの１つを使用して分離された２Ｄ培養から調製された３Ｄ培養の画像である。スフェロイド形成の効率は、培養齢及び分離方法に影響されるものであり、分離試薬（ＴＲＹＰＬＥ（商標）又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標））が穏やかであるほど、より早期の時点でより効率的なスフェロイド形成が可能となった。図４Ｃでは、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞が、７日間、２Ｄ形態で事前プレーティングされた後、指定の分離剤で分離され、細胞外基質たんぱく質で促進された微小組織形成のための３Ｄ培養プレートで再プレーティングされた。これらの結果は、スフェロイド形成効率が、分離方法（ＴＲＹＰＬＥ（商標）又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）等の分離試薬が穏やかであるほど、効率がよりよくなる）、使用される細胞外基質補給（本例では、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）がＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）よりも効率が高い）の種別及び／又は濃度、３Ｄ培養プレートジオメトリ（すなわち、ここでは、ＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートがＣｏｒｎｉｎｇ ＵＬＡプレートよりも効率が高いものと見受けられる）の組み合わせによる影響を受ける。 図４Ａ〜図４Ｃにおいて、最適な培養タイミングと分離条件とのスクリーニングが細胞外基質の補給と組み合わせられることにより、効率的な微小組織の形成を促進する。図４Ａは、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（頂上部）又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（底部）で分離された、事前プレーティングされたｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０培養から調製された３Ｄ培養の画像であり、３Ｄ培養開始後、約４８時間の時点で撮影したものである。（ＤＩＶ＝インビトロの日数であり、解凍された細胞が、３Ｄ培養調製のための穏やかな分離に先立って、従来の２Ｄ培養形態で事前プレーティングされた日数）。図４Ｂは、インビトロで異なる日数、４つの試薬のうちの１つを使用して分離された２Ｄ培養から調製された３Ｄ培養の画像である。スフェロイド形成の効率は、培養齢及び分離方法に影響されるものであり、分離試薬（ＴＲＹＰＬＥ（商標）又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標））が穏やかであるほど、より早期の時点でより効率的なスフェロイド形成が可能となった。図４Ｃでは、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞が、７日間、２Ｄ形態で事前プレーティングされた後、指定の分離剤で分離され、細胞外基質たんぱく質で促進された微小組織形成のための３Ｄ培養プレートで再プレーティングされた。これらの結果は、スフェロイド形成効率が、分離方法（ＴＲＹＰＬＥ（商標）又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）等の分離試薬が穏やかであるほど、効率がよりよくなる）、使用される細胞外基質補給（本例では、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）がＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）よりも効率が高い）の種別及び／又は濃度、３Ｄ培養プレートジオメトリ（すなわち、ここでは、ＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートがＣｏｒｎｉｎｇ ＵＬＡプレートよりも効率が高いものと見受けられる）の組み合わせによる影響を受ける。 図４Ａ〜図４Ｃにおいて、最適な培養タイミングと分離条件とのスクリーニングが細胞外基質の補給と組み合わせられることにより、効率的な微小組織の形成を促進する。図４Ａは、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（頂上部）又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（底部）で分離された、事前プレーティングされたｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０培養から調製された３Ｄ培養の画像であり、３Ｄ培養開始後、約４８時間の時点で撮影したものである。（ＤＩＶ＝インビトロの日数であり、解凍された細胞が、３Ｄ培養調製のための穏やかな分離に先立って、従来の２Ｄ培養形態で事前プレーティングされた日数）。図４Ｂは、インビトロで異なる日数、４つの試薬のうちの１つを使用して分離された２Ｄ培養から調製された３Ｄ培養の画像である。スフェロイド形成の効率は、培養齢及び分離方法に影響されるものであり、分離試薬（ＴＲＹＰＬＥ（商標）又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標））が穏やかであるほど、より早期の時点でより効率的なスフェロイド形成が可能となった。図４Ｃでは、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞が、７日間、２Ｄ形態で事前プレーティングされた後、指定の分離剤で分離され、細胞外基質たんぱく質で促進された微小組織形成のための３Ｄ培養プレートで再プレーティングされた。これらの結果は、スフェロイド形成効率が、分離方法（ＴＲＹＰＬＥ（商標）又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）等の分離試薬が穏やかであるほど、効率がよりよくなる）、使用される細胞外基質補給（本例では、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）がＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）よりも効率が高い）の種別及び／又は濃度、３Ｄ培養プレートジオメトリ（すなわち、ここでは、ＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートがＣｏｒｎｉｎｇ ＵＬＡプレートよりも効率が高いものと見受けられる）の組み合わせによる影響を受ける。
図５Ａ及び図５Ｂでは、微小組織サイズは、ＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートのウェルに播種された２０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）（図５Ａ）又はＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）（図５Ｂ）の補給されたｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞の数に基づき、調整可能である。
図６Ａ及び図６Ｂでは、微小組織が、培養時間を延長して、維持可能である。図６Ａは、分離前の７日間、事前プレーティングされた細胞から３Ｄ培養を開始した後、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）が補給された約２，５００個／ウェルをＩｎＳｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートに播種した後、異なる日数が経過したものを撮影した画像である。（ＤＩＶ＝インビトロの日数であり、解凍されたｉＣｅｌｌ（登録商標）細胞が培養された総日数、すなわち、３Ｄ培養の日数プラス最初の７日間の２Ｄ培養時間の組み合わせである）。図６Ｂは、２５日間の時間経過に亘って測定した３Ｄ微小組織の直径サイズ（ｎ＝スフェロイド３個）の平均グラフであり、経時的になだらかなサイズ減少を示している。 図６Ａ及び図６Ｂでは、微小組織が、培養時間を延長して、維持可能である。図６Ａは、分離前の７日間、事前プレーティングされた細胞から３Ｄ培養を開始した後、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）が補給された約２，５００個／ウェルをＩｎＳｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートに播種した後、異なる日数が経過したものを撮影した画像である。（ＤＩＶ＝インビトロの日数であり、解凍されたｉＣｅｌｌ（登録商標）細胞が培養された総日数、すなわち、３Ｄ培養の日数プラス最初の７日間の２Ｄ培養時間の組み合わせである）。図６Ｂは、２５日間の時間経過に亘って測定した３Ｄ微小組織の直径サイズ（ｎ＝スフェロイド３個）の平均グラフであり、経時的になだらかなサイズ減少を示している。
図７Ａ〜図７Ｃは、微小組織機能と、予測可能なインビトロ肝臓様モデルの生成に対する適合性との査定に使用可能な機能性アッセイを示す。図７Ａは、指定の細胞が播種された微小組織のための細胞ＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）３Ｄアッセイによって測定されたＡＴＰレベル（細胞生存率インジケータ）を示す。図７Ｂは、Ｐ４５０−ＧＬＯ（商標）ＣＹＰ１Ａ２アッセイによって測定された、Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅで２４時間処理した６日目のスフェロイド（左側）、又はＰ４５０−ＧＬＯ（商標）Ｃｙｐ３Ａ４アッセイで測定された、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎで９６時間処理した９日目のスフェロイド（右側）の薬物誘導型シトクロムＰ４５０活性を示す。図７Ｃは、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎで７２時間処理した２Ｄ培養中のｉＣｅＬＬ（登録商標）肝細胞のＰ４５０−ＧＬＯ（商標）ＣＹＰ３Ａ４アッセイ（左側）と、９日目のスフェロイド（右側）とを示す。 図７Ａ〜図７Ｃは、微小組織機能と、予測可能なインビトロ肝臓様モデルの生成に対する適合性との査定に使用可能な機能性アッセイを示す。図７Ａは、指定の細胞が播種された微小組織のための細胞ＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）３Ｄアッセイによって測定されたＡＴＰレベル（細胞生存率インジケータ）を示す。図７Ｂは、Ｐ４５０−ＧＬＯ（商標）ＣＹＰ１Ａ２アッセイによって測定された、Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅで２４時間処理した６日目のスフェロイド（左側）、又はＰ４５０−ＧＬＯ（商標）Ｃｙｐ３Ａ４アッセイで測定された、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎで９６時間処理した９日目のスフェロイド（右側）の薬物誘導型シトクロムＰ４５０活性を示す。図７Ｃは、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎで７２時間処理した２Ｄ培養中のｉＣｅＬＬ（登録商標）肝細胞のＰ４５０−ＧＬＯ（商標）ＣＹＰ３Ａ４アッセイ（左側）と、９日目のスフェロイド（右側）とを示す。 図７Ａ〜図７Ｃは、微小組織機能と、予測可能なインビトロ肝臓様モデルの生成に対する適合性との査定に使用可能な機能性アッセイを示す。図７Ａは、指定の細胞が播種された微小組織のための細胞ＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）３Ｄアッセイによって測定されたＡＴＰレベル（細胞生存率インジケータ）を示す。図７Ｂは、Ｐ４５０−ＧＬＯ（商標）ＣＹＰ１Ａ２アッセイによって測定された、Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅで２４時間処理した６日目のスフェロイド（左側）、又はＰ４５０−ＧＬＯ（商標）Ｃｙｐ３Ａ４アッセイで測定された、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎで９６時間処理した９日目のスフェロイド（右側）の薬物誘導型シトクロムＰ４５０活性を示す。図７Ｃは、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎで７２時間処理した２Ｄ培養中のｉＣｅＬＬ（登録商標）肝細胞のＰ４５０−ＧＬＯ（商標）ＣＹＰ３Ａ４アッセイ（左側）と、９日目のスフェロイド（右側）とを示す。
図８Ａ〜図８Ｈについて、図８Ａは、微小組織の寿命への影響を調べるための維持培地処方の試験を示す概略図である。図８Ｂは、異なる維持培地処方において２１日間に亘ってスフェロイド形態を維持した様子を示す。図８Ｃは、種々の維持培地において培養されたスフェロイドの直径（ｍｍ）を示すグラフである（左側の２つのアスタリスクは、スフェロイド周辺で沈殿物の収集を行うため膨張した測定値を示し、右側の３つのアスタリスクは、良好な維持条件を示している）。図８Ｄは、条件＃６、＃８、及び＃１２におけるスフェロイド培養の画像である。図８Ｅ及び図８Ｆは、細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）３Ｄ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定されたＡＴＰレベルを示す。培地＃１２は、２０日目で最高となるＡＴＰを示し、次いで＃６、＃４、及び＃２となった。図８Ｇ及び図８Ｈは、Ｐ４５０−ＧＬＯＣＹＰ３Ａ４（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定されたＣＹＰ３Ａ４を示す。図８Ｈでは、２０日目で、培地＃４が最高となるＣＹＰ３Ａ４レベルを示し、次いで＃６、＃１２、及び＃２となった。培地＃１、＃３、及び＃５は、１日目に低いレベルで開始し、１５日目まで徐々に低下した。培地＃１２は、１日目から２０日目まで、約１５，０００の比較的一定のレベルを示した。 図８Ａ〜図８Ｈについて、図８Ａは、微小組織の寿命への影響を調べるための維持培地処方の試験を示す概略図である。図８Ｂは、異なる維持培地処方において２１日間に亘ってスフェロイド形態を維持した様子を示す。図８Ｃは、種々の維持培地において培養されたスフェロイドの直径（ｍｍ）を示すグラフである（左側の２つのアスタリスクは、スフェロイド周辺で沈殿物の収集を行うため膨張した測定値を示し、右側の３つのアスタリスクは、良好な維持条件を示している）。図８Ｄは、条件＃６、＃８、及び＃１２におけるスフェロイド培養の画像である。図８Ｅ及び図８Ｆは、細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）３Ｄ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定されたＡＴＰレベルを示す。培地＃１２は、２０日目で最高となるＡＴＰを示し、次いで＃６、＃４、及び＃２となった。図８Ｇ及び図８Ｈは、Ｐ４５０−ＧＬＯＣＹＰ３Ａ４（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定されたＣＹＰ３Ａ４を示す。図８Ｈでは、２０日目で、培地＃４が最高となるＣＹＰ３Ａ４レベルを示し、次いで＃６、＃１２、及び＃２となった。培地＃１、＃３、及び＃５は、１日目に低いレベルで開始し、１５日目まで徐々に低下した。培地＃１２は、１日目から２０日目まで、約１５，０００の比較的一定のレベルを示した。 図８Ａ〜図８Ｈについて、図８Ａは、微小組織の寿命への影響を調べるための維持培地処方の試験を示す概略図である。図８Ｂは、異なる維持培地処方において２１日間に亘ってスフェロイド形態を維持した様子を示す。図８Ｃは、種々の維持培地において培養されたスフェロイドの直径（ｍｍ）を示すグラフである（左側の２つのアスタリスクは、スフェロイド周辺で沈殿物の収集を行うため膨張した測定値を示し、右側の３つのアスタリスクは、良好な維持条件を示している）。図８Ｄは、条件＃６、＃８、及び＃１２におけるスフェロイド培養の画像である。図８Ｅ及び図８Ｆは、細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）３Ｄ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定されたＡＴＰレベルを示す。培地＃１２は、２０日目で最高となるＡＴＰを示し、次いで＃６、＃４、及び＃２となった。図８Ｇ及び図８Ｈは、Ｐ４５０−ＧＬＯＣＹＰ３Ａ４（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定されたＣＹＰ３Ａ４を示す。図８Ｈでは、２０日目で、培地＃４が最高となるＣＹＰ３Ａ４レベルを示し、次いで＃６、＃１２、及び＃２となった。培地＃１、＃３、及び＃５は、１日目に低いレベルで開始し、１５日目まで徐々に低下した。培地＃１２は、１日目から２０日目まで、約１５，０００の比較的一定のレベルを示した。 図８Ａ〜図８Ｈについて、図８Ａは、微小組織の寿命への影響を調べるための維持培地処方の試験を示す概略図である。図８Ｂは、異なる維持培地処方において２１日間に亘ってスフェロイド形態を維持した様子を示す。図８Ｃは、種々の維持培地において培養されたスフェロイドの直径（ｍｍ）を示すグラフである（左側の２つのアスタリスクは、スフェロイド周辺で沈殿物の収集を行うため膨張した測定値を示し、右側の３つのアスタリスクは、良好な維持条件を示している）。図８Ｄは、条件＃６、＃８、及び＃１２におけるスフェロイド培養の画像である。図８Ｅ及び図８Ｆは、細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）３Ｄ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定されたＡＴＰレベルを示す。培地＃１２は、２０日目で最高となるＡＴＰを示し、次いで＃６、＃４、及び＃２となった。図８Ｇ及び図８Ｈは、Ｐ４５０−ＧＬＯＣＹＰ３Ａ４（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定されたＣＹＰ３Ａ４を示す。図８Ｈでは、２０日目で、培地＃４が最高となるＣＹＰ３Ａ４レベルを示し、次いで＃６、＃１２、及び＃２となった。培地＃１、＃３、及び＃５は、１日目に低いレベルで開始し、１５日目まで徐々に低下した。培地＃１２は、１日目から２０日目まで、約１５，０００の比較的一定のレベルを示した。 図８Ａ〜図８Ｈについて、図８Ａは、微小組織の寿命への影響を調べるための維持培地処方の試験を示す概略図である。図８Ｂは、異なる維持培地処方において２１日間に亘ってスフェロイド形態を維持した様子を示す。図８Ｃは、種々の維持培地において培養されたスフェロイドの直径（ｍｍ）を示すグラフである（左側の２つのアスタリスクは、スフェロイド周辺で沈殿物の収集を行うため膨張した測定値を示し、右側の３つのアスタリスクは、良好な維持条件を示している）。図８Ｄは、条件＃６、＃８、及び＃１２におけるスフェロイド培養の画像である。図８Ｅ及び図８Ｆは、細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）３Ｄ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定されたＡＴＰレベルを示す。培地＃１２は、２０日目で最高となるＡＴＰを示し、次いで＃６、＃４、及び＃２となった。図８Ｇ及び図８Ｈは、Ｐ４５０−ＧＬＯＣＹＰ３Ａ４（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定されたＣＹＰ３Ａ４を示す。図８Ｈでは、２０日目で、培地＃４が最高となるＣＹＰ３Ａ４レベルを示し、次いで＃６、＃１２、及び＃２となった。培地＃１、＃３、及び＃５は、１日目に低いレベルで開始し、１５日目まで徐々に低下した。培地＃１２は、１日目から２０日目まで、約１５，０００の比較的一定のレベルを示した。 図８Ａ〜図８Ｈについて、図８Ａは、微小組織の寿命への影響を調べるための維持培地処方の試験を示す概略図である。図８Ｂは、異なる維持培地処方において２１日間に亘ってスフェロイド形態を維持した様子を示す。図８Ｃは、種々の維持培地において培養されたスフェロイドの直径（ｍｍ）を示すグラフである（左側の２つのアスタリスクは、スフェロイド周辺で沈殿物の収集を行うため膨張した測定値を示し、右側の３つのアスタリスクは、良好な維持条件を示している）。図８Ｄは、条件＃６、＃８、及び＃１２におけるスフェロイド培養の画像である。図８Ｅ及び図８Ｆは、細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）３Ｄ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定されたＡＴＰレベルを示す。培地＃１２は、２０日目で最高となるＡＴＰを示し、次いで＃６、＃４、及び＃２となった。図８Ｇ及び図８Ｈは、Ｐ４５０−ＧＬＯＣＹＰ３Ａ４（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定されたＣＹＰ３Ａ４を示す。図８Ｈでは、２０日目で、培地＃４が最高となるＣＹＰ３Ａ４レベルを示し、次いで＃６、＃１２、及び＃２となった。培地＃１、＃３、及び＃５は、１日目に低いレベルで開始し、１５日目まで徐々に低下した。培地＃１２は、１日目から２０日目まで、約１５，０００の比較的一定のレベルを示した。 図８Ａ〜図８Ｈについて、図８Ａは、微小組織の寿命への影響を調べるための維持培地処方の試験を示す概略図である。図８Ｂは、異なる維持培地処方において２１日間に亘ってスフェロイド形態を維持した様子を示す。図８Ｃは、種々の維持培地において培養されたスフェロイドの直径（ｍｍ）を示すグラフである（左側の２つのアスタリスクは、スフェロイド周辺で沈殿物の収集を行うため膨張した測定値を示し、右側の３つのアスタリスクは、良好な維持条件を示している）。図８Ｄは、条件＃６、＃８、及び＃１２におけるスフェロイド培養の画像である。図８Ｅ及び図８Ｆは、細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）３Ｄ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定されたＡＴＰレベルを示す。培地＃１２は、２０日目で最高となるＡＴＰを示し、次いで＃６、＃４、及び＃２となった。図８Ｇ及び図８Ｈは、Ｐ４５０−ＧＬＯＣＹＰ３Ａ４（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定されたＣＹＰ３Ａ４を示す。図８Ｈでは、２０日目で、培地＃４が最高となるＣＹＰ３Ａ４レベルを示し、次いで＃６、＃１２、及び＃２となった。培地＃１、＃３、及び＃５は、１日目に低いレベルで開始し、１５日目まで徐々に低下した。培地＃１２は、１日目から２０日目まで、約１５，０００の比較的一定のレベルを示した。 図８Ａ〜図８Ｈについて、図８Ａは、微小組織の寿命への影響を調べるための維持培地処方の試験を示す概略図である。図８Ｂは、異なる維持培地処方において２１日間に亘ってスフェロイド形態を維持した様子を示す。図８Ｃは、種々の維持培地において培養されたスフェロイドの直径（ｍｍ）を示すグラフである（左側の２つのアスタリスクは、スフェロイド周辺で沈殿物の収集を行うため膨張した測定値を示し、右側の３つのアスタリスクは、良好な維持条件を示している）。図８Ｄは、条件＃６、＃８、及び＃１２におけるスフェロイド培養の画像である。図８Ｅ及び図８Ｆは、細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）３Ｄ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定されたＡＴＰレベルを示す。培地＃１２は、２０日目で最高となるＡＴＰを示し、次いで＃６、＃４、及び＃２となった。図８Ｇ及び図８Ｈは、Ｐ４５０−ＧＬＯＣＹＰ３Ａ４（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定されたＣＹＰ３Ａ４を示す。図８Ｈでは、２０日目で、培地＃４が最高となるＣＹＰ３Ａ４レベルを示し、次いで＃６、＃１２、及び＃２となった。培地＃１、＃３、及び＃５は、１日目に低いレベルで開始し、１５日目まで徐々に低下した。培地＃１２は、１日目から２０日目まで、約１５，０００の比較的一定のレベルを示した。
図９Ａ〜図９Ｃについて、図９Ａは、Ｇｒａｖｉｙ ＴＲＡＰ又はＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドプレート上におけるスフェロイドの形成を示す。図９Ｂは、指定の培地条件下におけるＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドプレート上のスフェロイド形成を示す。図９Ｃは、培地スクリーニング実験の結果のまとめを示す。培地＃１、＃２、＃３、＃５、＃９、及び＃１３は、すべて、又はほとんどすべて、悪い結果を示した。培地＃１０及び＃１１は、平均的な結果を示し、培地＃４、＃６、＃７、及び＃８は、平均的〜良好な結果を示した。培地＃１２は、実施されたすべての試験において良好な結果を示した。 図９Ａ〜図９Ｃについて、図９Ａは、Ｇｒａｖｉｙ ＴＲＡＰ又はＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドプレート上におけるスフェロイドの形成を示す。図９Ｂは、指定の培地条件下におけるＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドプレート上のスフェロイド形成を示す。図９Ｃは、培地スクリーニング実験の結果のまとめを示す。培地＃１、＃２、＃３、＃５、＃９、及び＃１３は、すべて、又はほとんどすべて、悪い結果を示した。培地＃１０及び＃１１は、平均的な結果を示し、培地＃４、＃６、＃７、及び＃８は、平均的〜良好な結果を示した。培地＃１２は、実施されたすべての試験において良好な結果を示した。 図９Ａ〜図９Ｃについて、図９Ａは、Ｇｒａｖｉｙ ＴＲＡＰ又はＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドプレート上におけるスフェロイドの形成を示す。図９Ｂは、指定の培地条件下におけるＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドプレート上のスフェロイド形成を示す。図９Ｃは、培地スクリーニング実験の結果のまとめを示す。培地＃１、＃２、＃３、＃５、＃９、及び＃１３は、すべて、又はほとんどすべて、悪い結果を示した。培地＃１０及び＃１１は、平均的な結果を示し、培地＃４、＃６、＃７、及び＃８は、平均的〜良好な結果を示した。培地＃１２は、実施されたすべての試験において良好な結果を示した。
図１０Ａ〜図１０Ｇについて、図１０Ａは、次のスフェロイド形成、寿命、及び機能への２Ｄプレーティング培地効果の特性を示す概略図である。図１０Ｂは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｃは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｄは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｅは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するためのスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｆは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するための（１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の存在下における）スフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｇは、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）（ＧＸ）又は１０％のＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）（ＣＮ）の存在下において実施されたスフェロイド形成により、プレーティング培地（ＰＭ）又はプレーティング培地２（ＰＭ２）において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、基礎ＣＹＰ３Ａ４活性を測定する機能性試験を示している。 図１０Ａ〜図１０Ｇについて、図１０Ａは、次のスフェロイド形成、寿命、及び機能への２Ｄプレーティング培地効果の特性を示す概略図である。図１０Ｂは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｃは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｄは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｅは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するためのスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｆは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するための（１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の存在下における）スフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｇは、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）（ＧＸ）又は１０％のＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）（ＣＮ）の存在下において実施されたスフェロイド形成により、プレーティング培地（ＰＭ）又はプレーティング培地２（ＰＭ２）において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、基礎ＣＹＰ３Ａ４活性を測定する機能性試験を示している。 図１０Ａ〜図１０Ｇについて、図１０Ａは、次のスフェロイド形成、寿命、及び機能への２Ｄプレーティング培地効果の特性を示す概略図である。図１０Ｂは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｃは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｄは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｅは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するためのスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｆは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するための（１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の存在下における）スフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｇは、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）（ＧＸ）又は１０％のＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）（ＣＮ）の存在下において実施されたスフェロイド形成により、プレーティング培地（ＰＭ）又はプレーティング培地２（ＰＭ２）において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、基礎ＣＹＰ３Ａ４活性を測定する機能性試験を示している。 図１０Ａ〜図１０Ｇについて、図１０Ａは、次のスフェロイド形成、寿命、及び機能への２Ｄプレーティング培地効果の特性を示す概略図である。図１０Ｂは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｃは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｄは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｅは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するためのスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｆは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するための（１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の存在下における）スフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｇは、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）（ＧＸ）又は１０％のＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）（ＣＮ）の存在下において実施されたスフェロイド形成により、プレーティング培地（ＰＭ）又はプレーティング培地２（ＰＭ２）において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、基礎ＣＹＰ３Ａ４活性を測定する機能性試験を示している。 図１０Ａ〜図１０Ｇについて、図１０Ａは、次のスフェロイド形成、寿命、及び機能への２Ｄプレーティング培地効果の特性を示す概略図である。図１０Ｂは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｃは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｄは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｅは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するためのスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｆは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するための（１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の存在下における）スフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｇは、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）（ＧＸ）又は１０％のＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）（ＣＮ）の存在下において実施されたスフェロイド形成により、プレーティング培地（ＰＭ）又はプレーティング培地２（ＰＭ２）において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、基礎ＣＹＰ３Ａ４活性を測定する機能性試験を示している。 図１０Ａ〜図１０Ｇについて、図１０Ａは、次のスフェロイド形成、寿命、及び機能への２Ｄプレーティング培地効果の特性を示す概略図である。図１０Ｂは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｃは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｄは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｅは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するためのスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｆは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するための（１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の存在下における）スフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｇは、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）（ＧＸ）又は１０％のＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）（ＣＮ）の存在下において実施されたスフェロイド形成により、プレーティング培地（ＰＭ）又はプレーティング培地２（ＰＭ２）において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、基礎ＣＹＰ３Ａ４活性を測定する機能性試験を示している。 図１０Ａ〜図１０Ｇについて、図１０Ａは、次のスフェロイド形成、寿命、及び機能への２Ｄプレーティング培地効果の特性を示す概略図である。図１０Ｂは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｃは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ウェルの丸底ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｄは、プレーティング培地（表２）又はプレーティング培地＃２（表６）のいずれかにおいて２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートにおけるスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｅは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するためのスフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｆは、いずれかのプレーティング培地処方において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、寿命を試験するための（１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の存在下における）スフェロイド形成を示す画像である。図１０Ｇは、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）（ＧＸ）又は１０％のＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）（ＣＮ）の存在下において実施されたスフェロイド形成により、プレーティング培地（ＰＭ）又はプレーティング培地２（ＰＭ２）において２Ｄ形態で事前プレーティングされた細胞を使用した、基礎ＣＹＰ３Ａ４活性を測定する機能性試験を示している。
図１１Ａ〜図１１Ｆについて、図１１Ａは、スフェロイド維持培地（ＭＭ２）と１０％ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の異なるプレート種別におけるスフェロイド形成を示す。図１１Ｂでは、ｉＣｅｌｌ肝細胞２．０スフェロイドが毛細胆管を形成する様子を示している。（左側：ヒトｉＰＳＣ由来肝臓スフェロイドのクローズアップフェーズコントラスト画像の例。右側：核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）と、毛細胆管染色（５（６）−カルボキシ−２’７’−ジクロロ−フルオレセイン二酢酸（ＣＤＣＦ）を有する染色スフェロイド（ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ）の４０μｍ断面の共焦点像。）毛細胆管の染色（白色）は、スフェロイド全体に亘って観察することができる。図１１Ｃでは、肝臓スフェロイドは、２Ｄ培養より高いレベルの尿素活性及びＣＹＰ３Ａ４活性を示す。図１１Ｄは、シトクロムＰ４５０フェーズＩ酵素活性の特徴付けを示す。２Ｄ培養に対して３Ｄ培養にてより高い活性が観察される。図１１Ｆでは、ｉＰＳＣ由来肝細胞スフェロイドは、ＣＹＰ３Ａ誘導の改善を示す。 図１１Ａ〜図１１Ｆについて、図１１Ａは、スフェロイド維持培地（ＭＭ２）と１０％ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の異なるプレート種別におけるスフェロイド形成を示す。図１１Ｂでは、ｉＣｅｌｌ肝細胞２．０スフェロイドが毛細胆管を形成する様子を示している。（左側：ヒトｉＰＳＣ由来肝臓スフェロイドのクローズアップフェーズコントラスト画像の例。右側：核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）と、毛細胆管染色（５（６）−カルボキシ−２’７’−ジクロロ−フルオレセイン二酢酸（ＣＤＣＦ）を有する染色スフェロイド（ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ）の４０μｍ断面の共焦点像。）毛細胆管の染色（白色）は、スフェロイド全体に亘って観察することができる。図１１Ｃでは、肝臓スフェロイドは、２Ｄ培養より高いレベルの尿素活性及びＣＹＰ３Ａ４活性を示す。図１１Ｄは、シトクロムＰ４５０フェーズＩ酵素活性の特徴付けを示す。２Ｄ培養に対して３Ｄ培養にてより高い活性が観察される。図１１Ｆでは、ｉＰＳＣ由来肝細胞スフェロイドは、ＣＹＰ３Ａ誘導の改善を示す。 図１１Ａ〜図１１Ｆについて、図１１Ａは、スフェロイド維持培地（ＭＭ２）と１０％ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の異なるプレート種別におけるスフェロイド形成を示す。図１１Ｂでは、ｉＣｅｌｌ肝細胞２．０スフェロイドが毛細胆管を形成する様子を示している。（左側：ヒトｉＰＳＣ由来肝臓スフェロイドのクローズアップフェーズコントラスト画像の例。右側：核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）と、毛細胆管染色（５（６）−カルボキシ−２’７’−ジクロロ−フルオレセイン二酢酸（ＣＤＣＦ）を有する染色スフェロイド（ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ）の４０μｍ断面の共焦点像。）毛細胆管の染色（白色）は、スフェロイド全体に亘って観察することができる。図１１Ｃでは、肝臓スフェロイドは、２Ｄ培養より高いレベルの尿素活性及びＣＹＰ３Ａ４活性を示す。図１１Ｄは、シトクロムＰ４５０フェーズＩ酵素活性の特徴付けを示す。２Ｄ培養に対して３Ｄ培養にてより高い活性が観察される。図１１Ｆでは、ｉＰＳＣ由来肝細胞スフェロイドは、ＣＹＰ３Ａ誘導の改善を示す。 図１１Ａ〜図１１Ｆについて、図１１Ａは、スフェロイド維持培地（ＭＭ２）と１０％ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の異なるプレート種別におけるスフェロイド形成を示す。図１１Ｂでは、ｉＣｅｌｌ肝細胞２．０スフェロイドが毛細胆管を形成する様子を示している。（左側：ヒトｉＰＳＣ由来肝臓スフェロイドのクローズアップフェーズコントラスト画像の例。右側：核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）と、毛細胆管染色（５（６）−カルボキシ−２’７’−ジクロロ−フルオレセイン二酢酸（ＣＤＣＦ）を有する染色スフェロイド（ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ）の４０μｍ断面の共焦点像。）毛細胆管の染色（白色）は、スフェロイド全体に亘って観察することができる。図１１Ｃでは、肝臓スフェロイドは、２Ｄ培養より高いレベルの尿素活性及びＣＹＰ３Ａ４活性を示す。図１１Ｄは、シトクロムＰ４５０フェーズＩ酵素活性の特徴付けを示す。２Ｄ培養に対して３Ｄ培養にてより高い活性が観察される。図１１Ｆでは、ｉＰＳＣ由来肝細胞スフェロイドは、ＣＹＰ３Ａ誘導の改善を示す。 図１１Ａ〜図１１Ｆについて、図１１Ａは、スフェロイド維持培地（ＭＭ２）と１０％ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の異なるプレート種別におけるスフェロイド形成を示す。図１１Ｂでは、ｉＣｅｌｌ肝細胞２．０スフェロイドが毛細胆管を形成する様子を示している。（左側：ヒトｉＰＳＣ由来肝臓スフェロイドのクローズアップフェーズコントラスト画像の例。右側：核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）と、毛細胆管染色（５（６）−カルボキシ−２’７’−ジクロロ−フルオレセイン二酢酸（ＣＤＣＦ）を有する染色スフェロイド（ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ）の４０μｍ断面の共焦点像。）毛細胆管の染色（白色）は、スフェロイド全体に亘って観察することができる。図１１Ｃでは、肝臓スフェロイドは、２Ｄ培養より高いレベルの尿素活性及びＣＹＰ３Ａ４活性を示す。図１１Ｄは、シトクロムＰ４５０フェーズＩ酵素活性の特徴付けを示す。２Ｄ培養に対して３Ｄ培養にてより高い活性が観察される。図１１Ｆでは、ｉＰＳＣ由来肝細胞スフェロイドは、ＣＹＰ３Ａ誘導の改善を示す。 図１１Ａ〜図１１Ｆについて、図１１Ａは、スフェロイド維持培地（ＭＭ２）と１０％ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の異なるプレート種別におけるスフェロイド形成を示す。図１１Ｂでは、ｉＣｅｌｌ肝細胞２．０スフェロイドが毛細胆管を形成する様子を示している。（左側：ヒトｉＰＳＣ由来肝臓スフェロイドのクローズアップフェーズコントラスト画像の例。右側：核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）と、毛細胆管染色（５（６）−カルボキシ−２’７’−ジクロロ−フルオレセイン二酢酸（ＣＤＣＦ）を有する染色スフェロイド（ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ）の４０μｍ断面の共焦点像。）毛細胆管の染色（白色）は、スフェロイド全体に亘って観察することができる。図１１Ｃでは、肝臓スフェロイドは、２Ｄ培養より高いレベルの尿素活性及びＣＹＰ３Ａ４活性を示す。図１１Ｄは、シトクロムＰ４５０フェーズＩ酵素活性の特徴付けを示す。２Ｄ培養に対して３Ｄ培養にてより高い活性が観察される。図１１Ｆでは、ｉＰＳＣ由来肝細胞スフェロイドは、ＣＹＰ３Ａ誘導の改善を示す。
図１２Ａ〜図１２Ｄについて、図１２Ａは、２Ｄ培養形態及び３Ｄ培養形態に対する肝毒性応答を示す。図１２Ｂは、薬物誘導型肝臓損傷（ＤＩＬＩ）のモデル化を示す。図１２Ｃは、肝毒性アッセイのミニチュア化を示す。図１２Ｄは、共培養スフェロイド形成（左側）の間に生成され、スフェロイド内の２つの細胞種別の相対的配置のビジュアル化を助けるようレンダリングする輪郭マップに変換した（右側）共焦点最大投影図である。ｉＣｅｌｌ肝細胞（明）及びｉＣｅＬＬマクロファージ（暗）が示されている。 図１２Ａ〜図１２Ｄについて、図１２Ａは、２Ｄ培養形態及び３Ｄ培養形態に対する肝毒性応答を示す。図１２Ｂは、薬物誘導型肝臓損傷（ＤＩＬＩ）のモデル化を示す。図１２Ｃは、肝毒性アッセイのミニチュア化を示す。図１２Ｄは、共培養スフェロイド形成（左側）の間に生成され、スフェロイド内の２つの細胞種別の相対的配置のビジュアル化を助けるようレンダリングする輪郭マップに変換した（右側）共焦点最大投影図である。ｉＣｅｌｌ肝細胞（明）及びｉＣｅＬＬマクロファージ（暗）が示されている。 図１２Ａ〜図１２Ｄについて、図１２Ａは、２Ｄ培養形態及び３Ｄ培養形態に対する肝毒性応答を示す。図１２Ｂは、薬物誘導型肝臓損傷（ＤＩＬＩ）のモデル化を示す。図１２Ｃは、肝毒性アッセイのミニチュア化を示す。図１２Ｄは、共培養スフェロイド形成（左側）の間に生成され、スフェロイド内の２つの細胞種別の相対的配置のビジュアル化を助けるようレンダリングする輪郭マップに変換した（右側）共焦点最大投影図である。ｉＣｅｌｌ肝細胞（明）及びｉＣｅＬＬマクロファージ（暗）が示されている。 図１２Ａ〜図１２Ｄについて、図１２Ａは、２Ｄ培養形態及び３Ｄ培養形態に対する肝毒性応答を示す。図１２Ｂは、薬物誘導型肝臓損傷（ＤＩＬＩ）のモデル化を示す。図１２Ｃは、肝毒性アッセイのミニチュア化を示す。図１２Ｄは、共培養スフェロイド形成（左側）の間に生成され、スフェロイド内の２つの細胞種別の相対的配置のビジュアル化を助けるようレンダリングする輪郭マップに変換した（右側）共焦点最大投影図である。ｉＣｅｌｌ肝細胞（明）及びｉＣｅＬＬマクロファージ（暗）が示されている。
腫瘍由来又は初代のヒト肝臓細胞モデルによる限定は、初代ヒト肝臓細胞の顕著な特徴の多くを反復する代替の幹細胞由来ヒト肝臓細胞の開発努力に拍車をかけてきた。以前の方法は、従来の２次元（２Ｄ）細胞培養において使用される幹細胞由来ヒト肝臓細胞をいかに調製するかを記述するものであった。しかしながら、これらの２Ｄ培養は、予測能力を限定するものであった。本開示は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞から３次元（３Ｄ）微小組織を作成する方法を提供することにより、現在の技術のいくつかの主要な問題を解消するものであり、ここでは、ＰＳＣ由来肝細胞には、細胞接着促進要素が補給され、非接着面上で培養されて３Ｄ微小組織を作成する。注目すべきは、本開示の方法は、例えば、胚性幹細胞又は誘導型多能性幹細胞を含む、任意の種別の多能性幹細胞に由来する肝細胞様細胞に適用されるという点である。
１つの特定の方法において、凍結保存された誘導型多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来ヒト肝細胞が原料物質として使用される。まず、細胞が従来の２Ｄ細胞培養プレート上に事前プレーティングされ、穏やかな分離及び３Ｄ微小組織の調製に先立って、細胞を解凍から回復させる。或いは、細胞は、３Ｄ微小組織の培養調製に使用される形態に直接解凍されてもよい。
次に、分離された肝細胞を細胞間接着促進要素（すなわち、細胞外基質（ＥＣＭ）たんぱく質又は組換たんぱく質誘導体）と混合した後、効率的に微小組織を形成するために非接着特性を備えた細胞培養容器にそれらを分配することで、ヒト微小組織を調製してもよい。一例として、ＰＳＣ由来肝細胞には、組換Ｉ型コラーゲンペプチド（例えば、ＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標））が補給され、細胞をコーティングして細胞間接着を向上する。
特定の実施形態において、本開示の方法は、非実質細胞による共培養又は細胞外基質等による細胞培養面のコーティングを必要としない。さらに、各細胞培養容器に播種される細胞の数を変更することにより、微小組織のサイズを調整することができる。培養において、延長期間（例えば、少なくとも３５日間）、微小組織を維持することもできる。さらに、本開示の方法によって作成された３Ｄ微小組織は、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎによる処置等に応じて、微小組織の薬物誘導型シトクロムＰ４５０活性のアッセイにより特徴付けられる生存能力及び肝特異的機能を示す。特に、３Ｄ微小組織は、従来のＰＳＣ由来肝細胞の２Ｄ培養に比して、シトクロムＰ４５０活性を増大させた。
そこで、好適な実施形態において、本開示の方法は、肝臓疾患のスペクトルに対する新たな治療の開発、予測中毒学と、線維症、脂肪症、及びウィルス感染等の疾患のインビトロモデルの作成のためのプラットフォーム確立のためのモデルシステムを含む、広域に亘る適用のための３Ｄ機能性微小組織を提供するものである。また、恐らくは肝臓機能の急性的低下、慢性的低下、又は遺伝的低下により、このような治療を必要とする被験者に対して、肝臓機能をある程度回復させるための肝細胞移植の臨床適用に使用するために、患者独自の微小組織を抽出すべく、本明細書に記載の方法を使用することができる。
Ｉ．定義
本明細書において使用される、特定要素に関する「原則的にない」という用語は、特定要素が、組成中に意図的に組み込まれておらず、及び／又は、汚染物としてのみ、又は、微量のみ存在することを意味する。従って、組成中、意図しない任意の汚染の結果として生じる特定の要素の総量は、０．０５％未満、好ましくは、０．０１％未満であればよい。特定要素が標準の分析法で検出できない量である組成が最も好ましい。
本明細書において使用される「１つ」という不定冠詞は、１つ以上を意味してもよい。クレーム中の使用において、「備える」という単語とともに使用されるとき、「１つ」という不定冠詞は、１であることもあり、１を上回る数であってもよい。
特許請求の範囲における「又は」という用語は、選択肢のみを言及することが明示的に示されない限り、又はその選択肢が互いに排他的でない限り、「及び／又は」を意味するものとして使用されるが、本開示は、選択肢のみを、また「及び／又は」を言及する定義をいずれもサポートする。本明細書において使用される「他の」は、少なくとも２つ目又はそれ以上であることを意味してもよい。
本願全体を通じて、「約」という用語は、値の判定のために採用されている装置、方法の誤差固有の変動、又は研究対象間に存在する変動を含んでいることを示すために使用される。
「細胞」という用語は、本明細書中、当分野において最も広義の意味で使用されており、多細胞生物の組織の構造単位であり、外部からそれを分離する膜構造によって包囲されており、自己複製能力を有し、それを発現するための遺伝子情報及び機構を有する生体をいう。本明細書において使用される細胞は、自然発生細胞又は人為的調整細胞（例えば、融合細胞、遺伝子組換細胞等）であってもよい。
「幹細胞」という用語は、本明細書中、好適な条件下において、多様な範囲の特殊化細胞種別に分化可能であり、他の好適な条件下においては、自己生成可能であり、原則的に分化されていない多能性状態に維持可能な細胞をいう。「幹細胞」という用語はまた、多能性細胞、多分化能細胞、前駆細胞、及び始原細胞を包含する。例として、ヒト肝細胞は、骨髄組織から得られた造血幹細胞又は間葉肝細胞、胚組織から得られた胚性幹細胞、又は胎児の生殖器組織から得られた胚生殖細胞から得ることができる。例として、多能性幹細胞は、多能性に関連付けられたある転写因子の発現により、多能性状態の再プログラミングをすることにより、体細胞から作成することもできる。これらの細胞を「誘導型多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」と称する。
「胚肝（ＥＳ）細胞」は、胚盤胞段階における内細胞塊等、早期段階の胎芽から得られるか、人工手段（例えば、核移植）によって作成された未分化多能性幹細胞であり、生殖細胞（例えば、精子及び卵子）を含む、胎芽又は成人における任意の分化された細胞種別に生じさせられ得る。
「誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、因子の組み合わせ（本明細書中、再プログラミング因子と称する）を発現することにより、又はこの発現を誘導することにより、体細胞の再プログラミングを行うことによって生成された細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、乳児、新生児、年少者、又は成人の体細胞を使用して生成可能である。ある実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用可能な因子には、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４と称することもある）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８が含まれる。いくつかの実施形態において、体細胞は、少なくとも２つの再プログラミング因子、少なくとも３つの再プログラミング因子、又は４つの再プログラミング因子を発現し、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングすることによって再プログラミングされる。
「再プログラミング」は、細胞に、同一条件下で再プログラミングを行わない場合に比べて、培養又はインビトロを問わず、少なくとも１つの新たな細胞種別の後代を形成するようにある程度まで向上された能力に対する優位性を与えるプロセスである。より具体的には、再プログラミングは、体細胞に多能性の潜在性に対する優位性を与えるプロセスである。これは、十分な増殖後、原則的にこのような後代が再プログラミング前に形成可能でなければ、ある程度の割合の後代が新たな細胞種別の表現型特性を有し、そうでなければ、新たな細胞種別の特性を有する割合が、再プログラミング前に比べてある程度高いことを意味する。ある条件下において、新たな細胞の特性を備えた後代の割合は、増加の順で好ましく、少なくとも０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、２５％以上であってもよい。
「多能性幹細胞」は、生物に好適に観察されるすべての細胞に分化される潜在性を有した幹細胞をいい、この細胞は、３つの生殖層、すなわち、内胚葉（胃の内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、又は外胚葉（表皮組織及び神経系）のうちのいずれかを表す。
本明細書において使用される「体細胞」という用語は、卵子、精子等の生殖細胞以外の任意の細胞をいい、そのＤＮＡを次世代に直接転写しないものをいう。通常、体細胞は、制限的であり、又は多能性を有さない。本明細書において使用される体細胞は、自然発生又は遺伝子組換であってもよい。
本明細書において使用される、細胞についての「改変された」という用語は、細胞ゲノムにインテグレーションされた細胞に対して外因的な少なくとも１つの遺伝子要素を備えた細胞をいう。いくつかの態様において、外因性遺伝子要素は、細胞ゲノムのランダムな位置にインテグレーション可能である。他の態様において、遺伝子要素は、ゲノムの特定部位にインテグレーションされる。例えば、遺伝子要素は、内因性配列の変化（例えば、単一のヌクレオチド位置の変化）を与える等、内因性核酸配列を入れ替える特定位置においてインテグレーションされてもよい。
培地、細胞外基質、又は培地条件との関連で使用するとき、「規定された」又は「完全規定された」という用語は、ほぼすべての成分の化学組成及び量が既知である培地、細胞外基質、又は培養条件をいう。例えば、規定された培地には、胎児ウシ血清、ウシ血清アルブミン、又はヒト血清アルブミン等、未規定の因子は含まれない。通常、規定された培地は、基礎培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭｅＭ）、Ｆ１２、又はロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０、であり、アミノ酸、ビタミン類、無機塩類、緩衝剤、酸化防止剤、及びエネルギー源を含む）を備え、この基礎培地には、組換アルブミン、化学的規定脂質、及び組換インスリンが補給される。一例として、完全規定された培地とは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地である。
本明細書において使用される「肝細胞」という用語は、形態学、マーカ発現、インビトロ機能アッセイ、及びインビボ機能アッセイによって判定される肝細胞のすべての特性を有する成熟且つ完全に機能的な肝細胞と同様に、成熟した肝細胞特性のすべてではないものの、一部を示す肝細胞様細胞を含むことが意図される。
「薬物」又は「候補化合物」という用語は、疾患と関連付けられた表現型の代替となるか、又は代替の候補である、小分子、核酸、たんぱく質、又はそれらの組み合わせを含むが、これに限定されない分子をいう。
「細胞外基質たんぱく質」という用語は、周辺細胞に構造的サポート及び生化学的サポートを提供する分子をいう。細胞外基質たんぱく質は、組換が可能であり、そのフラグメント又はペプチドもいう。例として、コラーゲンと、ヘパリン硫酸が挙げられる。
「微小組織」という用語は、密着結合等、細胞間結合によって相互結合されたヒト肝細胞の３Ｄスフェロイド細胞凝集物をいう。微小組織には、内皮細胞又はマクロファージを非限定的に含む、ヒト肝臓内に共通に見出される他の細胞種別も含まれてもよい。細胞間結合の存在は、従来既知の多数の方法、例えば、透視型電子顕微鏡により、検出可能である。本開示の方法で得られた微小組織は、肝毒性等のための肝臓の予測可能インビトロモデルとして使用されるのに好適となるサイズを有することができる。微小組織の直径は、少なくとも５０μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも１５０μｍ、少なくとも２００μｍ以上であることが好ましい。「微小組織」、「スフェロイド」、「オルガノイド」、及び「ヘプタトスフェア」は、本明細書において相互交換可能に使用される。
「３次元（３Ｄ）培養」は、生体細胞が３つの次元全てで成長させられ、それらの周辺と相互作用させられる人工環境をいう。３Ｄ培養は、バイオリアクタ、細胞がスフェロイドに成長可能な小さなカプセル、又は非接着性培養プレート等、種々の細胞培養コンテナで成長させることができる。特定の態様において、３Ｄ培養には足場がない。一方、「２次元（２Ｄ）」培養は、接着面上の単一層等の細胞培養をいう。
細胞の「原則的に非接着性の」表面とは、接着依存細胞が接着しないか、又は容易には接着しない表面をいう。いくつかの態様において、培養中の細胞の５％未満、好ましくは１％未満が非接着面に接着する。
本明細書において使用される「粘性」という用語は、２５℃における水の粘性の２倍を超える粘度等、水よりも実質的に高い粘度を有する液体に対して適用される。特定の態様において、細胞外基質たんぱく質の補給されたＰＳＣ由来肝細胞浮遊液は、２５℃における水の粘度の１．５倍未満等、２倍未満の粘度を有する。
「足場」という用語は、播種された細胞を表面上及び／又は空孔内で成長させる多孔性物質をいう。例えば、多孔性物質は、一般的なゲル化剤であり、例えば、アルギン酸塩、寒天、カラギーナン、加工ユーケマ藻類、ローカストビーンガム、グアーガム、トラガカント、アカシアガム、キサンタンガム、タラガム、ゲラン、ペクチン、及びセルロース（例えば、メチルセルロース）又はコラーゲン等の細胞外基質たんぱく質である。
ＩＩ．微小組織の作成
本開示の実施形態は、ヒト誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来肝細胞又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来肝細胞等の多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞から３Ｄ微小組織を作成する方法を提供するものである。
Ａ．多能性幹細胞由来肝細胞
本開示のある実施形態では、多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞又は初代肝細胞から３Ｄ微小組織を作成する方法及び組成を開示する。いくつかの実施形態において、肝細胞の出発集団は、誘導型多能性幹細胞及び胚性幹細胞を非限定的に含む肝細胞由来のものであってもよい。
１．多能性幹細胞
ＰＳＣ由来肝細胞の出発集団は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来とすることができる。ＥＳＣ及びｉＰＳＣの双方は、肝細胞を含む体のすべての細胞種別に分化される潜在性を保ちつつ、インビトロで長期増殖が可能である。ヒトＥＳＣ由来肝細胞及びｉＰＳＣ由来肝細胞の出発集団は、通常、ヒトの初代成人肝細胞の完全な機能スペクトルを示さない。本開示のある態様は、肝細胞分化／機能が、ｉＰＳＣの生成と同様に、すべてでなくても大部分の正常発育段階をバイパスするように、転写因子の組み合わせの発現を通じて、ヒトＥＳＣ又はｉＰＳＣから直接誘導可能なＰＳＣ由来肝細胞の出発集団に関する（米国特許第８，４８１，３１７号、米国特許公開第２０１４０２４２５９５号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２６５８３号）。
ａ．胚性幹細胞
ある態様において、肝細胞の出発集団は、胚性幹細胞に由来するものである。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内細胞塊に由来し、高いインビトロ分化能力を有する。ＥＳ細胞は、発育胎芽の外側栄養外胚葉層を除去した後、非成長細胞の支持細胞層の内側塊細胞を培養することによって分離可能である。再プレーティングされた細胞は、急増を続け、除去、分離、さらなる再プレーティングを行い、成長が可能なＥＳ細胞の新たなコロニーを作成することができる。
この未分化ＥＳ細胞を「継代培養」するプロセスは、未分化ＥＳ細胞を含有する細胞株を作成するために複数回、反復可能である（米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号、第７，０２９，９１３号）。ＥＳ細胞は、それらの多能性を維持しつつ増殖する潜在性を有する。例えば、ＥＳ細胞は、細胞分化を制御する細胞及び遺伝子の研究において有用である。ＥＳ細胞の多能性の遺伝子操作及び選択との組み合わせは、遺伝形質転換マウス、キメラマウス、及びノックアウトマウスの生成によるインビボにおける遺伝子解析研究に使用することができる。
マウスＥＳ細胞を作成する方法は周知である。１つの方法によると、マウスの１２９株から着床前胚盤胞をマウス抗血清で処置して栄養外胚葉を除去し、内細胞塊は、ウシ胎仔血清を含有する培地で化学的に非活性なマウス胚線維芽細胞の支持細胞層で培養される。発育する未分化ＥＳ細胞のコロニーが、ウシ胎仔血清の存在下においてマウス胚線維芽細胞支持細胞層上で継代培養され、ＥＳ細胞の集団を作成する。いくつかの方法によると、血清含有培養培地にサイトカイン白血病阻止因子（ＬＩＦ）を添加することにより、支持細胞層の不存在下で、マウスのＥＳ細胞を成長させることができる（Ｓｍｉｔｈ、２０００年）。他の方法によると、マウスＥＳ細胞は、骨形成たんぱく質及びＬＩＦの存在下において、無血清培地で成長可能である（Ｙｉｎｇら、２００３年）。
ヒトＥＳ細胞を作成又は導出することができる。精子及び卵子細胞の融合、核移植、病因、又はクロマチンの再プログラミングと再プログラミングされたクロマチンのプラズマ膜への組み込みにより前述の方法で胚細胞を作成することにより作成された接合体又は胚盤胞段階の哺乳類胎芽から作成可能である（Ｔｈｏｍｓｏｎ及びＭａｒｓｈａｌｌ、１９９８年。Ｒｅｕｂｉｎｏｆら、２０００年）。１つの方法によると、ヒト胚盤胞を抗ヒト血清に露出し、栄養外肺葉細胞を溶解して、マウス胚線維芽細胞の支持細胞層上で培養した内細胞塊から除去する。さらに、内細胞塊から導出した細胞の塊を化学的又は機械的に分離し、再プレーティングし、未分化形態を備えたコロニーをマイクロピペットで選択し、分離して再プレーティングする。いくつかの方法によると、ヒトＥＳ細胞は、基礎線維芽細胞成長因子の存在下において、線維芽細胞の支持細胞層上でＥＳ細胞を培養することにより、血清を伴うことなく成長させることができる（Ａｍｉｔら、２０００年）。他の方法によると、ヒトＥＳ細胞は、「調整された」培地含有基礎線維芽細胞成長因子の存在下において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はラミニン等のたんぱく質基質上で細胞を培養することにより、支持細胞層を伴うことなく成長させることができる（Ｘｕら、２００１年）。
ＥＳ細胞は、構築されたマウス細胞株及びヒト細胞株と同様に、過去に記載の方法（Ｔｈｏｍｓｏｎ及びＭａｒｓｈａｌｌ、１９９８年。Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年。Ｔｈｏｍｓｏｎ及びＯｄｏｒｉｃｏ、２０００年。米国特許第５，８４３，７８０号）により、アカゲザル及びマーモセットを含む他の生物に由来するものとすることもできる。例えば、構築されたヒトＥＳ細胞株には、ＭＡＯＩ、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４、及びＡＣＴ３０が含まれる。さらなる例として、構築されたマウスＥＳ細胞株には、マウス株１２９胎芽の内細胞塊から確立されたＣＧＲ８細胞株が含まれ、ＣＧＲ８細胞の培養が、支持細胞層を伴わず、ＬＩＦの存在下で成長可能である。
ＥＳ幹細胞は、転写因子Ｏｃｔ４、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、段階特異的胚光源ＳＳＥＡ−１、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−３、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−４、転写因子ＮＡＮＯＧ、腫瘍拒絶抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、腫瘍拒絶抗原１−８１（ＴＲＡ−１−８１）、ＳＯＸ２、又はＲＥＸ１を含むたんぱく質マーカによって検出可能である。
ｂ．誘導型多能性幹細胞
他の態様において、肝細胞の出発集団は、一般的にｉＰＳ細胞、又はｉＰＳＣと称される誘導型多能性幹細胞から導出される。多能性の誘導は、当初、マウス細胞を使用して２００６年に達成され（Ｙａｍａｎａｋａら、２００６年）、多能性に紐づけられた転写因子の導入により、体細胞の再プログラミングにより、ヒト細胞を使用して２００７年に達成された（Ｙｕら、２００７年、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年）。ｉＰＳＣを使用することにより、ＥＳ細胞の大規模な臨床使用に関連付けられた倫理的な問題及び実際的な問題の大部分を回避し、ｉＰＳＣ由来自家移植を施した患者は、移植片拒絶反応を防ぐための生涯免疫抑制療法を必要としないこともある。
ある細胞種別（生殖細胞及び除核赤血球等）を除いて、任意の細胞をｉＰＳＣの出発点として使用することができる。例えば、細胞種別は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、又は胃細胞とすることができる。Ｔ細胞も再プログラミングの体細胞源として使用してもよい（米国特許公開第２０１４０３１５３０４号、米国特許第８，７４１，６４８号）。細胞分化の程度と細胞を収集する動物の年齢とに制限はない。未分化始原細胞（体性幹細胞を含む）と最終分化成熟細胞は、本開示の方法における体細胞源として使用可能である。一実施形態において、体細胞自体は、ヒトＣＤ３４＋造血始原細胞等の血液細胞、又はヒト線維芽細胞等の皮膚細胞である。体細胞は、成人又は胎児の体細胞とすることができる。ｉＰＳＣは、ヒトＥＳ細胞を特定の細胞種別に分化し、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を含むヒトＥＳ細胞マーカを発現することが知られている条件下において、成長させることができる。
体細胞は、当業者に既知の方法を使用して、誘導型多能性幹細胞を作成するように再プログラミング可能である。当業者は、誘導型多能性幹細胞を容易に作成可能である。例えば、公開米国特許出願第２００９０２４６８７５号、公開米国特許出願第２０１０／０２１００１４号、公開米国特許出願第２０１２０２７６６３６号、米国特許第８，０５８，０６５号、米国特許第８，１２９，１８７号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０６９６６６号、及び米国特許第８，２６８，６２０号を参照されたい。これらを参照としてここに援用する。通常、核再プログラミング因子を使用して、体細胞から多能性幹細胞を作成する。いくつかの実施形態において、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８のうちの少なくとも３つ、又は少なくとも４つを利用する。他の実施形態において、Ｏｃｔ３／４と、Ｓｏｘ２と、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つとを利用する。他の実施形態において、Ｏｃｔ３／４と、Ｓｏｘ２と、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のうちの少なくとも１つとを利用する。
これらの核再プログラミング配列のマウス及びヒトのｃＤＮＡ配列は、米国特許第８，１８３，０３８号及びＷＯ２００７／０６９６６６号に言及されているＮＣＢＩ受入番号を参照して入手可能であり、これらを参照としてここに援用する。１つ以上の再プログラミング物質又はこれらの再プログラミング物質をエンコードする核酸を導入する方法は、当分野で既知であり、例えば、公開米国特許第８，０７１，３６９号、第８，２６８，６２０号、第８，６９１，５７４号、第８，７４１，６４８号、第８，５４６，１４０号、第８，９００，８７１号、及び第９，１７５，２６８号に開示されており、これらを参照としてここに援用する。
ｉＰＳＣは、一旦導出されると、多能性を維持するのに十分な培地で培養可能である。ｉＰＳＣは、米国特許第７，４４２，５４８号及び米国特許公開第２００３／０２１１６０３号に記載の通り、多能性幹細胞、より具体的には、胚性幹細胞を培養するために開発された種々の培地及び技術と併せて使用されてもよい。マウス細胞の場合、培養は、分化抑制因子としての白血病阻止因子（ＬＩＦ）を通常の培地に添加して実施される。ヒト細胞の場合、ＬＩＦの代わりに基礎線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が添加されることが望ましい。ｉＰＳＣを培養及び維持する他の方法は当業者にとって既知であり、本開示と併せて使用されてもよい。
ある実施形態において、未規定条件が使用されてもよい。例えば、多能性細胞は、肝細胞を未分化状態に維持するために、線維芽細胞支持細胞に露出された線維芽細胞支持細胞又は培地上で培養されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、支持細胞として、細胞分割を終わらせるために放射線又は抗生物質で処置したマウス胚線維芽細胞の共存下で培養される。或いは、多能性細胞は、ＴＥＳＲ（商標）培地（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ａ。Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ｂ）又はＥ８（商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地（Ｃｈｅｎら、２０１１年）等、規定のフィーダ非依存培養システムを使用して、原則的に未分化の状態で培養及び維持されてもよい。
プラスミド類は、制約された高コピー数を達成してバクテリア中のプラスミド不安定化の潜在的要因を回避すること、ヒト細胞を含む哺乳類細胞における使用に匹敵するプラスミドを選択する手段を提供すること等、多数の目的を想定して設計されてきた。ヒト細胞において使用されるプラスミドの２つの要件には特別な注目が注がれてきた。第１に、大腸菌中の維持及び発酵に適合しており、大量のＤＮＡの生産及び生成が可能である。第２に、ヒト患者及び動物における使用において、安全かつ好適である。第１の要件は、バクテリア発酵のために選択可能であり、その間、比較的容易に安定的に維持可能な高コピー数のプラスミドを要求する。第２の要件は、選択可能マーカ及び他のコーディングシーケンス等の要素に注目することを要求する。いくつかの実施形態において、マーカをエンコードするプラスミド類は、（１）高コピー数の複製源と、（２）カナマイシンによる抗生物質選択のためのｎｅｏ遺伝子を非限定的に含む選択可能なマーカと、（３）チロシナーゼエンハンサを含む転写終結配列と、（４）種々の核酸カセットの組み込みを行うマルチクローニング部位と、（５）チロシナーゼプロモータに対して作用可能に紐づけられたマーカをエンコードする核酸配列とからなる。たんぱく質をエンコードする核酸を含むための多数のプラスミドベクターが既知である。これらには、米国特許第６，１０３，４７０号、米国特許第７，５９８，３６４号、米国特許第７，９８９，４２５号、及び米国特許第６，４１６，９９８号、に開示されたベクターが非限定的に含まれ、これらを参照としてここに援用する。
エピソーム遺伝子導入システムは、プラスミド、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ）ベースエピソームベクター（米国特許第８，５４６，１４０号）、酵母ベースベクター、アデノウィルスベースベクター、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）ベースエピソームベクター、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）ベースベクター、又はレンチウィルスベクターとすることができる。ウィルス遺伝子導入システムは、ＲＮＡベース又はＤＮＡベースのウィルスベクターとすることができる（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６２９１１号、ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６９５８８号）。
ｃ．体細胞核移植により導入される胚性幹細胞
肝細胞の出発集団を導入するための多能性幹細胞は、ドナー核がスピンドルフリーの卵母細胞に転写される体細胞核移植によっても調製することができる。核移植で作成された幹細胞は、ドナー核と遺伝子的に同一である。１つの方法によると、アカゲザルの皮膚の線維芽細胞から得たドナー線維芽細胞核を、スピンドルフリー細胞質に導入し、電子融合によって分裂期ＩＩアカゲザル卵母細胞を成熟させる（Ｂｙｒｎｅら、２００７年）。融合した卵母細胞をイオノマイシンに露出することによって活性化させた後、胚盤胞段階までインキュベートする。その後、選択した胚盤胞の内細胞塊を培養して、胚性幹細胞株を作成する。胚性幹細胞株は、正常なＥＳ細胞形態を示し、種々のＥＳ細胞マーカを発現し、インビトロ及びインビボの双方で多数の細胞種別に分化する。
２．ＰＳＣ由来肝細胞のプログラミング因子
本開示のある態様は、肝細胞フォーワードプログラミングの肝細胞プログラミング因子によって作成されたｉＰＳＣ由来肝細胞の出発集団に関する。肝細胞は、細胞における肝細胞プログラミング因子のレベルを上げることにより、ＰＳＣから直接作成可能である（米国特許第８，４８１，３１７号、米国特許公開第２０１４０２４２５９５号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２６５８３号。参照としてここに援用する）。肝細胞の多数の機能は、限定的な数の肝細胞強化転写因子の関連作用により、転写レベルで制御可能である。肝細胞の分化又は機能における役割を備えた任意の転写因子を使用して、肝細胞強化転写因子、特に表１に一覧表示された遺伝子のように、本明細書に記載のＰＳＣ由来肝細胞の出発集団を作成してもよい。
例えば、表１の転写因子の組み合わせの発現を有効化することにより、多能性幹細胞から肝細胞へのフォワードプログラミングを使用してＰＳＣ由来肝細胞を得てもよい。例えば、ＰＳＣ由来肝細胞は、以下の転写因子の組み合わせに由来するものとすることができる。すなわち、ＦＯＸＡ２、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ａ、ＧＡＴＡ４、ＮＲ１Ｉ３、ＭＡＦＢ、及びＴＢＸ３である。
Ｂ．微小組織の作成方法
１．ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液
ある実施形態において、本開示は、ｉＣｅＬＬ（登録商標）肝細胞等のＰＳＣ由来肝細胞の出発細胞浮遊液から機能性３Ｄ微小組織を作成する方法を提供するものである。ＰＳＣ由来肝細胞の出発細胞浮遊液は、保存ＰＳＣ由来肝細胞の２Ｄ培養から得るか、又は凍結保存ＰＳＣ由来肝細胞から直接得ることができる。いくつかの態様において、凍結保存ＰＳＣ由来肝細胞が解凍されて細胞浮遊液が得られ、３Ｄ培養で直接培養される。或いは、凍結保存ＰＳＣ由来肝細胞が従来の２Ｄ培養で事前プレーティングされ、細胞を回復させることができる。２Ｄ培養の方法は、当分野で既知である。１つの方法によると、解凍された肝細胞をプレーティング培地（表２）等の培地に再懸濁し、細胞浮遊液を調製することができる。１つの特定の方法によると、解凍された肝細胞は、プレーティング培地２（表６において、９８％のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、ＩＸ Ｂ２７補給、０．１μｍのデキサメタゾン、２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及び２０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭからなる）に再懸濁される。例えば、約２５℃〜約４０℃の温度で、通常は、約３７℃の温度で、凍結保存細胞が解凍されてもよい。
ある態様において、本方法における出発細胞浮遊液は、少なくとも、又はおおよそ１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、１０10個，１０11個、１０12個、１０13個、又はこの範囲内で導出可能な任意の範囲の細胞を含有してもよい。開始細胞集団は、少なくとも、又はおおよそ１０個／ｍｌ、１０1個／ｍｌ、１０2個／ｍｌ、１０3個／ｍｌ、１０4個／ｍｌ、１０5個／ｍｌ、１０6個／ｍｌ、１０7個／ｍｌ、１０8個／ｍｌ、又はこの範囲内で導出可能な任意の範囲の播種密度を有してもよい。
解凍されたＰＳＣ由来肝細胞は、細胞接着性底部を備えたもの（例えば、基質でコーティングされたもの）等の細胞培養容器に播種可能である。細胞接着性培養容器は、細胞外基質（ＥＣＭ）等、細胞を接着するための任意の基質でコーティングされたものとし、容器面の細胞に対する接着性を向上させることができる。細胞を接着するために使用される基質は、幹細胞又は支持細胞（使用された場合）を貼り付けることが意図された任意の物質とすることができる。細胞を接着するための非限定的な基質として、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、ビトロネクチン、及びフィブロネクチンと、その混合物、例えば、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞から得られたたんぱく質混合物（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）及び溶解細胞膜調合液（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら、２００５年）が挙げられる。ＰＳＣ由来肝細胞は、約２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日のように、約１日〜約１５日間、凍結保存からの回復に十分な期間、培養可能である。
ＰＳＣ由来肝細胞が凍結保存から回復した後、細胞は、細胞表面から剥がされるのが好ましく、細胞分離試薬の添加等により、細胞浮遊液を得る。コロニーは、分離に好適な任意の方法で凝集細胞又は単一細胞へも分割され、これらの細胞は、その後、継代のための新たな培養コンテナに投入される。細胞の継代又は分割は、延長期間中、培養条件下で細胞を生存及び成長させることのできる技術である。細胞は、通常、約７０％〜１００％の融合性であるときに継代される。
当分野で既知の任意の細胞分離試薬を使用して、ＰＳＣ由来肝細胞を分離することができる。例えば、細胞分離試薬は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）、ＴＲＹＰＬＥ（商標）、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標）、又はトリプシンである。特に、細胞分離試薬は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）である。ある実施形態において、多能性幹細胞は、単一の個々の細胞、又は単一の個々の細胞の組み合わせ及び２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上の細胞を含む小さな細胞集合に分離されてもよい。特定の態様において、分離は、細胞の集合を妨げるものでない。
２．細胞接着促進成分による補給
ＰＳＣ由来の細胞浮遊液は一旦得られると、この細胞浮遊液には、細胞外基質たんぱく質又はそのペプチド等、細胞接着促進成分が補給される。ある態様において、補給は、細胞浮遊液がゲル化したり、粘性を増すのを防ぐために、低濃度で実施される。低率の細胞外基質たんぱく質（ＥＣＭ）は、細胞浮遊液の約５％〜約２０％等、細胞浮遊液の体積の約０．１％〜約３０％とすることができる。いくつかの実施形態において、細胞浮遊液中のＥＣＭたんぱく質総濃度は、約０．００５ｍｇ／ｍＬ〜約０．０５ｍｇ／ｍＬ等、約１ｎｇ／ｍＬ〜約０．１ｍｇ／ｍＬの範囲とすることができる。特定の実施形態において、基質補給のたんぱく質総濃度は、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）については約１５ｕｇ／ｍＬであり、ＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）については約２００ｕｇ／ｍＬである（例えば、米国第２０１２０３２９１５７号。参照としてここに援用する）。
例えば、細胞外基質成分には、以下のたんぱく質のうちの１つ以上が含まれる。フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンカリン、コンドロネクチン、リンクたんぱく質、骨シアロたんぱく質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、アンジュリン、エピリグリン、及びカリニンである。例としての方法によると、細胞浮遊液には、混合ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチン、及びヘパリン硫酸プロテオグリカン（例えば、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標））が補給される。
他の方法によると、細胞浮遊液には、５１．６ｋＤの分子量の組換ゼラチンＣＢＥ３として、米国特許出願第ＵＳ２０１３０３２９１５７号（例えば、段落［００７１］〜［００８８］）及び国際特許出願第ＷＯ２００８１０３０４１に記載のＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）等のＩ型コラーゲンの組換ペプチドが補給される。ＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）は、細胞接着を向上するアルギニン・グリシン・アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列の強化されたヒトＩ型コラーゲン（αＩチェーン）に基づく非動物組換ペプチド（ＲＣＰ）である。
細胞外基質（ＥＣＭ）たんぱく質は、天然由来であってもよく、ヒト又は動物の組織から精製されていてもよく、或いは、ＥＣＭたんぱく質は、遺伝子改変組換たんぱく質又は天然合成であってもよい。ＥＣＭたんぱく質は、総たんぱく質であってもよく、野生型又は改変型を問わず、ペプチドフラグメントの形態であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞浮遊液には、コラーゲン又は組換コラーゲンの合成生成ペプチドフラグメントが補給される。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、異種を含有しない。
細胞外基質補給は、少なくとも１つの細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを含有する。補給に使用される細胞外基質たんぱく質には、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、又はそれらの組み合わせが非限定的に含まれる。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ補給は、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）基質（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である。ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）基質は、コラーゲンＩＶ、エンタクチン、及びラミニンからなる。ＥＣＭ補給は、精製された個別ＥＣＭ成分、腫瘍細胞から導出された基底膜、又は例えば、肝臓からの導出ＥＣＭ等、組織からのＥＣＭ分離株から作成することができる。細胞外基質たんぱく質、ＥＣＭ成分、及びＥＣＭ物質は、市販のものが利用可能である。
３．非接着性細胞培養面
細胞接着促進成分の補給されたＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液は、その後、フラスコ、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、又は３８４ウェルプレート等の超低接着組織培養プレート等、細胞非付着面を備えた適切な培養容器に播種可能である。例えば、超低接着（ＵＬＡ）プレートは、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）丸底ＵＬＡプレート又はＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ（商標）ＵＬＡプレートである。超低接着プレートは、周知のものであり、市販のものが利用可能である。例えば、Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ（商標）ＵＬＡプレートは、親水性の電荷中性コーティングで非接着コーティングされた、足場のない超低接着プレートである。接着依存細胞が接着しないか、又は容易に接着しない限り、任意の細胞非付着面を採用してもよい。このような面の例として、ポリスチレン、ポリプロピレン、フルオロレジン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、ポリエステル、培養コンテナの正電荷底部等で作成された培養コンテナの底部が挙げられてもよい。
細胞を培養するために使用される培養容器は、内部で幹細胞の培養が可能である限り、フラスコ、組織培養用フラスコ、皿、ペトリ皿、組織培養用皿、マルチ皿、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバスライド、チューブ、トレイ、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバ、培養バッグ、及びローラボトルに特に限定されるものではないが、これらを含むことができる。細胞は、培養のニーズに応じて、少なくとも、又はおおよそ０．２ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍＬ、４５０ｍＬ、５００ｍＬ、５５０ｍＬ、６００ｍＬ、８００ｍＬ、１０００ｍＬ、１５００ｍＬ、又はこれらの範囲内で導出可能な任意の範囲の容量で培養されてもよい。特定の実施形態において、培養容器は、バイオリアクタであってもよく、これは、細胞が繁殖できるように、生物学的に活性な環境をサポートするエクスビボの任意の装置又はシステムであってもよい。バイオリアクタは、少なくとも、又はおおよそ２リットル、４リットル、５リットル、６リットル、８リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、５００リットル、１立方メートル、２立方メートル、４立方メートル、６立方メートル、８立方メートル、１０立方メートル、１５立方メートルの容量を有してもよく、又はこれらの範囲内で導出可能な任意の範囲であってもよい。
ある態様において、微小組織のサイズは、出発細胞の数によって判定されるであろう。使用される細胞の数は、通常、約１０００個〜約１００万個の範囲である。ある態様において、細胞浮遊液は、ウェル毎に約２，０００個〜約２０，０００個の細胞等、ウェル毎に約１００個〜約１００，０００個の細胞の細胞密度で播種可能である。例えば、ウェル毎に２，５００個の細胞を播種することにより、約２５０μｍの直径を備えた微小組織を作成することができ、ウェル毎に１５，０００個の細胞を播種することにより、約６００μｍの直径の微小組織を作成することができる。通常、細胞は、約５，０００個／ｃｍ2〜約３００，０００個／ｃｍ2の細胞等、約１，０００個／ｃｍ2〜約１，０００，０００個／ｃｍ2の細胞密度において３Ｄ形態でプレーティングされる。特定の実施形態において、６ウェル２Ｄ培養プレート（ウェル毎に約１０ｃｍ2の表面積）等、２Ｄ培養で細胞の事前プレーティングのため、細胞が、ウェル毎に約５００，０００個〜約５，０００，０００個の細胞密度で播種されてもよい。
通常、ＰＳＣ由来肝細胞は、３Ｄ微小組織を作成するのに十分な時間の長さを得るために、非接着面上で培養される。例としての方法において、肝細胞は、約４８時間等、約２４時間〜約７２時間培養され、機能性微小組織を得る。微小組織は、約２日間〜約４週間、一日おき等に、培地を新しいものに交換することによって維持される。
ある態様において、微小組織の作成に非静的培養を使用することができる。非静的培養は、例えば、プラットフォーム又は培養容器、特に大容量回転バイオリアクタを振動、回転、又は撹拌することにより、細胞を制御された移動速度に維持する任意の培養とすることができる。撹拌により、養分と細胞老廃物の循環を向上させてもよく、より均一な環境を提供することにより、細胞凝集を制御するために使用されてもよい。例えば、回転速度は、少なくとも、又は最高でも約２５ｒｐｍ、３０ｒｐｍ、３５ｒｐｍ、４０ｒｐｍ、４５ｒｐｍ、５０ｒｐｍ、７５ｒｐｍ、１００ｒｐｍ、又はこの範囲内で導出可能な任意の範囲に設定されてもよい。非静的培養中の培養時間は、少なくとも、又はおおよそ４時間、８時間、１６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、又はこの範囲内で導出可能な任意の範囲であってもよい。
肝細胞は、その成長をサポートするのに必要な養分で培養可能である。通常、細胞は、炭素源、窒素源、及びｐＨを維持する緩衝剤を含む成長培地で培養される。培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸）、ビタミン、成長因子、サイトカイン類、酸化防止物質、ピルビン酸、緩衝剤、及び無機塩も含有可能である。例として、成長培地は、幹細胞成長を促進するために、非必須アミノ酸及びビタミン等、種々の養分の補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（商標）（Ｅ８（商標））培地等の最小必須培地を含む。最小必須培地の例として、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、１９９培地、及びＦ１２培地が非限定的に挙げられる。さらに、最小必須培地には、ウマ、コウシ、又はウシ胎児血清等の添加材が補給されてもよい。或いは、培地は、無血清とすることができる。その他の場合において、成長培地には、培養中で幹細胞等の未分化細胞を成長及び維持するために最適化された、本明細書中で無血清処方と称される「ノックアウト形成代替物」を含有してもよい。ノックアウト（商標）血清代替は、例えば、米国特許出願第２００２／０７６７４７号に開示されており、これを参照としてここに援用する。ＰＳＣ由来肝細胞は、完全規定且つフィーダフリーの培地で培養される。例としての方法によると、ＰＳＣ由来肝細胞は、プレーティング培地（表２）で培養され、維持培地（表３）で維持される。１つの特定の方法によると、維持培地２におけるスフェロイドの形成及び維持（表６。オンコスタチンＭだけを伴わない、プレーティング培地２と同一の処方）に先立って、プレーティング培地２（表６。９８％ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、ＩＸ Ｂ２７補給、０．１μｍデキサメタゾン、２５μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び２０ｎｇ／ｍＬオンコスタチンＭを含有する）において解凍された肝細胞を数日間培養し、解凍から回復する。
培地は、任意の血清に対する代替物を含有してもよく、又は含有しなくてもよい。血清の代替物には、アルブミン（脂質強化アルブミン、組換アルブミン等のアルブミン置換、植物性澱粉、デキストラン類、及びたんぱく質加水分解物）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インシュリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、又はこれらの同等物を適切に含有する物質が含まれ得る。血清の代替物は、例えば、国際出願第ＷＯ９８／３０６７９号に開示の方法によって調製可能である。或いは、より簡便に、任意の市販の物質を使用することができる。市販の物質には、ノックアウト（商標）血清代替（ＫＳＲ）、化学規定脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）、及びＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）が含まれる。
他の培養条件を適切に規定することができる。例えば、培養温度は、約３０〜４０℃とすることができ、例えば、少なくとも約３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃とすることができるが、特にこれらに限定されるものではない。一実施形態において、細胞は、３７℃で培養される。ＣＯ2濃度は、約１〜１０％とすることができ、例えば、約２〜５％、又はこの範囲内で導出可能な任意の範囲とすることができる。酸素分圧は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、又はこの範囲内で導出可能な任意の範囲とすることができる。
Ｃ．微小組織の特徴付け
本開示の方法によって作成された３Ｄ微小組織の生存能力及び／又は機能性は、多数の表現型基準及び／又は機能性基準に従って査定可能である。これらの基準には、ＨＢＶ感染等のウィルス感染への感受性、発現した細胞マーカの検出又は定量化、酵素活性、及び形態学的特徴及び細胞間シグナリングの特徴付けが非限定的に含まれる。
１つの方法によると、微小組織は、初代ヒト肝細胞と同様の肝臓特異的マーカを示すことに特徴付けられる。このように発現したマーカには、アルブミン、鍵薬物代謝酵素（例えば、ＣＹＰ３Ａ４等のシトクロムＰ４５０酵素）、シグナル伝達経路成分（例えば、核受容体）、及び薬物輸送体（例えば、ＭＲＰ２）が非限定的に含まれる。例えば、Ｇｒｉｐｏｎら、２００２年、Ｐａｒｅｎｔら、２００４年を参照されたい。
従って、機能性微小組織は、オメプラゾール（ＯＭＰ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、及びリファンピシン（ＲＩＦ）等の原型的シトクロムＰ４５０誘導剤に応答する。肝臓微小組織は、長い培養期間（例えば、＞７日間、＞１４日間、＞２１日間）に対する耐性があり、そのため、例えば、内因性及び／又は代謝系機能の結果として生じる急性的毒性及び慢性的毒性のインビトロ判定に好適である。
ＩＩＩ．微小組織の使用
ある態様では、多数の重要な研究、開発、及び商用の目的のために使用可能な機能性の３Ｄ微小組織を作成する方法を提供する。本開示のある態様の方法及び組成によって作成された微小組織は、様々な適用によって使用可能である。いくつか例を挙げると、これらには、インビボにおける微小組織の移植又は着床、インビトロで抗ウィルス細胞毒性化合物、発癌性物質、突然変異原、成長／制御因子、製剤化合物等をスクリーニングすること、肝臓の疾患及び感染症のメカニズムを解明すること、薬物及び／又は成長因子が作用するメカニズムの研究、患者の癌の診断及びモニタリング、遺伝子治療、及び生物学的活性生成物の作成が非限定的に含まれる。
Ａ．試験化合物のスクリーニング
本開示の微小組織を使用して、本明細書において提供される微小組織の特性に影響を及ぼす因子（溶媒、小分子薬物、ペプチド、及びポリヌクレオチド）又は環境条件（培養条件又は操作等）をスクリーニングすることができる。
本開示の特定のスクリーニング適用は、薬剤研究の薬品試験に関連する。読者は、標準テキストであるＩｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７年を参照のこと。本開示のある態様において、薬剤処置肝細胞は、肝細胞株又は初代肝細胞上での短期培養で以前に実施された通り、標準薬物スクリーニング及び毒性アッセイのための試験細胞の役割を果たす。候補薬品の活性の査定には、通常、本開示のある態様において提供される微小組織を候補化合物と組み合わせること、（未処置細胞又は不活性化合物で処置した細胞と比較して）形態学、マーカ表現型、又は化合物に寄与する細胞の代謝活性における任意の変化を判定することと、次いで化合物の作用を観察された変化と関連付けることとを含む。化合物が肝臓細胞に対する薬理学的作用を有するように設計されるため、又はどこか他に作用を有するように設計された化合物が意図しない肝臓副作用を有することもあるため、スクリーニングが行われてもよい。２つ以上の薬物が組み合わせにより（同時又は連続して細胞と組み合わせることにより）試験可能であり、可能性のある薬剤間相互反応作用を検出する。
いくつかの適用において、化合物は、潜在的な肝毒性について最初にスクリーニングされる（Ｃａｓｔｅｌｌ他、１９９７年）。第１の例では、細胞毒性は、細胞製造率、生存、形態学、酵素の培地への漏れの影響により判定可能である。化合物が毒性を生じることなく、細胞機能（グルコネオゲネシス、尿素生成、及びプラズマたんぱく質合成等）に影響するか否かを判定するために、より詳細な解析を実施する。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、肝アイソザイム（種別Ｖ）が培養条件において安定であるため、良好なマーカであり、１２〜２４時間のインキュベート後、培養上澄みにおける再現可能な測定を可能にする。ミトコンドリアグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ及びグルタミン酸ピルビントランスアミナーゼ等の酵素の漏れも使用可能である。Ｇｏｍｅｚ−Ｌｅｃｈｏｎら（１９９６年）は、グリコーゲンを測定するマイクロアッセイを記述しており、これを使用して、幹細胞糖新生に対する薬品の作用を測定することができる。
肝毒性を評価する現在の他の方法には、アルブミン、コレステロール、及びリポプロテインの合成及び分泌と、抱合胆汁酸及びビリルビンの輸送と、尿素生成と、シトクロムＰ４５０レベル及び活性と、グルタチオンレベルと、α−グルタチオンｓ−トランスフェラーゼの放出と、ＡＴＰと、ＡＤＰと、ＡＭＰの代謝と、細胞内Ｋ＋及びＣａ２＋濃度と、核基質たんぱく質又はオリゴヌクレオソームの放出と、及びアポトーシス（細胞円形化、クロマチンの凝集、及び核フラグメント化によって示される）の誘導の判定とが含まれる。ＤＮＡ合成は、［3Ｈ］−チミジン又はＢｒｄＵ取り込みとして測定可能である。薬剤のＤＮＡ合成又は構造に対する作用は、ＤＮＡ合成又は修復を測定することにより、判定可能である。特に細胞サイクル中の未計画の時間における、又は細胞複製に必要とされるレベルを上回る［3Ｈ］−チミジン又はＢｒｄＵの取り込みは、薬物効果と一致する。望ましくない効果には、中期スプレッドで判定される、独特の割合の姉妹染色分体交換も含まれ得る。さらなる詳細については、Ｖｉｃｋｅｒｓ（１９９７年）を参照されたい。
Ｂ．肝臓の治療及び移植
本開示は、恐らくは肝臓機能の急性的低下、慢性的低下、又は遺伝的低下により、このような治療を必要とする被験者に対して、肝臓機能をある程度回復させるため、本明細書において提供される微小組織の使用も可能にする。
治療適用のために本明細書において提供される微小組織の適合性を判定するために、まず、微小組織を好適な動物モデルにおいて試験可能である。１つのレベルにおいて、インビボにおいて生存し、且つ、表現型を維持する能力について、微小組織を査定する。本明細書において提供される微小組織を、腎臓被膜下、脾臓内、又は肝小葉内等、さらなる観察に適した部位で、免疫不全動物（ＳＣＩＤマウス、又は化学的又は放射線で免疫不全にされた動物）に投与する。数日から数週間以上までの期間の後、組織を採取し、多能性幹細胞等の出発細胞種別が依然として存在するか否かについて査定する。これは、投与した細胞に検出可能なラベル（緑色蛍光たんぱく質又はβ−ガラクトシダーゼ）を提供することにより、又は投与された細胞に特有な構造性マーカを測定することにより、実施可能である。本明細書において提供される微小組織が齧歯動物モデルで試験中である場合、免疫組織化学又はヒト特異的抗体を使用したＥＬＩＳＡにより、又は増幅をヒトポリヌクレオチド配列に特異的とするプライマ及び交配条件を使用したＲＴ−ＰＣＲ解析により、投与された細胞の存在及び表現型を査定することができる。ｍＲＮＡ又はたんぱく質レベルでの遺伝子発現を査定するのに好適なマーカは、本開示の他の部分で提供する。動物モデルにおける肝細胞様細胞の運命判定に関する一般的な説明については、Ｇｒｏｍｐｅら（１９９９年）、Ｐｅｅｔｅｒｓら（１９９７年）、及びＯｈａｓｈｉら（２０００年）により提供されている。
他のレベルにおいて、完全な肝臓機能の欠落した動物において肝臓機能を回復する能力について、本明細書において提供される微小組織を査定する。Ｂｒａｕｎら（２０００年）は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のマウス遺伝形質転換における毒素誘導型肝臓疾患についてのモデルの概略を示している。Ｒｈｉｍら（１９９５年）及びＬｉｅｂｅｒら（１９９５年）は、ウロキナーゼの発現による肝臓疾患のモデルの概略を示している。Ｍｉｇｎｏｎら（１９９８年）は、細胞表面マーカＦａｓに対する抗体による肝臓疾患誘導型の概略を示している。Ｏｖｅｒｔｕｒｆら（１９９８年）は、Ｆａｈ遺伝子の標的破壊によるマウスの遺伝性チロシン血症型Ｉのモデルを開発した。これらの動物は、２（２−ニトロ−４−フルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）の供給により、欠失から救出可能ではあるが、ＮＴＢＣが中断された時、肝臓疾患が進行する。急性肝臓疾患は、９０％肝切除によってモデル化可能である（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２０００年）。急性肝臓疾患は、ガラクトサミン、ＣＣ１４、又はチオアセトアミド等の肝臓毒で動物を処置することによってもモデル化可能である。
線維症を誘導するのに十分な長さ、致死量以下の肝臓毒で動物を処置することにより、肝硬変等の慢性肝臓疾患をモデル化することができる（Ｒｕｄｏｌｐｈら、２０００年）。肝臓機能を再構築するために本明細書において提供される微小組織の能力を査定することには、細胞をこのような動物に投与することと、次いで症状の進行について動物をモニタリングし、１〜８週間以上の期間に亘って生存を判定することとが含まれる。肝臓組織に発現するマーカ、シトクロムＰ４５０活性、及びアルカリフォスファターゼ活性、ビリルビン抱合、プロトロンビン時間等の血液インジケータ、及びホストの生存を評価することにより、肝臓機能への作用を判定することができる。これらの基準に応じた生存、疾患進行、又は肝臓機能の維持におけるいずれかの改善は、治療の効果に関連し、さらなる最適化をもたらすことができる。
代謝酵素のプロファイル又は動物モデルにおける効能に応じて所望の機能特性を実証する本開示のある態様において提供される微小組織はまた、肝臓機能を損傷したヒト被験者への直接投与にも好適であり得る。止血の目的で、通常は、腹腔内の循環に十分なアクセスを有する任意の箇所に、微小組織を投与することができる。何らかの代謝機能及び解毒機能について、微小組織が胆管にアクセスを有することは好都合である。従って、微小組織は、肝臓付近（例えば、慢性肝臓疾患の処置の場合）又は脾臓付近（例えば、劇症肝不全の処置の場合）に投与される。１つの方法によると、留置カテーテルにより肝動脈又は門脈を通じて、微小組織を肝循環に投与する。微小組織が主として脾臓、肝臓、又はこれら双方の組み合わせに流入するように、門脈中のカテーテルを操作可能である。他の方法によると、標的器官付近のキャビティ内、通常は、ボーラスを低位置に保つ賦形剤又は基質内にボーラスを投入することにより、細胞を投与する。他の方法によると、肝臓又は脾臓の葉部に細胞を直接注入する。
本開示のある態様において提供される微小組織は、肝臓機能の回復又は補給を必要としている任意の被験者の治療に使用可能である。このような治療に適切であり得るヒトの症状には、任意の原因による劇症肝不全、ウィルス性肝炎、薬物誘導型肝臓損傷、肝硬変、遺伝性肝不全（ウィルソン病、ジルベール症候群、又はα１−アンチトリプシン欠乏症等）、肝胆道癌、自己免疫性肝疾患（自己免疫性慢性肝炎又は初代胆管肝硬変等）、及び結果として肝臓機能損傷を生じるその他任意の症状が含まれる。ヒトの治療のためには、投与量は、通常、約１０9〜１０12個の細胞、通常は約５×１０9〜５×１０10個の細胞であり、被験者の体重、苦痛の性質及び深刻度、及び投与した細胞の複製能に合わせて調整される。処置モード及び適切な投与量を判定する最終的な責任は、管理する臨床医にある。
Ｃ．肝臓補助装置における使用
本開示のある態様には、生体人工肝臓装置にカプセル化されるか、又はその一部である、本明細書において提供される微小組織が含まれる。Ｃｅｌｌ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１９９９年に種々の形態のカプセル化が記載されている。本開示のある態様において提供される肝細胞は、インビトロ又はインビボのいずれかで使用される、このような方法に応じてカプセル化が可能である。
臨床使用のための生体人工臓器は、長期治療の一部として、又は劇症性の肝臓障害と肝臓再構築又は肝臓移植との間の時間のブリッジとして、肝臓機能を損傷した個人をサポートするよう設計される。生体人工肝臓装置は、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（１９９９年）によって検討されており、米国特許第５，２９０，６８４号、第５，６２４，８４０号、第５，８３７，２３４号、第５，８５３，７１７号、及び第５，９３５，８４９号に例示されている。サスペンションタイプの生体人工肝臓は、プレート透析器に懸濁されるか、好適な基質にマイクロカプセル化されるか、又は細胞外基質のコーティングされたマイクロキャリアビーズに取り付けられた細胞を備える。或いは、肝細胞は、充填層内、マルチプレート平坦層内、マイクロチャンネルスクリーン上、又は中空ファイバキャピラリの周辺に投入することができる。装置は、被験者の血液を通過させる投入口及び排出口と、場合によっては細胞に養分を供給する別個のポートの組を有する。
微小組織は、前述の方法によって調製された後、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）の基質又はコラーゲン等、好適な基質上で装置内にプレーティングされる。装置の効能は、求心性フローから取り除かれた代謝と遠心性フローにおいて新たに合成されたたんぱく質の点で、求心性チャネルの血液組成を遠心性チャネルの血液組成と比較することにより、査定可能である。
この種の装置を使用して、血液等の流体を解毒することができるが、ここにおいて、この流体は、細胞に流体中の毒性を除去又は変化させる条件下において、本開示のある態様において提供される肝細胞と接触する。解毒には、通常、肝臓で処理される少なくとも１つのリガンド、代謝物、又はその他の化合物（天然又は合成を問わず）を除去すること、又は変化させることが含まれる。このような化合物には、ビリルビン、胆汁酸、尿素、ヘム、リポたんぱく質、炭水化物、トランスフェリン、ヘモペキシン、アシアログリコプロテイン、ホルモン様インシュリン及びグルカゴン、及び種々の小分子薬物が非限定的に含まれる。装置を使用して、アルブミン、急性期反応物質、及び無負荷担体たんぱく質等の合成たんぱく質で遠心性流体を強化することもできる。これら種々の機能を実施することにより、必要な量の肝臓機能を回復できるように、装置を最適化することができる。治療ケアの場面において、この装置は、幹細胞障害のある患者から得た血液を処理した後、患者にこの血液を戻す。
Ｄ．商用、治療、及び研究を目的とした流通
いくつかの実施形態において、製造、流通、又は使用を行う任意の時に存在する微小組織を含む試薬システムを提供する。これらのキットは、本開示に記載の微小組織と、多くの場合に同一のゲノムを共有する未分化多能性幹細胞又はその他の未分化細胞種別との任意の組み合わせを含有してもよい。各細胞種別は、事業関係を共有する同一の団体又は異なる団体の制御下において、ともにパッケージ化されてもよく、又は同一施設の異なるコンテナにパッケージ化されてもよく、又は異なる箇所に同一時期又は異なる時期にパッケージ化されてもよい。機構的薬物学等、所望の目的のために指示書を添えた好適なコンテナ内に医薬品組成を最適にパッケージ化してもよい。
いくつかの実施形態において、キットは、例えば、１つ以上の培地を含むことができ、微小組織作成成分が提供される。試薬システムは、適宜、水系培地又は凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化されてもよい。キットのコンテナ手段には、通常、成分が投入されてもよく、好適に等分されることが好ましい少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその他のコンテナ手段が含まれる。キット内に１つを上回る数の成分がある場合、このキットは、通常、追加成分が別途投入されてもよい第２、第３、又はその他の追加コンテナを含むことになるであろう。しかしながら、種々の組み合わせの成分が１つのバイアルに入れられてもよい。キットの成分は、乾燥粉体として提供されてもよい。試薬及び／又は成分が乾燥粉体として提供されるとき、好適な溶媒を添加することにより、この粉体を再構築することができる。溶媒も他のコンテナ手段で提供されてよいと想定される。本開示のキットはまた、通常、市販のため、キット成分を厳重に閉じ込める手段を含むであろう。このようなコンテナには、所望のバイアルを維持する射出成型又は中空成形によるプラスチックコンテナが含まれてもよい。キットにはまた、印刷形態やデジタル形態等の電子形態で、使用のための指示を含むことができる。
ＩＶ．実施例
本発明の好適な実施形態を実証するために、以下に実施例を挙げる。当業者は、以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施においてよく機能するように、本発明者によって発見された技術を表しており、従って、その実施の好適なモードとなるものであると考えられることを理解しなければならない。しかしながら、当業者は、本開示に鑑み、開示の特定の実施形態において、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、開示の特定の実施形態において多くの変更を加えることができ、以前として類似又は同様の結果を得ることができることを理解しなければならない。
実施例１−微小組織生成のためのパラメータの評価
ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等の肝細胞由来肝細胞から機能性３Ｄ微小組織を作成するために、いくつかのパラメータを評価して微小組織形成を最適化した。第１に、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞を解凍して３Ｄ場用で直接培養可能であるか、又は従来の２Ｄ培養に事前プレーティングして細胞を凍結保存から回復させなければならないかを判定した。これに応じて、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０のアリコートを解凍し、プレーティング培地（表２）で再懸濁して約１００万個／ｍＬの細胞の浮遊液を調製した後、Ｉ型コラーゲンのコーティングされた６ウェル細胞培養プレートに播種した。融合性培養が得られると（図２Ａ）、培地を細胞から除去し、３ｍＬ／ウェルのＰＢＳ（カルシウム又は塩化マグネシウムを含まない）で細胞を１度洗浄し、１ｍＬ／ウェルのＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）、トリプシン、ＴＲＹＰＬＥ（商標）、又はＡＣＣＵＭＡＸ（商標）を付与することにより、細胞を剥がした。その後、細胞浮遊液に２０％ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）を補給し、超低接着プレートに再プレーティングした。２Ｄ培養形態での事前プレーティングにより、微小組織形成を増大することが観察された。また肝細胞を細胞浮遊液に解離させるために使用した分離剤が、微小組織の作成に作用することが分かった。約４８〜７２時間後、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）又はＴＲＹＰＬＥ（商標）等、より穏やかな分離試薬で解離された細胞の方が、トリプシンで解離されたものに比べて、より効果的に微小組織を形成することが観察された（図４Ｂ）。
評価される次のパラメータは、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞への細胞外基質たんぱく質又はペプチドの補給であった。細胞浮遊液がゲル化しないように、低率の細胞外基質（ＥＣＭ）（例えば、５％、１０％、又は２０％）をｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞の細胞浮遊液に添加した（図３Ｄ）。ＥＣＭ補給を行わないｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞は微小組織の効率的な形成を行うことができなかったものの、低率での細胞外基質補給で、細胞をコーティングし、細胞間接着を促進することにより、幹細胞由来ヒト肝臓細胞からロバストな微小組織形成を促進することが分かった（図３Ｂ、図３Ｄ）。細胞外基質補給の割合による作用を判定するために、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞に、０．６２５％、１．２５％、２．５％、５％、１０％、及び２０％の体積の最終濃度（すなわち、細胞浮遊液の基質／体積の体積）でＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）を補給し、ウェル毎に２０，０００個、４０，０００個、６０，０００個、又は８０，０００個の細胞の細胞密度にて、Ｃｏｒｎｉｎｇの丸底ＵＬＡプレートでプレーティングした（図３Ａ）。２０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の補給時、５％程度の低い割合のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）又は１０％程度の低い割合の細胞ＮＥＳＴ（商標）を補給した場合であっても、すべての細胞密度で形成された微小組織が、微小組織形成を促進できることが観察された。
微小組織の形成で評価される他の因子は、低貼付培養プレートの使用であった。プレートの微小組織形成への影響を特徴付けるために、２０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）補給を伴うか、又は伴わないｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞を、３８４ウェル形態のＣｏｒｎｉｎｇ丸底ＵＬＡプレート（図３Ｂ。解凍後３日で撮影した画像）、又は９６ウェル形態のＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレート（図３Ｃ。解凍後、２日間で撮影した画像）でプレーティングした。商法の超低接着プレートにおいて２０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）を補給したｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞の培養を観察し、微小組織を作成した。
また、他のＥＣＭたんぱく質も、Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレートにおけるｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞の微小組織形成を促進した。０．１５ｍｇ／ｍＬのコラーゲン型１、０．１５ｍｇ／ｍＬのコラーゲン型３、０．１５ｍｇ／ｍＬのコラーゲン型４、０．０５ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン、０．０３ｍｇ／ｍＬのラミニン、０．０３ｍｇ／ｍＬのビトロネクチン、及び５ｍｇ／ｍＬのゼラチンの補給時、微小組織形成が観察された（図３Ｅ）。
評価された微小組織形成の最終パラメータは、各ウェルに播種された細胞の数であった。ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞を解凍し、４００個、６００個、２０００個、４５００個、１００００個、及び２３０００個等に細胞の数を変えて、超低接着プレートでの分離と再プレーティングとに先立ち、約９日間、２Ｄ培養で培養した。驚くべきことに、ウェル毎に播種される細胞の数を変更することにより、微小組織のサイズが所望のサイズに調整できることが分かった（図５）。例えば、使用される細胞外基質補給と、３Ｄ培養が開始された後に測定が行われた時点とに応じて、ウェル毎に２，５００個の細胞を播種した結果として、約２５０μｍの直径を備えた微小組織を生じ（図６Ｂ）、ウェル毎に１５，０００個の細胞を播種することにより、約５００〜６００μｍの直径の微小組織を作成する（図５Ａ及び図５Ｂ）。そこで、ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液に低率のＥＣＭたんぱく質又は組換ペプチドを補給し、超低接着培養プレートにプレーティングすることにより、３Ｄ微小組織を効率的に作成できると判定された。また、２Ｄ培養形態に凍結保存細胞の事前プレーティングを行い、次いでＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で分離することにより、３Ｄ微小組織の作成を増加させるが、これは重要でも必要でもない。
実施例２−ＰＳＣ由来肝細胞からの３Ｄ微小組織の生成
実施例１の微小組織作成におけるパラメータの評価は、ＰＳＣ由来肝細胞からの３Ｄ微小組織の作成方法の最適化をもたらす。第１に、幹細胞由来肝細胞の細胞浮遊液は、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０ユーザガイドに従ってｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞のアリコートを解凍することによって得た。解凍した肝細胞をプレーティング培地（表２）に再懸濁して約１００万個／ｍＬの細胞の細胞浮遊液を調製した。その後、幹細胞を解凍から回復させるために、細胞浮遊液を約３００万個／ウェルの細胞の細胞密度でＩ型コラーゲンコーティング６ウェル細胞培養プレートに播種した。その後、幹細胞を３７℃の５％ＣＯ2にて約３〜４時間培養した。インキュベートに続いて、６ウェル細胞培養プレートを体格面で４回振動させることにより、死んだ細胞及び破片を除去した。その後、ピペッタを使用してプレーティング培地をプレートから吸引し、３ｍＬ／ウェルの室温プレーティング培地と交換した。ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０を４日間培養し、毎日新たなプレーティング培地を供給した。その後、５日目にて、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞を維持培地で約４８時間培養した。
融合性培養が得られると（図２Ａ）、培地を細胞から取り外し、３ｍＬ／ウェルのＰＢＳ（カルシウム又は塩化マグネシウムを伴わない）で細胞を１度洗浄し、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）細胞分離試薬を添加することにより、細胞を剥がした。細胞がプレートから剥がれ始めるまで、室温で約２〜４分間、細胞をインキュベートした。次に、２ｍＬ／ウェルの維持培地（表３）又は補給済のウィリアムＥ培地（ＳＷＥ；肝細胞維持補給カクテルＢ、ペニシリン−ストレプトマイシンのカクテル溶液、ＩＴＳ＋［インシュリン、トランスフェリン、セレニウムコンプレックス、ＢＳＡ、及びリノール酸］、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、及びＨＥＰＥＳ）を補給したウィリアムＥ培地）を添加して分離試薬を希釈し、ウェル周辺で数回、ピペットで穏やかに上下させて細胞が確実に剥がれるようにし、小さな塊の細胞を伴う細胞浮遊液を生成した。細胞浮遊液を１５ｍＬチューブに移した後、ウェルを３ｍＬ／ウェルの維持培地又はＳＷＥですすぎ、これも１５ｍＬチューブに加えた。
遠心分離により、細胞組織を静かにペレット化した後、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）を補給した維持培地又はＳＷＥ（すなわち、８ｍＬの維持培地又はＳＷＥと、２ｍＬの既成のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）基質）又は細胞ＮＥＳＴ（商標）（すなわち、８ｍＬの維持培地又はＳＷＥ及び４ｍＬの細胞ＮＥＳＴ（商標））で再懸濁した。ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）基質）又は細胞ＮＥＳＴ（商標）のいずれかを補給した細胞浮遊液を、７０μＬ／ウェルの容量のＧｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ（商標）ＵＬＡ９６ウェルスフェロイドプレートで播種した。スフェロイドプレートを遠心分離して、気泡を取り除き、室温で３分間、２００×ｇにてウェルの底部に細胞を沈ませた。ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞を約４８時間培養し、機能性微小組織を得た（図２Ｂ）。
実施例３−微小組織機能の特徴付け
実施例２で作成した微小組織の生存能力を、代謝活性細胞の存在に関するマーカであるＡＴＰの定量により判定した。培地を１日おきに新たな維持培地と交換することにより、微小組織を維持した。培地を除去するために、ピペットチップをウェル底部には触れずにウェルの側面に沿って角度をつけて置き、約５〜７ｍＬの最小体積がウェルの底部に残るように、使用済みの培地を低いピペット速度（例えば、＜３０μＬ／秒）で慎重に取り除いた。その後、室温まで温めた維持培地の７０ｍＬを各ウェルに添加し、プレートを遠心分離した。
ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）３Ｄ試薬を、解凍後１０日間、２Ｄ形態で培養したｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞から作成したスフェロイドに添加し、最終体積２０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）を補給し、結果として得られた発酵シグナル（ＲＬＵ）を測定した（図７Ａ）。微小組織サイズとＡＴＰのレベルとの間に相関があり、微小組織が実際に生存可能であることを示していることを観察した。
微小組織の機能を特徴付けるために、シトクロムＰ５４０は、肝臓の腫瘍機能である薬物代謝として判定された。微小組織中のＣＹＰ酵素の活性を測定するために、最終体積２０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）を補給した６日目のスフェロイドを、約０．１〜１００μＭのオメプラゾール又は希釈剤で約２４時間、処置した。Ｐ４５０−ＧＬＯ（商標）ＣＹＰ１Ａ２基質を培養プレートに添加した後、ルシフェリン検出試薬を添加し、次いでルミノメータで焦土を測定した（図７Ｂの左側）。微小組織中のオメプラゾール誘導型ＣＹＰ１Ａ２活性が約２．５倍で観察された。また、９日目のスフェロイドを、リファンピシンで９６時間処置し、Ｐ４５０−ＧＬＯ（商標）ＣＹＰ３Ａ４アッセイでは、ほぼ３．２倍の活性誘導を示した（図７Ｂの右側）。
そして、微小組織におけるＲｉｆａｍｐｉｃｉｎによるＣＹＰ３Ａ４活性誘導型を、解凍後１４日間、２Ｄ形態で培養したｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞のＣＹＰ３Ａ４活性と比較した（図７Ｃ）。双方の培養を、試薬の添加前の約７２時間、約０．１μＭ〜約１０μＭのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎで処置した。２Ｄ培養ではＣＹＰ３Ａ４活性の約１．７倍の誘導を示したが、３Ｄ培養では、活性のほぼ３．２倍の誘導を有した。従って、微小組織の機能は、従来の２Ｄ培養と比較して著しく向上した。
実施例４−微小組織形成の最適化
微小組織形成の追加開発により、微小組織の最適な作成を行うための他のパラメータについて評価した。試験された第１のパラメータは、いずれの培地処方が、３Ｄ培養における微小組織の形態学的一体性及び機能的一体性の維持を最もよくサポートするかという点である（図８Ａ）。ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０の２Ｄ培養を原料物質として使用し、１０％の１０ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）の補給されたウィリアムＥ（ＳＷＥ）培地において約１，０００個／ウェルの細胞を使用して、９６ウェル形態（ＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレート）でスフェロイドを形成した。細胞の取り外しに先立って、解凍後の５日間、２Ｄ形態で培養し、これらをＳＷＥで再懸濁し、３Ｄ形態に再プレーティングした。３Ｄ培養の１日目、微小組織形成培地を新たに調製した微小組織試験維持培地条件（表５）と交換した。３Ｄ培養には、２１日間の経過時間全体を通じて、２〜３日ごとに指定の試験培地を与えた。形態学、サイズ、生存能力、及びＣＹＰ３Ａ４機能を含むいくつかのキーとなるパラメータの維持のため、２１日目まで数回の時点で３Ｄ培地のアッセイを行った。４、６、７、８、１２、及び１４を含む維持培地組成のいくつかでは、他の条件と比較してスフェロイド形態の改善が観察された（図８Ｂ）。スフェロイドサイズ維持の評価（図８Ｃ及び図８Ｄ）では、条件６、８、及び１２において好適な直径サイズを生じることを示した。細胞生存率の測定では、条件１２及び１４において２１日目に達するまでＡＴＰレベルを維持することを示した（図８Ｅ及び図８Ｆ）。最後に、ＣＹＰ３Ａ４レベルでは、条件４、６、７、８、及び１２において経過時間全体を通じて基礎ＣＹＰ３Ａ４活性を一定レベルに維持することを示した（図８Ｇ及び図８Ｈ）。
さらに、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）を含有した試験培地１、９、及び１２において、約１，７５０〜２，０００個／ウェルの細胞を使用して、９６ウェル又は３８４ウェルの形態（ＩｎＳｐｈｅｒｏ Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ ＵＬＡプレート又はＣｏｒｎｉｎｇ丸底ＵＬＡプレート）で、スフェロイド形成を試験した。Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰプレートは、Ｃｏｒｎｉｎｇスフェロイドプレートに比べて、３Ｄ培養１日目までのスフェロイド生成効率が高いことが分かった（図９Ａ）。また、試験培地＃１２は、厳格な３８４ウェルプレート形態において以前のＳＷＥスフェロイド形成培地条件（試験培地＃１０としても既知である）に比べてより効率的なスフェロイド形成を生じた（図９Ｂ）。まとめると、試験培地＃１２は、９６ウェル形態及び３８４ウェル形態の双方で効率的なスフェロイド形成を可能にし、スフェロイド寿命（サイズ、形態、及び＞２１日間維持される生存能力）とＣＹＰ３Ａ４機能を維持することによって実証された通り、すべての試験基準に合致した（図９Ｃ）。試験培地＃１２はまた、維持培地２（ＭＭ２）又はスフェロイド維持培地とも称され、９８％のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、ＩＸ Ｂ２７補給、０．１μｍデキサメタゾン、及び２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンからなる（表６）。
次に、ロバストなスフェロイド形成及び寿命を得るために事前プレーティングされた細胞を調製する能力について、２Ｄプレーティング培地処方を評価した（図１０Ａ）。過去に判定されたｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０プレーティング培地処方（表２）、又はオンコスタチンを１０μｇ／ｍＬ補給されたＭＭ２培地からなるプレーティング培地２（ＰＭ２）と称される新たな処方（表６）のいずれかを使用して、コラーゲンＩのコーティングされたプレート上の２Ｄ形態内に、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞をプレーティングした。培養の５日後、細胞を剥がし、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）又は１０％のＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）のいずれかからなるＥＣＭ補給を得たＭＭ２培地で再懸濁し、３Ｄ形態で再プレーティングした。その後、異なる超低接着プレートにおいて効率的にスフェロイドを形成する能力と、少なくとも１か月、スフェロイドサイズ及び形態を維持する能力について、細胞を評価した。ＰＭ２に事前プレーティングされた細胞は、９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ丸底ＵＬＡプレートにプレーティングされた時のロバストなスフェロイド、１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）又は１０％のＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）のいずれかを補給した時に形成されるスフェロイドの形成に、より高い傾向を示した（図１０Ｂ）。３８４ウェルＣｏｒｎｉｎｇの丸底ＵＬＡプレートの使用時、スフェロイドは、ＰＭ２に事前プレーティングされた細胞から１０％のＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）により最もよく形成された（図１０Ｃ）。Ｇｒａｖｉｔｙ ＴＲＡＰ９６ウェルＵＬＡプレートでは、細胞から形成されたスフェロイドを、双方のプレーティング培地処方において事前プレートした後、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）又はＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）の補給されたＭＭ２において再プレーティングした（図１０Ｄ）。寿命試験では、スフェロイド形成ステップ中にＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）が含まれる時のみ、プレーティング培地で事前プレーティングした細胞から生成されたスフェロイドが３５日目にその形態を維持できることを示した。一方、ＰＭ２で事前プレーティングされた細胞は、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）又はＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）がスフェロイド形成ステップで含まれる時、スフェロイド形態を維持する能力を増大することを示した（図１０Ｅ）。図１０Ｆはいずれかのプレーティング培地で事前プレーティングされた細胞について、スフェロイドのサイズ及び無損傷が３５日まで維持された後、スフェロイド形成ステップ中の、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）が補給される様子のクローズアップ図を提供する。基礎ＣＹＰ３Ａ４活性が３５日目まで測定される機能性試験を実施し、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）又はＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）のいずれかを補給したＭＭ２におけるスフェロイドの調製に先立ち、ＰＭ２で事前プレーティングされた細胞が最もよくそのＣＹＰ３Ａ４活性を維持したことを示した（図１０Ｇ）。従って、ＰＭ２（プレーティング培地２又は最適化２Ｄプレーティング培地とも称する）が、ロバストなスフェロイド形成及び寿命を得るために２Ｄ培養を調製するのにより好適であることが分かった。
スフェロイド形成中、スフェロイド維持培地（ＭＭ２）を使用し、異なるプレート種別及び形態でスフェロイド形成が達成可能であることを確認した（図１１Ａ）。スフェロイドは、毛細胆管を形成する能力を有することが分かった（図１１Ｂ）。スフェロイドはまた、ｉＣｅＬＬ肝細胞の２Ｄ培養及び３Ｄ培養における経時的な尿素分泌及び基礎ＣＹＰ３Ａ４活性（Ｐ４５０−ＧＬＯアッセイ）によって測定された機能上昇を示す（図１１Ｃ）。シトクロムＰ４５０酵素活性をさらに特徴付けるために、プローブ基板フェナセチン、ブプロピオン、ジクロフェナク、デキストロメトルファン、及びミダゾラムでＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２−Ｄ６、及びＣＲＰ３Ａ４／５のそれぞれのアクティビティを判定した。２時間（２Ｄ形態）又は４時間（３Ｄ形態）の最適反応時間を使用し、質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）と液体クロマトグラフィとの組み合せにより、試料を解析した（図１１Ｄ）。すべての酵素活性が３Ｄ培養で増大することが分かった。
３Ｄ肝臓スフェロイド形成はまた、異なるｉＰＳＣドナーからも試験され（図１１Ｅ）、３Ｄ肝臓スフェロイド形成が異なるｉＰＳＣドナーから生成された肝細胞を使用して達成可能であることを見出した。次に、ＭｙＣｅｌｌ肝細胞２．０から調製されたスフェロイドを、１４日目のＣＹＰ３Ａ４誘導について試験した。Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎが２Ｄ培養における１．６倍の誘導に対してスフェロイドにおけるＣＹＰ３Ａ４活性における約３．３倍誘導を生じることが観察され（図１１Ｆ）、ここでもｉＰＳＣ由来肝細胞が３Ｄ形態で培養されるとき、機能性を増大することが確認された。
次に、２Ｄ形態及び３Ｄ形態におけるｉＣｅｌｌ肝細胞の培養を、回数を変更して、ジクロフェナク、マイトマイシンＣ、及びトルカポンを含む選択化合物で処置し、肝毒性応答のアッセイを行った。露出時間が長いほど、化合物への感受性が増大することが観察された。３Ｄ培養では、従来の２Ｄ培養とは異なる機能性肝毒性応答を示した（図１２Ａ）。
肝臓スフェロイドを使用して薬物誘導型肝臓損傷をモデル化できるか否かのアッセイを行うために、ｉＣｅＬＬ肝細胞の３Ｄ培養を調製し、１４日間アセトアミノフェンで処置した（図１２Ｂ）。急性の４８時間に亘る治療時間では肝毒性作用が観察されなかったものの、露出が長くなるほど、高濃度の薬物に対する感受性を増大化させ、経時的な薬物誘導型肝臓損傷作用をモデル化するためにこれらのスフェロイド培養の適合性を確認した。また、（９６ウェルの２Ｄ形態に必要とされる約３０，０００個／ウェルの細胞に対して）５００〜２，０００個／ウェルの細胞等、比較的少量の細胞を使用して、９６ウェル形態で３Ｄ培養を調製することにより、アッセイ微小化を試験した。細胞を毒性化合物カルボニルシアニド−４−（トリフリオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）で処置し、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−ＧＬＯ３Ｄ試薬を使用してＡＴＰ判定（細胞生存率インジケータ）を実施した（図１２Ｃ）。５００個／ウェルといった少量の細胞のスフェロイドであっても、優れたＳＮ比が得られた。従って、３Ｄスフェロイドは、肝毒性の微小化を実現することができる。
最後に、細胞種別を組み合わせることにより、３Ｄスフェロイド共培養が形成されるか否かを試験した。ｉＣｅＬＬ肝細胞及びｉＣｅＬＬマクロファージをともに共培養し、ヒト肝臓様微小組織を生成した。２つの細胞種別をともに混合してスフェロイド共培養を調製するのに先立ち、ｉＣｅｌｌマクロファージを細胞トラッカレッドで染色し、ｉＣｅＬＬ肝細胞を、細胞トラッカグリーンで染色した（図１２Ｄ）。細胞種別を組み合わせることにより、共培養を形成できることが観察された。
本明細書に開示及び主張の方法はすべて、本開示に照らし合わせて過度の実験を行うことなく、実施及び実行可能である。本発明の組成及び方法を好適な実施形態の観点より説明したが、当業者にとって、本発明の概念、主旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法と、該方法のステップ又はステップのシーケンスにおいて、変更が適用されてもよいことは明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理的にも関連する薬物が本明細書に記載の薬物の代替とされてもよく、同一又は同様の結果が達成されるであろうことが明らかである。当業者にとって明らかなこのような同様の代替及び修正はすべて、添付のクレームに規定される本発明の主旨、範囲、及び概念に含まれるものとみなされる。
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米国特許第８，１２９，１８７号
米国特許第８，１８３，０３８号
米国特許第８，２６８，６２０号
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米国特許第８，５４６，１４０号
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米国特許第８，７４１，６４８号
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米国特許公開第２０１２０３２９１５７号
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米国特許公開第２０１４０２４２５９５号
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Claims (40)

  1. 多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞から微小組織を作成するインビトロ法であって、
    微小組織を得るための原則的に細胞非付着性の底部を有する超低接着プレートにおいて、１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントの存在下で、ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液を培養することを備える方法。
  2. 多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞の細胞浮遊液を得ることをさらに備える請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞浮遊液に１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを補給することをさらに備える請求項２に記載の方法。
  4. 前記培養容器は、足場又は基質の重層を備えない請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記細胞浮遊液は、粘着性ではない請求項４に記載の方法。
  6. 前記培養容器の前記底部は、凹状である請求項５に記載の方法。
  7. 前記多能性幹細胞は、ヒトである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞である請求項７に記載の方法。
  9. 前記多能性幹細胞は、誘導型多能性幹細胞である請求項７に記載の方法。
  10. 前記ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液にＰＳＣ−由来マクロファージを補給することをさらに備える請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液にＰＳＣ−由来内皮細胞を補給することをさらに備える請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液にＰＳＣ−由来マクロファージ及びＰＳＣ−由来内皮細胞を補給することをさらに備える請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記１つ以上の細胞外基質たんぱく質は、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチン、基質細胞外リン糖たんぱく質（ＭＥＰＥ）、ニドゲン−１、Ｆ−スポンジン、Ｒ−スポンジン、テネイシン、テスティカン、ビトロネクチン、及びデコリンからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
  14. 前記１つ以上の細胞外基質たんぱく質は、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチン、及びヘパリン硫酸プロテオグリカンである請求項１に記載の方法。
  15. 前記１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントは、Ｉ型コラーゲン組換ペプチドである請求項１に記載の方法。
  16. 前記１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントは、ＣＥＬＬＮＥＳＴ（商標）である請求項１に記載の方法。
  17. 前記１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントは、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）である請求項１に記載の方法。
  18. 前記１つ以上の細胞外基質たんぱく質は、組換体である請求項１又は１３に記載の方法。
  19. 前記ＰＳＣ由来肝細胞の細胞浮遊液を得ることは、
    （ｉ）凍結保存ＰＳＣ由来肝細胞を解凍することと、
    （ｉｉ）２次元（２Ｄ）培養で前記ＰＳＣ由来肝細胞を培養することと、
    （ｉｉｉ）前記ＰＳＣ由来肝細胞を細胞分離試薬で分離して細胞浮遊液を得ることとを備える請求項２に記載の方法。
  20. 前記培養することは、オンコスタチンＭの存在下において実施される請求項１９に記載の方法。
  21. 前記２次元培養は、接着面上で実施される請求項１９に記載の方法。
  22. 前記接着面は、基質である請求項２１に記載の方法。
  23. 前記基質は、少なくとも１つの細胞外基質たんぱく質を含有する請求項２２に記載の方法。
  24. 前記少なくとも１つの細胞外基質たんぱく質は、コラーゲン、ラミニン、又はフィブロネクチンである請求項２３に記載の方法。
  25. 前記細胞分離試薬は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）である請求項１９に記載の方法。
  26. 前記ＰＳＣ由来肝細胞は、原則的に単一細胞に分離されない請求項１９に記載の方法。
  27. 前記分離は、細胞のクラスタを中断させない請求項１９に記載の方法。
  28. 前記微小組織は、薬物誘導型シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）活性を有する請求項１に記載の方法。
  29. 前記ＣＹＰ活性は、ＣＹＰ１Ａ２及び／又はＣＹＰ３Ａ４の誘導により判定される請求項２８に記載の方法。
  30. 前記微小組織の前記薬物誘導型ＣＹＰ活性は、前記ＰＳＣ由来肝細胞の２Ｄ培養に比して増大させられる請求項１９に記載の方法。
  31. 前記薬物誘導型ＣＹＰ活性の増大は、少なくとも１．５倍である請求項３０に記載の方法。
  32. 前記微小組織のサイズを調整することをさらに備える請求項１に記載の方法。
  33. 前記ＰＳＣ由来肝細胞は、無血清培地又は血清限定培地において培養される請求項１に記載の方法。
  34. 前記微小組織は、少なくとも５０μｍの直径を有する請求項１に記載の方法。
  35. ３Ｄ微小組織であって、１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを補給されたＰＳＣ由来肝細胞の凝集物を含有する３Ｄ微小組織。
  36. 前記微小組織は、安定的誘導の可能なＣＹＰ発現を有する請求項３５に記載の３Ｄ微小組織。
  37. 医薬品組成であって、請求項３５に記載の機能性微小組織を含有する医薬品組成。
  38. キットであって、１つ以上の細胞外基質たんぱく質又はそのフラグメントを補給されたＰＳＣ由来肝細胞の凝集物を含有する３Ｄ微小組織を含有するキット。
  39. 前記微小組織は、培養容器上に提供される請求項３８に記載のキット。
  40. 前記培養容器は、超低接着（ＵＬＡ）プレートである請求項３９に記載のキット。
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