CN105797154B - 软骨干细胞的分离及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及软骨干细胞的分离及其应用。本发明首次利用纤连蛋白粘附法分离出软骨干细胞。本发明还提出NF‑κB信号通路是治疗骨关节炎的一个靶点，NF‑κB信号通路抑制剂是治疗骨关节炎的有效靶向药物。本发明还建立了利用BrdU‑Ki67差时双标法在体内标记活化的软骨干细胞的方法。

Description

软骨干细胞的分离及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地，本发明涉及软骨干细胞的分离及其应用。

背景技术

因外伤、肿瘤、骨关节炎引起的关节软骨缺损是临床骨科的常见疾病，由于体内关节软骨的自身修复能力极其有限，一旦发生损伤或者病变，很难自愈，甚至导致关节损坏，多需要外源性修复或启动内源性因素修复。目前临床应用较多的、效果肯定的软骨退变与缺损治疗方法是自体软骨细胞移植，但软骨细胞来源有限，体外扩增时极易反分化而丧失表型。成熟的关节软骨是一种富含细胞外基质、无血管、无神经的组织，软骨细胞只占其体积的2％-3％，其余为丰富的软骨基质，主要包括二型胶原(type Ⅱ collagen)、高分子的聚集蛋白聚糖(aggrecan)以及极度亲水的透明质酸(hyaluronic acid)。通常情况下软骨细胞不能进行有丝分裂，因而找到能在体外快速增殖、不丧失软骨细胞表型且能够分泌大量胞外基质的种子细胞是治疗软骨缺损需要解决的首要问题。

成体干细胞是存在于已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。越来越多的研究表明成体干细胞广泛存在于成体组织中，例如肝脏干细胞、表皮干细胞、造血干细胞、神经干/前体细胞、肌腱干细胞等等。对于关节软骨组织，由于其无血管结构，组织内的细胞随年龄增加逐渐减少，以及扩散型的营养供给，一直以来，普遍认为软骨组织内只有一种终末分化的细胞类型——软骨细胞，而不存在软骨前体细胞或软骨干细胞(ArticularCartilage Stem Cells，ACSCs)，即软骨组织是不可再生的组织。但近年来随着干细胞研究的飞速发展，人们认识到：一方面在骨关节炎早期，关节软骨表现出短暂的自我修复行为，包括生长因子和软骨外基质的合成增加；另一方面国际上有研究团队在体外证实了关节软骨干/前体细胞的存在，但目前关于软骨干/前体细胞的研究还仅限于体外培养并初步鉴定了这一细胞群落，并没有在体内标记出来这个细胞群落。

关于ACSCs存在的可能性的最早报道是在2001年，直到2004年，才开始有研究者将其陆续分选出来。组织特异性干细胞的存在可以为该种组织损伤后提供最为快速有效的修复途径，但是目前ACSCs在生理和病理状态下功能的报道非常少。

综上，本领域有必要针对ACSCs的分离方法及其功能进行深入的研究，以期应用于临床软骨修复、关节炎治疗等方面。

发明内容

本发明的目的在于提供软骨干细胞的分离及其应用。

在本发明的第一方面，提供NF-κB信号通路的抑制剂的用途，用于制备缓解或治疗骨关节炎的药物组合物。

在一个优选例中，所述的抑制剂选自：BAY11-7082；特异性干扰NF-κB信号通路基因表达的干扰分子；特异性结合NF-κB信号通路蛋白的抗体或配体。

在另一优选例中，所述的组合物还用于：

促进软骨干细胞的成软骨分化；较佳地，为在受炎症因子影响的环境下，促进软骨干细胞的成软骨分化；

抑制炎症因子(如IL-1β)引起的p65入核；

抑制MMP13的表达；和/或

促进软骨标志基因Sox9、ColIIa、Aggrecan、Has2的表达。

在本发明的另一方面，提供一种筛选缓解或治疗骨关节炎的潜在物质的方法，所述的方法包括：

(1)将候选物质与含有NF-κB信号通路的体系接触；

(2)检测候选物质对NF-κB信号通路的影响；

若所述候选物质抑制NF-κB信号通路或其基因或蛋白(包括其下游基因或蛋白，如MMP13)的表达或活性，则表明该候选物质是缓解或治疗骨关节炎的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到含有NF-κB信号通路的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中NF-κB信号通路或其基因或蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有NF-κB信号通路的体系；

如果与对照组相比，测试组中在统计学上NF-κB信号通路或其基因或蛋白的表达或活性受到抑制(优选显著抑制，如抑制率20％以上，较佳的抑制率50％以上；更佳的抑制率80％以上)，就表明该候选物质是缓解或治疗骨关节炎的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如内源存在NF-κB信号通路的细胞或细胞培养物)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述的体系是细胞培养物体系，所述的细胞是ACSCs，所述筛选方法还包括：在体系中加入IL-1β激活NF-κB，之后观察受激活的NF-κB信号通路或其基因或蛋白在加入候选物质后受到抑制的情况，如统计学上受到抑制(优选显著抑制，如抑制率20％以上，较佳的抑制率50％以上；更佳的抑制率80％以上)，则表明该候选物质是缓解或治疗骨关节炎的潜在物质。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述存在NF-κB信号通路或其基因或蛋白设计的小分子化合物，针对NF-κB信号通路或其基因或蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)等。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于缓解或治疗骨关节炎有用的物质。

在本发明的另一方面，提供一种分离软骨干细胞(ACSCs)的方法，所述方法包括：将关节软骨细胞(原代关节软骨细胞)接种在预先以纤连蛋白包被的培养容器内，10-60分钟后，选择贴壁的细胞，该细胞为软骨干细胞。

在一个优选中，所述的关节软骨细胞悬浮于PBS液中进行接种。

在另一优选例中，所述的原代关节软骨细胞来源于关节软骨。

在本发明的另一方面，提供5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和Ki-67的应用，用于制备体内标记软骨干细胞的试剂。

在另一优选例中，体内标记软骨干细胞包括：分析软骨干细胞处于活化态还是静息态。

在本发明的另一方面，提供一种用于体内标记软骨干细胞的试剂盒，该试剂盒中包括：

5-溴脱氧尿嘧啶核苷；

特异性抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷的抗体；

特异性抗Ki-67的抗体。

在本发明的另一方面，提供一种体内标记软骨干细胞的方法，所述方法包括：

(i)对新生动物施用(较佳地为短时高剂量使用，更佳地如在1-5天内给予40-100μg/g体重；较佳地在2-4天内给予45-60μg/g体重)5-溴脱氧尿嘧啶核苷，从而其渗入到新生动物全身细胞的基因组之中；

(ii)培养(i)的新生动物，直至渗入到体细胞内的5-溴脱氧尿嘧啶核苷稀释至无法测得，渗入到干细胞的5-溴脱氧尿嘧啶核苷可以测得；

(iii)利用特异性抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷的抗体特异性结合5-溴脱氧尿嘧啶核苷，从而标记出软骨干细胞；

(iv)利用特异性抗Ki-67的抗体特异性结合细胞的Ki-67，从而标记出处于分裂增殖状态的细胞；

(v)观测标记结果，既被标记为软骨干细胞、又被标记为处于分裂增殖状态的细胞，该软骨干细胞是活化态的软骨干细胞；被标记为软骨干细胞、但未被标记为处于分裂增殖状态的细胞，该软骨干细胞是静息态的软骨干细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、骨关节炎(OA)动物模型造模手术后不同时期，ACSCs活化情况。

A1-A4～G1-G4、免疫荧光检测Brdu和Ki67，确定造模手术后不同时间ACSCs的活化情况。

A5-G5、免疫组化染色显示在手术不同阶段关节软骨的退变程度。

H、造模手术后不同时间点，Ki67+/BrdU+细胞占BrdU+细胞的百分比。

I、OARSI评分显示OA病变程度。

其中，Con：假手术组，D2、D8...D90分别表示手术后第2天、第8天...3个月。其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.NS表示无显著性差异。

图2、ACSCs在体外的多向分化能力。

A、流式细胞检测软骨细胞(Cho)中CD90、CD44、CD45、CD31和CD34的表达水平。

B、流式细胞检测ACSCs中CD90、CD44、CD45、CD31和CD34的表达水平。

C、经过12天培养，单个ACSC可以形成大于32个细胞的单克隆细胞团。

D、成骨诱导7天后，ALP定量测定，作为成骨诱导的早期指标。

E、成骨诱导21天后，茜素红染色测定钙结节形成的量，作为成骨诱导的晚期指标。

F、成脂诱导15天后，油红-O染色测定脂滴形成的量，作为成脂诱导的指标(Cho-：关节软骨细胞正常培养；Cho+：关节软骨细胞成脂诱导培养；ACSCs+：关节软骨干细胞成脂诱导培养；BMSCs+：骨髓间充质干细胞成脂诱导培养)。

G、成软骨诱导14天后，阿辛蓝染色测定形成的软骨微团的大小，作为成软骨诱导的指标。

H、ImageJ软件统计micromass法成软骨诱导培养后软骨微团的直径。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.NS，无显著性差异。

图3、IL-1β在体外抑制ACSCs的成软骨分化。

A、在体外利用pellet方法通过加入TGF-β1诱导ACSCs的成软骨分化，并加入炎症因子IL-1β干预，观察形成软骨小球的情况。对照组(Control)加入TGF-β组但不加入IL-1β。

B、A各个培养情况下形成的软骨小球的直径。

C、甲苯胺蓝染色测定软骨小球中含有细胞外基质情况。

D、利用Q-PCR检测四个软骨标志性基因(Aggrecan、SOX9、Col2a1、Has2)在诱导过程中的表达水平。

其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.NS表示无显著性差异。

图4、IL-1β对ACSCs成软骨分化的抑制作用是呈剂量依赖的。

A、将三种浓度梯度的IL-1β(0.1、1和10ng/ml)添加到pellet诱导体系中，观察形成软骨小球的情况。对照组(Control)加入TGF-β组但不加入IL-1β。

B、A各个培养情况下形成的软骨小球的直径。T+I表示TGF-β1(10ng/mlTGFβ1)+IL-1β(0.1、1和10ng/ml)。

C、甲苯胺蓝染色测定软骨小球中含有细胞外基质情况。

D、利用Q-PCR检测四个软骨标志性基因(Aggrecan、SOX9、Col2a1、Has2)在诱导过程中的表达水平。

其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.NS表示无显著性差异。

图5、IL-1β通过上调Smad7、下调TGF-βRII来阻断TGF-β/Smad通路。

A-G、Q-PCR检测了在IL-1β的共刺激下TGF-β/Smad通路中几个关键分子的表达水平的变化。

H、Western-bloting检测TGF-βRII、Smad7的蛋白水平的变化。

其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.NS表示无显著性差异。T+I表示TGF-β1(10ng/ml TGFβ1)+IL-1β(0.1、1和10ng/ml)。

图6、BAY11-7082通过阻断NF-κB可以挽救IL-1β对ACSCs成软骨分化的抑制作用。

A、免疫荧光检测IL-1β(10ng/ml)刺激ACSCs，不同剂量BAY11-7082对于p65入核的影响。

B、BAY11-7082抑制IL-1β引起的MMP-13表达量上调(即NF-κB通路活化)。其中，I+B表示IL-1β(10ng/ml)+BAY11-7082(1，5，或10μM)。

C-E、在pellet诱导体系中分别加入TGF-β1(10ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)，以及三种不同浓度的BAY11-7082(1，5，或10μM)，通过测量pellet直径、甲苯胺蓝染色观察ACSCs成软骨分化的变化。其中，T+I表示TGF-β1(10ng/ml)+IL-1β(10ng/ml)；TIB1、5或10表示TGF-β1(10ng/ml)+IL-1β(10ng/ml)+BAY11-7082(1，5，或10μM)。

F、Q-PCR检测软骨标志基因SOX9、ColIIa、Aggrecan、Has2的表达。其中，T+I表示TGF-β1(简称TGF，10ng/ml)+IL-1β(10ng/ml)；TIB1、5或10表示TGF-β1(10ng/ml)+IL-1β(10ng/ml)+BAY11-7082(1，5，或10μM)。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.NS表示无显著性差异。

图7、原代ACSCs的制备过程示意图。

经二型胶原酶消化下的原代软骨细胞用PBS重悬，接种在预先加入纤连蛋白并4℃过夜的6孔板内，20分钟后吸走细胞悬液，已经贴壁的细胞即为ACSCs，未粘附的细胞为成熟软骨细胞。

图8、BAY11-7082抑制NF-κB通路可以促进ACSCs的活化，对OA(实验模型)有一定的治疗作用。

A1-A4～D1-D4、对照组(DMSO)中，免疫荧光检测Brdu和Ki67，确定造模手术后不同时间ACSCs的活化情况。

E1-E4～H1-H4、实验组(注射BAY11-7082，简称BAY)中，免疫荧光检测Brdu和Ki67，确定造模手术后不同时间ACSCs的活化情况。

A5-H5、免疫组化染色显示在手术不同阶段关节软骨的退变程度。

I、实验组和对照组中，造模手术后不同时间点，Ki67+/BrdU+细胞占BrdU+细胞的百分比。

J、实验组和对照组中，OARSI评分显示OA病变程度。

其中，D08、D14、D30、D90分别表示手术后第8天、第14天、1个月、3个月。其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.NS表示无显著性差异。

具体实施方式

本发明人经过系统和深入的研究，首次利用纤连蛋白粘附法分离出软骨干细胞(ACSCs)，并对其进行了系统地研究。并且，本发明人还首次发现在骨关节炎中，抑制NF-κB信号通路可以促进软骨干细胞的成软骨分化，促使软骨自我修复。因此，NF-κB信号通路是治疗骨关节炎的一个靶点。本发明还证实NF-κB信号通路抑制剂是治疗骨关节炎的有效靶向药物。

NF-κB信号通路抑制剂及其用途

如本文所用，“NF-κB信号通路”、“NF-κB通路”、“NF-κB细胞通路”可互换使用。

如本文所用，所述的“NF-κB信号通路基因或蛋白”包括NF-κB信号通路中的任何相关基因或蛋白，它们的下调可以影响NF-κB信号通路的活性。

本发明人发现，NF-κB信号通路抑制剂可以通过靶向NF-κB信号通路，显著逆转炎症因子对于关节软骨自我修复的抑制。因此，NF-κB信号通路抑制剂是很有前景的治疗软骨损伤的靶向药物。

基于本发明人的上述新发现，提供了一种NF-κB信号通路的抑制剂的用途，用于制备改善或治疗骨关节炎的组合物。

如本文所用，所述的NF-κB信号通路基因或蛋白的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。

所述的NF-κB信号通路基因或蛋白的抑制剂是指任何可降低NF-κB信号通路蛋白的活性、降低NF-κB信号通路基因或蛋白的稳定性、下调NF-κB信号通路蛋白的表达、减少NF-κB信号通路蛋白有效作用时间、或抑制NF-κB信号通路基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调NF-κB信号通路有用的物质，从而可用于改善或治疗骨关节炎。例如，所述的抑制剂可以是：小分子化合物；特异性干扰NF-κB信号通路基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异性与NF-κB信号通路蛋白结合的抗体或配体。

由TGFβ1诱导的ACSCs的pellet培养成软骨分化过程可以被炎症因子抑制，且抑制效果呈现明显的剂量依赖性。炎症因子是通过下调TGFβ的二型受体(TGFβRII)，上调Smad7，抑制TGF-β/Smad通路，进而抑制了TGFβ1的诱导作用。NF-κB信号通路抑制剂可以通过阻止炎症因子引起NF-κB通路的激活，进而阻止炎症因子对TGFβ1成软骨诱导作用的抑制，并恢复TGF-β/Smad通路的活性。

作为本发明的优选方式，所述的NF-κB信号通路抑制剂包括：BAY11-7082或其类似物。

药物筛选

在得知了NF-κB信号通路与骨关节炎的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制NF-κB信号通路的物质。可从所述的物质中找到对于改善或治疗骨关节炎真正有用的药物。

因此，本发明提供一种筛选改善或治疗骨关节炎的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理包含(表达)NF-κB信号通路的体系；和检测所述体系中NF-κB信号通路或其基因或蛋白的表达量或活性；若所述候选物质可下调NF-κB信号通路或其基因或蛋白的表达量或活性，则表明该候选物质是改善或治疗骨关节炎的潜在物质。

所述的包含NF-κB信号通路的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性包含(表达)NF-κB信号通路的细胞；或可以是重组表达NF-κB信号通路的细胞。所述的包含NF-κB信号通路的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到NF-κB信号通路或其基因或蛋白的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的包含NF-κB信号通路的体系。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于改善或治疗骨关节炎真正有用的物质。

本发明对于NF-κB信号通路蛋白的表达、活性、表达量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法等。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的改善或治疗骨关节炎的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制NF-κB信号通路的表达和活性，进而改善或治疗骨关节炎有用的物质。

分离软骨干细胞的方法

本发明人首次利用纤连蛋白粘附法分离出软骨干细胞(ACSCs)，为后续研究提供了可行的途径。

所述的方法包括：将原代关节软骨细胞接种在预先以纤连蛋白包被的培养容器内，10-60分钟(较佳地为15-30分钟)后，选择贴壁的细胞，该细胞为软骨干细胞。所述的原代关节软骨细胞来源于关节软骨。

利用所述方法，可以获得状态良好的ACSCs。本发明获得的ACSCs有很强的克隆形成能力，同时其成骨和成脂分化能力明显强于关节软骨细胞，而比骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs)弱。

在本发明的具体实施例中，本发明人应用流式细胞技术鉴定了经典的干细胞阳性marker和阴性marker在ACSCs中的表达水平；应用克隆形成率实验鉴定了ACSCs的单克隆形成能力；应用成骨、成脂及成软骨诱导鉴定了ACSCs的多向分化潜能。通过加入生长因子TGFβ1鉴定了ACSCs的成软骨分化能力。通过加入炎症因子研究了炎症环境对ACSCs成软骨分化的影响。结果显示该ACSCs是典型的、状态良好的干细胞。

体内标记软骨干细胞

本发明还首次建立了利用BrdU-Ki67差时双标法在体内标记活化的ACSCs的方法，从而可通过此标记方法在体内研究ACSCs的生物学功能。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)，活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，免疫荧光染色，显示增殖细胞。对新生的动物模型进行短时高剂量的BrdU腹腔注射，此时新生动物全身细胞均处于快速分裂期，因此理论上所有细胞都会带有BrdU标记。随着动物的不断生长，体细胞不断的进行有丝分裂、分化、凋亡，渗入到体细胞的基因组之中的BrdU逐渐被稀释，直至免疫荧光技术检测不出。但现有技术公知，成体干细胞具有维持静息态的特点，因此对于隐藏在体细胞之中的各种组织干细胞，不会像体细胞一样一直处于活跃分裂的状态，而是逐渐进入静息态，处于一种缓慢的细胞分裂状态，因此干细胞基因组中的BrdU不会被稀释。经过足够时间(如大鼠，需要至少3个月)的生长，动物长至成年后，只有组织干细胞可以用BrdU特异性抗体通过免疫荧光检测到，从而达到特异性标记ACSCs的目的。

同时，本发明人通过免疫荧光检测Ki-67来判断细胞是否处于分裂增殖状态。Ki-67是细胞自身表达的一种蛋白，仅在处于有丝分裂状态的细胞中表达。可以通过检测Ki-67来分析ACSCs是否被活化。

借助上述的BrdU-Ki67差时双标技术，本发明人已证实在关节软骨表层确实存在一群细胞周期循环缓慢的干细胞，并用纤连蛋白(fibronectin)粘附法对其成功的进行了分离鉴定。

进一步地，本发明人对已经带有BrdU标记的SD成年大鼠手术建立OA模型，并设立假手术组作为对照。对手术后指定时间点的大鼠处死后取膝关节作为样本，进行BrdU，Ki67双标的免疫荧光检测。此时ACSCs带有特异性的BrdU标记，若OA中软骨磨损使部分ACSCs由静息态转变为活化态，处于分裂增殖状态，参与到关节软骨在OA早期的自我修复过程中，则会观察到BrdU和Ki67均着色的一群细胞。未被活化仍处于静息态的ACSCs只能被检测到BrdU标记而没有Ki67。

基于上述新发现，本发明还提供了BrdU和Ki-67的应用，用于制备体内标记软骨干细胞的试剂。

基于上述新发现，本发明还提供了一种用于体内标记软骨干细胞的试剂盒，该试剂盒中包括：5-溴脱氧尿嘧啶核苷；特异性抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷的抗体；特异性抗Ki-67的抗体。所述的试剂盒中还可包括使用说明书以指导本领域技术人员使用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

1、纤连蛋白预处理6孔板

将纤连蛋白溶于含有1mM MgCl₂和1mM CaCl₂的0.1M磷酸盐缓冲液(phosphatebuffered saline，PBS，PH＝7.4)，终浓度为10mg/ml。0.22um滤器过滤除菌。超净台内按1ml/孔的量加入6孔板中，并用封口膜封住以保持无菌。平放于4℃冰箱内过夜，避免晃动，使纤连蛋白充分粘附于培养板的底部。加入细胞悬液分选前应将纤连蛋白溶液吸出，整个过程保持无菌。

2、SD大鼠原代关节软骨细胞的分离培养与原代ACSCs的分选

颈椎脱臼法处死体重为180g左右的Sprague Dawley(SD)大鼠(7周龄左右)，75％酒精浸泡5-10分钟。超净工作台内，无菌条件下分离膝关节和髋关节的软骨组织，避免取到软骨下骨，PBS清洗两遍，并切成2-3mm³大小的碎片。培养箱内用0.25％Trypsin-EDTA(GibcoTM，Invitrogen)37℃消化10mins，含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)的完全培养液终止消化并用PBS清洗两遍，以除去血清。培养箱内用0.02％的二型胶原酶消化软骨碎片5小时，期间每隔30分钟摇晃一次，以加速消化。消化下的原代关节软骨细胞用PBS重悬。

将前述消化下的细胞重悬后，接种在预先加入纤连蛋白并4℃过夜的6孔板内，20分钟后吸走细胞悬液，已经贴壁的细胞即为ACSCs，制备过程的示意图如图7。

3、关节软骨细胞与ACSCs的培养、传代、冻存、复苏

关节软骨细胞与ACSCs两种细胞的常规培养方法相同，均用含10％FBS，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素(HyClone，Logan，Utah)的DMEM/F12＝1:1(Invitrogen，Carlsbad，CA)完全培养液培养于37℃、含5％CO₂的恒温培养箱中。当细胞生长至90～95％时，吸弃培养基，用PBS清洗两次，再用0.25％Trypsin-EDTA(Gibco TM，Invitrogen)37℃消化1分钟，之后轻轻拍打培养皿至细胞全部浮起，加入适量含10％FBS的DMEM/F12＝1:1完全培养液终止反应，用移液器反复抽吸若干次，室温300g离心5分钟收集细胞，弃上清后加入含10％FBS的DMEM/F12＝1:1完全培养液重悬细胞，随后按一传三的比例分别种植于若干培养皿中。细胞冻存的程序为：消化细胞→冻存液(DMSO:DMEM/F12:FBS＝1:2:7)重悬细胞→调整细胞浓度→4℃，40mins→-20℃，15mins→-80℃，过夜后转移至液氮罐。或利用程序降温盒(使用前注入适量的异丙醇)：消化细胞→冻存液重悬细胞→调整细胞浓度→-80℃过夜→移至液氮罐。细胞复苏时，从液氮罐中取出，旋紧冻存管盖子，迅速放入37℃水浴。待到溶解，将细胞悬液吸出，缓慢加入含10％FBS的DMEM/F12＝1:1完全培养液，并不断摇晃。反复抽吸若干次，室温300g离心5mins，弃上清，用含10％FBS的DMEM/F12＝1:1完全培养液重悬沉淀细胞，种植于培养皿中。

4、关节软骨干细胞表面抗原检测

细胞选用第三代以前的ACSCs，当细胞生长至90％～95％时，吸弃培养基，用PBS清洗两次，再用0.25％Trypsin-EDTA(GibcoTM，Invitrogen)37℃消化1分钟，之后轻轻拍打培养皿至细胞全部浮起，加入适量含10％FBS的DMEM/F12＝1:1完全培养液终止反应，用移液器反复抽吸若干次，室温300g离心5分钟收集细胞，弃上清后加入PBS重悬并清洗细胞，重复两遍。调整细胞密度，5×10⁵个细胞分别和1μg的抗体在室温下孵育45分钟，注意避光。然后用1ml PBS清洗三遍，300g离心5分钟，弃上清。用300μl PBS重悬，流式细胞仪(BectonDickinson Biosciences，San Diego，CA)检测。

5、成骨诱导体系

关节软骨细胞(Cho)、关节软骨干细胞(ACSCs)与骨髓间充质干细胞(BMSCs)(常规方法获得)分别以3000个/cm²的密度接种于12孔板，所用培养液均为含10％FBS，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素(HyClone，Logan，Utah)的DMEM/F12＝1:1完全培养液。当细胞生长至80％-85％融合时，将培养基同时更换为对照培养基(含10％FBS，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素及与诱导培养液等量DMSO的DMEM/F12＝1:1完全培养液)或成骨诱导培养基(含10％FBS，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素，100nM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸钠，50μM维生素C的DMEM/F12＝1:1培养液)，每两天换液一次。连续诱导7天后，进行早期成骨重要指标—碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)定量。连续诱导21天后，进行茜素红染色，显示钙结节形成情况。

6、成软骨诱导体系(micro-mass法)

扩增至一定数量的关节软骨细胞，ACSCs和BMSCs，用0.25％Trypsin-EDTA(GibcoTM，Invitrogen)37℃消化1min，离心收集。10％FBS，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素的低糖DMEM完全培养液重悬细胞沉淀，分别调整浓度至1×10⁷个/ml。按10ul/滴的量将高密度细胞悬液接种在12孔板内，每孔3个重复。小心放于培养箱内培养3小时后，加入相应培养液：

对照组：普通对照培养液(含10％FBS，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素及与诱导培养液等量DMSO的低糖DMEM完全培养液)；

成软骨诱导组：成软骨诱导培养液(含10％FBS，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素，1％胰岛素-转铁蛋白-硒(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)，40μg/ml脯氨酸，100nM地塞米松，50μg/ml维生素C，10ng/ml TGFβ1的低糖DMEM完全培养液)；

每两天换液一次，换液时动作轻柔避免吹起细胞团块。连续培养2周，可见明显的软骨团块。进行阿辛蓝染色，观察成软骨分化情况。

7、关节软骨干细胞成软骨体系(pellet培养法)及炎症因子的干预

扩增至一定数量的ACSCs，用0.25％Trypsin-EDTA(GibcoTM，Invitrogen)37℃消化1min，离心收集。无血清低糖DMEM培养液重悬细胞沉淀，调整浓度至1×10⁶个/ml。实验分为四组：对照组，成软骨诱导组，成软骨诱导+IL-1β组，成软骨诱导+TNF-α组。分别按200μl/孔的量接种于V-形底96板(Corning，Corning，NY)内。以400g的离心力离心5mins。小心吸弃离心后上清，在细胞沉淀内分别加入各种培养液：对照组，普通对照培养液(含10％FBS，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素及与诱导培养液等量DMSO的低糖DMEM完全培养液)；成软骨诱导组，成软骨诱导培养液(含10％FBS，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素，1％胰岛素-转铁蛋白-硒(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)，40μg/ml脯氨酸，100nM地塞米松，50μg/ml维生素C，10ng/ml TGFβ1的低糖DMEM完全培养液)；成软骨诱导+IL-1β组，成软骨诱导培养液+10ng/mlIL-1β；成软骨诱导+TNF-α组，软骨诱导培养液+10ng/ml。每两天换液一次，换液时动作轻柔避免吸出细胞团块。连续培养7周，可见明显的软骨小球(pellet)。

8、BrdU-Ki67差时双标技术

对新生大鼠进行为期3天的短时高剂量(50μg/g体重)腹腔注射Brdu，并对标记效果进行鉴定，鉴定结果，新生大鼠的全身细胞的基因组均渗入了Brdu。

三个月后，对注射过Brdu的大鼠右后肢进行OA造模手术，大鼠左后肢进行假手术，作为每个时间点的阴性对照。分别在手术后第0天，第2天，第8天，第14天、1、2、3个月处死实验大鼠取样，免疫荧光检测Brdu(利用特异性抗Brdu的抗体，利用偶联有FITC的二抗检测)和Ki67(利用特异性抗Ki67的抗体，利用偶联有Cy3的二抗检测)，与假手术对照组(sham)对比，确定ACSCs是否由静息态转变为活化态。

既被标记为Brdu+、又被标记为Ki67+，该软骨干细胞是活化态的软骨干细胞；被标记为Brdu+、但Ki67-的细胞，该软骨干细胞是静息态的软骨干细胞。

9、软骨小球石蜡切片

冲洗：用PBS缓冲液体冲洗干净标本表面的培养液；固定：取材组织固定于4％多聚甲醛0.1mol/L磷酸缓冲液(ph 7.0-7.4)中12h以上(不超过24h)；冲洗：将标记的标本经流水冲洗5h以上，去除标本中的固定液成分；冲洗：将标记的标本经流水冲洗过夜(12h)，彻底去除标本中的脱钙液成分；脱水：按照以下过程梯度脱水：(1)80％酒精：2h；(2)95％酒精I：2h；(3)95％酒精II：2h；(4)100％酒精I：1h；(5)100％酒精II：1h；(6)100％酒精III：1h。二甲苯透明标本：按以下步骤：(1)二甲苯I：15min，(2)二甲苯II：15min，在透明过程中随时观察标本的透明程度，直到标本观察呈完全透明状时取出；浸蜡：透明后标本浸于60℃蜡中，时间如下：(1)石蜡I：30min；(2)石蜡II：90min；(3)石蜡III：90min；包埋及修块：常规方法包埋后，修整蜡块，分组标记；切片：做5μm的连续切片，捞片到载玻片上，将载玻片放到烤片台上60℃烤片2h或37℃过夜。

实施例1、OA后不同时间点关节软骨表面的ACSCs的活化情况

对新生SD大鼠腹腔注射BrdU，并对注射效果进行了免疫荧光检测。检测结果显示，在新生鼠膝关节和踝关节处，所有细胞均被标记上了BrdU。同时，由于此时新生鼠正处于快速生长期，全身细胞都在进行分裂增殖，所以所有细胞均可被检测出Ki67的表达。本发明人成功地构建了手术诱导大鼠膝关节骨关节炎模型。并在预设时间点取样，免疫荧光，激光共聚焦技术检测BrdU和Ki67，从而判定ACSCs的活化状态，结果发现sham组只检测到BrdU+细胞，而没有发现Ki67+细胞(图1，A1-A5)，这表明，在软骨表层前体细胞是存在的，但是处于未激活的状态(静息状态)。随着OA的病变程度加深，Ki67+细胞数量逐渐增加，在术后14天，Ki67+/BrdU+细胞占到了BrdU+细胞的65％左右(图1，B1-D5，H)。同时OARSI评分显示OA病变程度不断加深(图1I)。以上数据表明，在OA早期ACSCs会被活化，表现出增殖能力，然而，随着软骨退变加剧(D90，D30，D60)和OA评分进一步增加，Ki67+/BrdU+细胞的数量会显著减少(图1，E1-G5，H)。至术后第90天，几乎检测不到Ki67+/BrdU+细胞。

实施例2、体外分选ACSCs，鉴定其多向分化潜能

为探究ACSCs的多向分化潜能，本发明人通过纤连蛋白粘附法从大鼠关节软骨组织中分离ACSCs。软骨细胞和ACSCs的表面标记通过流式细胞术进行分析。软骨细胞(Cho)显示较低的Thy-1/CD90(glycosylphosphatidylinositol-anchored糖蛋白)(6.4％)和透明质酸受体(将CD44)(5.6％)表达水平(图2A)，而ACSCs高表达CD90(>95％)和CD44(>70％)(图2B)。CD90和CD44都是间充质干细胞(MSC)的阳性表面标记分子。造血细胞和内皮细胞标记分子，如CD31、CD34、CD45，在软骨细胞和ACSCs中几乎不表达(图2A和2B)。ACSCs高表达干细胞的阳性marker(CD90，CD44)，几乎不表达干细胞的阴性marker(CD45，CD31，CD34)。

图2C表明ACSCs具有很强的克隆形成能力，本发明人把超过32个细胞的细胞群落定义为一个单克隆。与软骨细胞相比，ACSCs具有很强的成骨、成脂分化能力，但弱于骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)(图2D-F)。然而，阿尔新蓝染色(如图2G)、测量Micromass直径(如图2H)结果显示ACSCs的成软骨分化能力远大于BM-MSCs。

这一现象表明，ACSCs具有成骨、成脂、成软骨的多向分化能力，但更倾向于向软骨分化。

实施例3、IL-1β抑制ACSCs的成软骨分化

为了研究炎症因子对ACSCs的成软骨分化的影响，本发明人在体外利用pellet方法通过加入TGF-β1诱导ACSCs的成软骨分化，并加入炎症因子IL-1β干预。对照组(TGF-β组)在连续诱导7周后出现明显的软骨小球(图3A和图3B)。甲苯胺蓝染色表明这些软骨小球中含有丰富的细胞外基质(图3C)。然而，实验组(TGF-β1与IL-1β共刺激)形成的软骨小球体积明显较对照组小。

随后，本发明人重复pellet体外诱导实验，并利用Q-PCR检测了四个软骨标志性基因(Aggrecan、SOX9、Col2a1、Has2)在诱导过程中的表达水平。Sox-9是一种在软骨细胞中高表达的转录因子，是软骨细胞的标志性基因；Col2a1、Aggrecan、Has2作为关节软骨细胞外基质的主要成分，其表达水平的高低代表软骨表型的维持情况。由此可以看出，IL-1β主要是通过抑制SOX-9、ECM(Col2a1、Aggrecan)以及相关的合酶(Has2)来抑制ACSCs的成软骨分化的(图3D)。

为了检测IL-1β的抑制效应是否是浓度依赖的，三种浓度梯度的IL-1β(0.1、1和10ng/ml)被添加到pellet诱导体系中，观察软骨小球的大小(图4A)，颗粒直径(图4B)，甲苯胺蓝染色(图4C)，和Q-PCR软骨标志基因表达分析(图4D)显示IL-1β对ACSCs成软骨分化的抑制作用是呈剂量依赖的。

实施例4、IL-1β通过下调TGFβⅡ型受体、上调Smad7来抑制TGF-β/Smad通路

为了探索在TGF-β诱导ACSCs成软骨分化以及IL-1β发挥抑制作用的过程中起到重要作用的分子，本发明人利用Q-PCR检测了在IL-1β的共刺激下TGF-β/Smad通路中几个关键分子的表达水平的变化，PAI-1是一个能直接反应TGF-β/Smad通路激活的基因，结果发现PAI-1被TGF-β1上调，IL-1β共刺激后，PAI-1被下调，并呈剂量依赖关系(图5G)。此外，TGF-β1可以上调Smad2(图5A)、Smad4(图5C)和TGF-βRI(图5E)至2-3倍，Smad3被上调30倍以上(图5B)，但IL-1β的共刺激对上述4种因子的影响没有显著变化。然而，IL-1β对TGF-βRII和Smad7具有截然相反的影响，TGF-βRII被TGF-β1上调，但被IL-1β显著下调，并呈剂量依赖(图5F)，相反，TGF-β1下调Smad7，但被IL-1β显著上调，并呈剂量依赖(图5D)。

为了确认Q-PCR的结果，本发明人利用Western-bloting检测上述因子蛋白水平的变化，和Q-PCR的结果完全一致，IL-1β是通过上调Smad7、下调TGF-βRII来阻断TGF-β/Smad通路。

实施例5、NF-κB在炎症因子抑制ACSCs成软骨分化过程中发挥重要作用

BAY11-7082(简称BAY11)是一种被广泛应用的NF-κB通路的抑制剂，本发明人用它来阻断NF-κB，从而判断IL-1β对ACSCs成软骨分化的抑制作用是否是通过激活NF-κB通路来实现的。

IL-1β(10ng/ml)刺激ACSCs后，免疫荧光结果显示，几乎所有的p65(先用特异性一抗孵育，再用带荧光标记的二抗检测，其入核代表了NF-κB的激活)均会入核(图6A)，但加入BAY11-7082后(在IL-1β之后加入)，IL-1β引起的p65入核被抑制，并呈剂量依赖，当BAY11-7082的浓度达到10μM时，p65的如何几乎被完全抑制。另外，IL-1β通过激活NF-κB显著上调MMP13(p65是激活MMP13表达的转录因子，因此MMP13做为NF-κB激活的标志性基因)，在加入BAY11-7082后，MMP13的表达被显著抑制，并呈剂量依赖关系(图6B)。本发明人在pellet诱导体系中分别加入TGF-β1(10ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)，以及三种不同浓度的BAY11-7082(1，5，和10μM)，通过测量pellet直径、台盼蓝染色可以看出TGF-β1(10ng/ml)可以诱导ACSCs的成软骨分化，而IL-1β(10ng/ml)可以阻断这一过程，在加入BAY11-7082后，可以挽救IL-1β对ACSCs成软骨分化的抑制作用，并呈剂量依赖(图6C、6D、6E)。

此外，本发明人从软骨小球中抽取总RNA，用Q-PCR检测了几个软骨标志基因(图6F)。与上述结果一致，BAY11-7082通过阻断NF-κB可以挽救IL-1β对ACSCs成软骨分化的抑制作用。

实施例6、在OA软骨中抑制NF-κB促进ACSCs的活化

为了直观地观察ACSCs在OA造模手术后各阶段的生物学行为，本发明人用免疫荧光检测BrdU和Ki67(图8A1-H4)。在OA的早期ACSCs(BrdU+)不断被激活(Ki67+/BrdU+)，对照组(注射DMSO组)在术后第14天时被激活的ACSCs数目达到最大值(图8A1-B4)，而实验组(注射BAY11-7082组)在术后第30天达到最大值(图8E1-G4)。对照组(DMSO组)在术后14天后活化的ACSCs(Ki67+/BrdU+)数目随着OA的进程不断减少，而实验组(BAY11-7082组)在术后30天后活化的ACSCs数目开始减少(图8B1-D4，G1-H4，i，j)。此外，实验组(BAY11-7082组)中ACSCs活化数目达到最大值较对照组大(图8B1-B4，G1-G4)，并且在术后第90天时仍有25％的活化细胞(Ki67+/BrdU+)(图8H1-H4，图8I)，对照组仅有7％(图8D1-D4)。实验组(BAY11-7082组)中软骨的降解以及OA的恶化程度(OARSI评分)较对照组(DMSO组)均有很大改善(图8A5-H5，图8J)。

如图8A5-H5所示，免疫荧光结果显示，在OA模型的早期(14天)ACSCs活性增强，快速增殖，使用BAY11-7082后，ACSCs活化程度更强，并且持续时间更长。因此，从免疫组化结果可以看出，使用BAY11-7082后，动物骨关节炎有很大程度地改善。

实施例7、细胞水平药物筛选

取前述制备的ACSCs细胞，用IL-1β(10ng/ml)刺激ACSCs使细胞的NF-κB信号通路活化，将该种细胞作为用于筛选抑制NF-κB信号通路的药物的细胞模型。

测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物；

对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。

在处理后适当时间，采用常规方法测定所述细胞的NF-κB信号通路的受抑制情况。如果与对照组相比，测试组中的NF-κB信号通路的活性被显著抑制，则说明该候选物质是潜在的治疗软骨损伤的物质。

采用BAY11-7082作为候选物质进行了测试，结果显示NF-κB通路的活性显著下降，从而其是潜在的治疗软骨损伤的物质。

讨论

在本发明中，首次利用纤连蛋白粘附法从大鼠膝关节和髋关节中分离出ACSCs，并对其特征做了系统地研究，包括细胞大小，形态，生长方式，干细胞阳性和阴性标志蛋白的表达情况，单克隆形成能力，以及与关节软骨细胞，BMSCs相比较的成骨，成脂，成软骨多向分化潜能。根据实验结果，ACSCs的体积明显比关节软骨细胞小，而且没有关节软骨细胞所具有的经典的多棱角形态(铺路石状)，而是呈现圆形。ACSCs在扩增过程中呈现一种关节软骨细胞所不具备的粘连状形态。而且根据本发明人的观察，ACSCs的扩增速率明显比关节软骨细胞快。作为干细胞的一种类型，ACSCs高表达干细胞的阳性marker(CD90，CD44)，几乎不表达干细胞的阴性marker(CD45，CD31，CD34)，同时具有很强的单克隆形成能力。在成骨和成脂分化实验中，ACSCs的分化潜能明显比关节软骨细胞强，但是弱于BMSCs。但是，ACSCs成软骨分化能力明显比BMSCs强，说明ACSCs的多向分化潜能并不是均衡，与其他类型的组织特异性干细胞类似，其分化成本身组织细胞的倾向要强于分化为其他类型的组织细胞。进一步提示，利用组织自身来源的干细胞，更有利于其自身的修复。

组织特异性干细胞的存在可以为该种组织损伤后提供最为快速有效的修复途径，但是目前ACSCs在生理和病理状态下功能的报道非常少。组织特异性干细胞通常处于静息态，组织外源性损伤产生的应激反应会使其活化，参与到组织修复中。值得注意的是，根据已有报道，在骨关节炎早期，关节软骨内的ACSCs数量是增加的。具体为：正常软骨中比例为6.77％，骨关节炎软骨中比例为10.16％；正常软骨中比例为3.94±2.7％，骨关节炎软骨中比例为4.57±3.1％。这提示ACSCs很可能参与到了骨关节炎早期关节软骨的自我修复中。但是至于关节软骨的这种自我修复行为逐渐消失的原因，仍然是未知的。根据本发明人的实验结果，正是在骨关节炎中期和后期可以被大量检测到的炎症因子，强烈的抑制了ACSCs参与的修复过程，使关节软骨最终走向降解。这些结果为骨关节炎早期关节软骨的自我修复行为，和最终降解提供了可能的分子机理。正常骨节软骨组织中，TGFβ1与IL-1β的作用是相互对立的，两者之间存在动态平衡，也就是TGFβ1介导的发育通路与IL-1β介导的炎性通路之间的平衡。这种平衡维持了健康关节软骨组织的正常生理代谢，但是在骨关节中，这种平衡被打破。TGFβ1可以通过下调IL-1β受体的表达量，抑制IL-1β的作用。而IL-1β则可以直接下调TGFβ1和TGFβ2。但是关于IL-1β对TGF-β/Smad通路相关因子的调节却知之甚少，尤其是在ACSCs这一较新的细胞类型中。Bauge等在软骨细胞中证实了IL-1β对TGF-β/Smad通路的抑制作用。在ACSCs中，本发明人发现炎症因子IL-1β可以在mRNA和蛋白水平上调Smad7，下调TGFβRII，从而抑制TGF-β/Smad通路。为了确定IL-1β是否通过NF-κB通路调节Smad7和TGFβRII，本发明人加入了NF-κB通路的特异性抑制剂BAY11-7082。结果发现，加入BAY11-7082抑制NF-κB通路后，IL-1β对Smad7和TGFβRII的调节作用逐渐消失。综上所述，炎症因子IL-1β首先激活NF-κB通路，激活后的NF-κB通路可以上调TGF-β/Smad通路中的抑制性因子Smad7，同时下调TGF-β/Smad通路中的促进性因子TGFβRII，降低TGF-β/Smad通路活性，以此抑制TGFβ1的作用，也就抑制了ACSCs的成软骨分化。这一有序的分子机理过程，解释了炎症因子使关节软骨自我修复逐渐消失的现象。

更为重要的是，根据本发明人的实验结果，结合已有的文献报道，本发明人提出了一个崭新的理论：“在某些病理进程中，炎症因子或者炎性通路往往通过两个途径发挥他们的作用：①促进有害的进程，②抑制有益的进程”。这一理论不仅可以为骨科疾病，而且可以为许多类型的其他疾病提供新的视角和研究思路。比如在骨质疏松或骨硬化的病理进程中，此前的研究主要集中于炎症因子可以激活NF-κB通路，进而促进破骨细胞的分化成熟(按照上述提出的理论，这是炎症因子的第①个功能)。但是，直到2009年，Jia Chang的研究指出炎症因子激活NF-κB通路后，也可以抑制成骨细胞的功能(按照上述提出的理论，这是炎症因子的第②个功能)，以此抑制骨形成。因此，参照上述新理论的思路，本发明人试图总结出炎症因子在骨关节炎病理进程中相似的两方面作用。已经有大量报道，骨关节炎中炎症因子可以诱导产生MMPs，ADAMTS和ADAMS，这三类因子是降解软骨主要蛋白酶。按照本发明人提出的理论，这是炎症因子在骨关节炎病理进程中的第①个功能。ACSCs作为一类比较新的细胞类型，为研究骨关节炎的病理进程提供了新的思路，尤其是骨关节炎早期关节软骨自我修复的分子机理，炎症因子对ACSCs生物学行为的影响，以及骨关节炎病理进程中发育通路与炎症通路之间的“对话”(Crosstalk)。根据已有报道，炎症因子可以抑制软骨基质的合成，而且炎症因子通过激活NF-κB通路，可以抑制两种对于软骨分化和表现维持很重要的因子SOX9和MyoD的表达。在此基础之上，N.Wehling等证明炎症因子可以通过NF-κB通路抑制人源BMSCs的成软骨分化。而本发明证明炎症因子可以通过NF-κB通路抑制ACScs的成软骨分化，从而抑制骨关节炎早期关节软骨的自我修复。按照前述提出的理论，这是炎症因子在骨关节炎病理进程中的第②个功能。

综上所述，在骨关节炎病理进程中，炎症因子通过两个途径发挥作用：①促进有害的进程，诱导产生MMPs，ADAMTS和ADAMS；②抑制有益的进程，抑制ACScs的成软骨分化，抑制骨关节炎早期关节软骨的自我修复。在骨关节炎研究中，大部分报道集中于炎症因子的第①项功能，对于其第②项功能，本研究尚属首次。临床治疗中，修复软骨损伤的主要手段是收集病人的BMSCs，在体外培养成软骨块，然后移植到软骨损伤部位。或者直接将高密度的BMSCs细胞悬液注射到软骨损伤部位，使其在损伤部位直接分化成软骨组织。但是这两种治疗手段都依赖外源性的细胞类型，都必须进行手术干预。ACSCs的存在为软骨损伤修复提供了新的希望。将来可能不必依赖外源性的细胞类型，而使用内源性的ACSCs，不必进行手术干预，而仅仅依靠药物刺激，就达到软骨修复的目的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.5-溴脱氧尿嘧啶核苷、特异性抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷的抗体、特异性抗Ki-67的抗体和纤连蛋白的应用，用于制备利用下述方法进行体内标记和分离关节软骨干细胞的试剂：

(i)对新生动物施用5-溴脱氧尿嘧啶核苷，从而其渗入到新生动物全身细胞的基因组之中；

(ii)培养(i)的新生动物，直至渗入到体细胞内的5-溴脱氧尿嘧啶核苷稀释至无法测得，渗入到干细胞的5-溴脱氧尿嘧啶核苷可以测得；

(iii)动物长至成年后，利用特异性抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷的抗体特异性结合5-溴脱氧尿嘧啶核苷，从而标记出关节软骨干细胞；利用特异性抗Ki-67的抗体特异性结合细胞的Ki-67，从而标记出处于分裂增殖状态的细胞；

(iv)观测标记结果，既被标记为关节软骨干细胞、又被标记为处于分裂增殖状态的细胞，该关节软骨干细胞是活化态的关节软骨干细胞；被标记为关节软骨干细胞、但未被标记为处于分裂增殖状态的细胞，该软骨干细胞是静息态的关节软骨干细胞；和

(v)用纤连蛋白粘附法对关节软骨干细胞进行分离鉴定。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的动物为大鼠，所述的动物长至成年后，为动物生长3个月后。

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