JP2022549765A - 老化に関連する疾患を治療するための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、細胞サンプル中の老化細胞を検出する方法、および少なくとも１つの老化剤を対象に投与することによって対象の老化に関連する疾患、障害、または状態を治療する方法を提供する。

Description

本出願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０２０年８月１４日に出願されており、２０１９年８月１５日に出願された、「老化細胞除去剤の使用（ＵＳＥ ＯＦ ＳＥＮＯＬＹＴＩＣ ＡＧＥＮＴＳ）」と題された、米国仮特許出願第６２／８８７，０９０号；２０１９年８月２３日に出願された「老化細胞の除去（ＣＬＥＡＲＩＮＧ ＳＥＮＥＳＣＥＮＴ ＣＥＬＬＳ）」と題された、同第６２／８９０，８９３号；２０１９年８月２３日に出願された、「フィセチンは、加齢、培養拡大、およびバンクされたヒト脂肪由来幹細胞の老化を軽減する（ＦＩＳＥＴＩＮ ＡＴＴＥＮＵＡＴＥＳ ＳＥＮＥＳＣＥＮＣＥ ＩＮ ＡＧＥＤ，ＣＵＬＴＵＲＥ ＥＸＰＡＮＤＥＤ，ＡＮＤ ＢＡＮＫＥＤ ＨＵＭＡＮ ＡＤＩＰＯＳＥ ＤＥＲＩＶＥＤ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ）」と題された同第６２／８９０，９１０号；２０２０年１月９日に出願された「老化細胞の検出および評価（ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＥＮＥＳＣＥＮＴ ＣＥＬＬＳ）」と題された、同第６２／９５９，０１２号；ならびに２０２０年３月４日に提出された「加齢性疾患および状態における老化：整形外科、筋骨格系およびオルソバイオロジクスへの影響（ＳＥＮＥＳＣＥＮＣＥ ＩＮ ＡＧＥ－ＲＥＬＡＴＥＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＡＮＤ ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ：ＩＭＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＯＲＴＨＯＰＥＤＩＣＳ，ＭＵＳＣＵＬＯＳＫＥＬＥＴＡＬ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＯＲＴＨＯＢＩＯＬＯＧＩＣＳ）」と題された同第６２／９８５，２４２号に対する優先権の利益を主張し、本明細書にそれぞれの開示が、それらの全体が参照により組み入れられる。

開示の分野
本開示は、老化細胞を除去するための老化細胞除去剤の使用に関する。本開示はさらに、老化に関連する疾患および障害を治療するための方法に関する。

細胞老化において、通常増殖している細胞は、細胞周期停止の永続的な状態にあり、そこでは、それらは、もはや成長刺激に応答せず、もはや分裂しない。前駆細胞の細胞周期停止は、組織を修復する能力の喪失に寄与する。さらに、老化細胞は炎症誘発性およびマトリックス分解性分子を産生し、これは、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）と呼ばれる応答である（非特許文献１；非特許文献２）。細胞老化は、加齢プロセスおよび加齢性疾患に関連している。結果として、老化細胞を標的とすることが治療アプローチとして浮上してきた。

Ｃｈｉｌｄｓら、２０１５ Ｎａｔ Ｍｅｄ ２１（１２）：１４２４－１４３５ Ｐａｅｚ－Ｒｉｂｅｓら、２０１９ ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １１：１－１９

発明の簡単な要約
一態様では、本発明は、細胞サンプル中の老化細胞を検出する方法を提供し、この方法は、細胞をＣ１２ＦＤＧで染色すること；この細胞をフローサイトメトリーに供することを含む。一実施形態では、この細胞サンプルは、ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、細胞サンプルは、全末梢血単核細胞、骨髄吸引物（ＢＭＡ）、全血、エキソビボ培養拡大幹細胞、バンクされた幹細胞、新たに単離された幹細胞、または内因性幹細胞である。さらに別の実施形態では、検出された老化細胞は、老化の段階に従って特徴付けられる。さらに別の実施形態では、特徴付けは、シグナルの明るさに基づく。さらなる実施形態では、老化の段階は、フローサイトメトリーによる正規化されたイベントゲーティングによって決定した場合、初期段階（比較的低いＣ１２ＦＤＧ陽性、「ディム（ｄｉｍ）」、フローサイトメトリープロット上の低い緑色蛍光強度）、中期（比較的中程度のＣ１２ＦＤＧ陽性）、または後期段階（比較的高いＣ１２ＦＤＧ陽性、「ブライト（ｂｒｉｇｈｔ）」、フローサイトメトリープロットでの高い蛍光強度）である。特定の実施形態では、後期老化細胞は、老化細胞除去剤または老化治療薬の標的である。

別の態様では、本発明は、バンクされた幹細胞から老化細胞を除去する方法を提供し、この方法は、細胞に少なくとも１つの老化細胞を加えることを含む。

さらに別の態様では、本発明は、バンクされた幹細胞を濃縮する方法を提供し、この方法は、細胞に少なくとも１つの老化細胞除去剤を添加することを含む。

本発明による方法の特定の実施形態では、バンクされた幹細胞は、ＡＤＳＣ、エキソビボ培養拡大幹細胞、新たに単離された幹細胞、内因性幹細胞、骨髄吸引物濃縮物（ＢＭＡＣ）幹細胞、および全血幹細胞からなる群より選択される。追加の実施形態では、老化細胞の少なくとも２５％が除去されるか、老化細胞の少なくとも５０％が除去されるか、老化細胞の少なくとも７５％が除去されるか、老化細胞の少なくとも８０％が除去されるか、老化細胞の８５％が除去されるか、老化細胞の少なくとも９０％が除去されるか、または老化細胞の少なくとも９５％が除去される。

さらに別の態様では、本発明は、対象の老化に関連する疾患、障害、または状態を治療する方法を提供し、この方法は、対象に少なくとも１つの老化細胞除去剤を投与することを含む。

さらなる態様では、本発明は、対象における老化に関連する疾患、障害、または状態を治療する方法を提供し、この方法は、対象から幹細胞を取り出すこと、細胞を少なくとも１つの老化細胞除去剤とともに培養すること、および培養細胞を対象に投与することを含む。

さらに別の態様では、本発明は、対象の加齢性疾患、障害、または状態を治療する方法を提供し、この方法は、対象から幹細胞を取り出すこと、細胞を少なくとも１つの老化細胞除去剤とともに培養すること、および培養細胞を対象に投与することを含む。

本発明による方法の特定の実施形態では、疾患、障害、または状態は変形性関節症である。

別の態様では、本発明は、対象における外科的転帰を改善する方法を提供し、この方法は、対象に少なくとも１つの老化細胞除去剤を投与することを含む。一実施形態では、老化細胞除去剤は、対象の手術部位に投与される。

さらに別の態様では、本発明は、対象の外科的転帰を改善する方法を提供し、この方法は、対象から幹細胞を取り出すこと、少なくとも１つの老化細胞除去剤とともに細胞を培養すること、および培養細胞を対象に投与することを含む。一実施形態では、培養細胞は、患者の手術部位に投与される。

本発明による方法の特定の実施形態では、外科的転帰は創傷治癒である。本発明による方法の追加の実施形態では、手術部位は創傷である。

別の態様では、本発明は、オルソバイオロジック生成物から老化細胞を除去する方法を提供し、この方法は、生成物に少なくとも１つの老化細胞除去剤を加えることを含む。オルソバイオロジック生成物は、限定するものではないが、骨移植片、自家血液、多血小板血漿（ＰＲＰ）、自家調整血清、幹細胞、骨髄吸引濃縮物（ＢＭＡＣ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）ＰＲＰ、アルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、羊水、胎盤組織、臍帯組織、およびヒアルロン酸からなる群より選択され得る。

本発明による方法の特定の実施形態では、少なくとも１つの老化細胞除去剤はフィセチンである。

一態様では、本発明は、加齢性疾患、障害、または状態の治療に使用するための少なくとも１つの老化細胞除去剤を含む医薬組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、老化に関連する疾患、障害、または状態の治療に使用するための少なくとも１つの老化細胞除去剤を含む医薬組成物を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、外科的転帰の改善に使用するための少なくとも１つの老化細胞除去剤を含む医薬組成物を提供する。

本発明による組成物の特定の実施形態では、少なくとも１つの老化細胞除去剤はフィセチン（Ｆｉｓｅｔｉｎ）である。

一態様では、本発明は、老化関連状態または疾患を有する対象を治療する方法を提供し、この方法は、対象または対象由来の組織サンプル中の老化を測定すること、老化細胞除去剤を対象に投与することを含む。一実施形態では、対象または対象の組織サンプルは、少なくとも約４％の老化細胞を含む。別の実施形態では、対象または対象の組織サンプルは、少なくとも約４％～約８％の老化細胞を含む。別の実施形態では、老化細胞除去剤はフィセチンである。

「からなる群より選択される少なくとも１つの．．．」または単に「からなる群より選択される」の選択を指定する本開示の実施形態では、このような言葉に続くリストの最後の２つの項目の間の接続詞「および」の使用は、その並び内の項目が互いに代替であること、およびこれらの項目の１つ（または複数）が選択されていることを示している。各項目が必ず選択されるということは意味しない。

本発明の他の実施形態は、後に続く詳細な説明を再検討すれば明らかになるであろう。

図１Ａ～１Ｅは、ＡＤＳＣの細胞老化に対する連続継代の影響を示している。図１Ａは、各継代数（ｐ３、ｐ４、ｐ６、およびｐ８）で、Ｃ１２ＦＤＧを用いて染色された細胞の割合をグラフで示している。図１Ｂ～１Ｅは、継代３（図１Ｂ）、継代４（図１Ｃ）、継代６（図１Ｄ）、および継代８（図１Ｅ）において、未染色対照をＣ１２ＦＤＧ染色ＡＤＳＣと比較する代表的なヒストグラムプロットである。Ｒ１領域は、Ｃ１２ＦＤＧに陽性の細胞を示す。一元ＡＮＯＶＡの結果は、全ての連続する継代が有意に異なることを示している（ｐ＜．０００１）。 図１－１の続き。 図１－２の続き。 図２Ａおよび２Ｂは、ＡＤＳＣにおける細胞老化に対する連続継代の効果を示している。図２Ａの棒グラフは、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）（因子ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＭＣＰ－１）が継代数（ｐ６からｐ８）とともに濃度が増加することを示している。図２Ｂは、継代数（ｐ４からｐ１８）とともに増加する老化関連ヘテロクロマチンフォーカス（ＳＡＨＦ Ｈ３Ｋ９およびＨ２ＡＸ）陽性細胞の％のプロットを示している。二元ＡＮＯＶＡは、ＳＡＳＰが有意に増加することを示している（＊＊＝ｐ＜．０１、＊＊＊＊＝ｐ＜．０００１）。一元ＡＮＯＶＡは、ＳＡＨＦが有意に増加することを示している（＊＊＝ｐ＜．０１）。 図３は、若い女性（ＹＦ）、高齢婦人（ＯＦ）、若い男性（ＹＭ）、および高齢男性（ＯＭ）の対象について、様々なフィセチン濃度（５０μＭ、２５μＭ、および１μＭ）での生細胞のパーセンテージを棒グラフの形で示している。値は、未処置の対照細胞を基準にしている。一元ＡＮＯＶＡでは、処置間で生細胞の割合に有意差は見られない。 図４Ａ～４Ｄは、フィセチン処置が、Ｃ１２ＦＤＧ染色を介してβ－ガラクトシダーゼを減少させることを示している。図４Ａのプロットは、フィセチン処置の有無にかかわらず、継代６、８、および１０でＣ１２ＦＤＧに陽性の細胞の割合を示している。処置の有無にかかわらず、Ｃ１２ＦＤＧについて陽性に染色された細胞の割合は、継代ごとに減少した。図４Ｂ～４Ｄは、継代６（図４Ｂ）、継代８（図４Ｃ）、および継代１０（図４Ｄ）において、未処置の対照をフィセチン処置したＡＤＳＣと比較する代表的なヒストグラムプロットを示す。Ｒ１領域は、Ｃ１２ＦＤＧに陽性の細胞を示す。一元ＡＮＯＶＡの統計は、各処置で有意差を示している（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１） 図４－１の続き。 図５Ａ～５Ｃは、フィセチン処置がＨ３Ｋ９およびγ－Ｈ２ＡＸ老化関連ヘテロクロマチンフォーカス（ＳＡＨＦ）を減少させることを示している。継代４および１８でフィセチンで処置された、または未処置のＹＦ（若い女性）に対するＯＦ（高齢女性）のＨ３Ｋ９およびγ－Ｈ２ＡＸに関して陽性に染色された細胞の減少率を図５Ａに要約する。結果は、図５Ｂ（継代４の場合）および図５Ｃ（継代１８の場合）のプロットにも示されている。一元ＡＮＯＶＡは、ＳＡＨＦの有意な減少を示す（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。 図６は、未処置の細胞対フィセチンで処置された細胞の、ＳＡＳＰ因子ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＭＣＰ－１の濃度を示す棒グラフを示す。一元ＡＮＯＶＡの統計は、各処置で有意差を示している（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１）。 図７は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓｅｐｍａｔｅｔ（商標）チューブおよびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを使用するＴ細胞濃縮のためのプロトコルを概略的に示している。 図８は、Ｃ１２ＦＤＧ染色およびフローサイトメトリーを使用した老化細胞の検出の結果の例を示している。イベントの細胞全体は、最適化された設定パラメータから得て、細胞のサブセットのさらなる評価のために考慮した。バックグラウンド細胞は除外／放出された。サブセットは、初期の老化細胞、中期の老化細胞、および後期の老化細胞として分類された。 図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、老化細胞の集団を示すフローサイトメトリープロット（ドット／密度プロットおよびヒストグラムプロット）である。図９Ａでは、細胞サイズがｙ軸とともに増加し、老化の強度がｘ軸とともに増加することが明らかにされている。図９Ｂは、中期老化（「Ｒ２」）および後期老化（「Ｒ１」）に対応する細胞集団を示している。図９Ｃのヒストグラムプロットは、別の方法で図９Ｂのデータを示し、中期（２４．６％）対、後期（３．５％）の老化細胞の割合をさらに定量化する。 図９－１の続き。 図１０Ａおよび１０Ｂは、フローサイトメトリーのドット／密度プロットを示す。図１０Ａは、２５歳の男性、５５歳の男性、および８５歳の男性のプロットを示している。 図１０Ａおよび１０Ｂは、フローサイトメトリーのドット／密度プロットを示す。図１０Ｂは、４１歳の女性と７７歳の女性のプロットを示している。 図１１Ａは、対象のサンプルの老化プロファイリング結果を示している。フローサイトメトリーの結果は、ドットプロット、生データ、および細胞数の平均として提供される。ディムでブライトな老化細胞を視覚化して、定量化する。 図１１Ｂは、研究対象のサブセット全体のディム老化細胞対ブライト老化細胞の量を棒グラフ形式で示している。

本開示が記載される前に、本開示は、記載された特定の方法および実験条件に限定されない（そのような方法および条件は変化し得るからである）ことを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用される場合、その値が列挙された値からの変化が１％以下であり得ることを意味する。例えば、本明細書において用いる場合、「約１００」という表現には、９９および１０１、ならびにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）が含まれる。

本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を本開示の実施に使用し得るが、ここでは、好ましい方法および材料を記載している。本明細書で言及される全ての刊行物は、それらの全体を説明するために参照により本明細書に組み入れられる。

老化細胞
老化細胞としては、限定するものではないが、老化前脂肪細胞、老化内皮細胞、老化線維芽細胞、老化ニューロン、老化上皮細胞、老化軟骨細胞、老化間葉細胞、老化マクロファージ、および老化平滑筋細胞が挙げられる。

老化細胞および老化細胞関連分子は、当技術分野で説明されている技術および手順によって検出され得る。例えば、組織内の老化細胞の存在は、老化マーカーであるＳＡ－βガラクトシダーゼ（ＳＡ－βｇａｌ）を検出する組織化学技術または免疫組織化学技術によって分析され得る（Ｄｉｍｒｉ，ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９３６３－９３６７；Ｌｅｅ、ｅｔ ａｌ．２００６ Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ ５（２）：１８７－１９５）。老化細胞関連ポリペプチドｐ１６、具体的には、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ２１Ｃｉｐ１の存在は、イムノブロッティング分析などの当技術分野で実施されている免疫化学法によって決定され得る（Ｄｉｍｒｉ、ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｂｉｏｌ．Ｓｉｇｎａｌｓ ５：１５４－１６２）。細胞におけるｐ１６ｍＲＮＡの発現は、定量的ＰＣＲを含む当技術分野で実践されている技術によって測定され得る。老化細胞関連ポリペプチド、例えば、一般にＳＡＳＰ因子もしくはタンパク質と呼ばれるＳＡＳＰのポリペプチド、または老化メッセージングセクレトーム（ＳＭＳ）の存在およびレベルは、自動化されたハイスループットアッセイを使用して決定され得る。

老化細胞の存在はまた、成長因子、プロテアーゼ、サイトカイン（例えば、炎症性サイトカイン）、ケモカイン、細胞関連代謝物、活性酸素種（例えば、Ｈ_２Ｏ_２）、ならびに炎症および／または対象の基礎疾患を促進もしくは悪化させ得る他の生物学的効果もしくは反応を刺激する他の分子を含む老化細胞関連分子の検出を介して決定され得る。

老化細胞除去剤
老化細胞除去剤は、老化細胞のアポトーシス／死を選択的に標的にして誘導する薬剤である（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｊ Ａｍ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｓｏｃ ６５（１０）：２２９７－２３０１；Ｚｈｕ，ｅｔ ａｌ．２０１５ Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ １４（４）：６４４－６５８）。老化細胞除去剤としては、限定するものではないが、フラボノイド（ケルセチン、フィセチン）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ダサチニブ）＋ケルセチン、アルカノイド（ピペロンギュミン）、クルクミン類似体、ナビトクラックス、１７－ＤＭＡＧ、ＢＣＬ－２標的化剤（ＡＢＴ－２６３、ＡＢＴ－７３７）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。具体的には、これらの薬剤は、老化の間にアップレギュレートされる老化細胞の抗アポトーシス経路（ＳＣＡＰ）を標的とする。老化細胞除去剤は、「ゲロプロテクター（ｇｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｏｒ）」または「セノセラピー（ｓｅｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」として公知の介入のグループに含まれることがある。老化細胞除去剤としてはまた、限定するものではないが、ミリセチン、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ガンマトコトリエノール、またはエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）のような老化保護（ｇｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）栄養素も含まれる。

老化マーカー／ＳＡＳＰ
老化細胞マーカーとしては、限定するものではないが、細胞サイズの増加、リポフシンの蓄積、細胞周期調節因子（例えば、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ）の高発現、ｐ２１ＣＩＰ１および老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）因子（例としては、限定するものではないが、ＴＮＦ－α、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、多機能サイトカインＩＬ－１ベータ、ケモカインＣＸＣＬ１０、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、およびＭＣＰ－１、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ３、およびセリンプロテアーゼ阻害剤ＰＡＩ－１（老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）：ＴＮＦ－アルファ、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、多機能サイトカインＩＬ－１β、ケモカインＣＸＣＬ１０、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５およびＭＣＰ－１、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ３、およびセリンプロテアーゼ阻害剤ＰＡＩ－１（Ｔｃｈｋｏｎｉａ，ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３，９６６－７２；Ｓｕｎ，ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２４，８７１－８８５；ＲａｏおよびＪａｃｋｓｏｎ ２０１６ Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ ２：６７６－６８７））、細胞老化関連β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－βｇａｌ）活性の増大／β－ガラクトシダーゼの蓄積、止血因子（例えば、ＰＡＩ－１）、プロテアーゼ、老化関連ヘテロクロマチンフォーカス（ＳＡＨＦ）の形成、ならびに老化関連衛星の膨張（ＳＡＤＳ）およびテロメア関連ＤＮＡ損傷フォーカス（ＴＡＦ）の出現（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｊ Ａｍ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｓｏｃ ２０１７ ６５（１０）：２２９７－２３０１；Ｃｏｐｐｅ、ｅｔ ａｌ．２０１０ ＡＲＰ ５：９９－１１８；ＹｏｕｎｇおよびＮａｒｉｔａ ２００９ ＥＭＢＯ Ｒｅｐ １０：２２８－３０）が挙げられる。

老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）は、老化細胞でしばしば発生する表現型を指し、それらのセクレトームの劇的な変化を示す（Ｃｏｐｐｅ，ｅｔ ａｌ．２０１０ ＡＲＰ５：９９－１１８；Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｎａｒｉｔａ ２００９ ＥＭＢＯ Ｒｅｐ １０：２２８－３０）。これは、炎症性サイトカイン、ブラジキニン、およびケモカイン、プロスタノイド、ｍｉＲＮＡ、ダメージ関連分子パターンタンパク質（ＤＡＭＰ）、組織損傷性プロテアーゼ（すなわち、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ））、幹細胞および前駆細胞の機能に影響を与える因子、止血因子、ならびに成長因子の放出を必然的に伴う（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｊ Ａｍ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｓｏｃ ２０１７ ６５（１０）：２２９７－２３０１）。ＳＡＳＰ因子としては、限定するものではないが、インターロイキン（ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１β）、単球走化性タンパク質－１、およびプラスミノーゲン活性化阻害剤－１が挙げられる。

老化細胞関連分子としては、老化関連分泌表現型、老化メッセージングセクレトーム、およびＤＮＡ損傷分泌プログラム（ＤＤＳＰ）を含むものとして当技術分野で記載されている分子が挙げられる。当技術分野で説明されているように、老化細胞関連分子のこれらの分類は、共通の分子を含み、分子の３つの別個の群を記述することを意図していない。老化細胞関連分子としては、特定の発現および分泌された成長因子、プロテアーゼ、サイトカイン、および強力なオートクリンおよびパラクリン活性を有し得る他の因子が挙げられる（例えば、Ｃｏｐｐｅ，ｅｔ ａｌ．２００６ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２９５６８－７４；Ｃｏｐｐｅ，ｅｔ ａｌ．２０１０ ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ５：９９－１１８；Ｋｒｔｏｌｉｃａ，ｅｔ ａｌ．２００１ ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１２０７２－７７；Ｐａｒｒｉｎｅｌｌｏ、ｅｔ ａｌ．２００５ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１８：４８５－９６）。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）関連因子としては、老化細胞で強く誘導される炎症性タンパク質およびＥＣＭリモデリングのメディエーターが挙げられる（例えば、Ｋｕｉｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９：８１－９４を参照のこと）。他の老化細胞関連分子としては、ＤＮＡ損傷分泌プログラム（ＤＤＳＰ）として集合的に記述される細胞外ポリペプチド（タンパク質）が挙げられる（例えば、Ｓｕｎ，ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｎａｔｕｒｅ １８：１３５９－１３６８を参照のこと）。老化細胞関連タンパク質としてはまた、老化細胞で発現される細胞表面タンパク質（または受容体）も含まれ、これには、検出可能な低量で存在するか、または非老化細胞の細胞表面に存在しないタンパク質が挙げられる。老化細胞関連タンパク質には、分化抗原群マーカーなど、特定の細胞型（例えば、ＣＤ２６、ＣＤ２８）の老化進行中に発現が変化した（喪失または獲得）細胞表面マーカーも含まれる。

老化細胞関連分子としては、老化細胞の炎症誘発性表現型を構成し得る分泌因子が挙げられる（例えば、ＳＡＳＰ）。これらの因子としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＲＯα、ＧＲＯαβγ、ＩＧＦＢＰ－７、ＩＬ－１γ、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＩＰ－１α、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－３、アンフィレグリン（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ＥＮＡ－７８、Ｅｏｔａｘｉｎ－３、ＧＣＰ－２、ＧＩＴＲ、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦＢＰ－２、ＩＧＦＢＰ－４、ＩＧＦＢＰ－５、ＩＧＦＢＰ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０、ＭＣＰ－４、ＭＩＦ、ＭＩＰ－３ａ、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４、ＮＡＰ２、オンコスタチン（Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ）Ｍ、オステオプロテオグリン、ＰＩＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ｓｇｐ１３０、ＴＩＭＰ－２、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、Ａｃｒｐ３０、アンギオゲニン、Ａｘｌ、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ、ＢＴＣ、ＣＴＡＣＫ、ＥＧＦ－Ｒ、Ｆａｓ、ＦＧＦ－７、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＨＣＣ－４、Ｉ－３０９、ＩＦＮ－γ、ＩＧＦＢＰ－１、ＩＧＦＢＰ－３、ＩＬ－１ Ｒ１、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＩＬ－２Ｒ－α、ＩＬ－６Ｒ、Ｉ－ＴＡＣ、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）、ＬＩＦ、ＭＭＰ－２、ＭＳＰ－ａ、ＰＡＩ－１、ＰＡＩ－２、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＳＣＦ、ＳＤＦ－１、ｓＴＮＦ ＲＩ、ｓＴＮＦ ＲＩＩ、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＴＩＭＰ－１、ｔＰＡ、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ－３、ＩＧＦ－１、ＴＧＦ－β３、ＭＩＰ－１－δ、ＩＬ－４、ＦＧＦ－７、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＩＬ－１６、ＢＭＰ－４、ＭＤＣ、ＭＣＰ－４、ＩＬ－１０、ＴＩＭＰ－１、Ｆｉｔ－３リガンド（Ｌｉｇａｎｄ）、ＩＣＡＭ－１、Ａｘｌ、ＣＮＴＦ、ＩＮＦγ、ＥＧＦ、ＢＭＰ－６。当技術分野で老化メッセージングセクレトーム（ＳＭＳ）因子と呼ばれることがある因子を含む追加の同定された因子は、そのいくつかはＳＡＳＰポリペプチドのリストに含まれており、これには、限定するものではないが、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、およびＩＧＦ２Ｒ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＤＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＡｌ１、ＴＧＦ－β、ＷＮＴ２、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＣＸＣＲ２結合ケモカインが挙げられる。細胞会合分子としてはまた、限定するものではないが、Ｓｕｎ，ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅに記載される分子が挙げられ、これには、例えば、遺伝子の産物、ＭＭＰ１、ＷＮＴ１６Ｂ、ＳＦＲＰ２、ＭＭＰ１２、ＳＰＩＮＫ１、ＭＭＰ１０、ＥＮＰＰ５、ＥＲＥＧ、ＢＭＰ６、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ、ＣＣＬ２６、ＡＲＥＧ、ＡＮＧＰＴ１、ＣＣＫ、ＴＨＢＤ、ＣＸＣＬ１４、ＮＯＶ、ＧＡＬ、ＮＰＰＣ、ＦＡＭ１５０Ｂ、ＣＳＴ１、ＧＤＮＦ、ＭＵＣＬ１、ＮＰＴＸ２、ＴＭＥＭ１５５、ＥＤＮ１、ＰＳＧ９、ＡＤＡＭＴＳ３、ＣＤ２４、ＰＰＢＰ、ＣＸＣＬ３、ＭＭＰ３、ＣＳＴ２、ＰＳＧ８、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＳＧ７、ＴＮＦＳＦ１５、Ｃ１７ｏｒｆ６７、ＣＡＬＣＡ、ＦＧＦＪ８、ＩＬ８、ＢＭＰ２、ＭＡＴＮ３、ＴＦＰ１、ＳＥＲＰＩＮＩ １、ＴＮＦＲＳＦ２５、およびＩＬ２３Ａが挙げられる（Ｃｏｐｐｅ，ｅｔ ａｌ．２０１０ ＡＲＰ ５：９９－１１８；ＹｏｕｎｇおよびＮａｒｉｔａ ２００９ ＥＭＢＯ Ｒｅｐ １０：２２８－３０；Ｂａｓｉｓｔｙ，ｅｔ ａｌ．２０２０ ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ１８（１）：ｅ３００５９９）。老化細胞関連タンパク質としては、また、老化細胞で発現される細胞表面タンパク質（または受容体）も挙げられ、これには、検出可能な低量で存在するか、または非老化細胞の細胞表面に存在しないタンパク質が挙げられる。

ＳＡＳＰ阻害剤
ＳＡＳＰ阻害剤とは、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）を中和する薬剤である。ＳＡＳＰ阻害剤は、老化防止剤と呼ばれることもあり、この薬剤は、炎症性セクレトームを調節し、老化および加齢性疾患を標的とする老化細胞除去薬を補充する。老化防止剤は、老化の有害な影響を選択的に抑制する（Ｋａｎｇ ２０１９ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ ４２（１２）：８２１－８２７）。ＳＡＳＰ阻害剤としては、限定するものではないが、メトホルミン、ラパマイシン、ＪＡＫ１／２阻害剤（例えば、ルキソリチニブ）、および糖質コルチコイドが挙げられる。特定の実施形態では、１つ以上のＳＡＰ阻害剤は、１つ以上の老化細胞除去剤と組み合わせて使用され得る。

加齢性疾患および状態を治療または改善するための方法
本開示は、加齢性疾患および状態を治療、改善、または予防する（すなわち、発生の可能性を低減する）ための方法を含む。加齢関連疾患および状態としては、老化に関連する状態が含まれる（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｊ Ａｍ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｓｏｃ ６５（１０）：２２９７－２３０１；Ｚｈｕ，ｅｔ ａｌ．２０１５Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ １４（４）：６４４－６５８）。本開示はまた、対象における加齢関連疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を治療、改善、または予防する（すなわち、発生の可能性を低減する）ための方法を含む。本発明のこの態様による方法は、治療有効量の老化細胞除去剤を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。さらなる実施形態では、この組成物は、少なくとも１つの老化防止剤をさらに含む。加齢性疾患および状態は、さらなる実施形態では、細胞老化に関するか、関連するか、またはそれによって引き起こされる状態、疾患、または障害である。老化細胞は、複数の病状のつながりになり得る（Ｂｈａｔｉａ－Ｄｅｙ，ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ ７：１３）。

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」などの用語は、症状を緩和すること、一時的または永続的に症状の原因を排除すること、または対象の加齢性疾患もしくは状態の症状の出現を予防もしくは遅らせることを意味する。特定の実施形態では、加齢に関連する疾患または状態としては、限定するものではないが、癌、腫瘍形成、転移、線維症、心血管疾患、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、心筋細胞肥大、心不全、末梢血管疾患、造血系の早期老化、肥満、肥満誘発性代謝症候群、脂肪萎縮、１型糖尿病、２型糖尿病、サルコペニア、炎症性疾患、骨関節炎、変性関節疾患、脊柱後弯症、骨粗鬆症、骨量の減少、椎間板ヘルニア、関節リウマチ、刺激性腸症候群、炎症性腸疾患、緑内障、白内障、肺疾患、肺機能不全、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、サルコペニア、腎機能障害／腎不全、タウ依存性病態、神経障害、神経変性、運動機能疾患、脳血管疾患、気腫、炎症性障害皮膚、および自然な老化が挙げられる。追加の実施形態では、加齢に関連する疾患または状態は、治癒が遅く、これには、損傷後（創傷治癒）または手術（術後治癒、理学療法への応答）を含む。

本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、加齢性疾患もしくは状態の１つもしくはそれ以上の症状もしくは徴候を示すか、および／または加齢性関連もしくは状態と診断されたヒトもしくは非ヒト哺乳動物を意味する。本開示を通して、「対象」、「患者」、および「それを必要とする対象」という用語は交換可能に使用される。「それを必要とする対象」という用語はまた、例えば、治療前に、加齢性疾患または状態の１つまたはそれ以上の兆候を示す（または示した）か、ならびに／または老化バイオマーカー、および／もしくはＳＡＳＰを示す患者も含み得る。「それを必要とする対象」という用語はまた、治療および／または外科手術、例えば整形外科手術を受ける予定の患者も含み得る。

医薬組成物
本発明は、少なくとも１つの老化細胞除去剤を対象に投与することを含み、ここで、この薬剤が、医薬組成物内に含まれる方法を含む。本発明の医薬組成物は、適切な担体、賦形剤、および適切な移動、送達、耐性などを提供する他の薬剤と配合されてもよい。多数の適切な処方が、全ての製薬化学者に公知の処方集に見出され得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質類、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型エマルジョンおよび油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物、が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「非経口製剤用の賦形剤の概要（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照のこと。

様々な送達システムが公知であり、これを用いて、本発明の医薬組成物、例えば、バイオエンジニアリングされた足場、リポソームへのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現し得る組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスを投与し得る（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照のこと）。投与方法としては、限定するものではないが、皮内、関節内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられる。組成物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。好ましい実施形態では、組成物は経口投与される。

特定の状況において、医薬組成物は、制御放出システムで送達され得る。別の実施形態では、高分子材料を使用してもよい；徐放性の医学的応用（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編集）、１９７４、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照のこと。さらに別の実施形態では、徐放性システムは、組成物の標的の近くに配置してもよく、したがって、全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４、徐放性の医学的応用（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）、前出、第２巻ｐｐ．１１５－１３８を参照のこと）。他の徐放性システムは、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３によるレビューで考察されている。

注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形を含み得る。これらの注射可能な調製物は、既知の方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射に従来使用されている滅菌水性媒体または油性媒体に薬剤を溶解、懸濁または乳化することによって調製され得る。注射用水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコースおよび他の補助剤などを含む等張液があり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などのような適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油状の媒体として、例えば、ゴマ油、大豆油などが使用され、これらは、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。

経口または非経口使用のための医薬組成物は、有効成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形に調製される。単位用量におけるそのような剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。

投与レジメン
本発明は、少なくとも１回の投薬頻度で少なくとも１つの老化細胞除去剤を対象に投与することを含む方法を含む。追加の実施形態では、本発明の方法は、対象に少なくとも１つの老化細胞除去剤を２回以上の投薬頻度で投与することを含む。なおさらなる実施形態では、投薬は、治療反応が達成されるような投薬である。この文脈での治療反応は、老化細胞の減少を構成する。特定の実施形態では、老化細胞除去剤の投薬は、慢性的または急性であるが、それでも、毎日の慢性治療からの潜在的な副作用を最小限にするために、本質的に一過性である（例えば、毎日服用はされない）。一実施形態では、老化細胞除去薬は、１か月間にわたって（急性）、月に２回、経口投与される。さらなる実施形態では、フィセチンは、経口的に１日２回用量で連続して投与され、その後、慣用的に２８日間休薬され、一過性レジメン（慢性）で数年または数十年にわたる。

本発明の特定の実施形態によれば、少なくとも１つの老化細胞除去剤の複数の用量を、定義された時間経過にわたって対象に投与してもよい。本発明のこの態様による方法は、対象に複数用量の薬剤を連続して投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続投与」とは、薬剤の各用量が、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週、または月）で隔てられた異なる日に、対象に投与されることを意味する。本発明は、薬剤の単一の初期用量、続いて薬剤の１つまたはそれ以上の二次用量、および場合によりその後薬剤の１つまたはそれ以上の三次用量を患者に連続して投与することを含む方法を含む。

「初期用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、少なくとも１つの老化細胞除去剤の投与の時間的順序を指す。したがって、「初期用量」とは、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり；「二次用量」とは、最初の用量の後に投与される用量であり；「三次用量」とは、二次用量の後に投与される用量である。初期、二次、および三次用量は、全て同じ量の薬剤を含み得るが、一般に、投与の頻度に関して互いに異なる場合がある。しかしながら、特定の実施形態では、初期、二次および／または三次用量に含まれる薬剤の量は、治療の過程中に互いに変化する（例えば、場合により上下に調整される）。

特定の実施形態による、本発明の方法は、少なくとも１つの老化細胞除去剤と組み合わせて第２の治療剤を対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」という表現は、第２の治療剤が老化細胞除去剤の前、後、または同時に投与されることを意味する。「と組み合わせて」という用語はまた、老化細胞除去剤および追加の治療剤の連続的または同時投与を含む。

投与量
本発明の方法に従って対象に投与される老化細胞除去剤の量は、一般に、治療上有効な量である。本明細書で使用される場合、「治療有効量」という句は、以下の１つまたはそれ以上をもたらす老化細胞除去剤の量を意味する：（ａ）老化細胞の測定可能な減少；および（ｂ）加齢性疾患または状態の症状の改善。一実施形態では、状態とは、創傷の治癒である。別の実施形態では、状態とは、変形性関節症または骨粗鬆症のような関連する整形外科状態である。

老化細胞除去剤の治療有効量とは、約０．０５ｍｇ～約１０００ｍｇ、例えば、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１．０ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２．０ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇまたはその間の任意の量の老化細胞除去剤であり得る。特定の実施形態では、５０ｍｇの老化細胞除去剤が投与される。追加の実施形態では、老化細胞除去剤は、フィセチンであり、インビトロで約１μＭ～約１００μＭで投与される。さらに別の実施形態では、老化細胞除去剤は、フィセチンであり、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇでヒト対象に投与される。

個々の用量内に含まれる老化細胞除去剤の量は、患者の体重１キログラムあたりの抗体のミリグラム（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）という用語で表してもよい。例えば、老化細胞除去剤は、患者の体重の約０．０００１～約１００ｍｇ／ｋｇの用量で患者に投与されてもよい。

本明細書に記載されているのは、老化細胞の排除を使用するための３つのアプローチである：ｉ）老化細胞および幹細胞バンクおよび移植を排除すること；ｉｉ）オルソバイオロジック生成物の老化細胞を排除すること；およびｉｉｉ）整形外科手術で老化細胞を排除すること。プロング（ｐｒｏｎｇ）１は、体の外側を想定しており、プロング２は体の内側を想定しており、プロング３は体の内側と外側の両方を想定している。

老化細胞の排除ならびに幹細胞バンクおよび移植
状態の治療のためにレシピエントに与えられる（「移植される」）ことを含めて、将来の使用のために幹細胞を保存すること（「幹細胞バンク」と呼ばれる）が望ましい。このバンクには、多くの場合、拡大が含まれる。ただし、幹細胞の再生能力は、エキソビボでの拡大後に低下する（Ｍｏｎｔｅｒｒａｓ，ｅｔ ａｌ．２００５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：２０６４－２０６７）。幹細胞がバンクされている場合、それらを拡大させると細胞に老化効果が誘導されると仮定されている。結果として、対象に注入されたバンクおよび拡大された細胞は、通常、老化細胞の割合が増加する。

一態様では、本開示は、バンクされた細胞の拡大時の（拡大中の）老化細胞の増殖／蓄積を最小化するために、バンクされた幹細胞から老化細胞を除去するための方法を提供する。追加の実施形態では、バンクされた細胞は、増殖後に処置される。さらに別の実施形態では、バンクされた細胞は、拡大サイクルの間に処置される。好ましい実施形態では、細胞は、液体窒素中で凍結する前に処置される。老化細胞を「取り除く、除去する（ｃｌｅａｒｉｎｇ）」とは、それらを標的にして殺滅することを意味する。「取り除く、除去する（ｃｌｅａｒｉｎｇ）」は、必ずしも全ての老化細胞が取り除かれる／殺滅されることを意味するわけではない。むしろ、それは、除去後の対象の老化細胞の数が以前よりもかなり少ないことを意味する。いくつかの実施形態では、老化細胞の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が取り除かれる。追加の実施形態では、老化治療剤は、上記の状況において、取り除くことによってではなく、むしろ健康および機能を若返らせることによって、幹細胞における老化表現型を減少させ得る。そのようなセノモルフィック剤は、例えば、細胞死を誘発することなく、老化のマーカーまたは老化細胞の分泌表現型を抑制し得る。

一実施形態では、老化細胞除去剤を、バンクされた幹細胞から老化細胞を取り除くために使用する。さらなる実施形態では、以前にバンクされた幹細胞は、インビトロで老化細胞除去剤で処置される。この治療は老化細胞の殺滅をもたらす。老化のない（または老化が減少した）幹細胞は、バンクのために細胞が最初に採取された対象への再導入のために精製および濃縮される。一実施形態では、このように精製および濃縮された老化のない（または老化が減少した）幹細胞は、例えば股関節炎を治療するために、関節軟骨が侵食された対象に再導入される。

加齢は、細胞老化および炎症誘発性シグナル伝達の増大に主に起因して、機能的な幹細胞の枯渇と関連している。筋骨格修復の潜在的な治療法とみなされるために、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）は、治療前に培養拡大する必要がある。加齢と同様に、ＡＤＳＣの長期のインビトロ拡大は、老化細胞の有意な蓄積をもたらす。本実施形態では、老化を弱め、濃縮された幹細胞集団を生成するために老化細胞除去薬を使用してもよい。

追加の実施形態では、老化細胞は、フローサイトメトリーを使用して、骨髄吸引物、骨髄濃縮物、および／または末梢血において定量化してもよい。後期老化細胞は、末梢血よりも骨髄穿刺液に多く存在するようである（データ示さず）。

オルソバイオロジック生成物における老化細胞の排除
本明細書で使用される「オルソバイオロジクス」または「オルソバイオロジック生成物」という用語は、例えば、損傷または手術後の骨、軟骨、腱、および／または靭帯の治癒を改善するために使用される生物学的物質を指す。この生成物は、体内で自然に見つかる物質から作られているので、生物製剤とみなされる。オルソバイオロジクスは、変性疾患の影響を最小限に抑え、筋骨格損傷からのより迅速な回復を可能にするという点で有利である。

オルソバイオロジクスとしては、典型的には、骨移植片、自家血液、多血小板血漿（ＰＰＰ）、高または低白血球含有量を有する誘導体（ＬＲ－ＰＲＰ、ＬＰ－ＰＲＰ）を含む多血小板血漿（ＰＲＰ）、自家調整血清、骨髄吸引濃縮物（ＢＭＡＣ）、および自家幹細胞が挙げられる。オルソバイオロジクスにはまた、抗線維化剤、老化療法剤、マイクロ断片化脂肪組織などの脂肪移植片、ナノ断片化脂肪組織、出生組織由来の生成物、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）インプラント、サプリメント、アルファ－２－マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、羊水、胎盤組織、臍帯組織、ヒアルロン酸注射（または他の粘液補充）、および幹細胞注射などの薬剤も含まれてもよい。

一実施形態では、フィセチン治療は、膝および／または股関節の中等度の変形性関節症を有する患者のオルソバイオロジクスに追加してもよく、オルソバイオロジクスによる老化細胞除去療法を受けていない患者と比較して、患者が報告する疼痛および軟骨喪失を減少させる。

整形外科手術における老化細胞の排除
老化細胞負荷は、加齢に伴う整形外科の状態と強く相関することが示されている。老化細胞の注射は、変形性関節症、虚弱、および生存率の低下などの加齢に関連する状態を促進するのに十分である。したがって、老化細胞を選択的に殺滅する治療法の開発は、老化表現型の発症を遅らせ、加齢性疾患の重症度を軽減し、回復力を改善し、生存を高め、寿命を延ばすことが期待される（Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４：１２４６－１２５６；Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｊ Ｇｅｒｅｎｔｏｌ Ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ７２（６）：７８０－７８５）。

さらに、老化細胞を標的にして排除することで、加齢に伴う筋骨格の衰退を緩和することが示されている。したがって、一態様では、本開示は、体内の既存の老化細胞を排除するために、幹細胞を採取する前に老化細胞除去剤で患者を治療することを提供する。対象には、例えば、フィセチンまたはケルセチンが投与される。次に、脂肪または骨髄または多血小板血漿細胞を採取し、対象への再注射のために拡大および／または濃縮する。結果として、対象の手術の転帰が改善される。例えば、治癒時間が短縮され、可動性が増大する（例えば、機能的性能試験によって評価されるように、関節の可動性が改善される）か、関節の軟骨が改善され（ＭＲＩ、Ｔ２マッピングなどによって評価される）か、疼痛が軽減される（ＰＲＯによって評価される）か、瘢痕組織が軽減されるか、および／または軟組織の治癒が強化されるか（すなわち、ＡＣＬＲ手順に従う）、および／または老化マーカーが軽減される。

外科的転帰の改善は、ベースラインからの正の変化を意味する。この文脈において、「陽性」という用語は、より良い治癒、または改善された疼痛スコアもしくは可動性のような他の臨床転帰に関連する変化を指す。本明細書で使用される場合、「ベースライン」という用語は、本発明による治療前または治療時の対象のパラメータの数値を意味する。

外科的転帰／パラメータが「改善された」か否かを決定するために、パラメータは、ベースラインおよび治療後の１つまたはそれ以上の時点で定量化される。治療開始後の特定の時点でのパラメータの値とベースラインでのパラメータの値との差を使用して、「改善」があったか否かを確認する。

以下の実施例は、当業者に、開示の方法および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために提示されており、本発明者らが、それらの開示とみなす範囲を限定することを意図するものではない。使用する数値（量、温度など）に関して正確性を確保するための努力が払われているが、いくつかの実験誤差および偏差を考慮する必要がある。特に明記されていない限り、部品は重量部、分子量は平均分子量、温度は摂氏の温度、圧力は大気圧またはそれに近い。

実施例１
幹細胞はエキソビボでの培養拡大の際に老化を蓄積する
連続継代（拡大）は、ＡＤＳＣにおける細胞老化を増大させる。老化はエキソビボで拡大した細胞で検出される。老化細胞を含む幹細胞の再注入は望ましくないので、各継代後に細胞の老化を評価した。脂肪由来幹細胞の培養拡大の影響を調べるために、継代２の細胞を解凍し、継代８まで培養した。細胞は、通常の増殖培地（１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ：Ｆ－１２）を使用してＴ－７５またはＴ－１７５培養フラスコで維持した。７０～９０％のコンフルエンシーで、細胞を継代し、１：４希釈でフラスコに再播種した。継代３、４、６、および８での老化を試験するために、細胞を１２ウェルプレートに４０，０００細胞／ウェルの密度で３回プレートした。一晩接着した後、細胞を、１００ｎＭのバフィロマイシンＡ１で３７℃および５％ＣＯ_２で１時間処置した。次に、３３μＭのＣ１２ＦＤＧを添加し、２時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ試薬を使用してプレートから収集した。Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターを使用して、Ｃ１２ＦＤＧ基質に陽性の細胞を定量した。

老化（老化細胞の％）は、継代ごとに増大し、継代３から継代４への急上昇を伴った。図１Ａは、ＡＤＳＣに対する継代の効果を示している。継代３（Ｐ３）での老化の６％は、継代４（Ｐ４）で３０％に急上昇して、継代６（Ｐ６）でさらに４５％に増大した。したがって、４回を超えて継代された細胞は、もはや再注入には適切ではなかった。むしろ、継代３まで培養されたバンク細胞が再注入に最適である。実際、Ｐ１からＰ４は、臨床グレードの細胞である。図１Ｂ～Ｅは、Ｃ１２ＦＤＧ染色のヒストグラムプロットを表している。Ｒ１領域は、Ｃ１２ＦＤＧに陽性の細胞を示す。

老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）濃度は、連続継代とともに増大する。老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）およびヘテロクロマチンフォーカス（ＳＡＨＦ）に対する継代の影響を決定するために、継代２細胞を解凍し、試験時にそれぞれの継代数まで培養した。ＡＤＳＣは１８回連続継代して、γ－Ｈ２ＡＸおよびＨ３Ｋ９に対する抗体で染色した。これらの抗体は、老化関連ヘテロクロマチンフォーカス（ＳＡＨＦ）に結合し、遺伝子サイレンシングおよびＤＮＡ損傷を示す。

具体的には、細胞は、通常の増殖培地（１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ：Ｆ－１２）を使用してＴ－７５培養フラスコで維持された。７０～９０％のコンフルエンシーで、細胞を継代し、１：４希釈でフラスコに再播種した。それぞれの試験継代数で、細胞を５，０００細胞／ｃｍ^２の密度でＳＡＨＦ染色用のチャンバースライドにプレートした。細胞を各群に３連で播種し、インキュベートして一晩接着させた。翌日、細胞を冷４％パラホルムアルデヒドで固定し、１：１５０希釈を使用してＨ２ＡＸ抗体で、および１：２５０希釈を使用してＨ３Ｋ９抗体で染色した。ＤＡＰＩは核の染色にも使用した。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｎｉ－Ｕ顕微鏡を使用して、ウェルあたり５つの画像および１群あたり３つのウェルを画像化した。Ｈ２ＡＸおよびＨ３Ｋ９抗体に陽性の細胞を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。

ＳＡＳＰ検出のために、細胞とともに２４時間インキュベートした後に培地を収集し、２０００×ｇで１０分間遠心分離し、新しいマイクロ遠心分離管に移し、そして試験まで－８０℃で保存した。ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ装置を使用したＨｕｍａｎ Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘキットを使用して、ＳＡＳＰを定量した。

図２Ａおよび２Ｂは、継代数の増加に伴い、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）およびヘテロクロマチンフォーカス（ＳＡＨＦ）も増加することを示している。ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＭＣＰ－１はそれぞれ、継代６継代から継代８代目まで濃度が増大した。したがって、本明細書では、加齢および培養物の拡大が老化レベルを増大させることが示されている。確かに、加齢個体および培養拡大細胞は、若い個体と比較して老化細胞の数が多かった。

実施例２
フィセチン治療は健康な幹細胞に対して無毒である
フィセチンは、多くの果物および野菜に見られる天然のフラボノイドである。フィセチンは、ヒドロキシル基に起因して、抗酸化剤および還元剤として公知である。これは、いくつかの炎症誘発性因子の分泌を減少させ、抗癌活性を有し、ｍＴＯＲおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を遮断し、したがって、フィセチンは、老化細胞を標的とする強力な治療剤であることが示されている。フィセチンは、分子式Ｃ_１５Ｈ_１０Ｏ_６、分子量２８６．２４ｇ／ｍｏｌ、ＣＡＳ名／番号：フィセチン、２－（３，４－ジヒドロキシフェニル）－３，７－ジヒドロキシクロメン－４－オン、５２８－４８－３、および化学構造：

を有する。

フィセチンで治療するときに健康な非老化細胞を殺滅することは有害であるので、最適なフィセチン用量を決定する必要があった。この濃度を決定する試みでは、健康な低継代ＡＤＳＣを使用して、健康な細胞が死んでいないことを確認した。

試薬には、ＡＤＳＣ培養培地（ＣＭ）（ＤＭＥＭ－Ｆ１２、Ｇｉｂｃｏ＃１１３２０；１０％ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ＃１６００００４４；１％ペニシリンストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０１２２）；が含まれていた；１ｘ ＣａおよびＭｇ Ｆｒｅｅ ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０２５０）；ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ＃１２６０５０２８）；およびフィセチン（Ｓｉｇｍａ＃Ｆ４０４３）。

脂肪由来幹細胞
１０歳の男性（ＹＭ）、２７歳の女性（ＹＦ）、７５歳の男性（ＯＭ）、および７９歳の女性（ＯＦ）から単離されたバンクのＡＤＳＣを購入し、通常の増殖培地（ＤＭＥＭ／Ｆ：１２、１０％ＦＢＳ、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で培養した。

フィセチン治療
フィセチンを成長培地に加え、細胞上で２４時間処置した。処置後、細胞毒性、蛍光抗体法、またはフローサイトメトリーに使用する前に、培地を通常の成長培地に２４時間交換した。

免疫蛍光
免疫蛍光の結果を生成して、核染色によって老化を検出する概念を証明した。γ－Ｈ２ＡＸおよびＨ３Ｋ９抗体を使用して、老化関連ヘテロクロマチンフォーカスを染色した。各細胞タイプには３つの複製ウェルが与えられ、各ウェルは、１群あたり合計１８の画像のために６回イメージングした。Ｉｍａｇｅ Ｊプログラムを使用して、各マーカーに陽性の細胞の数を定量した。収集されたデータを、一元ＡＮＯＶＡを使用して処理して、２つを除く全ての治療群が、継代４の若年女性および継代１８の高齢女性の細胞のγＨ２ＡＸ以外のあらゆる群で統計的に意味があることが見出された。

フローサイトメトリー
細胞を１００ｎＭのバフィロマイシンＡ１を用いて３７℃および５％ＣＯ_２で１時間処置した。次に、３３μＭのＣ１２ＦＤＧを添加し、２時間インキュベートした。したがって、細胞を蛍光老化関連マーカーＣ１２ＦＤＧで染色し、収集し、５０μＭのフィセチン処置後にフローサイトメトリーを使用して老化について試験した。１処置ごとに３つの複製を使用した。ＩｎＣｙｔｅソフトウェアを使用し、染色されていない対照細胞を使用して蛍光ゲーティングを決定した。

具体的には、細胞を３７℃の水浴中で解凍した。バイオセーフティーキャビネット内で、細胞（１ｍＬ）を収集し、９ｍＬの予熱したＡＤＳＣ培養培地（ＣＭ、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ：Ｆ－１２）に添加した。細胞を１０００×ｇで５分間遠心分離した。培地を吸引し、細胞を１ｍＬのＣＭに再懸濁した。１０μＬの細胞懸濁液を、マイクロ遠心チューブ中にピペッティングした。１０μＬの細胞懸濁液を１０μＬのトリパンブルーと混合した。１０ｕＬの細胞懸濁液／トリパンブルーを、カウンテススライドにピペッティングした。細胞数は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して記録した。３００，０００細胞／Ｔ－１７５フラスコに播種するのに必要な容積を計算した。２０ｍｌのＣＭをＴ－１７５フラスコに加えた。計算した細胞懸濁液容積を、Ｔ－１７５フラスコに加えた。そのフラスコを５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーターに入れた。細胞を一晩付着させた。フラスコをバイオセーフティーキャビネットに戻した。ＣＭを吸引し、次いで、１０ｍＬの１×ＤＰＢＳを加えて洗浄した。ＤＰＢＳを吸引した。２０ｍＬの予熱したＣＭを添加し、続いてインキュベーターで８０％コンフルエントになるまで培養し、２日ごとに培地を交換した。７０～９０％のコンフルエントで、培地を吸引した後、１０ｍＬの１×ＤＰＢＳで洗浄した。５ｍＬのＴｒｙｐＬＥを追加した。フラスコをインキュベーターに入れ、細胞の剥離を、顕微鏡でモニターした。剥離したら、５ｍＬのＣＭをフラスコに加えた。細胞懸濁液を１５ｍＬコニカルチューブに回収し、１０００×ｇで５分間遠心分離した。

培地を吸引し、細胞を１ｍＬのＣＭに再懸濁した。１０μＬの細胞懸濁液を、マイクロ遠心チューブ中にピペッティングした。１０μＬの細胞懸濁液を１０μＬのトリパンブルーと混合した。１０ｕＬの細胞懸濁液／トリパンブルーをカウンテススライド中にピペッティングした。細胞数は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して記録した。１２ウェルプレートに４０，０００細胞／ウェルを播種するのに必要な容積を計算した。１ウェルごとに１ｍＬのＣＭを添加し、続いて計算された細胞懸濁液容積を（各ウェルに）添加した。フラスコを５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーターに入れた。細胞を一晩付着させた。フラスコをバイオセーフティーキャビネットに戻した。ＣＭを吸引した後、ウェルごとに１ｍＬの１×ＤＰＢＳを加えて洗浄した。ＤＰＢＳを吸引した。１ｍＬの５０ｕＭフィセチン補充培養培地（Ｆｉｓｅｔｉｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ）を加えた。プレートをインキュベーター内で２４時間培養した。プレートは、バイオセーフティーキャビネットに戻した。培地を吸引した後、１ウェルあたり１ｍＬの１×ＤＰＢＳを加えて洗浄した。ＤＰＢＳを吸引した。１ｍＬの予熱したＣＭを添加した。細胞が８０％コンフルエンシーになるまでプレートをインキュベートした。次の工程は、下流の使用を続行することであった。

したがって、安価な市販の成長培地生成物を使用し、細胞を市販の培養システムで培養し、単回投与処置により老化細胞集団を減少させ、老化細胞を蓄積することなく培養拡大を可能にした。

細胞毒性
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを使用して、低継代（＜ｐ４）細胞に対する５０μＭ、２５μＭ、および１μＭのフィセチンの毒性を測定した。細胞を１２ウェルプレートに４０，０００細胞／ウェルで播種した。一晩接着した後、細胞を、５０μＭ、２５μＭ、および１μＭのフィセチンで２４時間処置した。処置後、培地をさらに２４時間、通常の増殖培地に変えて戻した。次に、製造元のプロトコルに従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙで細胞を処置した。値は、未処置の対照細胞を基準にしている。

結果
ＡＤＳＣの生存能力および増殖は、フィセチン曝露によって妨げられなかった。フィセチンは、１～５０μＭでＡＤＳＣに対して無毒であることが見出された（図３）。処置濃度間で毒性に有意差は認められなかった。５０μＭのフィセチン治療は、低継代ＡＤＳＣの健康に毒性はなかった。

実施例３
フィセチン治療は、老化幹細胞の減少をもたらす
ラパマイシンなどの免疫抑制剤は、早老症マウス由来の筋肉由来幹細胞における筋形成および軟骨形成分化を改善しながら、細胞老化を減少させることが以前に示されている。したがって、老化細胞、培養拡大細胞、およびバンク細胞からのＡＤＳＣの老化を低下させるために、老化細胞除去剤および抗酸化剤フィセチンを研究した。

脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）は、他の幹細胞の中でも、組織再生および加齢に伴う筋骨格変性の予防のための有望なツールとなり得る。ただし、これらの加齢に伴う状態は、細胞老化の形でＡＤＳＣ集団にも影響を及ぼす。これらの老化したＡＤＳＣは、高齢個体から単離されるか、および／または培養拡大されてバンクされた場合、治療の可能性を有意に失う場合がある。したがって、生存可能な幹細胞バンクが患者のために生成される場合、培養拡大の間にこれらの細胞を排除する理由がある。

老化細胞除去薬の使用は、加齢性疾患の影響を軽減し、寿命を改善することが示されている。インビボの転帰を改善するための新規の方法として、老化細胞除去剤は有望であることが証明されている；しかし、培養拡大およびバンクされたヒト幹細胞の濃縮のためのそれらの使用は示されていない。

先行の実施例からのデータに基づいて、インビトロでのフィセチンの老化能力を決定するために、５０μＭのフィセチン濃度を使用して、ＹＦおよびＯＦ細胞を処置した。老化細胞は、γ－Ｈ２ＡＸおよびＨ３Ｋ９を使用した免疫蛍光法によって定量した。同様に、ＹＭおよびＯＭ細胞は、フローサイトメトリー用のＣ_１２ＦＤＧを使用して定量した。Ｃ_１２ＦＤＧは、老化のバイオマーカーであるベータガラクトシダーゼと反応して、フローサイトメトリーで検出および定量化される蛍光発生基質が生成される。

方法
前述の培養方法および播種密度を使用して、各群に細胞を３回ずつ播種した。一晩付着させた後、培地を交換した。未処置群には通常のＡＤＳＣ成長培地を使用し（１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ：Ｆ－１２）、処置群には５０ｕＭのフィセチンを添加した。細胞を２４時間処置した後、全ての群で培地を通常の成長培地に変えて戻した。通常の成長培地でさらに２４時間培養した後、先行する実施例で説明したように、培地をＳＡＳＰ定量化のために収集するか、または細胞をＣ１２ＦＤＧもしくはＳＡＨＦ染色のために処置した。

Ｈ３Ｋ９およびＨ２ＡＸ（老化細胞の遺伝子サイレンシングに関与する核タンパク質）の抗体を使用して、７５歳の男性（「ＯＭ（ｏｌｄ ｍａｌｅ）」）由来の幹細胞におけるベースライン老化のレベルを定量した。老化細胞の除去に対するフィセチンの効果を決定するために、同じＯＭからのエキソビボで培養された幹細胞を、５０μＭのフィセチンで処置した。Ｈ３Ｋ９およびＨ２ＡＸは本質的に老化細胞を表している。

結果
本明細書では、天然のフラボノイドであり、老化細胞除去が証明されているフィセチンが、培養拡大の間の単回および断続的な用量によって、培養拡大およびバンクＡＤＳＣにおける老化蓄積を低減し得ることが示されている。これは、老化関連β－ガラクトシダーゼ（Ｃ１２ＦＤＧ、図４Ａ～図４Ｄ）、老化関連ヘテロクロマチンフォーカス（ＳＡＨＦ）Ｈ３Ｋ９およびγＨ２ＡＸ（図５Ａ－５Ｃ）、および老化関連分泌表現型（図６）の染色によって本明細書で実証されている。これらのＳＡＨＦは老化細胞によく見られ、遺伝子サイレンシングおよびＤＮＡ損傷を示すが、β－ガラクトシダーゼは老化細胞および加齢細胞での過剰発現に起因して、細胞老化のバイオマーカーとして標準的に使用されている。

したがって、フィセチン処置は、Ｃ１２ＦＤＧ染色を介して評価されるように、β－ガラクトシダーゼを減少させた（図４Ａ～図４Ｄ）。図４Ｂ～図４ＤのＲ１領域内で、Ｃ１２ＦＤＧに陽性の細胞はそれぞれのピークで示される。未処置の細胞は、処置された細胞と比較して有意に大きなピークを示すように見える。各スキャンの左半分は未処置の細胞を示し、「内側」のピークは老化細胞を表し、約１２０のカウントを示している。スキャンの右半分は５０μＭのフィセチンで処置された細胞を示し、「内側」のピークは老化細胞であり、約２０のカウントを示している。したがって、老化は、フィセチン処置細胞で有意に減少した。さらに、フィセチン処置により、Ｈ３Ｋ９およびγ－Ｈ２ＡＸ老化関連ヘテロクロマチンフォーカス（ＳＡＨＦ）が減少した（図５Ａ～図５Ｃ）。Ｈ３Ｋ９陽性の細胞数は、全ての群で有意に減少した（図５Ａ）。γ－Ｈ２ＡＸは、低継代ＯＦ細胞、低継代ＹＦ細胞、および高継代ＹＦ細胞で減少した。全ての群で、減少が示された。最後に、フィセチン処置は、血清枯渇培養培地で２４時間培養された、フィセチンで処置された細胞で示されるように、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）を減少させ、その後、培養培地はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用してＳＡＳＰについてアッセイされた。各処置に３つの複製を使用した。（図６）。サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＭＣＰ－１、公知のＳＡＳＰ因子は全て、フィセチン処置後に濃度の低下を示し、ＩＬ－６およびＭＣＰ－１の低下は特に顕著であった。

実施例４
老化細胞はＣ_１２ＦＤＧ染色およびフローサイトメトリーを使用して検出される
老化細胞およびそれらに関連する老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）因子を正確に検出する能力は、治療に対する個々の患者の応答の理解を容易にするか、および／または診療所における介入戦略を決定するのを助け得る。老化／老化細胞の同定、定量化、および／または特徴付けは、老化細胞の排除のために企図される上記で特定した４つのプロングのそれぞれにおいて使用され得る。一態様では、老化細胞は、Ｃ_１２ＦＤＧ染色およびフローサイトメトリーを使用して検出および／または定量化される。

老化した末梢血単核細胞のフローサイトメトリー支援分析の使用は、臨床診断用途で公知である。このような分析は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の特定のサブセット、すなわちＴ細胞に依存して、ヒト全血の経時的な年齢または老化状態を反映することが多い。しかし、本明細書では、ＰＢＭＣ由来のＣＤ４およびＣＤ８サブセットの１つではなくＣＤ４およびＣＤ８サブセットの両方を含む、全てのＴ細胞（ＣＤ３＋）を選択することで、Ｃ_１２ＦＤＧ染色を使用した老化細胞数において、再現性があり年齢相関のある変化の検出が可能になることを初めて説明する。

Ｃ_１２ＦＤＧ（５－ドデカノイルアミノフルオレセイン ジ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）は、β－ガラクトシダーゼ基質であり、１２炭素の親油性部分を含むように共有結合的に修飾されている。染色手順によって細胞内に一旦入ると、この基質はβ－ガラクトシダーゼ酵素によって切断され、おそらく細胞膜内に親油性テールを組み込むことによって、細胞によって十分に保持される蛍光生成物を生成する。Ｃ_１２ＦＤＧの分子式はＣ_４４Ｈ_５５ＮＯ_１６、分子量は８５３．９１５６、ＣＡＳ名／番号はドデカナミド、Ｎ－［３’、６’－ビス（β－Ｄ－ガラクトピラノシルオキシ）－３－オキソスピロ［イソベンゾフラン－１（３Ｈ）、９’－［９Ｈ］キサンテン］－５－イル］－１３８７７７－２５－０を有する。

ベータガラクトシダーゼ：

老化関連β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌまたはＳＡＢＧ）は、仮説によると、老化細胞および加齢細胞でのみβ－ガラクトシダーゼの単糖への加水分解を触媒する加水分解酵素である。老化関連ベータガラクトシダーゼは、特に老化細胞および加齢細胞におけるその過剰発現および蓄積に起因して、細胞老化のバイオマーカーである。

全血を対象からＡＣＤ－Ａを含む５０ｍｌの注射器に収集し、ロッカーにセットした。ＳｅｐＭａｔｅチューブ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、滅菌環境で１５ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐを使用して調製した。１０ｍｌの全血を、５０ｍｌのコニカルチューブに分注した。５００μｌ（５０ｕｌ／ｍｌ）のＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０ｍＬの血液サンプルに添加した。他の血液サンプルについては、比較のためにＴ細胞を濃縮せずに以下に説明するように総ＰＢＭＣを収集した。混合物を室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。等量希釈培地（ＤＭ－滅菌ＰＢＳおよび２％ＦＢＳ）を、サンプルに添加し、穏やかに混合した。希釈したサンプルを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配培地を含むＳｅｐＭａｔｅチューブにゆっくりと加えた。その混合物を１２００×ｇで１０分間遠心分離し、ブレーキをかけた。上清を新しいチューブに注ぐことにより、濃縮された細胞を収集した。濃縮された細胞を、ＤＭを乗せることにより洗浄し、次いで、ブレーキを低くして（４に設定）３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清みを廃棄し、細胞を１０ｍｌのＤＭで穏やかに復元した。最後の２つの工程を繰り返した。Ｔ細胞濃縮プロトコルを、図７に模式的に示す。ペレットを４ｍＬのＣ１２培養培地で復元し、２本の１５ｍｌコニカルチューブに均等に分配した。１方は３０μＭのＣ_１２ＦＤＧで処置して、もう１方は未標識の対照のままであった。キャップを緩め、チューブを１時間インキュベートした後、５％ＣＯ_２を含む組織培養インキュベーター内で３０分に１回反転混合した。細胞を回転させ、５ｍｌの冷ＰＢＳで２回洗浄した（フルブレーキで３００×ｇ）。次に、光から保護された氷上で、１ｍＬＰＢＳで復元した。

Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ＨＴを利用して、フローサイトメトリーを介してＣ１２ＦＤＧ細胞を分析した。Ｇｕａｖａの負荷は、以下のウェル割り当てスキームの例（以下の表１）に従ったものであった。

閾値およびゲインコントロールを設定した際に、サンプルを３回取得した。実行はＦＣＳファイルとして保存して、ゲートは標識した対照を除外した。ゲート内の全てがＣ_１２－ＦＤＧについて陽性であった。

分析
老化したＣＤ３^＋Ｔ細胞のパーセント、数、および濃度（細胞／ｍｌ）を評価するために、未染色の対照（すなわち、Ｃ_１２ＦＤＧで処置されていない細胞）を使用して設定を調整した。最初に、ＦＳＣおよびＳＳＣが細胞のイベントをキャッチするための閾値を設定した。次に、バックグラウンドのイベントが１０年から２０年の間に収まるように、グリーンチャネルゲインコントロールを設定した。最後に、ＰＢＳのみ（ビヒクル）は、調整された設定パラメータでイベントを登録しないことを保証した。

サンプルは、３つのウェルで実行し、あらゆる５つのウェルで水のみで実行した。通常、強度の程度が異なる老化細胞の明確な「亜集団」が見出された（図８）。これらは、Ｃ_１２ＦＤＧ分子の高い酵素分解に起因して強い蛍光シグナルを示す非常に「ブライト」な細胞を表している。これらの細胞は「後期」の老化細胞であると考えられており、生理学的に最も破壊的な細胞であり得る。さらなる実施形態では、細胞選別機を使用して、初期段階の老化細胞、中期老化細胞、および後期老化細胞として分類される細胞サブセットを選択（分類／蓄積）し得る。治療環境（前臨床または臨床）では、自己（自家）移植または同種（異系）移植の前に、選別された細胞を使用して、健康な細胞または非老化細胞の収集を最適化してもよい。

迅速アッセイの利点には、以下が挙げられる：ｉ）蛍光染色としてのＣ_１２ＦＤＧの使用（抗体染色免疫表現型検査とは対照的に）；ｉｉ）ベンチトップフローサイトメトリーの使用；ｉｉｉ）染色のダイナミクスに起因して、完全なアッセイがより迅速に（数時間で）実行され得る；ｉｖ）必要なサンプルは少量（わずか２～５ｍｌの血液）である；ｖ）ＣＤ３＋Ｔ細胞集団または総ＰＢＭＣ集団の使用；ｖｉ）老化細胞除去治療後の変化を検出する能力；ｖｉｉ）老化細胞数を血漿中の特定の炎症性因子および／またはＳＡＳＰと相関させる能力；ｖｉｉｉ）ＢＭＡおよび全血での使用；ならびにｉｘ）老化の潜在的な段階に対する感受性。

実施例５
フィセチン治療は、８２歳の男性の老化細胞の減少につながる
老化細胞をフィセチンで処置し、次にフローサイトメトリーを使用してさらに特徴付けた（上記の実施例４に記載されているように）。フィセチン治療（１日あたり１００ｍｇ、４５日間）の前後の８２歳の男性の末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞を、老化および老化細胞集団について評価した。治療前、対象は約２９％の老化細胞を測定し、治療後、対象は約４％の老化細胞を測定した（データ示さず）。したがって、老化細胞の数は、以下の表２に示すように、老化細胞除去剤フィセチンで処置することによって有意に減少した。

実施例６
老化細胞のさらなる特徴付け（「老化プロファイリング」）
静脈穿刺（血液検査）
資格のある瀉血専門医が、１９ゲージの翼状針を使用して、肘前（ＡＣ）領域、前腕または手の静脈から標準的な静脈穿刺を行った。約３５ｍＬの血液を、１つの３０ｃｃシリンジ（ＡＣＤ－Ａあり）および１つの５ｃｃ（ＡＣＤ－Ａなし）シリンジに吸引した。血液を、ＣＢＣカウント（データ示さず）、マルチプレックスイムノアッセイ（データ示さず）、Ｔ細胞発現アッセイ（データ示さず）、ならびにＣ１２ＦＤＧＦＬＯＷアッセイのために、濃縮Ｔ細胞および総ＰＢＭＣを使用して、使用した。総ＰＢＭＣおよび濃縮Ｔ細胞については、ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）勾配遠心分離による製造プロトコルに従って、ＳｅｐＭａｔｅＴＭチューブ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。具体的には、別のチューブで、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭ市販キットを、製造業者の指示（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１５０２１）に従って使用して、ＣＤ３＋Ｔ細胞を濃縮した。細胞の一部（濃縮Ｔ細胞および総ＰＢＭＣ）を、１０％ＦＢＳを補充した一般の培養培地で３０μＭ Ｃ１２ＦＤＧで染色し、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ、Ｌｕｍｉｎｅｘ）で分析した。老化したＣＤ３＋Ｔ細胞およびＰＢＭＣのパーセント、数、および濃度（細胞／ｍｌ）を評価するために、最初に未染色の対照（すなわち、Ｃ１２ＦＤＧで処置されていない細胞）を使用して設定を調整した。最初に、ＦＳＣおよびＳＳＣについて、細胞イベントをキャッチするための閾値を設定した。次に、バックグラウンドイベントが１０年から２０年の間に収まるように、グリーンチャネルゲインコントロールを設定した。最後に、ＰＢＳのみ（ビヒクル）が調整された設定パラメータでイベントを登録しないことを保証した。サンプルは、３回流し、５ウェル全部水のみで実行した。

図９Ａは、対照の非標識細胞を示している。標識がないと、老化細胞は検出されない。Ｔ細胞の染色により、高強度のブライト細胞および低強度のディム細胞の明確な集団が明らかになった。この強度の違いは、老化の間にアップレギュレートされた酵素であるβ－ガラクトシダーゼによって加水分解された場合にのみ蛍光マーカーＣ１２ＦＤＧが蛍光を発することに起因している（後者の発現の範囲のためにある範囲のシグナルにつながる）。集団は老化の段階を表しており、最もブライトなイベントは後期老化（高いＣ１２ＦＤＧシグナル）であり、おそらくより病的である。

一実施形態では、老化細胞をさらに特徴付けてもよい。別の実施形態では、老化細胞は、老化細胞除去剤での処置の前後に特徴付けられ得る。図９Ｂおよび図９Ｃは、老化細胞が中程度の老化細胞および高度に老化した細胞の集団から構成され、中程度の老化細胞が中期老化に対応し、高度に老化した細胞が後期老化に対応することを示す。

老化細胞の構成（例えば、中期および後期老化細胞）を、２５歳の男性と、５５歳の男性と、８５歳の男性との間で比較した。評価されたサンプルは末梢血サンプルであった。図１０Ａは、２５歳の男性の方が５５歳の男性よりも後期老化細胞の割合が低く（０．６％）、８５歳の男性（４．１％）よりも後期老化細胞の割合が低い（１．１％）ことを示している。図１０Ｂは、４１歳の女性が中期＋後期老化細胞の総数が少なく、後期老化細胞の総数が少なく、中期＋後期老化細胞の割合が低く、７７歳の女性に比べて後期老化細胞の割合が低いことを示している。

老化プロファイリングは、異なる年齢群の男性および女性の対象を含む、６７人の対象に対して実施された。各対象から末梢血を採取し、老化細胞の評価のために各サンプルでＴ細胞を濃縮した。総細胞、ディム細胞、およびブライト細胞（老化細胞）を、Ｃ１２ＦＤＧ細胞染色およびフローサイトメーター装置での分析を使用して測定した。散布図から得られた生データを、目的の２つの領域にゲートした：ｉ）ディム細胞（イベント）とｉｉ）ブライト細胞（イベント）。以下の「結果の解釈の実施例」で説明するように、各対象は、前述の形式のレポートで老化プロファイリングの結果を受け取った。ブライト老化細胞のパーセンテージ対ディム老化細胞のパーセンテージを評価した。各対象は、図１１Ａの形式のレポートで、老化プロファイリングの結果を受け取った。複数回の採血を行っている対象（縦断研究）の場合、レポートには老化細胞の経時変化が反映される。

染色された血液細胞（Ｔ細胞）の分析により、高強度または「ブライト」細胞とより低い「ディム」細胞の明確な亜集団が明らかになった。目的の蛍光マーカー（Ｃ１２ＦＤＧ、老化マーカー化合物）は、老化の間にアップレギュレートされた酵素（β－ガラクトシダーゼ）によって加水分解された場合にのみ蛍光を発し、β－ガラクトシダーゼ発現の範囲に起因するある範囲のシグナルをもたらす。これによって、これらの集団が老化の段階を表し、それによって最もブライトなイベントがより後期の老化（高いＣ１２ＦＤＧシグナル）であり、したがって潜在的により病的であることが示唆された。一実施形態では、これらの後期または「ブライト」細胞は、健康状態、具体的には、健康状態が悪いこと、または加齢関連および／または老化関連の疾患／障害のリスクが高いことを示す。これには、変形性関節症、骨粗鬆症、骨減少症、虚弱リスク、サルコペニア、腱障害、関節炎、筋力低下など（ただしこれらに限定されない）の筋骨格系の状態が挙げられる。これにはまた、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、認知機能低下などの神経変性疾患、およびアテローム性動脈硬化症などの心臓病のような他の加齢に伴う併存疾患も挙げられる。対象の群のデータは、図１１Ｂに要約されている。ブライト老化細胞の割合は、ディム老化細胞の割合よりも有意に低かった（さらに調査されているいくつかの外れ値を保存する）。

実施例７
老化細胞除去剤を使用して老化細胞を取り除くと、早老症マウスの変形性関節症が遅延した
ハッチンソン－ギルフォードプロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）は、早期老化（ラミンＡ欠乏症）を伴う常染色体優性疾患であり、小児期に早期死亡を引き起こす。急速な硬化性皮膚、関節拘縮、骨異常、および成長障害が、障害を有する対象において観察された。

Ｚｍｐｓｔｅ２４－／－（Ｚ２４－／－）マウスは、ＨＧＰＳの信頼できる動物モデルを構成する。それらは核ラミナの必須構成要素であるラミンＡを生成することができない。Ｚｍｐｓｔｅ２４－／－マウスモデルでは早期老化が観察され、実際、マウスでは老化細胞の蓄積が観察された。

Ｚｍｐｓｔｅ２４－／－マウスの変形性関節症に対する老化細胞除去薬の効果を調べた。

インビボでの老化細胞除去薬治療
成体早老症Ｚ２４－／－マウスに、２．５～３．０か月齢から開始して、強制経口投与（１５０μｌ容積）によって老化細胞除去薬を投与した。Ｄ／Ｑ（１０％ＰＥＧ４００／５．０％ＤＭＳＯ中に５ｍｇ／ｋｇ；５０ｍｇ／ｋｇ）は、２．５か月で単回投与、または２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、および５．０か月で複数回投与した。単回投与と複数回投与の両方のＤＱマウスを、５か月で屠殺した。ＦＩＳ（９０％ＰＥＧ４００／１０．０％エタノール中に１００ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスには、３．０か月齢から開始し、合計４週間の薬物投与を行い、４．０か月齢で屠殺した。１７－ＤＭＡＧ治療（１０ｍｇ／ｋｇ、１％ＤＭＳＯ－ＰＢＳ）の場合、マウスは２か月齢から開始して週に３回治療し、次いで４か月齢で屠殺した。

軟骨の組織学的評価
Ｚ２４－／－動物由来の膝関節を、１０％エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）プラス１％水酸化ナトリウムを使用して６週間脱灰した。膝関節全体を切断し、脱水し、次いでパラフィン包埋して、関節の中央（溝の高さ）および関節の端（顆頭の高さ）を矢状に見ることができるようにした。関節軟骨を調べるために、５μｍのパラフィン切片を切り取り、アルシアンブルー（酸性グリコサミノグリカンＧＡＧ；ムコ多糖を検出するため）およびサフラニン－Ｏ（プロテオグリカン含有量を検出するため）で染色した。中央（溝）と端（顆）の両方で、各動物の軟骨表面の全領域の画像を×２００の倍率でキャプチャした。画像は、Ｒｅｔｉｇａデジタルカメラを搭載したＬｅｉｃａ ＤＭＩＲＢ顕微鏡を使用して取得し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅソフトウェア（ｖ６．０；Ｅｍｐｉｘ Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用して評価した。

軟骨および初代軟骨細胞の免疫学的染色
ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性細胞の免疫組織化学染色を使用して、膝関節からの５μｍパラフィン切片の老化軟骨細胞数を評価した。簡単に説明すると、脱パラフィン、洗浄、およびＰＢＳ中の５％ロバ血清でブロッキングした後に、切片を５％ロバ血清中のウサギ抗ｐ１６抗体（Ａｂｃａｍ、１：１００）とともに一晩インキュベートした。続いて、ヤギ抗ウサギビオチン（ＢＡ １０００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ，１：２００希釈）、ＡＢＣ試薬（ＰＫ ７２００，Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのインキュベーションを使用して免疫反応性を検出し、製造業者の指示に従って、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色（ＳＫ－４１００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で可視化した。

初代軟骨細胞において異常な細胞核を検出するために、免疫蛍光測定法を実施した。培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で透過処置した。次に、細胞を、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ダコ・ジャパン、京都、日本）とインキュベートし、核ラミナの高感度マーカーとしてラミンＡ／Ｃ（１：５０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体で染色した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ１（１：１，０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して１時間インキュベートした。核を視覚化するために、核をＤＡＰＩ溶液（１：５００；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で５分間対比染色した。画像は、Ｒｅｔｉｇａデジタルカメラを搭載したＬｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢ顕微鏡で取得し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅソフトウェア（ｖ６．０；Ｅｍｐｉｘ Ｉｍａｇｉｎｇ）で評価した。

マイクロＣＴ分析
フィセチン治療のために、マウスは、以下の取得設定で、ｐｒｅ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＣＴ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙを介して、ｅＸｐｌｏｒｅ Ｌｏｃｕｓ Ｕｔｒａｐｒｅ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＣＴ Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＯＮ）を使用して画像化した：１４０ｋＶｐ、２２ｍＡ、１６秒回転／露出。非心臓ゲートＣＴ画像を、全ての時点で取得した。単純な逆投影は、０．１５４μｍの画像再構成から取得し、ＤＩＣＯＭ画像としてエクスポートした。画像解析は、ＯｓｉｒｉＸソフトウェアを使用して実行した。骨の定性分析は、ＯｓｉｒｉＸを使用した２Ｄおよび３Ｄ再構成で実行した。ＭｉｃｒｏＶｉｅｗイメージングソフトウェアは、骨塩密度の定量分析にも使用した。

Ｄ＋Ｑを使用して骨における有意な保護効果は観察されなかったが、植物栄養素フィセチンの使用は効果的であった。Ｚ２４－／－マウスは、３か月齢から開始して４週間にわたって毎週フィセチンで治療され（１００ｍｇ／ｋｇ）、その後４か月齢で屠殺された。Ｄ＋Ｑで治療された動物に見られるように、治療が無視できる影響を与え得る時点である、５か月で発生した、より高度な病状を考慮して、犠牲期間として４か月（５か月ではなく）を選択した。ＦＩＳで治療されたＺ２４－／－マウスは、老化マーカーｐ１６ＩＮＫ４ａならびにＳＡＳＰ因子ＩＬ－６およびＴＧＦ－βの転写レベルが低下していることがわかった（データ示さず）。組織の老化マーカーの減少に加えて、３か月齢から始まる数週間のＦＩＳの毎週の投与は、マイクロＣＴ分析によって証明されるように、Ｚ２４－／－マウスの骨密度の低下を有意に軽減することができた。フィセチンで治療したＺ２４－／－マウス対未治療のＺ２４－／－マウスでは、ハウンズフィールド単位（ＨＵ）強度、骨塩密度（ＢＭＤ）、および特定の骨表面（ＢＳ／ＢＶ）で有意に高いスコアが観察された。したがって、Ｄ＋Ｑとは異なり、フィセチンによる老化細胞除去療法は、加齢に伴う骨密度の低下を防ぎ、加齢の間の骨量減少に対する老化の重要性を示唆している。

実施例９
関節軟骨修復を改善するためのセノセラピー（ｓｅｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）フラボノイドを含む骨髄穿刺液濃縮物
マイクロフラクチャー（ＭＦｘ）は、軟骨損傷に対して最も一般的に使用される第一選択治療であり、主に線維軟骨修復組織の産生に起因して、長期の臨床転帰が劣っていることが示されている。ロサルタン投与は、軟骨修復のためのマイクロフラクチャーを強化することが判明した（Ｕｔｓｕｎｏｍｉｙａ，ｅｔ ａｌ．２０２０ ＡＪＳＭ ４８（４）：９７４－９８４）。骨髄穿刺液濃縮物（ＢＭＡＣ）は、骨軟骨欠損症、変形性関節症、および骨偽関節などの骨および軟骨の用途で正の効果を示した、別の生物学的生成物である。さらに、初期の臨床データは、ＢＭＡＣがＭＳＣの軟骨細胞分化およびパラクリンシグナル伝達の両方を通じて、より強力な硝子軟骨修復組織応答を刺激するのに役立ち得ることを示唆している。以前の研究では、フィセチンがマウスのＯＡ（変形性関節症）モデルにおいて軟骨破壊と軟骨下骨板の厚さを減少させ、滑膜炎を軽減したことが報告されている。しかし、フィセチンにＢＭＡＣおよびロサルタンを追加することの相乗効果は、まだ骨軟骨モデルで調査されていない。この実施例の目的は、ウサギモデルの軟骨修復に対するフィセチンの効果、ならびにロサルタンおよびＢＭＡＣとの相乗効果を決定することであった。

方法
自家移植のためのＢＭＡＣの収集および処理：骨髄穿刺液（ＢＭＡ）を、各ウサギの腸骨稜吸引によって収集し、ベンチトップ遠心分離機を使用して処理して、ＢＭＡＣを準備した。

外科的手順：４８個の骨格的に成熟したニュージーランド白ウサギを麻酔して、膝蓋骨溝（深さ：２ｍｍ）に直径５ｍｍの全層骨軟骨欠損（ＯＤ）を作製した。マイクロフラクチャー手術は、マイクロオール（ｍｉｃｒｏ－ａｗｌ）を使用して軟骨下骨に等間隔でかつ深さ２ｍｍの５つの穴を作成することにより、欠損内で実行した。マイクロフラクチャー手術後、０．５ｍｌのＢＭＡＣを左膝の関節内に注射した。各群に６匹のウサギを使用して、以下に列挙した８つの条件を比較する６週間および１２週間の研究を実施した。各エンドポイントで、マイクロＣＴ、ｑＰＣＲ、および組織学的分析のためにウサギを安楽死させた。

結果
予備データは、ウサギ骨軟骨欠損モデルにおいて、マイクロフラクチャーへのＢＭＡＣ、またはフィセチンおよびロサルタンの増強が、軟骨再生を加速することを示した（データ示さず）。したがって、フィセチンのような老化治療剤を使用すると、老化細胞をオルソバイオロジックＢＭＡＣから排除し得、この濃縮により、ＢＭＡＣの幹細胞が活性化され、再生能力が改善する可能性がある。

実施例１０
フィセチンは初期および後期の老化細胞を減少させる
５６～７７歳の年齢範囲を有する５人の患者を、１００ｍｇ／日のフィセチンで３０～４５日間治療した。注目すべきことに、Ｃ１２ＦＤＧ＋Ｔ細胞の「高い」ベースライン数または「ブライト」細胞を有する患者は、「ブライト」Ｃ１２ＦＤＧ＋Ｔ細胞の１０～２０分の１の減少を示した（データ示さず）。継代１９（Ｐ１９）で、前処理／未処理のブライト細胞は、平均１２．５３％と測定され、処理／後処理したブライト細胞は、平均１．１５％と測定された。継代５０（Ｐ５０）で、前処理／未処理のブライト細胞は、平均１９．８０％と測定され、一方で処理／後処理したブライト細胞は平均０．６０％と測定された。

中程度の老化、または「初期」段階の老化細胞集団（すなわち、Ｃ１２ＦＤＧについてよりディム染色をするもの）では、Ｃ１２ＦＤＧ＋細胞のパーセントも１～２分の１に減少した（データ示さず）。継代１９（Ｐ１９）で、前処理／未処理のディム細胞は、平均５４．２２％と測定され、一方で、処理済み／処理後のディム細胞は平均２６．７０％と測定された。継代５０（Ｐ５０）で、前処理／未処理のディム細胞は、平均５９．５９％と測定され、一方で処理済み／処理後のディム細胞は平均２７．５５％と測定された。

全体として、データは、１）既知の老化細胞標的化薬（老化細胞除去薬）を使用して老化細胞の変化を検出するための本明細書に記載の方法論の感度、および２）「ブライト」または「高度に老化した」細胞、老化の間の老化に関連する病状の主なドライバーであると考えられている細胞の数を有意に減少させる経口投与されたフィセチンの能力を示した。いくつかの実施形態では、高いベースラインのブライト／後期老化細胞を有する患者は、老化療法治療に特に有意に反応する。

本開示は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な修正が、前述の説明および添付の図から当業者には明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。

Claims (35)

1. 細胞サンプル中の老化細胞を検出する方法であって、細胞をＣ１２ＦＤＧで染色すること、および細胞をフローサイトメトリーに供することを含む前記方法。
2. 細胞サンプルがＣＤ３＋Ｔ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
3. 細胞サンプルが、全末梢血単核細胞、骨髄吸引物（ＢＭＡ）、全血、エキソビボ培養拡大幹細胞、バンクされた幹細胞、新たに単離された幹細胞、または内因性幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
4. 検出された老化細胞が老化の段階に従って特徴付けられる、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 特徴付けがシグナルの明るさに基づく、請求項４に記載の方法。
6. 老化の段階が、フローサイトメトリーによる正規化されたイベントゲーティングによって決定されるとおり、初期段階（比較的低いＣ１２ＦＤＧ陽性）、中期段階（比較的中程度のＣ１２ＦＤＧ陽性）、または後期段階（比較的高いＣ１２ＦＤＧ陽性）である、請求項４または５に記載の方法。
7. バンクされた幹細胞から老化細胞を除去する方法であって、細胞に少なくとも１つの老化細胞除去剤を加えることを含む前記方法。
8. バンクされた幹細胞を濃縮する方法であって、細胞に対して少なくとも１つの老化細胞除去剤を添加することを含む前記方法。
9. バンクされた幹細胞が、ＡＤＳＣ、エキソビボ培養拡大幹細胞、新たに単離された幹細胞、内因性幹細胞、骨髄吸引濃縮物（ＢＭＡＣ）幹細胞、および全血幹細胞からなる群より選択される、請求項７または８に記載の方法。
10. 老化細胞の少なくとも２５％が除去される、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 老化細胞の少なくとも５０％が除去される、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 老化細胞の少なくとも７５％が除去される、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 老化細胞の少なくとも８０％が除去される、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 老化細胞の少なくとも８５％が除去される、請求項７～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 老化細胞の少なくとも９０％が除去される、請求項７～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 老化細胞の少なくとも９５％が除去される、請求項７～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 対象における老化に関連する疾患、障害、または状態を治療する方法であって、対象に少なくとも１つの老化細胞除去剤を投与することを含む前記方法。
18. 対象の老化に関連する疾患、障害、または状態を治療する方法であって、対象から幹細胞を取り出すこと、少なくとも１つの老化細胞除去剤とともに細胞を培養すること、および培養細胞を対象に投与することを含む前記方法。
19. 対象の加齢性疾患、障害、または状態を治療する方法であって、対象から幹細胞を取り出すこと、少なくとも１つの老化細胞除去剤とともに細胞を培養すること、培養細胞を対象に投与することを含む前記方法。
20. 疾患、障害、または状態が変形性関節症である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 対象の外科的転帰を改善する方法であって、対象に少なくとも１つの老化細胞除去剤を投与することを含む前記方法。
22. 老化細胞除去剤が対象の手術部位に投与される、請求項２１に記載の方法。
23. 対象の外科的転帰を改善する方法であって、対象から幹細胞を取り出すこと、少なくとも１つの老化細胞除去剤とともに細胞を培養すること、および対象細胞を対象に投与することを含む前記方法。
24. 培養細胞が患者の手術部位に投与される、請求項２３に記載の方法。
25. 外科的転帰が創傷治癒である、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 手術部位が創傷である、請求項２２または２４に記載の方法。
27. オルソバイオロジック生成物から老化細胞を除去する方法であって、生成物に少なくとも１つの老化細胞除去剤を添加することを含む前記方法。
28. 少なくとも１つの老化細胞除去剤がフィセチンである、請求項７～２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 加齢性疾患、障害、または状態の治療に使用するための少なくとも１つの老化細胞除去剤を含む医薬組成物。
30. 老化に関連する疾患、障害、または状態の治療に使用するための少なくとも１つの老化細胞を含む医薬組成物。
31. 外科的転帰の改善に使用するための少なくとも１つの老化細胞除去剤を含む医薬組成物。
32. 少なくとも１つの老化細胞除去剤がフィセチンである、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の組成物。
33. 老化に関連する状態または疾患を有する対象を治療する方法であって、対象または対象由来の組織サンプル中の老化を測定すること、および老化細胞除去剤を対象に投与することを含む前記方法。
34. 対象または対象の組織サンプルが、少なくとも約４％の老化細胞を含む、請求項３３に記載の方法。
35. 老化細胞除去剤がフィセチンである、請求項３３または３４に記載の方法。

Images