KR102199048B1 - 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체로 구성된 건병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 포함하는 줄기세포의 증식 또는 이동성 향상용 조성물, 상기 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식 또는 이동성 향상방법 및 상기 방법에 의해 얻어진 증식 또는 이동성이 향상된 줄기세포, 및 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체는 동시 처리를 통해 건유래 줄기세포의 증식 및 이동성을 향상시키며 비정상적인 변질로 인한 석회화 건염 및 지방 변성 등의 부작용을 억제하여 건병증의 치료효과를 높일 수 있는바, 건병증 치료법 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체로 구성된 건병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating tendinosis containing bone marrow aspirate concentrates-platelet-rich plasma complex}

본 발명은 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체로 구성된 줄기세포의 증식 또는 이동성 향상용 조성물, 상기 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식 또는 이동성 향상방법 및 상기 방법에 의해 얻어진 증식 또는 이동성이 향상된 줄기세포, 및 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

건 조직은 콜라겐 섬유(collagen fibril)가 소수의 건세포(tenocytes) 및 섬유아세포와 밀집된 고도로 정렬된 복합체이다. 콜라겐 섬유는 주로 제 I형 콜라겐이며 다른 유형의 콜라겐과 디코린(decorin), 비글리칸(biglycan), 및 파이브로모듈린(fibromodulin)과 같은 프로테오글리칸이 일부 존재한다. 건 조직의 발달 동안 건세포는 콜라겐 섬유의 합성을 담당하며, 프로테오글리칸은 콜라겐 섬유질의 조립과 건의 생체 역학적 특성 획득을 조절하는 중요한 구성 요소이다.

건병증(Tendinopathy)은 임상에서 나타나는 건 조직의 일반적인 병리학적 상태로, 세포의 형태가 더욱 둥글게 되면서 그 수가 많아지며 아폽토시스성 세포사멸(apoptotic cell death)의 특징을 나타낸다. 이러한 상태에서 세포 외 기질에 다양한 변화가 일어나 콜라겐 섬유가 파괴되고 강한 에너지를 전달하는데 사용되는 독특한 생체 역학적 특성을 잃어버리게 된다.

이에 건병증을 치료하기 위한 새로운 치료법에 대한 많은 연구가 진행 중이다. 예컨대, 재생 의학 분야에서는 성장 인자, 유전자 치료법 및 조직 공학 기술을 사용하여 건 조직의 기능을 회복 시키기 위한 연구를 진행하고 있다. 최근, 건유래 줄기세포(tendon-derived stem cell; TDSCs)의 발견은 건병증을 치료하기 위한 새로운 패러다임으로 제시되었고, 이러한 줄기세포를 정상적인 건세포로 분화시키기 위한 적절한 환경을 제공하는 것이 중요한 연구 이슈가 되었다. 만성적인 건병증은 건세포 또는 건유래 줄기세포의 비정상적인 변질로 인한 석회화 건염(calcific tendinitis) 및 지방 변성(fatty degeneration)을 포함하며, 이는 건 세포의 정확한 조절의 중요성을 증가시킨다.

골수유래 중간엽 줄기세포(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells; BMMSCs)와 골수 흡인 농축물(bone marrow aspirate concentrates; BMACs)은 손상된 조직의 치료에 이용하기 좋은 세포 공급원이며 전임상 및 임상 연구에서 회전근개 파열의 치유를 향상시키는데 이용되었다. 그러나 적절한 지지체(scaffold)가 없는 경우 골수유래 중간엽 줄기세포와 골수 흡인 농축물의 생존율, 재발 용량 및 분화능은 회전근개 파열의 치료효과를 향상 시키기에 부적합하였다. 따라서 적절한 지지체를 선택하는 것이 회전근개 파열을 포함한 줄기세포 매개 치료 있어서 중요하다.

혈소판 농축혈장(Platelet-rich plasma; PRP)은 많은 성장인자를 포함하는 혈소판이 풍부한 혈장을 의미한다. 혈소판 농축혈장은 골수 흡인 농축물의 다분화능과 증식능을 향상시키는 골격으로서 재생을 촉진시키는 치료 물질로 사용되어왔다. 또한, 혈소판 농축혈장은 체내 주입 시 다른 줄기세포들의 분화, 증식 등에 영향을 미쳐 줄기세포 지지체로서의 역할도 한다고 알려져 있다. 당뇨병성 궤양, 골 연골 이상 및 척수 손상과 같은 환경에서 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 사용하여 연구가 수행되어왔으며(Cytotherapy 2013;15:792?804), 이러한 연구 결과들은 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체의 재생 가능성을 보여주며, 혈소판 농축혈장이 골수흡인 농축물의 재생작용을 촉진시키는 역할을 한다는 것을 입증한다. 그러나 아직까지 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체가 건유래 줄기세포와 건병증에 미치는 영향에 대해서는 연구된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 골수 흡인 농축물과 혈소판 농축혈장이 건유래 줄기세포의 정확한 분화를 조절하고 이의 재생 작용을 증가 시키는데 중요한 역할을 할 것이라는 가정 하에 예의 연구한 결과, 인간 건유래 줄기세포를 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 함께 배양한 경우 상기 줄기세포의 증식 및 이동성이 향상되고 골세포 및 연골세포로의 비정상적인 분화가 억제됨을 확인하였으며, 실제 건병증 중 하나인 회전근개 건 파열 환자에 상기 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 주입하여 임상적 치료효과를 확인하였는바, 본 발명을 완성하였다. 또한, 이러한 임상적 치료효과를 극대화할 수 있는 골수 흡인 농축물과 혈소판 농축혈장 간의 배합 비율도 연구하여 밝혀내고 있다.

이에, 본 발명은 골수 흡인 농축물(Bone marrow aspirate concentrates; BMACs)-혈소판 농축혈장(platelet-rich plasma; PRP) 복합체를 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 증식 또는 이동성 향상용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 증식 또는 이동성 향상 방법, 및 상기 방법에 의해 얻어진 증식 또는 이동성이 향상된 줄기세포를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 골수 흡인 농축물(Bone marrow aspirate concentrates; BMACs)-혈소판 농축혈장(platelet-rich plasma; PRP) 복합체를 유효성분으로 포함하는, 건병증(Tendinosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 골수 흡인 농축물(Bone marrow aspirate concentrates; BMACs)-혈소판 농축혈장(platelet-rich plasma; PRP) 복합체를 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 증식 또는 이동성 향상용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식 또는 이동성 향상방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻어진, 증식 또는 이동성이 향상된 줄기세포를 제공한다.

또한 본 발명은 건병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서의 기능을 최적화하는 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 간 배합 비율을 제공한다.

또한, 본 발명은 골수 흡인 농축물(Bone marrow aspirate concentrates; BMACs)-혈소판 농축혈장(platelet-rich plasma; PRP) 복합체를 유효성분으로 포함하는, 건병증(Tendinosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 건병증은 회전근개 건 파열(rotator cuff tendon tear)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 성체줄기세포는 건유래 줄기세포(tendon-derived stem cells; TDSCs)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 건유래 줄기세포의 증식 또는 이동성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 건유래 줄기세포의 골세포 또는 연골세포로의 비정상적인 분화를 억제할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 건병증 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 건병증 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명자들은 퇴행성 건병증 환자로부터 추출한 건유래 줄기세포를 최적 비율로 배합한 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 함께 배양하였을 때 상기 줄기세포의 증식 및 이동성이 향상되고, 골세포 및 연골세포로의 비정상적인 분화가 억제되는 것을 확인하였으며 실제 회전근개 건 파열 환자에 상기 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 주입하여 임상적인 치료효과를 확인하였다. 이에 본 발명에 따른 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체는 건유래 줄기세포의 증식 및 이동성을 향상시키며 비정상적인 변질로 인한 석회화 건염 및 지방 변성 등의 부작용을 억제하여 건병증의 치료효과를 높일 수 있는바, 건병증 치료법 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 퇴행성 건병증 환자에서 추출한 건유래 줄기세포의 특성을 확인한 결과로서, 면역세포화학염색법을 통해 뉴클레오스테민(Nucleostemin), OCT4, SSEA4, 및 테노모듈린(Tenomodulin)의 발현을 분석한 결과(도 1a) 및 FACS를 통해 세포 표면의 CD34, CD45, CD90, 및 CD105의 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 상기 건유래 줄기세포(TDSC)의 분화능에 대해 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체(BMAC-PRP)가 미치는 영향을 분석한 결과로서, 상기 건유래 줄기세포를 단독배양(TDSC)하거나 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양(TDSC with BMAC-PRP)한 후 지방세포(Adipogenesis), 골세포(Osteogenesis)로의 분화능을 비교한 결과(도 2a), 및 연골세포로의 분화(Safranin O 염색)와 제 Ⅱ형 콜라겐의 발현(collagen Ⅱ)을 비교(도 2b)한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 상기 건유래 줄기세포(TDSC)의 증식능에 대해 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체(BMAC-PRP)가 미치는 영향을 분석한 결과로서, 상기 건유래 줄기세포를 단독배양(TDSC)하거나 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양(TDSC with BMAC-PRP)한 후 CCK-8 어세이를 통해 세포 증식능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 상기 건유래 줄기세포(TDSC)의 이동능에 대해 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체(BMAC-PRP)가 미치는 영향을 분석한 결과로서, 상기 건유래 줄기세포를 단독배양(TDSC)하거나 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양(TDSC with BMAC-PRP)한 후 wound healing assay를 통해 세포 이동능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 상기 건유래 줄기세포(TDSC)의 콜라겐 발현수준이 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체(BMAC-PRP)와의 공동 배양에 의해 변화되는지 검증한 결과로서, 상기 건유래 줄기세포를 단독배양(TDSC)하거나 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양(TDSC with BMAC-PRP)한 후 면역세포화학염색법을 통해 제 I형 콜라겐(Collagen type I) 및 제 Ⅲ형 콜라겐(Collagen type Ⅲ)의 발현수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 회전근개 건 파열 환자에 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 주입한 후 치료효과를 검증하기 위해 주입 전(before), 주입 3주 후(3 weeks), 및 주입 3개월 후(3 months)에 통증 진단 척도를 평가할 수 있는 VAS 및 어깨 기능 평가를 위한 ASES 점수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체가 건유래 줄기세포와 건병증에 미치는 긍정적인 영향을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 골수 흡인 농축물(Bone marrow aspirate concentrates; BMACs)-혈소판 농축혈장(platelet-rich plasma; PRP) 복합체를 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 증식 또는 이동성 향상용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 실시예를 통해 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체가 인간 건유래 줄기세포의 증식 및 이동성을 향상시키는 것을 실험적으로 확인하였다.

보다 구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는, 퇴행성 건병증 환자들로부터 추출한 인간 건 조직 유래 줄기세포의 특성을 검증한 결과, 테노모듈린(Tnomodulin) 단백질의 발현을 확인함으로써 건 조직 유래 세포임을 확인하였고 Nucleostemin, OCT4, 및 SSEA4 단백질의 발현을 통해 줄기세포의 특성인 미분화능을 갖는다는 것을 확인하였다. 이에 더하여, 세포 표면에서의 CD90 및 CD105 발현을 통해 중간엽 줄기세포의 특성을 갖는다는 것을 확인하였다(실시예 2-1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 건조직 유래 줄기세포의 분화에 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체가 미치는 영향을 분석하기 위해 상기 줄기세포를 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동배양 한 후 지방세포, 골세포, 및 연골세포로의 분화능을 검증한 결과 상기 줄기세포만을 단독 배양한 경우와 비교하여 지방세포로의 분화능에는 차이가 없었으며, 골세포 및 연골세포로의 분화능은 감소한 것으로 나타났다. 따라서 상기 공동 배양에 의해 건유래 줄기세포의 골세포 및 연골세포로의 비정상적인 분화능이 감소하는 것을 확인하였다(실시예 2-2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 건조직 유래 줄기세포를 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양한 후 세포 증식 및 이동성을 각각 분석한 결과, 상기 줄기세포를 단독 배양한 경우에 비하여 증식 및 이동성이 향상된 것을 확인하였으며(실시예 2-3 및 2-4 참조), 제 I형 및 제 Ⅲ형 콜라겐 발현수준에는 차이가 없음을 알 수 있었다(실시예 2-5 참조).

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포이고, 성체줄기세포는 바람직하게 건유래 줄기세포이며, 보다 바람직하게는 인간 건유래 줄기세포를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 포함하는 조성물에서 상기 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식 또는 이동성 향상방법을 제공하며, 상기 방법에 의해 증식 또는 이동성이 향상된 줄기세포를 제공한다.

본 발명자들은 상기 실시예 결과들을 바탕으로, 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체가 건유래 줄기세포가 건세포로 분화되어 건병증을 치료하는데 임상적으로 효과를 나타내는지 검증하기 위해 회전근개 건 파열 환자에 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 주입한 후 통증 진단 척도를 평가할 수 있는 VAS 및 어깨 기능 평가를 위한 ASES 점수를 매겨 임상적 증상을 평가하였다. 그 결과, 주입 전에 비하여 주입 후 3개월까지 VAS는 감소하였고 ASES는 증가하였다. 초음파 검사를 통한 파열크기 분석에서는 파열 크기를 측정한 결과 수치적으로 감소하였으나 통계적 유의성은 얻지 못하였다(실시예 3 참조).

상기 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체에 의한 임상적 회전근개 건 파열의 치료효과는 세포수준에서 확인한 바와 같은 건유래 줄기세포의 증식 및 이동성 향상효과, 및 골세포 또는 연골세포로의 비정상적인 분화 억제효과에 기인한 것이다.

이에 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 골수 흡인 농축물(Bone marrow aspirate concentrates; BMACs)-혈소판 농축혈장(platelet-rich plasma; PRP) 복합체를 유효성분으로 포함하는, 건병증(Tendinosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 건병증은 바람직하게 회전근개 건 파열을 의미하는 것이나, 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체에 의해 증상이 개선될 수 있는 건의 병증에 의해 나타나는 모든 질환을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 상기 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 건병증 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 건병증 예방 또는 치료용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

본 실시예 연구 및 임상 절차의 프로토콜에 대한 생물학적 표본의 사용은 본 기관의 심사위원회(IRB)의 승인을 받은 것이며, 모든 환자들로부터 서면 동의서를 받은 후 실험을 진행하였다.

1-1. 퇴행성 건병증(Degenerative Tendinopathy) 환자에서 건유래 줄기세포(TDSCs) 획득

본 발명의 실시예에서 이용한 인간의 건(힘줄) 조직은 외측 상과염(lateral epicondylopathy) 환자의 수술 과정에서 수집하였다. 상기 조직 기증자는 보수 관리가 어려운 심각한 통증과 불편함을 겪던 58세의 여성(Pt-1)이었다. 상기 여성은 수술 전 3개월 동안 스테로이드를 주입 받지 않았으며, 건 조직은 일반적인 요골쪽 손목펴짐근(extensor carpi radialis)에서 추출하였다. 이후 상기 추출한 조직을 1 mm x 1 mm 크기의 조각으로 절단하고 건 조직을 싸고 있는 막(sheath)을 제거하였으며 조직의 중량을 측정하였다. 다음으로 조직 추출 후 20분 내에 조직 100 mg 당 3 mg의 콜라게나아제 타입 I(collagenase type I)(Catalog No. D4693; Sigma-Aldrich)이 포함된 1 ml의 인산완충액(PBS)으로 조직을 세척한 후 37℃에서 2시간 동안 조직이 분해되도록 하였다. 분해된 조직 용액을 800 x g에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 버린 다음, 펠렛을 20% 소태아혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 항생제(Gibco, Waltham, MA, USA)가 포함된 5 ml의 DMEM 배지로 재현탁하여 T25 배양 플라스크로 옮겨 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였으며, 배지는 이틀에 한번씩 교체해주었다. 세포가 배양 용기의 80% 면적에 이르면 PBS로 세포를 3회 세척하고 트립신-EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건에서 3분 동안 배양하여 세포를 플라스크 바닥에서 떼어낸 후 상기와 동일한 DMEM 배지로 재현탁하고 혈구계로 세포 수를 측정하여 1 ㎕ 당 1개 세포(1 cell/㎕)로 희석하여 100 ul씩 취해 10 x 10 mm 배양접시에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 이후 단일세포 부착 배양 시 경계를 표시하고 세포를 상기와 동일한 DMEM 배지에서 단일세포가 콜로니를 형성할 때까지 배양하였다. 약 10일 동안 배양을 진행한 다음 형성된 여러 개의 콜로니를 마이크로피펫을 사용해 각 콜로니 경계 부위에 트립신-EDTA를 국소적으로 처리하여 떼어내고 각 세포로 분리하였다. 이후 상기 세포들을 24웰 배양접시에 모으고 상기와 동일한 DMEM 배지로 배양하였다. 본 실시예에서 모든 건유래 줄기세포(TDSCs)는 다클론성 기원을 갖는 passages 4와 6 사이의 것을 이용하였다.

1-2. 골수 흡인 농축물(Bone marrow aspirate concentrates; BMACs)과 혈소판 농축혈장(platelet-rich plasma; PRP) 추출 및 건유래 줄기세포와의 공동배양

골수 흡인 농축물과 혈소판 농축혈장은 회전근개 건 파열로 진단 받은 52세의 여성(Pt-2)으로부터 제공받았다. 먼저 골수 흡인 농축물 추출을 위해, 상기 여성을 테이블 위에 복와위(prone position)로 눕히고 손가락으로 장골능(iliac crest)의 위치를 확인한 다음, 해당 부위를 포비돈-아이오딘(povidone iodine)으로 소독한 후 1% 리도카인(lidocaine)을 이용해 피부와 해당부위의 피부와 골막(periosteum)을 마취시켰다. 다음으로, 골수 흡인용 바늘을 장골 내로 침투시켜 골수 부위로 투입한 다음 골수에서 골수 흡인물을 채취하고 BIOMET MarrowStim™ Mini kit(Biomet Biologics and Biomaterials, Inc., Warsaw, IN, USA)를 이용해 원심분리하여 농축된 골수 흡인물을 수득하였다. 한편, 상기 여성의 전주와 정맥에서 말초혈액 30 ml를 채취한 다음 BIOMET GPS™ Ⅲ kit(Biomet Biologics and Biomaterials, Inc.)로 원심분리를 실시하여 혈소판 농축혈장을 분리하였다.

상기 방법으로 수집한 골수 흡인 농축물 및 혈소판 농축혈장이 건 조직으로의 분화를 촉진시킬 수 있는지 검증하기 위하여, 상기 실시예 1-1의 방법으로 분리한 건유래 줄기세포와 직접적인 방법으로 공동 배양하였다. P3의 건유래 줄기세포를 T75 배양 플라스크에 1 x 10⁶개씩 씨딩하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, 450 ㎕의 골수 흡인 농축물 및 혈소판 농축혈장을 후 처리 없이 주입하고 20% FBS가 포함된 DMEM에서 배양하였다. 음성대조군으로는 건유래 줄기세포를 동일한 조건에서 단독으로 배양하였다. 각 배양 플라스크를 5% CO₂가 제공되는 습기가 있는 대기에서 37℃ 조건으로 7일 동안 배양하였으며 배지는 2~3일 간격으로 교체해주었고 실험은 다른 샘플을 이용해 독립적으로 3회 반복하였다.

1-3. 면역세포화학염색법(Immunocytochemical Staining)

건유래 줄기세포(TDSCs)를 22 x 22 mm 커버 글라스 위에 2 x10³ 세포/cm²의 밀도로 씨딩하고, 37℃, 5% CO₂에서 세포가 배양용기 면적의 70%에 도달할 때까지 완전 배지에서 배양하였다. 이후 세포에 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde; PFA)를 실온에서 15분 동안 처리하여 세포를 고정시키고, PBS로 희석한 0.25% Triton X-100(Sigma-Aldrich)을 실온에서 10분 동안 처리한 다음, PBS로 희석한 1% 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)(Sigma-Aldrich)을 실온에서 30분 동안 처리하여 블로킹 과정을 실시한 후 1차 항체를 처리하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 본 실험에서 사용한 1차 항체 및 사용량은 하기에 나타낸 바와 같다: rabbit polyclonal anti-tenomodulin (1:100; Catalog No. sc-98875; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), rabbit polyclonal anti-nucleostemin (1:500; Catalog No. ab70346; Abcam, Cambridge, UK), rabbit polyclonal anti-octamerbinding transcription factor 4 (OCT4; 1:100; Catalog No. ab18976; Abcam), 및 mouse monoclonal anti-stagespecific embryonic antigen-4 (SSEA4; 1:500; Catalog No. ab16287; Abcam). 음성대조군의 경우에는 1차 항체를 블로킹 용액으로 대체하여 처리하였다. 1차 항체를 세포와 반응시킨 후 PBS로 세척하고 donkey polyclonal anti-rabbit IgG 항체(Alexa Fluor® 488; 1:1,000; Catalog No. ab150073; Abcam) 또는 donkey polyclonal anti-mouse IgG 항체(Alexa Fluor® 594; 1:1,000; Catalog No. ab150108; Abcam)를 처리한 후 빛을 차단한 상태에서 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후 PBS로 세포를 세척하고 DAPI(4’, 6-diamidino-2-phenylindole)가 포함된 Fluoroshield 마운팅 배지로 마운팅하였다. 우수한 재현성과 비교 가능성을 위해 모든 배양 시간과 조건을 엄격하게 통제하였으며, 세포를 LSM 700 현미경(Carl Zeiss Meditec, Jena, Germany)을 이용해 공초점 현미경 하에서 관찰하였다. 한편, 건유래 줄기세포의 확인을 위해서는 힘줄유래 세포의 특이적인 표지자로 테노모듈린(tenomodulin)에 대한 세포화학염색법을 진행하였으며, tenomodulin을 1차 항체로 사용하고 Alexa Fluor 488을 2차 항체로 사용하였다. 건유래 줄기세포에서 줄기세포의 특성을 검증하기 위해서는 줄기세포 표지자인 OCT4, SSEA4, nucleostemin의 발현을 면역형광법으로 분석하였으며, 음성대조군의 경우에는 동일한 조건하에서 1차 항체를 제거하여 실험을 진행하였다.

1-4. FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting) 분석

FACS 분석을 위해 건유래 줄기세포는 3 passage때 트립신 처리하여 회수한 후 PBS로 2회 세척한 다음, 1 x 10⁵개의 건유래 줄기세포와 3번째 passage 후 회수한 골수 흡인 농축물을 인간 PE(phycoerythrin)가 접합된 CD34(Catalog No. ab46970; Abcam) 및 CD90(Catalog No. ab95700; Abcam) 항체, 및 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 접합된 human CD45(Catalog No. ab27287; Abcam) 및 CD105(Catalog No. ab18278; Abcam) 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 비특이적 FITC 또는 PE-접합 IgG를 아이소타입 대조군으로 사용하였다. 다음으로, PBS로 씻어내고 400 x g에서 10분 동안 원심 분리한 후, 염색된 세포를 500 ml의 차가운 PBS로 재현탁시키고 FACSCalibur machine(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 사용하여 분석하였으며, 각 샘플당 1 x 10⁴개의 세포 계수하여 분석하였다. Cell Quest software(BD Biosciences)를 이용하여 양성 신호를 나타내는 세포의 백분율 및 양성 집단의 평균 기하학적 형광 값을 분석하였다.

1-5. 골세포 분화 검증

건유래 줄기세포의 다분화능을 검증하기 위하여, 상기 건유래 줄기세포를 지방세포, 연골세포 및 골 형성 세포 배지에서 배양한 후 각 세포에 특이적인 마커를 통해 분화여부를 평가하였다.

먼저, 골세포로의 분화여부를 평가하기 위하여, 힘줄유래 세포를 24웰 플레이트에 5 x 10³ cells/cm² 밀도로 분주한 후 표준 성장배지(DMEM + 10% FBS)에서 일정 양이 될 때까지 배양하였다. 다음으로 세포를 표준 성장배지 또는 골 형성 배지(Catalog No. A10072-01; Gibco)에서 21일 동안 배양 하였으며, 배지는 2일~3일 간격으로 교체해주었다. 이후 골형성 여부를 평가하기 위해 알리자린 레드 S(Alizarin red S) 염색을 실시하였다. 간단하게, 세포 배양액을 제거하고 세포를 PBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데히드를 실온에서 30분 동안 처리하였다. 이어서 세포를 다시 PBS로 세척한 후 알리자린 레드 S 염색 용액(Catalog No. 0223; ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA)를 세포에 처리하고 30분 동안 놓아둔 후 증류수로 3회 세척하였다. 이후 광학현미경으로 석회질이 빨간색으로 염색된 것을 관찰하였다.

1-6. 지방세포 분화 검증

건유래 줄기세포를 상기 실시예 1-5와 동일한 밀도로 24웰 플레이트에 씨딩한 다음 표준 성장배지 또는 지방세포 분화 배지(Catalog No. A10070-01; Gibco) 하에서 배양하였다. 세포를 추가로 21일 동안 배양하면서 배지는 2~3일 간격으로 교체해주었다. 지방세포로의 분화는 Oil red O 염색법으로 평가하였는데, 간략하게 세포 배양액을 제거하고 세포를 PBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데히드를 실온에서 30분 동안 처리하였다. 이어서 세포를 다시 PBS로 세척한 후 0.3% Oil red O 용액(Catalog No. O1391; Sigma-Aldrich)을 처리하고 50분 동안 배양한 다음, 증류수로 3회 세척 하였다. 이후 광학현미경으로 지방세포의 지방방울(lipid droplet)이 빨간색으로 염색된 것을 관찰하였다.

1-7. 연골세포 분화 검증

연골세포로의 분화를 검증하기 위해, 펠렛 배양 시스템을 이용하였다. 보다 구체적으로, 8 x 10⁵개 세포를 15 ml 튜브에 넣고 800 x g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 생성한 후 표준 배양배지 또는 연골세포 분화배지(Catalog No. A10071-01; Gibco)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 28일 동안 배양하였으며, 2~3일 간격으로 배지를 교체해주었다. 배양 후 얻어진 세포 펠렛에 4% 파라포름알데히드를 처리하여 고정하고 탈수시킨 다음 파라핀에 포매하였다. 이후 파라핀에 포매된 조직을 5 um 두께의 절편으로 절단한 다음 탈파라핀화시키고 헤마톡실린(hematoxylin) 및 사프라닌 O(Safranin O)(Koma Biotech, Daejeon, South Korea) 염색을 실시하였으며, 사프라닌 O 염색은 NovaUltra™ Safranin O stain kit(Catalog No. IW-3011; IHC World, Ellicott City, MD, USA)를 이용해 실시하였다. 보다 구체적으로, 조직에 헤마톡실린 염색 용액을 10분 동안 처리한 다음 10분 동안 흐르는 물에 씻어내고, 사프라닌 O 염색 용액을 5분 동안 처리한 후 증류수로 씻어내었으며, Fast Green 용액(Koma Biotech)으로 10분간 염색시키고 10~15초 동안 빠르게 아세트산 용액으로 씻어내었다. 염색된 샘플은 digital slide scanner (Aperio AT; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)로 관찰하였다.

1-8. 면역조직화학염색법

파라핀에 포매된 조직 절편에 자일렌(xylene)을 처리하여 탈파라핀화시키고, 단계적 에탄올을 이용해 탈수시켰다. 다음으로 제 Ⅱ형 콜라겐 검출을 위해 항원이 드러나도록 121℃ 및 고압에서 7분 동안 표적 회수 용액 pH 6.0 구연산염(Catalog No. S2031; Dako, Glostrup, Denmark)을 처리하였다. 또한, 내인성 퍼옥시다아제(peroxidase) 활성을 차단하기 위해 퍼옥시다아제 차단 용액(Catalog No. S2023; Dako)을 실온에서 15분 동안 처리한 다음, 실온에서 20분 동안 블록 무혈청 용액(Catalog No. X0909; Dako)을 처리하여 블로킹 과정을 수행하였다. 이후 조직 절편을 제 Ⅱ형 콜라겐에 대한 토끼 다클론 항체(1:200; Catalog No. ab34712; Abcam)와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 액상 DAB + 기질 발색 시스템(Catalog No. K3468; Dako)을 처리하였다. 이후 조직절편을 씻어낸 다음 헤마톡실린(hematoxylin)(Catalog No. S3309; Dako)으로 대조염색하고 단계적 에탄올과 자일렌으로 탈수시키고 마운팅하였다. 음성대조군의 경우, 1차 항체 대신에 블로킹 용액을 사용하였으며, 양성대조군으로는 마우스(Orient Bio Inc., Gapyeong, Korea) 유래 무릎 관절 연골을 사용하였다. 조직학은 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 평가하였다.

1-9. 세포 이동 분석

스크래치 어세이를 통해 건유래 줄기세포의 이동 능력을 평가 하였다. 보다 구체적으로, 건유래 줄기세포를 바닥이 평평한 12웰 플레이트에 웰 당 2 x10⁴개씩 씨딩한 다음 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 4일 동안 항온 배양한 다음 P100 피펫 팁을 사용하여 상기 줄기세포가 존재하는 부분을 긁어내었다. 스크래치는 피펫 팁을 약 30° 각도로 유지함으로써 일정한 폭이 유지되도록 하였다. 동일한 과정을 모든 플레이트의 웰 마다 실시하였고, 세포를 배지로 씻어낸 다음 배지를 10% FBS가 포함된 DMEM으로 교체하였다. 스크래치 분석의 정량화를 위해 이미지를 캡쳐하여 데이터 분석을 실시하였는데, 초기 스크래치 면적을 기록하기 위해 초기 0시간 (t = 0h)의 이미지를 캡쳐하고, 벗겨진 부위 쪽으로의 세포 이동에 의한 스크래치 부위의 회복을 24시간(t = Dh)째에 평가하였다. 이미지는 4x 대물렌즈가 장착된 역위상차 현미경을 사용하여 캡쳐하였으며, 각 스크래치 부위에 대하여 다상 선택 모드를 사용하여 ImageJ 소프트웨어[National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA]를 이용해 정량화하였다. 스크래치 부위로의 세포 이동은 스크래치 봉합의 백분율로 나타내었다: wound closure % = [At = 0h - At = Dh) / At = 0h] X 100 %, 및 At = 0 h는 스크래치를 낸 후 바로 측정한 스크래치 면역이고, At = D h는 스크래치를 낸 후 24시간 후 측정된 스크래치의 면적이다.

1-10. 세포 증식 분석

먼저 건유래 줄기세포의 군집 배가 시간(population Doubling Time; PDT)을 측정하기 위해, 총 배양 시간(8일)을 PD로 나누었으며, PD는 6 passage에서 하기 식에 따라 결정되었다.

PD = log2 (N_n/N₀),

상기 N₀는 초기에 분주한 세포의 수이며, N_n은 8일 동안 배양 후 회수된 세포의 수이다.

PDT는 세포의 수가 2배로 증가하는데 걸리는 시간을 의미하며, PDT를 계산하기 위해 세포가 성장한 시간을 동일한 시간 주기(time period)에 상응하는 PD 값으로 나누었다:

PDT (hours) = (time period)/PD

PDT는 신뢰도를 높이기 위해 총 3회 측정하여 평균값을 도출하였다.

또한, CCK-8 어세이를 통해 세포 증식률을 측정하였다. 보다 구체적으로, 세포를 분주한 후 1, 3, 5, 7, 및 9일째에 Cell Counting Kit-8® 용액(CCK-8; Dojindo, Gaithersburg, MD, USA)를 이용해 세포 증식률을 측정하였다. 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1x103 cells/100 μl로 씨딩하고 Cell Counting Kit-8® 용액을 웰 당 10 ㎕씩 처리한 후 3시간 동안 배양하였다. 이후 microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 각 그룹의 샘플을 3개씩 측정하였으며, 3회 반복 실험하였다.

1-11. 제 I형 및 제 Ⅲ형 콜라겐 발현 분석

건유래 줄기세포의 재생능력을 평가하기 위하여, 면역세포화학염색법을 이용해 제 I형 및 제 Ⅲ형 콜라겐의 발현을 분석하였다. 상기 두 가지 유형의 콜라겐 단백질 발현을 확인하기 위해 각각 rabbit polyclonal anti-collagen I (1:500; Catalog No. ab292; Abcam) 및 mouse monoclonal anti-collagen III (1:100; Catalog No. NBP1-05119; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) 항체를 이용하여 실험을 진행하였다.

1-12. 임상연구

본 임상 연구는 전향적 단일 맹검 연구로 실시되었다. 2014년 8월부터 2016년 7월까지 방문한 외래 환자 중 부분 회전근개 파열로 진단받은 환자를 대상으로 하였고, 상기 실시예 1-2에 기재한 Pt-2 환자를 포함한 12명의 환자가 임상 연구에 참여하여 이들로부터 골수 흡인 농축물 및 혈소판 농축혈장을 추출하였다. 대상 환자의 선별 기준은 (1) 지난 3개월 동안 어깨 수술을 하지 않은 경우, (2) 단순 방사선 검사에서 이상 소견이 없었던 경우, (3) 초음파를 통해 회전근개 부분 파열로 진단된 환자, (4) 혈액 응고 및 일상 검사실 검사가 없는 경우, 및 (5) 지난 3개월 동안 스테로이드 주사를 맞지 않은 경우로 하였다. 환자들은 3개월 이상 어깨 통증을 경험하였으며 구강 약물과 물리치료를 통해서 증상이 개선되지 않았다. 상기 환자들을 대상으로 변형된 Crass 위치에서 초음파 영상을 시행하였고, 파열된 크기의 폭과 깊이(둘다 mm)를 측정하였다.

1-13. 회전근개 건 파열 부위로의 골수 흡인 농축물 및 혈소판 농축혈장(BMAC-PRP) 주입

상기 실시예 1-2에 기재한 방법에 따라 환자들로부터 골수 흡인 농축물과 혈소판 농축혈장을 채취한 후 골수 흡인 농축물 2 ml을 5 ml 주사기 내에서 혈소판 농축혈장 1ml과 혼합하였다. 초음파 영상 하에서 환자를 테이블에 양와위 자세로 눕힌 후 파열 부위로 상기 혼합한 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 주입하였다.

1-14. 어깨 기능 평가

어깨 기능을 평가하기 위해, 어깨 외전근의 VAS(visual analog scale) 및 MMT(manual muscle test)를 경험이 많은 한 명의 의사가 측정하였으며, ASES(American Shoulder and Elbow Surgeons)은 주입 전, 3주 후, 및 3개월 후에 기록하였다. 주입 후 3개월째에 파열 크기(mm)를 측정하기 위해 초음파 이미징을 실시하였으며, ASES의 오리지널 버전을 이용하였다.

1-15. 통계분석

In vitro 실험을 위해, 각 실험은 적어도 3회 독립적으로 수행하였고 각각의 처리는 3회 반복하였다. 실험 결과는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현하였다. 독립적인 t-검정법을 통계 분석에 이용하였으며, p <0.05에서 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 임상연구에서는 모든 매개변수에 대하여 ANOVA와 paired t-test를 실시하였으며, 역시 p <0.05의 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 또한 통계 분석을 위해 SPSS 20.0 소프트웨어(IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 사용하였다.

실시예 2. In vitro 수준에서 건유래 줄기세포에 대한 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장의 영향 분석

2-1. 인간 건 조직에서 추출한 건유래 줄기세포(TDSCs)의 확인

상기 실시예 1-1의 방법에 따라 인간 힘줄조직에서 추출한 조직의 중량을 측정한 결과 102 mg임을 확인하였고, 11일 동안 배양하여 약 1.33 x 10⁶개의 세포를 얻었다. 이후 상기 방법으로 얻은 건유래 줄기세포에 대하여 실시예 1-3의 방법에 따라 면역세포화학염색법을 실시하여 상기 줄기세포가 테노모듈린(Tenomodulin), Nucleostemin, OCT4, 및 SSEA4 단백질을 발현하는지 분석하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 상기 줄기세포에서 Tenomodulin 단백질의 발현을 통해 힘줄조직 유래 세포임을 확인하였고, Nucleostemin, OCT4, 및 SSEA4 단백질이 발현되는 것을 확인함으로써 상기 세포가 줄기세포능을 갖는 것을 알 수 있었다.

이에 더하여, 상기 실시예 1-4의 방법에 따른 FACS 분석을 통해 상기 건유래 줄기세포가 CD34, CD45, CD90, 및 CD105의 표면항원 단백질을 발현하는지 분석한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 조혈줄기세포 마커인 CD34 및 백혈구 마커인 CD45는 거의 발현하지 않는 반면, 중간엽줄기세포 마커인 CD90과 CD105는 각각 99.4% 및 98.4% 발현하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 본 발명에서 추출한 건유래 줄기세포가 건 조직 세포의 특성 및 중간엽 줄기세포의 특성을 갖는 것을 알 수 있었다.

2-2. 다분화능 분석

본 발명자들은 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체가 건유래 줄기세포의 분화능에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기 세포의 실시예 1-5 내지 1-7에 기재한 방법에 따라 골 형성, 지방 세포, 및 연골 형성 분화에 대한 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 지방세포로의 분화를 유도하였을 때, 대조군인 건유래 줄기세포를 단독 배양한 경우(TDSC)와 비교하여 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양(TDSC with BMAC-PRP)한 경우 염색 정도의 차이가 없는 것으로 보아 지방세포로의 분화능에 변화가 없는 것을 알 수 있었다. 이에 반해, 골형성 분화능의 경우에는 대조군(TDSCs)에 비해 TDSC with BMAC-PRP에서 염색된 세포가 유의하게 감소되어 있는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와의 공동 배양에 의해 건유래 줄기세포의 골세포로의 분화능이 감소된 것을 알 수 있었다.

또한, 대조군(TDSCs)과 TDSC with BMAC-PRP에 대하여 사프라닌 O(safranin O) 염색을 통해 연골세포로의 분화능 및 제 Ⅱ형 콜라겐(collagen Ⅱ) 발현수준을 분석한 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 대조군에 비하여 TDSC with BMAC-PRP에서 염색 정도에 다소 감소되어 있는 것을 확인하였다.

2-3. 세포 증식능 분석

골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양한 건유래 줄기세포의 증식능을 분석하기 위해, 상기 실시예 1-10의 방법에 따라 군집 배가 시간(population Doubling Time; PDT)을 측정하였다. 그 결과, 건유래 줄기세포를 단독 배양한 경우와 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양한 경우 PDT는 각각 48.4 ± 1.4와 46.6 ± 1.9 시간으로 측정되어 상기 공동 배양에 의해 PDT가 감소한 것을 확인하였다.

또한, CCK-8 어세이를 통해 증식능을 분석한 결과 도 3에 나타낸 바와 같이 건유래 줄기세포를 단독 배양한 경우(TDSC)에 비하여 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양(TDSC with BMAC-PRP)한 경우 배양 시간이 증가함에 따라 증식능이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통해 건유래 줄기세포를 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양함으로써 상기 줄기세포의 증식능이 향상되는 것을 알 수 있었다.

2-4. 세포 이동능 분석

상기 결과들에 더하여, 건유래 줄기세포의 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양에 따른 이동능 변화여부를 분석하기 위해 상기 실시예 1-9의 방법에 따라 실험을 진행하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 실험시작 24시간 후에 스크래치에 의해 분리된 건유래 줄기세포가 양쪽에서 스크래치 방향으로 이동한 것을 확인하였다. 또한, 상기 줄기세포의 이동률을 정량적으로 분석하기 위해 Wound closure(%)을 측정한 결과, 건유래 줄기세포를 단독 배양(TDSC)한 경우에 비해 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양(TDSC with BMAC-PRP)한 경우 Wound closure(%)가 유의하게 증가한 것을 확인하였으며, 이를 통해 세포 이동능력이 향상되었음을 알 수 있었다.

2-5. 제 I형 및 제 Ⅲ형 콜라겐 발현 분석

건유래 줄기세포의 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양에 따른 제 I형 및 제 Ⅲ형 콜라겐 발현수준을 분석하기 위해, 상기 실시예 1-11의 방법에 따라 면역세포화학염색법을 실시하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 건유래 줄기세포를 단독 배양(TDSC)한 경우에 비해 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체와 공동 배양(TDSC with BMAC-PRP)한 경우 상기 두 종류의 콜라겐(Collagen type I, Collagen type Ⅲ) 발현수준에 차이가 없음을 확인하였다.

실시예 3. 임상 연구를 통한 회전근개 파열에서 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체의 효과 분석

3-1. 임상적 증상 분석

회전근개 건 파열 환자에 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체를 주입한 후 어깨 기능을 평가하기 위해 상기 실시예 1-14의 방법에 따라 전문의를 통해 환자의 통증 진단 척도를 평가할 수 있는 VAS 및 어깨 기능 평가를 위한 ASES 점수를 매겨 임상적 증상을 평가하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 초기 VAS 점수는 5.8 ± 1.9였으나 주입 후 3주째에 5.0 ± 2.3으로, 주입 후 3개월째에 2.8 ± 2.3으로 변화하였다(F = 38.08, p <0.01). 또한, ASES 점수는 주입 전 39.4 ± 13.0에서 주입 3주 후 52.9 ± 22.9로, 주입 후 3 개월에서는 71.8 ± 19.7로 증가하였다(F = 14.51, p <0.01). 또한 어깨 외전자의 도수 근력검사(MMT)를 실시한 결과 초기에 3명 환자에서 3등급, 4명의 환자에서 4등급, 5명의 환자에서 5등급으로 측정되었으나, 주입 3개월 후 5명의 환자에서 3등급, 3명의 환자에서 4등급, 및 5명의 환자에서 5등급으로 나타났다.

상기 결과와 같이 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체의 주입을 통해 어깨 기능이 향상된 것을 알 수 있었다.

3-2. 초음파검사를 통한 파열크기 분석

상기 실시예 3-1의 결과에 더하여, 초음파 검사를 통해 회전근개 파열 부위의 크기가 변화하였는지 분석하였다. 그 결과, 초기 파열된 부위의 크기가 30.2 ± 24.5 mm²에서 3개월 후 22.5 ± 18.9 mm²로 그 크기가 감소하였으나, 통계적인 유의성은 확인하지 못하였다. 시술 도중 또는 시술 후 합병증이나 부작용은 나타나지 않았으며, 골수 흡인 농축물-혈소판 농축혈장 복합체의 주입 직후 급성 통증 이외의 통증에 대해 불만을 가진 환자는 없었다. 이 통증은 4 시간 이내에 가라 앉았다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

1. 골수 흡인 농축물(Bone marrow aspirate concentrates; BMACs)-혈소판 농축혈장(platelet-rich plasma; PRP) 복합체를 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 증식 향상용 시험관 내(in vitro) 조성물로서,
   상기 줄기세포는 건유래 줄기세포(tendon-derived stem cells; TDSCs)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
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4. 제1항의 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식 향상방법으로서,
   상기 줄기세포는 건유래 줄기세포(tendon-derived stem cells; TDSCs)인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
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7. 제4항의 방법에 의해 얻어진, 증식이 향상된 건유래 줄기세포(tendon-derived stem cells; TDSCs).
   
   
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