CN101646418B - 调节免疫应答的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了调节免疫应答的方法和组合物，其包含以粒子形式将试剂递送至免疫细胞，其中试剂包含NF-κB信号转导途径的抑制剂和相当于靶抗原的抗原。本发明的方法和组合物特别用于与靶抗原相关的非所需的免疫应答的治疗或预防，所述的免疫应答包含自身免疫性疾病、变态反应和移植相关疾病。
Description
技术领域
本发明一般涉及调节免疫应答的组合物和方法。更具体地，本发明涉及通过粒子将试剂递送到免疫细胞，其中所述试剂包含NF-κB信号转导途径的抑制剂和相当于靶抗原的抗原。本发明的方法和组合物特别用于治疗或预防与靶抗原相关的非所需的免疫应答(包含自身免疫性疾病、变态反应和移植相关疾病)。
背景技术
NF-κB将信号从细胞表面转导至细胞核。经接头分子，通过细胞表面受体激活NF-κB和MAP激酶的信号转导，对于体内所有细胞的存活和激活十分重要，所述的细胞包含那些调节天然和适应性免疫的细胞，包含抗原递呈细胞如树突状细胞(DC)。因此，NF-κB是自身免疫中的关键信号转导组分，是自身免疫性疾病治疗中有吸引力的靶标。
NF-κB的功能
哺乳动物中存在五种NF-κB蛋白：p50、p52、c-Rel、p65/RelA和RelB。它们都有rel同源结构域(rel homology domain，RHD)，该结构域介导DNA结合，二聚体化和核转运。p50和p52同源二聚体转录不活跃，但能结合DNA。相比之下，c-rel或RelA能结合DNA，p50或p52能结合DNA并介导转录激活。因此，亚单位和亲和力的可利用性决定了细胞中NF-κB的组成(Hoffmann A，Baltimore D：Circuitry of nuclear factor kappaB signaling.Immunol.Rev.(2006)210：171-186)。
在未刺激的细胞中，NF-κB与抑制性蛋白或IκB(包含IκBα、IκBβ、IκBε、IκBγ、IκBNS、Bcl-3、p100和p105)结合，以非活性形式存在于胞质中(Ghosh S，M：Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.Cell(2002)109Suppl：S81-96)。这些蛋白含有锚蛋白重复结构(ankyrin repeats)，这一锚蛋白重复结构由两个紧密挤压在一起的螺旋、其后的环和紧密的发夹转角组成，该锚蛋白重复结构有利于结合NF-κB二聚体。NF-κB的NLS区使二聚体能够入核。IκBβ掩蔽NLS，阻止二聚体入核。相比之下，IκBα仅能掩蔽p65而非p50的NLS。通常IκBα中的出核序列能够阻止核保留。如果封闭NF-κB的这一出核序列，RelA/p50复合物保留在核中(Huang Tt，Kudo N，Yoshida M，Miyamoto S：A nuclear export signal in the N-terminal regulatorydomain of IkappaBalpha controls cytoplasmic localization of inactiveNF-kappaB/IkappaBalpha complexes.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2000)97(3)：1014-1019)。
多种受体-配体对激活NF-κB，这些受体-配体对包含TLR/病原信号、炎症受体(TNFR/TNF和IL-1R/IL-1)、T细胞(CD40/CD40L、TCR/MHC肽)和B细胞信号(BAFFR/BAFF、BCR/Ag)和分化信号如淋巴毒素/LTβ和RANK/RANKL。这些途径的信号转导导致丝/苏氨酸激酶IκB激酶(IKK)的激活(Yamamoto Y.Gaynor RB：IkappaB kinases：key regulators of the NF-kappaB pathway.TrendsBiochem.Sci.(2004)29(2)：72-79)。IKK磷酸化IκB，后者被特异性泛素连接酶复合体b-TrCP-SCF识别。泛素化的IκB被26S蛋白酶体降解，导致NF-κB的释放、入核和转录激活。IKK复合物由3个亚单位组成，这3个亚单位包含IKKα(IKK1)、IKKβ(IKK2)和相关的非催化调节亚单位IKKγ/NF-KB必需调节因子(IKKγ/NF-KBessential modulator，NEMO)。IKK可通过被丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)或NF-κB诱导激酶(NF-κB inducing kinase，NIK)磷酸化而激活，导致随后IKK复合物发生自身磷酸化并产生完整活性。IKKβ和NEMO缺陷小鼠对细胞因子和TLR激活的刺激不能产生完全的NF-κB激活，特别是RelA/p50的激活。相比之下，IKKα对于激活RelB/p52复合物和组蛋白磷酸化以增强NF-κB的DNA结合能力有特别的作用。
根据IKKα和IKKβ/NEMO在激活不同NF-κB亚单位中的不同作用，将NF-κB途径分为经典和替代途径，(此处统称为“NF-KB途径”)(Xiao G，Rabson AB，YoungW，Qing G，Qu Z：Alternative pathways of NF-kappaB activation：a double-edged swordin health and disease.Cytokine Growth Factor Rev.(2006)17(4)：281-293)。经典途径由TLR和促炎性细胞因子激活，产生IKKβ和NEMO依赖的磷酸化作用，降解IκB，随后激活RelA/p50异源二聚体。没有持续信号时，这一途径迅速关闭，这是由于IKKβ活性降低和诱导产生IκB。相比之下，替代途径由与细胞分化相关的信号(包含LTβ、CD40L和BAFF)激活。RelB/p52异源二聚体是主要被诱导的NF-κB蛋白，被p100(p52的前体)调节，p100含有被IKKα磷酸化所需要的IκB结构域靶位点。IKKα的信号特异性激活导致p100被加工成p52和RelB/p52的激活。这一途径的特征是持续的IKKα和持久的NF-κB的激活。替代途径似乎是经典NF-κB途径对细胞分化过程的适应，在B细胞和DC分化和淋巴器官发生中很重要。NIK似乎是激活IKKα的上游激酶。NIK、IKKα和RelB敲除小鼠在淋巴器官发生中有相似的缺陷。重要的是，经典和替代途径的激活有一些重叠。例如，在两个途径中都有LTβ信号并导致靶基因被激活(Dejardin E，Droin NM，Delhase M et al.：Thelymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via twoNF-kappaB pathways.Immunity(2002)17(4)：525-535)。LPS为典型的经典途径的激活因子，它也导致替代途径的激活(Mordmuller B，Krappmann D，Esen M，WegenerE，Scheidereit C：Lymphotoxin and lipopolysaccharide induce NF-kappaB-p52generation by a co-translational mechanism.EMBO Rep.(2003)4(1)：82-87)。这可能对于DC的有效分化是必需的，其在接触抗原后两条NF-κB途径上调，并向二级淋巴器官迁移。替代途径的激活保证了尽管新合成的IκBα抑制RelA/p50，但是新合成的RelB以及p100加工成p52导致RelB/p52取代二聚体或与其交换以及DC的持久分化(Saccani S，Pantano S，Natoli G：Modulation of NF-kappaB activity byexchange of dimers.Mol.Cell(2003)11(6)：1563-1574)。
在免疫应答中，NF-κB靶基因参与炎症、细胞组织和分化和增殖。组织巨噬细胞是NF-κB诱导的促炎性细胞因子的主要来源。NF-κB诱导的细胞因子如TNFα、IL-1和IL-6激活天然应答导致c-反应蛋白(c-reactive protein，CRP)和补体的释放，和局部内皮细胞粘附分子的上调。NF-κB诱导的趋化因子包含和生长因子(如GM-CSF)动员并将髓系细胞重新定向到局部组织，上述趋化因子包含IL-8、MIP-1α、MCP-1、RANTES和嗜酸性粒细胞活化趋化因子(eotaxin)。在炎性疾病如类风湿性关节炎(RA)和炎性肠病(IBD)中也出现如对感染的同样的反应。
NF-κB通过趋化因子CXC12、CXCL13、CCL21和CCL19的诱导而在淋巴器官发生中发挥作用。NF-κB在B和T细胞分化的许多阶段发挥作用(Claudio E.Brown K，Siebenlist U：NF-kappaB guides the survival and differentiation ofdeveloping lymphocytes.Cell Death Differ.(2006)13(5)：697-701)，包含在NKT细胞发育中的替代途径和在调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)发育中的经典和替代途径中的作用(Schmidt-Supprian M，Tian J，Grant EP et al.：Differential dependenceof CD4+CD25+regulatory and natural killer-like T cells on signals leading toNF-kappaB activation.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2004)101(13)：4566-4571；Schmidt-Supprian M，Courtois G，Tian J et al.：Mature T cells depend on signalingthrough the IKK complex.Immunity(2003)19(3)：377-389；Zheng Y，Vig M，Lyons J，Van Parijs L，Beg AA：Combined deficiency of p50 and cRel in CD4+ T cells reveals anessential requirement for nuclear factor kappaB in regulating mature T cell survival andin vivo function.J.Exp.Med.(2003)197(7)：861-874)。在幼稚T细胞有效产生IL-2中也需要c-Rel(Banerjee D，Liou HC，Sen R：c-Rel-dependent priming of naive T cellsby inflammatory cytokines.Immunity(2005)23(4)：445-458)，调节性T细胞(Treg)在胸腺后存活中严重依赖IL-2(D′Cruz LM，Klein L：Development and function ofagonist-induced CD25+Foxp3+regulatory T cells in the absence of interleukin 2signaling.Nat.Immunol.(2005)6(11)：1152-1159；Fontenot JD，Rasmussen JP，GavinMA，Rudensky AY：A function for interleukin 2 in Foxp3-expressing regulatory T cells.Nat.Immunol.(2005)6(11)：1142-1151)。NF-κB在淋巴细胞和非造血细胞如滑膜细胞(在RA中过度增殖)的增殖中发挥重要作用。相关的NF-κB靶基因包含c-myc、细胞周期因子D1(cyclin D1)和抗凋亡基因(包含c-IAP和Bcl-2)。
NF-κB在自身免疫性炎症中的作用
自身免疫性疾病是由包含三个不同但相关的要素的过程导致的，该过程包含：自身耐受性破坏，一个或几个器官慢性炎症的发展，以及(如果继续发展的话)组织崩解及随之产生的有害效应。“中枢”耐受缺陷是自发性自身免疫性疾病的重要原因。在胎儿和新生儿期，中枢耐受在胸腺中活跃地维持(Ardavin C：Thymicdendritic cells.Immunol.Today(1997)18：350-361)。在这一过程中，每个个体选择胸腺皮质上皮细胞(cTEC)展示的自身MHC限制的T细胞库。此外，对包含髓质上皮细胞(mTEC)和髓质树突状细胞(DC)的髓质抗原递呈细胞(APC)递呈的自身抗原发生反应的T细胞通过在与那些APC递呈的自身抗原之间的亲和力的阈值之上的阴性选择法而去除(Kappler JW，Roehm N，Marrack P：T cell toleranceby clonal elimination in the thymus.Cell(1987)49：273-280)。由于亲和力阈值适用于自身反应性T细胞的中枢去除，在外周就不可避免的有低亲和力的自身反应性T细胞的循环。正常情况下由外周体细胞表达的自身抗原在胸腺的低水平表达和递呈是常见的。这些抗原的表达被AIRE通过转录控制，而AIRE的表达又反过来由替代NF-κB途径控制(Anderson MS，Venanzi Es，Klein L et al.：Projection of animmunological self shadow within the thymus by the aire protein.Science(2002)298(5597)：1395-1401)。在自发性自身免疫模型中，APC和胸腺细胞相互作用中的多种缺陷干扰正常的阴性选择过程，从而允许自身反应性T细胞进入外周，在外周继发的环境事件更容易诱发自身免疫性疾病(Yoshitomi H，Sakaguchi N，Kobayashi K et al.：A role for fungal{beta}-glucans and their receptor Dectin-1 in theinduction of autoimmune arthritis in genetically susceptible mice.J.Exp.Med.(2005)201(6)：949-960)。一般来说，病毒或没有在胸腺中表达过的修饰自身抗原被外周DC递呈而引起自身免疫。在人类自身免疫性疾病中已经描述了一些修饰的自身抗原。
树突状细胞(Dendritic Cell)
有人提出，在免疫系统中，DC是关键的决定细胞(Fazekas de St Groth B.Theevolution of self-tolerance：a new cell arises to meet the challenge of self-reactivity.Immunol Today.1998；19：448-54)。通过它们在产生中枢和外周耐受中的作用，以及在初始免疫应答和在刺激记忆性和效应性T细胞中的作用，DC似乎在自身免疫性和自身免疫性疾病的持续中发挥重要作用。然而，令人兴奋的是，对DC对外周耐受的作用方式的理解使人们可能在自身免疫性疾病的抗原特异性免疫治疗和移植中利用它们。
目前认为，DC是天然和获得性免疫两大免疫系统的重要调节因子(BanchereauJ，Steinman RM.Dendritic cells and the control of immunity.Nature.1998 Mar19；392(6673)：245-52)。它们负责刺激幼稚T淋巴细胞，这一特性使它们与所有其他抗原递呈细胞(APC)相区别。DC还是初次抗体应答的产生中的必要的辅助细胞(Inaba K，Steinman RM，Van Voorhis WC，Muramatsu S.Dendritic cells are criticalaccessory cells for thymus-dependent antibody responses in mouse and in man.ProcNatl Acad Sci U S A.1983Oct；80(19)：6041-5)，是NK细胞的细胞毒性的有力增强子(Kitamura H，Iwakabe K，Yahata T，Nishimura S，Ohta A，Ohmi Y，et al.The naturalkiller T(NKT)cell ligand alpha-galactosylceramide demonstrates itsimmunopotentiating effect by inducing interleukin(IL)-12 production by dendritic cellsand IL-12 receptor expression on NKT cells.J Exp Med.1999Apr 5；189(7)：1121-8)。DC对于启动辅助性和细胞毒性T淋巴细胞的初次免疫应答十分重要，因而DC起“天然佐剂”的作用(Schuler G，Steinman RM.Dendritic cells as adjuvants forimmune-mediated resistance to tumors.J Exp Med.1997Oct 20；186(8)：1183-7)。相比之下，DC也参与维持对抗原的耐受。DC通过将抗原递呈给T细胞并清除那些表现出强自身反应性的T细胞，从而在胸腺中枢耐受和T细胞库形成中起作用(Brocker T.Survival of mature CD4T lymphocytes is dependent on majorhistocompatibility complex class II-expressing dendritic cells.J Exp Med.1997Oct20；186(8)：1223-32)。然而，DC也在外周耐受中发挥作用。在此，DC通过清除自身反应性淋巴细胞和扩增调节性T细胞(T reg)群而发挥作用。因此，有可能在自身免疫性疾病中恢复耐受性的保护性和治疗性策略中使用DC。
DC前体通过血流从骨髓迁移到外周组织，在那里作为未成熟的DC驻留。未成熟的DC有效捕捉入侵的病原和其他粒子和可溶性的抗原(Ag)。摄入抗原后，DC迅速穿过淋巴管内皮并迁移到引流的次级淋巴器官。在摄入免疫原性抗原及淋巴迁移后，DC经历成熟的过程，该过程的特征是捕捉抗原的能力下调及抗原处理和递呈的能力上调，协同刺激分子的表达和树突状形态的改变(Steinman RM.Thedendritic cell system and its role in immunogenicity.Annu Rev Immunol.1991；9：271-96；Cella M，Sallusto F，Lanzavecchia A.Origin，maturation and antigenpresenting function of dendritic cells.Curr Opin Immunol.1997Feb；9(1)：10-6；Cella M，Scheidegger D，Palmer-Lehmann K，Lane P，Lanzavecchia A，Alber G.Ligation ofCD40 on dendritic cells triggers production of high levels of interleukin-12 andenhances T cell stimulatory capacity：T-T help via APC activation.J Exp Med.1996Aug 1；184(2)：747-52)。在将抗原递呈给次级淋巴器官的T细胞区的幼稚T细胞后，大多数DC消失(可能通过凋亡而消失)。因此，在最适条件下，同一DC顺次执行不同的功能如捕捉和处理抗原，将抗原递呈给稀少的幼稚的抗原特异性T细胞和诱导抗原特异性T细胞克隆扩增。
考虑到DC在抗原处理和递呈，从而在调节免疫反应性方面的重要作用，DC是免疫应答的重要指导者，这一作用通过与应答淋巴细胞和其他辅佐细胞的相互作用来实现。一般而言，有证据表明，在稳定状态条件下，DC前体向组织的募集和向次级淋巴器官的迁移/成熟的发生率低并可能有助于诱导耐受。另一方面，对未成熟的DC的导致DC成熟和激活的刺激可以诱导有效的免疫应答(Sallusto F，Lanzavecchia A.Mobilizing dendritic cells for tolerance，priming，and chronicinflammation.J Exp Med.1999Feb 15；189(4)：611-4)。
多种机制可刺激DC的成熟过程，包含来自病原的分子(LPS、DNA、RNA)、促炎性细胞因子(TNFα、IL-1、IL-6)，组织因子如透明质烷片段，DC在发炎的组织和淋巴系统间的内皮屏障间的迁移，以及来自T细胞的信号(CD154)(Sparwasser T，Koch ES，Vabulas RM，Heeg K，Lipford GB，Ellwart JW，et al.Bacterial DNA and immunostimulatory CpG oligonucleotides trigger maturation andactivation of murine dendritic cells.Eur J Immunol.1998 Jun；28(6)：2045-54；Cella M，Salio M，Sakakibara Y，Langen H，Julkunen I，Lanzavecchia A.Maturation，activation，and protection of dendritic cells induced by double-stranded RNA.J Exp Med.1999Mar 1；189(5)：821-9；De Smedt T，Pajak B，Muraille E，Lespagnard L，Heinen E，DeBaetselier P，et al.Regulation of dendritic cell numbers and maturation bylipopolysaccharide in vivo.J Exp Med.1996 Oct 1；184(4)：1413-24)。相比而言，抗炎性信号(如IL-10，TGFβ，前列腺素和皮质类固醇)倾向于抑制成熟(De Smedt T，Van Mechelen M，De Becker G，Urbain J，Leo O，Moser M.Effect of interleukin-10ondendritic cell maturation and function.Eur J Immunol.1997 May；27(5)：1229-35；Geissmann F，Revy P，Regnault A，Lepelletier Y，Dy M，Brousse N，et al.TGF-beta 1prevents the noncognate maturation of human dendritic Langerhans cells.J Immunol.1999 Apr 15；162(8)：4567-75；de Jong EC，Vieira PL，Kalinski P，Kapsenberg ML.Corticosteroids inhibit the production of inflammatory mediators in immaturemonocyte-derived DC and induce the development of tolerogenic DC3.J Leukoc Biol.1999Aug；66(2)：201-4)。因此，无论是增强还是减弱免疫性从而使疾病缓解，DC都代表了一种有吸引力的治疗靶标。迄今为止，在将其转入动物或人的接受者体内之前，将DC进行离体调节和使其暴露于抗原已经成为实现保护性和治疗性免疫的主要方法。这部分地与DC系统有免疫系统疾病的完整人体环境中的复杂性相关，部分地与难以将特异性抗原和免疫调节剂递送至体内相关。
NF-κB在调节DC功能中的作用
髓系DC诱导免疫或耐受的能力与其成熟状态相关，从而与NF-κB活性相关(Dhodapkar MV，Steinman RM，Krasovsky J，Munz C，Bhardwaj N.Antigen-specificinhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendriticcells.J Exp Med.2001 Jan 15；193(2)：233-8；Jonuleit H，Schmitt E，Schuler G，Knop J，Enk AH.Induction of interleukin 10-producing，nonproliferating CD4(+)T cells withregulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature humandendritic cells.J Exp Med.2000Nov 6；192(9)：1213-22；Lutz MB，Kukutsch NA，Menges M，Rossner S，Schuler G.Culture of bone marrow cells in GM-CSF plus highdoses of lipopolysaccharide generates exclusively immature dendritic cells whichinduce alloantigen-specific CD4T cell anergy in vitro.Eur J Immunol.2000Apr；30(4)：1048-52：Mehling A，Grabbe S，Voskort M，Schwarz T，Luger TA，Beissert S.Mycophenolate mofetil impairs the maturation and function of murine dendritic cells.JImmunol.2000Sep 1；165(5)：2374-81)。小鼠BM产生的未成熟DC诱导体外T细胞不应答和同种异体移植的存活时间延长(Lutz MB，Suri RM，Niimi M，Ogilvie AL，Kukutsch NA，Rossner S，et al.Immature dendritic cells generated with low doses ofGM-CSF in the absence of IL-4 are maturation resistant and prolong allograft survivalin vivo.Eur J Immunol.2000 Jul；30(7)：1813-22)。多种药物、细胞因子和NF-κB的抑制剂抑制髓系DC的成熟(de Jong EC，Vieira PL，Kalinski P，Kapsenberg ML.Corticosteroids inhibit the production of inflammatory mediators in immaturemonocyte-derived DC and induce the development of tolerogenic DC3.J Leukoc Biol.1999 Aug；66(2)：201-4；Griffin MD，Lutz W，Phan VA，Bachman LA，McKean DJ，Kumar R.Dendritic cell modulation by 1 alpha，25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs：a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturityin vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A.2001 Jun 5；98(12)：6800-5；Hackstein H，Morelli AE，Larregina AT，Ganster RW，Papworth GD，Logar AJ，et al.Aspirin inhibitsin vitro maturation and in vivo immunostimulatory function of murine myeloid dendriticcells.J Immunol.2001 Jun 15；166(12)：7053-62；Lee JI，Ganster RW，Geller DA，Burckart GJ，Thomson AW，Lu L.Cyclosporine A inhibits the expression ofcostimulatory molecules on in vitro-generated dendritic cells：association with reducednuclear translocation of nuclear factor kappa B.Transplantation.1999 Nov15；68(9)：1255-63；Steinbrink K，Wolfl M，Jonuleit H，Knop J，Enk AH.Induction oftolerance by IL-10-treated dendritic cells.J Immunol.1997Nov 15；159(10)：4772-80；Yoshimura S，Bondeson J，Foxwell BM，Brennan FM，Feldmann M.Effective antigenpresentation by dendritic cells is NF-kappaB dependent：coordinate regulation of MHC，co-stimulatory molecules and cytokines.Int Immunol.2001May；13(5)：675-83)，这些因素包含皮质类固醇、水杨酸盐、麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)、转化生长因子(TGF)-β、IL-10。在这些制剂存在时产生的DC改变体内体外T细胞的功能，包含促进同种异体移植的存活(Giannoukakis N，Bonham CA，Qian S，ZhouZ，Peng L，Harnaha J，et al.Prolongation of cardiac allograft survival using dendriticcells treated with NF-κB decoy oligodeoxyribonucleotides.Mol Ther.2000；1(5Pt1)：430-7；Griffin MD，Lutz W，Phan VA，Bachman LA，McKean DJ，Kumar R.Dendritic cell modulation by 1 alpha，25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs：a vitaminD receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitroand in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A.2001；98(12)：6800-5；Rea D，van Kooten C，vanMeijgaarden KE，Ottenhoff TH，Melief CJ，Offringa R.Glucocorticoids transformCD40-triggering of dendritic cells into an alternative activation pathway resulting inantigen-presenting cells that secrete IL-10.Blood.2000May 15；95(10)：3162-7；AdoriniL，Penna G，Giarratana N，Uskokovic M.Tolerogenic dendritic cells induced by vitaminD receptor ligands enhance regulatory T cells inhibiting allograft rejection andautoimmune diseases.J Cell Biochem.2003 Feb 1；88(2)：227-33)。NF-κB的活性导致一些参与免疫应答的基因的转录。特别地，髓质DC的分化需要RelB的活性(BurklyL，Hession C，Ogata L，Reilly C，Marconi LA，Olson D，et al.Expression of relB isrequired for the development of thymic medulla and dendritic cells.Nature.1995 Feb9；373(6514)：531-6；Weih F，Carrasco D，Durham SK，Barton DS，Rizzo CA，Ryseck RP，et al.Multiorgan inflammation and hematopoietic abnormalities in mice with a targeteddisruption of RelB，a member of the NF-kappa B/Rel family.Cell.1995；80(2)：331-40；Wu L，D′Amico A，Winkel KD，Suter M，Lo D，Shortman K.RelB is essential for thedevelopment of myeloid-related CD8alpha-dendritic cells but not of lymphoid-relatedCD8alpha+dendritic cells.Immunity.1998Dec；9(6)：839-47)。RelB通过调节CD40和MHC分子的表达来调节DC和B细胞的APC功能(O′Sullivan BJ，MacDonald KP，Pettit AR，Thomas R.RelB nuclear translocation regulates B cell MHC molecule，CD40expression，and antigen-presenting cell function.Proc Natl Acad Sci U S A.2000Oct10；97(21)：11421-6；O′Sullivan BJ，Thomas R.CD40 Ligation conditions dendritic cellantigen-presenting function through sustained activation of NF-kappaB.J Immunol.2002Jun 1；168(11)：5491-8；Martin E，O′Sullivan B，Low P，Thomas R.antigen-specificsuppression of a primed immune response by dendritic cells mediated by regulatory Tcells secreting interleukin-10.Immunity.2003 Jan；18(1)：155-67)。本发明人证明，RelB功能被抑制的暴露于抗原的DC缺少细胞表面的CD40，阻止免疫的启动，并且抑制以前启动的免疫应答。而保留了随后激活潜能的未成熟的DC仅能中度抑制已启动的免疫应答，没有这种潜能的RelB缺陷的DC有强得多的抑制能力(Martin E，O′Sullivan B，Low P，Thomas R.Antigen-specific suppression of a primed immuneresponse by dendritic cells mediated by regulatory T cells secreting interleukin-10.Immunity.2003 Jan；18(1)：155-67)。
树突状细胞在耐受中的用途
人类和啮齿动物中，越来越多的证据强烈提示，未成熟的或NF-KB缺陷的DC可通过诱导调节性T细胞的分化控制外周耐受(Dhodapkar MV，Steinman RM，Krasovsky J，Munz C，Bhardwaj N.Antigen-specific inhibition of effector T cellfunction in humans after injection of immature dendritic cells.J Exp Med.2001 Jan15；193(2)：233-8；Jonuleit H，Schmitt E，Schuler G，Knop J，Enk AH.Induction ofinterleukin 10-producing，nonproliferating CD4(+)T cells with regulatory properties byrepetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells.J Exp Med.2000Nov 6；192(9)：1213-22；Martin E，O′Sullivan B，Low P，Thomas R.Antigen-specificsuppression of a primed immune response by dendritic cells mediated by regulatory Tcells secreting interleukin-10.Immunity.2003Jan；18(1)：155-67；Roncarolo MG，Levings MK，Traversari C.Differentiation of T regulatory cells by immature dendriticcells.J Exp Med.2001Jan 15；193(2)：F5-9)。因而，用未成熟的单细胞来源的树突状细胞重复体外刺激同种异体的人类T细胞导致产生非增殖性的抑制性的产白介素10(IL-10)的T reg(Jonuleit H，Schmitt E，Schuler G，Knop J，Enk AH.Induction ofinterleukin 10-producing，nonproliferating CD4(+)T cells with regulatory properties byrepetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells.J Exp Med.2000Nov 6；192(9)：1213-22)。Dhodapkar等人将以流感基质肽和钥孔血蓝素(keyholelimpet hemocyanin)脉冲处理的自体单核细胞来源的DC皮下注射至两个人类志愿者。他们报道了CD8+T细胞杀伤活性的抗原特异性抑制，以及肽特异性产IL-10的T细胞的出现，伴随着产干扰素(IFN)-γ的T细胞数目的减少(Dhodapkar M V，Steinman RM，Krasovsky J，Munz C，Bhardwaj N.Antigen-specific inhibition ofeffector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells.J Exp Med.2001 Jan 15；193(2)：233-8)。
CD40是DC免疫原性的关键决定因子。抑制RelB转录因子或CD40本身产生调节性DC，其能够体内产生产IL-10的调节性T细胞(Martin E，O′Sullivan B，Low P，Thomas R.Antigen-specific suppression of a primed immune response bydendritic cells mediated by regulatory T cells secreting interleukin-10.Immunity.2003Jan；18(1)：155-67)。相比之下，工程化处理能够体内长时间表达CD40的DC，能显著增强肿瘤抗原特异性免疫(Hanks BA，Jiang J，Singh RA，Song W，Barry M，HulsMH，et al.Re-engineered CD40 receptor enables potent pharmacological activation ofdendritic-cell cancer vaccines in vivo.Nat Med.2005Feb；11(2)：130-7)。调节性T细胞产生的IL-10和TGFβ可通过限制DC的II类MHC和协同刺激分子的表达而在耐受中起作用(Jonuleit H，Schmitt E，Schuler G，Knop J，Enk AH.Induction ofinterleukin 10-producing，nonproliferating CD4(+)T cells with regulatory properties byrepetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells.J Exp Med.2000Nov 6；192(9)：1213-22；Roncarolo MG，Levings MK，Traversari C.Differentiation of Tregulatory cells by immature dendritic cells.J Exp Med.2001 Jan 15；193(2)：F5-9)。
在协同刺激分子的表达下降的同时，调节性DC可增强其ILT3和ILT4的表达(Chang CC，Ciubotariu R，Manavalan JS，Yuan J，Colovai AI，Piazza F，et al.Tolerization of dendritic cells by T(S)cells：the crucial role of inhibitory receptors ILT3and ILT4.Nat Immunol.2002Mar；3(3)：237-43)。这些与NK杀伤细胞抑制性受体相关的Ig样(Ig-like)抑制性受体被APC上调，这是与CD8+CD28-调节性T细胞之间相互作用的结果。这些受体通过基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIMs)转导信号，负调节单核细胞和DC(Colonna M，Nakajima H，Cella M.A family of inhibitory and activatingIg-like receptors that modulate function of lymphoid and myeloid cells.Semin Immunol.2000；12(2)：121-7；Colonna M，Navarro F，Bellon T，Llano M，Garcia P，Samaridis J，etal.A common inhibitory receptor for major histocompatibility complex class Imolecules on human lymphoid and myelomonocytic cells.J Exp Med.1997；186(11)：1809-18；Colonna M，Samaridis J，Cella M，Angman L，Allen RL，O′Callaghan CA，et al.Human myelomonocytic cells express an inhibitory receptor forclassical and nonclassical MHC class I molecules.J Immunol.1998；160(7)：3096-100)。在CD8+CD28-T细胞存在时，APC的CD4+T细胞诱导的NFκB的激活降低，可能通过这一信号转导途径(Chang CC，Ciubotariu R，Manavalan JS，Yuan J，ColovaiAI，Piazza F，et al.Tolerization of dendritic cells by T(S)cells：the crucial role ofinhibitory receptors ILT3 and ILT4.Nat Immunol.2002；3(3)：237-43)。
IL-10是参与DC产生调节性T细胞的重要的细胞因子。用IL-10处理DC能通过抑制NF-KB从而停止成熟过程，将未成熟的DC转变为调节性DC。这驱动了体内体外产生产IL-10的1型调节性T细胞的分化(Steinbrink K，Wolfl M，Jonuleit H，Knop J，Enk AH.Induction of tolerance by IL-10-treated dendritic cells.JImmunol.1997Nov 15；159(10)：4772-80；Steinbrink K，Jonuleit H，Muller G，Schuler G，Knop J，Enk AH.Interleukin-10-treated human dendritic cells induce amelanoma-antigen-specific anergy in CD8(+)T cells resulting in a failure to lyse tumorcells.Blood.1999Mar 1；93(5)：1634-42；Liu L，Rich BE，Inobe J，Chen W，Weiner HL.Induction of Th2 cell differentiation in the primary immune response：dendritic cellsisolated from adherent cell culture treated with IL-10 prime naive CD4+T cells tosecrete IL-4.Int Immunol.1998 Aug；10(8)：1017-26)。暴露于IL-10的人类DC诱导CD4+T细胞和CD8+细胞的抗原特异性无能(anergy)状态，这是通过与将DC转化为免疫调节状态的机制相似的机制而实现(104)。IL-10抑制DC产生IL-12和表达协同刺激分子，从而产生调节性DC(Kalinski P，Hilkens CM，Wierenga EA，Kapsenberg ML.T-cell priming by type-1 and type-2 polarized dendritic cells：theconcept of a third signal.Immunol Today.1999Dec；20(12)：561-7)。
也可原位处理DC诱导外周耐受。例如Flt3L，一种扩增DC的生长因子，增强体内口服耐受的诱导(Viney JL，Mowat AM，O′Malley JM，Williamson E，FangerNA.Expanding dendritic cells in vivo enhances the induction of oral tolerance.JImmunol.1998 Jun 15；160(12)：5815-25)。相比而言，用Flt-3L处理，由于增强了Thl应答而增加了实验性自身免疫性甲状腺炎的严重程度，的，而GM-CSF由于增强的Th2应答而能甚至在晚期阻止或显著抑制疾病的发展(Vasu C，Dogan RN，Holterman MJ，Prabhakar BS.Selective induction of dendritic cells using granulocytemacrophage-colony stimulating factor，but not fms-like tyrosine kinase receptor3-ligand，activates thyroglobulin-specific CD4+/CD25+T cells and suppressesexperimental autoimmune thyroiditis.J Immunol.2003Jun 1；170(11)：5511-22)。
已经开发出一些诱导耐受的方法，这些方法通过就在上文中描述的修饰的DC，或使用不同的DC给药途径。例如，皮下(sc)注射抗原脉冲处理的(antigen-pulsed)脾DC或表皮朗格汉斯细胞(Langerhans cells)诱导抗原特异性免疫，而静脉(iv)注射同样制剂导致耐受(Morikawa Y，Furotani M，Kuribayashi K，Matsuura N，Kakudo K.The role of antigen-presenting cells in the regulation ofdelayed-type hypersensitivity.I.Spleen dendritic cells.Immunology.1992Sep；77(1)：81-7；Morikawa Y，Furotani M，Matsuura N，Kakudo K.The role ofantigen-presenting cells in the regulation of delayed-type hypersensitivity.II.EpidermalLangerhans′cells and peritoneal exudate macrophages.Cell Immunol.1993Nov；152(1)：200-10)。自身免疫性疾病的具体策略可能包含使用调节性DC促进调节性T细胞的发育，或通过基因工程改造DC引入有免疫抑制功能的分子如IL-10、TGFβ、Fas配体、ILT3和ILT4。迄今为止，DC抑制自身免疫性炎症疾病的能力的证据来自将DC应用到自身免疫性疾病的模型，如下详述。已经表明，暴露或未暴露于自身抗原的同系基因型的(Syngeneic)DC抑制神经肌肉系统自身免疫性疾病，如实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、自身免疫性内分泌病(如1型糖尿病)和自身免疫性关节炎模型(如胶原诱导的关节炎)的进展。
在体外暴露于TGFβ后，来自健康的同系基因型大鼠供体的脾DC能够将抑制转移到EAE受体中。相比之下，从EAE供体大鼠中获得的暴露于TGFβ的DC在转移后没有效果。在EAE的初始阶段，用致脑炎的髓鞘碱性蛋白肽68-86(MBP68-86)和完全弗氏佐剂(CFA)免疫Lewis大鼠，5天后对其使用DC(HuangYM，Yang JS，Xu LY，Link H，Xiao BG.Autoantigen-pulsed dendritic cells inducetolerance to experimental allergic encephalomyelitis(EAE)in Lewis rats.Clin ExpImmunol.2000Dec；122(3)：437-44)。在免疫前，Sc注射未成熟的但未经脂多糖(LPS)处理的骨髓(BM)来源的DC也能预防EAE(Xiao BG，Huang YM，Yang JS，Xu LY，Link H.Bone marrow-derived dendritic cells from experimental allergicencephalomyelitis induce immune tolerance to EAE in Lewis rats.Clin Exp Immunol.2001Aug；125(2)：300-9)。当在EAMG的初始阶段，使用TGFβ修饰的DC相似地抑制Lewis大鼠的实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)的临床症状的进展(Yarilin D，Duan R，Huang YM，Xiao BG.Dendritic cells exposed in vitro toTGF-betal ameliorate experimental autoimmune myasthenia gravis.Clin Exp Immunol.2002Feb；127(2)：214-9)。
在眼的自身免疫性疾病中，带有肽的未成熟的DC抑制致葡萄膜炎(uveitogenic)的T细胞产生IFN-γ，从而诱导体内实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)(Jiang HR，Muckersie E，Robertson M，Forrester JV.Antigen-specificinhibition of experimental autoimmune uveoretinitis by bone marrow-derived immaturedendritic cells.Invest Ophthalmol Vis Sci.2003Apr；44(4)：1598-607)。引流淋巴结T细胞分泌高水平的IL-10和IL-15。在另一个模型中，将光感受器间维生素A类结合蛋白(inter-photoreceptor retinoid binding protein)脉冲处理的TGFβ2处理的APC转移到光感受器间维生素A类结合蛋白免疫的小鼠中成功抑制了小鼠中实验性葡萄膜视网膜炎的诱导(Okamoto S，Kosiewicz M，Caspi R，Streilein J.ACAID as apotential therapy for establishmental autoimmune uveitis.In：Science E，editor.Advances in Ocular Immunology.Amsterdam；1994)。
研究表明，髓磷脂抗原脉冲处理的脾细胞通过选择性诱导致脑炎T细胞的无能(anergy)来抑制EAE(Vandenbark AA，Celnik B，Vainiene M，Miller SD，Offner H.Myelin antigen-coupled splenocytes suppress experimental autoimmuneencephalomyelitis in Lewis rats through a partially reversible anergy mechanism.JImmunol.1995Dec 15；155(12)：5861-7)。通过暴露于TGFb2和MBPAg产生的调节性APC促进抑制EAE的CD8+T reg的发育(Faunce DE，Teraiewicz A，Stein-StreileinJ.Cutting edge：in vitro-generated tolerogenic APC induce CD8+T regulatory cells thatcan suppress ongoing experimental autoimmune encephalomyelitis.J Immunol.2004Feb 15；172(4)：1991-5)。这些结果提供的证据证明，DC能够通过对应答的T细胞的作用诱导实验性自身免疫性疾病中的耐受。在替代的方法中，可通过静脉注射离体(ex vivo)暴露于MBP和CTLA-4-Ig融合蛋白的脾DC来预防EAE，推测是通过离体(ex vivo)阻止CD28-CD80的相互作用(Khoury SJ，Gallon L，Verburg RR，Chandraker A，Peach R，Linsley PS，et al.Ex vivo treatment of antigen-presenting cellswith CTLA4Ig and encephalitogenic peptide prevents experimental autoimmuneencephalomyelitis in the Lewis rat.J Immunol.1996Oct 15；157(8)：3700-5)。
在一些模型中，静脉内重复使用所谓的“半成熟”DC(通过体外暴露于肿瘤坏死因子TNF-α制备)诱导抗原特异性保护。已经表明，TNF-α-DC表达高水平的MHC和T细胞协同刺激分子，但不像成熟DC，它们产生低水平的促炎性细胞因子，并且不能分泌IL-12p70。这些DC通过产生分泌自身抗原特异性的IL-10的CD4+T细胞而抑制EAE(Menges M，Rossner S，Voigtlander C，Schindler H，KukutschNA，Bogdan C，et al.Repetitive injections of dendritic cells matured with tumornecrosis factor alpha induce antigen-specific protection of mice from autoimmunity.JExp Med.2002Jan 7；195(1)：15-21)，可能是缺少协同刺激的“信号3”表达的结果(Thomas R.Signal 3and its role in autoimmunity.Arthritis Res Ther.2004；6：26-7)。最后，与接受未处理DC或盐水注射的动物相比，暴露于TGF-β1或IFN-γ的DC抑制EAE的发病和复发(Xiao BG，Wu XC，Yang JS，Xu LY，Liu X，Huang YM，et al.Therapeutic potential of IFN-gamma-modified dendritic cells in acute and chronicexperimental allergic encephalomyelitis.Int Immunol.2004Jan；16(1)：13-22)。
在糖尿病NOD小鼠模型中，用IFN-γ处理的DC的转移也诱导对1型糖尿病的长期的保护作用(Shinomiya M，Fazle Akbar SM，Shinomiya H，Onji M.Transfer ofdendritic cells(DC)ex vivo stimulated with interferon-gamma(IFN-gamma)down-modulates autoimmune diabetes in non-obese diabetic(NOD)mice.Clin ExpImmunol.1999Jul；117(1)：38-43)。转移胰腺淋巴结DC的转移通过诱导调节性细胞也抑制NOD小鼠中糖尿病的进展(Clare-Salzler MJ，Brooks J，Chai A，Van Herle K，Anderson C.Prevention of diabetes in nonobese diabetic mice by dendritic cell transfer.J Clin Invest.1992Sep；90(3)：741-8)。在其他实验中，单次静脉注射来自暴露于人IgG的血糖正常的NOD小鼠的同系基因型脾DC保护小鼠不发生糖尿病。与糖尿病对照相比，这些小鼠的胰岛(islets)上清中含有水平升高的IL-4和IL-10以及水平降低的IFN-γ，提示2型细胞因子对疾病有良好效果(Papaccio G，Nicoletti F，Pisanti FA，Bendtzen K，Galdieri M.Prevention of spontaneous autoimmune diabetes inNOD mice by transferring in vitro antigen-pulsed syngeneic dendritic cells.Endocrinology.2000Apr；141(4)：1500-5)。
成熟的BM来源的DC也能预防NOD小鼠糖尿病的进展，这一效应是由于CD25+CD4+调节性T细胞的产生和Th2细胞因子的分泌(Feili-Hariri M，Dong X，Alber SM，Watkins SC，Salter RD，Morel PA.Immunotherapy of NOD mice with bonemarrow-derived dendritic cells.Diabetes.1999Dec；48(12)：2300-8)。在NF-κB的抑制性寡二核苷酸(inhibitory oligo-dinucleotides)或可溶性NF-κB抑制剂Bay11-7082存在时，产生的BM来源的DC也能预防糖尿病(Ma L，Qian S，Liang X，Wang L，Woodward JE，Giannoukakis N，et al.Prevention of diabetes in NOD mice byadministration of dendritic cells deficient in nuclear transcription factor-kappaB activity.Diabetes.2003Aug；52(8)：1976-85)。然而，没有研究证明转移的DC能改善NOD小鼠中已经建立的1型糖尿病。
实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)是人类桥本甲状腺炎的鼠类模型，可通过使用甲状腺球蛋白和佐剂攻击(challenge)易感动物来诱导产生(Charreire J.Immune mechanisms in autoimmune thyroiditis.Adv Immunol.1989；46：263-334)。该疾病被CD4+T细胞介导，其特征是甲状腺的淋巴细胞性浸润(Weetman AP，McGregor AM.Autoimmune thyroid disease：further developments in ourunderstanding.Endocr Rev.1994Dec；15(6)：788-830)。暴露于TNFα和抗原的DC诱导抗原特异性CD4+CD25+T细胞，能够抑制EAT的进展，证实了以前在EAE模型中发表的结果(Verginis P，Li HS，Carayanniotis G.Tolerogenic semimature dendriticcells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation ofthyroglobulin-specific CD4+CD25+T cells.J Immunol.2005Jun 1；174(11)：7433-9)。
一些在实验性关节炎中的研究评价了用多种免疫调节基因转导的DC的治疗效果。在胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠中，评价了转导TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的DC。TRAIL的表达受强力霉素诱导的四环素反应元件(doxycycline-inducible tetracycline response element)控制。转染的DC能够诱导致关节炎性T细胞的凋亡(Liu Z，Xu X，Hsu HC，Tousson A，Yang PA，Wu Q，et al.CII-DC-AdTRAIL cell gene therapy inhibits infiltration of CII-reactive T cells andCII-induced arthritis.J Clin Invest.2003Nov；112(9)：1332-41)。对原代DC进行基因修饰以使其表达Fas-L，能清除或降低负责CIA进展的抗原特异性T细胞的数目(Kim SH，Kim S，Oligino TJ，Robbins PD.Effective treatment of established mousecollagen-induced arthritis by systemic administration of dendritic cells geneticallymodified to express FasL.Mol Ther.2002Nov；6(5)：584-90)。此外，在暴露于以前已用其致敏(sensitize)的肽后，转染Fas-L的DC能够诱导抗原特异性耐受。这一观察证明，有可能使用修饰的DC从T细胞库中清除自身反应性T细胞(Matsue H，Matsue K，Walters M，Okumura K，Yagita H，Takashima A.Induction ofantigen-specific immunosuppression by CD95L cDNA-transfected′killer′dendritic cells.Nat Med.1999Aug；5(8)：930-7)。
腺病毒感染后，将表达IL-4的未成熟的DC过继转移到已建立CIA的小鼠体内，该过继转移抑制疾病达4周(Kim SH，Kim S，Evans CH，Ghivizzani SC，OliginoT，Robbins PD.Effective treatment of established murine collagen-induced arthritis bysystemic administration of dendritic cells genetically modified to express IL-4.JImmunol.2001 Mar 1；166(5)：3499-505)。相似地，在疾病发病前，过继转移转导了IL-4的骨髓来源的DC的降低鼠类CIA的发病率和严重性，而通过逆转录病毒转导的T细胞和NIH 3T3细胞递送IL-4没有效果(Morita Y，Yang J，Gupta R，ShimizuK，Shelden EA，Endres J，et al.Dendritic cells genetically engineered to express IL-4inhibit murine collagen-induced arthritis.J Clin Invest.2001May；107(10)：1275-84)。尽管在这些方法中，每种方法都抑制Th1介导的T细胞和抗体应答，但是这些方法一般没有脱离Th2型免疫应答或调节性应答。相比之下，在血管活性肠肽(VIP)存在下产生的DC能够以IL-10依赖的方式抑制CIA(Chorny A，Gonzalez-Rey E，Fernandez-Martin A，Ganea D，Delgado M.Vasoactive intestinal peptide inducesregulatory dendritic cells that can prevent acute graft-versus-host disease while maintaingraft-versus-tumor.Blood.2006Jan 17)。当以高剂量静脉注射(i.v.)递送给药时，TNF-DC也以部分IL-10依赖性方式抑制CIA(Verginis P，Li HS，Carayanniotis G.Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditisby activation of thyroglobulin-specific CD4+CD25+T cells.J Immunol.2005Jun1；174(11)：7433-9)。TNF-DC和VIP-DC都刺激CD4+CD25+调节性T细胞和Tr1型Treg的外周转化。已经表明，VIP降低DC的NF-KB激活和CD40表达(Chorny A，Gonzalez-Rey E，Fernandez-Martin A，Ganea D，Delgado M.Vasoactive intestinalpeptide induces regulatory dendritic cells that can prevent acute graft-versus-hostdisease while maintain graft-versus-tumor.Blood.2006Jan 17)。
已将DC免疫治疗引入临床，并证明其是可行的，特别是如果DC被适当地激活，DC免疫治疗在一些癌症患者中是无毒的和有效的(Banchereau J，Palucka AK，Dhodapkar M，Burkeholder S，Taquet N，Rolland A，et al.Immune and clinicalresponses in patients with metastatic melanoma to CD34(+)progenitor-derived dendriticcell vaccine.Cancer Res.2001Sep 1；61(17)：6451-8；Nestle FO，Banchereau J，Hart D.Dendritic cells：On the move from bench to bedside.Nat Med.2001Jul；7(7)：761-5；Dhodapkar MV，Krasovsky J，Steinman RM，Bhardwaj N.Mature dendritic cells boostfunctionally superior CD8(+)T-cell in humans without foreign helper epitopes.J ClinInvest.2000Mar；105(6)：R9-R14)。通过体内激活DC并以DC为靶标，以及开发DC以抑制自身免疫，将DC的应用扩展到广泛众多的免疫介导的疾病中。然而，在自身免疫性的免疫治疗中，一些技术问题需要解决，这些问题包含给药频率和途径，要使用的DC亚型和数量，以及细胞因子处理的浓度和持续时间。例如，单次静脉注射或皮下注射使用剂量为0.5×106的以NF-KB抑制剂处理的DC足以抑制致敏的(priming)或抗原诱导的关节炎，TNF处理的DC必须以高剂量重复静脉注射使用。
与人类DC相关的数据很少，但有些研究已经报道了令人鼓舞的结果。使用人类体外模型系统，暴露于同种异体特异性的CD8+CD28-T抑制性细胞或CD4+CD25+Treg的未成熟DC表现出抑制性分子ILT3和ILT4的表面表达增加(Chang CC，Ciubotariu R，Manavalan JS，Yuan J，Colovai AI，Piazza F，et al.Tolerization of dendritic cells by T(S)cells：the crucial role of inhibitory receptors ILT3and ILT4.Nat Immunol.2002Mar；3(3)：237-43)。这些人类调节性DC诱导未致敏或致敏辅助性T细胞的可逆性无能，促进同种异体反应性CD4+T细胞向Treg的转化。在IL-3存在时进行培养能够产生人类血液CD4+CD123+CD11c-前体DC(Grouard G，Rissoan MC，Filgueira L，Durand I，Banchereau J，Liu YJ.The enigmaticplasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin(IL)-3andCD40-ligand.J Exp Med.1997Mar 17；185(6)：1101-11；Rissoan MC，Soumelis V，Kadowaki N，Grouard G，Briere F，de Waal Malefyt R，et al.Reciprocal control of Thelper cell and dendritic cell differentiation.Science.1999 Feb 19；283(5405)：1183-6；Arpinati M，Green CL，Heimfeld S，Heuser JE，Anasetti C.Granulocyte-colonystimulating factor mobilizes T helper 2-inducing dendritic cells.Blood.2000 Apr15；95(8)：2484-90)。在体外被TNF-α激活后，这些DC促进T细胞IL-4和IL-10的产生(Rissoan MC，Soumelis V，Kadowaki N，Grouard G，Briere F，de Waal MalefytR，et al.Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation.Science.1999Feb 19；283(5405)：1183-6).这类DC具有治疗自身免疫性疾病和急性移植物抗宿主病的潜力(Liu YJ，Blom B.Introduction：TH2-inducing DC2 for immunotherapy.Blood.2000Apr 15；95(8)：2482-3)。
暴露于IFN-β的PB单核细胞来源的DC分泌高水平IL-10，但是分泌低水平IL-12，并抑制单核细胞IFN-γ的产生(Huang YM，Hussien Y，Yarilin D，Xiao BG，LiuYJ，Link H.Interferon-beta induces the development of type 2dendritic cells.Cytokine.2001Mar 7；13(5)：264-71)。来自MS患者的在体内以IFN-β处理的DC，比来自对照患者的DC产生的IFN-γ和TNF-α更少(Huang YM，Xiao BG，Ozenci V，Kouwenhoven M，Teleshova N，Fredrikson S，et al.Multiple sclerosis is associated withhigh levels of circulating dendritic cells secreting pro-inflammatory cytokines.JNeuroimmunol.1999Sep 1；99(1)：82-90)。这些发现提示，将DC暴露于IFN-β和IL-10可减少促炎性细胞因子的产生，再灌注(re-infusion)后，这些DC可代表MS治疗的有前景的方向。研究还表明，经由NF-κB的信号转导途径决定体外DC刺激T细胞增殖的能力，即在NF-κB抑制剂存在下产生的CD40-人类单核细胞来源的DC几乎不能刺激T细胞的增殖或IFN-γ产生(Thompson AG，O′Sullivan BJ，Beamish H，Thomas R.T cells signaled by NF-kappa B-dendritic cells are sensitizednot anergic to subsequent activation.J Immunol.2004 Aug 1；173(3)：1671-80)。
在有两个健康志愿者的人类研究中，为正常志愿者注射暴露于抗原的未成熟的DC时，对回忆抗原的体内应答被抑制了(Dhodapkar MV，Steinman RM，Krasovsky J，Munz C，Bhardwaj N.antigen-specific inhibition of effector T cellfunction in humans after injection of immature dendritic cells.J Exp Med.2001 Jan15；193(2)：233-8)。这一效应与调节型的CD4+和CD8+T细胞的产生以及IL-10的产生相关，并且与用成熟DC达到的主动免疫成鲜明对比。这小型研究是迄今为止仅有的临床证据，证明未成熟DC具有作为免疫抑制工具的潜力。然而，还不清楚这种潜力是否能在由于存在免疫系统缺陷而导致发生自发性自身免疫性疾病的患者中有效。
已经表明，患有系统性红斑狼疮的患者(SLE)表现出DC稳态的重大改变，即血液中浆细胞样DC降低，以及这些患者的IFNα激活的单核细胞在体外是有效的APC(Blanco P，Palucka AK，Gill M，Pascual V，Banchereau J.Induction of dendriticcell differentiation by IFN-alpha in systemic lupus erythematosus.Science.2001；294(5546)：1540-3)。据推测，单核细胞来源的DC可有效地捕捉SLE患者血液和组织中的凋亡细胞和核小体(Amoura Z，Piette JC，Chabre H，Cacoub P，Papo T，Wechsler B，et al.Circulating plasma levels of nucleosomes in patients with systemiclupus erythematosus：correlation with serum antinucleosome antibody titers and absenceof clear association with disease activity.Arthritis Rheum.1997；40(12)：2217-25)。考虑到血清中高水平的IFNα及其在SLE中的非所需的影响，正在将IFNα开发成SLE干预治疗的潜在靶标(Vallin H，Blomberg S，Alm GV，Cederblad B，Ronnblom L.Patients with systemic lupus erythematosus(SLE)have a circulating inducer ofinterferon-alpha(IFN-alpha)production acting on leucocytes resembling immaturedendritic cells.Clin Exp Immunol.1999；115(1)：196-202)。IFNα不仅激活包含单核细胞和髓系DC的髓系细胞，也激活SLE皮肤损害的炎症部位富集的浆细胞样DC本身(Farkas L，Beiske K，Lund-Johansen F，Brandtzaeg P，Jahnsen FL.PlasmacytoidDendritic Cells(Natural Interferon-alpha/beta-Producing Cells)Accumulate inCutaneous Lupus Erythematosus Lesions.Am J Pathol.2001；159(1)：237-43)。有趣的是，已经表明，Ro 60和Sm/RNP小核糖核蛋白的自身抗原的RNA成分能够作为刺激浆细胞样DC(PDC)成熟及I型IFN产生的内源性佐剂而起作用(Kelly KM，Zhuang H，Nacionales DC，Scumpia PO，Lyons R，Akaogi J，et al.″Endogenousadjuvant″activity of the RNA components of lupus autoantigen Sm/RNP and Ro 60.Arthritis Rheum.2006Apr 27；54(5)：1557-67；Savarese E，Chae OW，Trowitzsch S，Weber G，Kastner B，Akira S，et al.U1 small nuclear ribonucleoprotein immunecomplexes induce type I interferon in plasmacytoid dendritic cells through TLR7.Blood.2006Apr 15；107(8)：3229-34；Vollmer J，Tluk S，Schmitz C，Hamm S，Jurk M，ForsbachA，et al.Immune stimulation mediated by autoantigen binding sites within small nuclearRNAs involves Toll-like receptors 7and 8.J Exp Med.2005Dec 5；202(11)：1575-85)。刺激局部T细胞和PDC的趋化因子产生的UV光也可触发皮肤LE内PDC产生I型IFN。
另外，一些研究人员已经提出假说，通过体内使用NF-KB途径的可溶性抑制剂(通过仅使用其本身或与可溶性抗原联合使用)诱导致耐受性的DC以治疗自身免疫性疾病、变态反应和移植物抗宿主病。揭示这一策略的示例性文献包含：美国专利No.7,078,027；美国专利申请公布No.2005/032725、2004/072228、2004/166095、2004/166099、2005/208036、2004/258688、2004/265912、2005/0220854、2005/0036993和2003/0153518；国际公布WO99/29865、WO00/61132、WO03/000199、WO2004/084927和WO2004/084942和欧洲专利申请No.1 462 111。然而，就本发明人所知，没有支持这一策略的有用性的临床证据。
令人惊讶地发现，体内共使用(co-administration)NF-κB抑制剂和抗原(两者可同时为可溶性形式，或一个为可溶性形式另一个被脂质体包被)在产生对该抗原的致耐受性应答中是无效的。本发明是部分基于这一令人惊讶的发现。然而，本发明人发现，通过使用包含NF-κB抑制剂和抗原包含的粒子(例如脂质体)在体内产生强烈的致耐受性应答。已将这一发现应用于实践中，即提供粒子形式的用于治疗或预防非所需的或有害的免疫应答的免疫调节组合物和方法如下所述。
发明内容
因此，一方面，本发明提供调节对靶抗原的免疫应答(特别是对靶抗原的非所需的或有害的免疫应答)的组合物。这些组合物一般包含NF-κB途径抑制剂和相当于至少一部分靶抗原的抗原，其中抑制剂和抗原为粒子形式。通常，NF-κB途径抑制剂和抗原包含在一个或多个粒子中。在一些具体实施方案中，抑制剂和抗原包含在同一粒子中。在其它具体实施方案中，抑制剂和抗原包含在不同粒子中。合乎需要地，该粒子或每个粒子能够被免疫细胞摄入(例如通过胞吞作用或吞噬作用摄入)，这些免疫细胞包含但不限于抗原递呈细胞(例如树突状细胞、巨噬细胞或朗格汉斯细胞)。在一些具体实施方案中，粒子包含基质，载体或底物。代表性的粒子大小适当并包含纳米粒子(nanoparticle)和微米粒子(microparticle)。在一些具体实施方案中，粒子包含脂类基质或载体，如阳离子脂类、阴离子脂类、非离子或两性粒子脂类、例如聚甘油酯烷基醚(polyglyceryl alkyl ether)、鞘脂或磷脂(如磷脂酰胆碱)。在这种类型的具体实施例中，粒子为脂质体。在其他具体实施方案中，粒子包含载体粒子，如金属粒子(例如，钨、金、铂或铱粒子)。在其他具体实施方案中，粒子包含聚合的基质或载体，其示例性例子包含生物相容的聚合粒子(例如，以聚(丙交酯-共-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolide)制作的粒子)。在其他具体实施方案中，粒子包含陶瓷或无机的基质或载体。
适当地，相当于至少一部分的靶抗原的抗原选自变应原、自身抗原或同种异体抗原。抗原可选自蛋白抗原、脂类抗原、糖脂类抗原或糖类抗原。在一些具体实施方案中，抗原为非核酸的形式(例如，抗原可自该形式表达)。
在一些具体实施方案中，NF-κB途径的抑制剂降低NF-κB途径成员的水平或功能活性，这些NF-κB途径成员适当地选自BTK、LYN、BCR Igα、BCR Igβ、Syk、Blnk、PLCγ2、PKCβ、DAG、CARMA1、BCL10、MALT1、PI3K、PIP3、AKT、p38MAPK、ERK、COT、IKKα、IKKβ、IKKγ、NIK、RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB、p52、NIK、Leu13、CD81、CD19、CD21及其在补体和凝血级联中的配体、TRAF6、泛素连接酶、Tab2、TAK1、NEMO、NOD2、RIP2、Lck、fyn、Zap70、LAT、GRB2、SOS、CD3zeta、Slp-76、GADS、ITK、PLCγ1、PKCθ、ICOS、CD28、SHP2、SAP、SLAM或2B4。在这种类型的示例性例子中，NF-κB途径抑制剂降低RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB或p52中任一个或多个的水平或功能活性。在一些具体实施方案中，NF-κB途径抑制剂增加NF-κB途径成员的水平或功能活性，这些NF-κB途径成员适当地选自SHP1、SHIP、PIR-B、CD22、CD72、FcgRIIB、IκB、P100、CTLA4、PD-1、Cbl、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL或Csk。在一些实施方案中，NF-κB途径抑制剂为非核酸形式(例如，抑制剂可自该形式表达)。
上面广泛限定的粒子组合物在诱导对指定抗原或指定组抗原的致耐受性应答中特别有用，所述致耐受性的应答包含诱导无能应答(anergic response)或抑制将来或目前存在的免疫应答。例如，免疫应答包含但不限于免疫球蛋白分子(例如，IgE)和/或T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和辅助性T淋巴细胞)介导的应答。免疫应答通常针对但非专门地针对选自下列的抗原：蛋白抗原、粒子抗原、同种异体抗原、自身抗原、变应原、细菌抗原、病毒抗原、寄生物抗原或免疫复合物。
在一些具体实施方案中，组合物可进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明的另一方面提供调节免疫应答的方法，特别是提供调节受治疗者对靶抗原的免疫应答的非所需或有害的免疫应答的方法。这些方法一般包含对受治疗者使用如上面广泛描述的组合物。组合物可通过注射、局部或粘膜应用，通过吸入或经口途径使用，包含通过经修饰的释放方式使用，以有效调节对靶抗原的免疫应答的一段时间和剂量使用。在特定具体实施方案中，系统性使用组合物。
通常，免疫应答与选自变态反应、自身免疫性疾病或移植物排斥的疾病相关。因此，在另一个方面，本发明提供治疗或预防其症状或病因与受治疗者对靶抗原的非所需或有害的免疫应答的存在相关或与其发生风险相关的病状(condition)方法。这些方法一般包含对受治疗者使用有效剂量的如上面所广泛描述的组合物。在一些具体实施方案中，受治疗者患有如上广泛描述的病状，而在其他具体实施方案中，受治疗者具有发生这样的疾病的风险。在一些具体实施方案中，当以不同粒子中提供NF-κB途径抑制剂和抗原时，对受治疗者同时使用这两种粒子。
在相关方面，本发明扩展到NF-κB途径抑制剂和相当于至少一部分靶抗原的抗原在制备用于抑制对靶抗原的免疫应答的药物，或治疗或预防与靶抗原相关的变态反应或自身免疫性疾病的药物，或治疗或预防与靶抗原相关的移植物排斥的药物中的用途，其中抑制剂和抗原为粒子形式。
本发明也包含NF-κB途径抑制剂和相当于至少一部分靶抗原的抗原在研究和调节对靶抗原的免疫应答中的用途，其中抑制剂和抗原为粒子形式。
附图说明
图1的图和照片表示脂质体被表达II类MHC的吞噬细胞(包含淋巴器官中的树突状细胞和巨噬细胞)摄入。A-C：100μL红色染料DiI标记的脂质体通过下列方式注射到C57BL/6小鼠体内：(A)尾静脉注射(iv)，或(B)尾根皮下注射(sc)，或(C)腹膜内注射(ip)。注射后24小时，去除静脉注射的小鼠的脾细胞和皮下或腹膜内注射的小鼠的引流LN，并将其处理成细胞悬液。细胞用抗MHC II类-FITC(对于i.v.和s.c.注射)或CD11c-APC(对于IP注射)染色，并通过流式细胞术分析。对照小鼠不接受脂质体。摄入脂质体的II+类或CD11c+细胞的比例在双标记的象限显示。D-H：注射后24小时，将i.v.或s.c.注射100μL DiI姜黄素脂质体小鼠的脾包被于OCT介质，并制成6μm的切片。放大率：x20。(D)iv注射。分别用AlexaFluor 647 CD11b(蓝)和AlexaFluor 488F480(绿)将脾单核细胞和巨噬细胞染色。DiI+脂质体标记为红色。(E)iv注射。将脾切片，分别用AlexaFluor647CD11c(蓝)和AlexaFluor 488F480(绿)将髓系树突状细胞和巨噬细胞染色。(F)sc注射。将脾切片，分别用AlexaFluor 647CD11b(蓝)和AlexaFluor 488 F480(绿)将单核细胞和巨噬细胞染色。(G)iv注射。将脾切片，分别用AlexaFluor 647CD11c(蓝)和AlexaFluor 488 F480(绿)将髓系树突状细胞和巨噬细胞染色。(H)未注射的脾的对照，用CD11b/F480(左图)和CD11c/F480(右图)染色，显示DiI染色(红色)的缺失。
图2的图显示含NF-κB抑制剂的脂质体阻断引流淋巴结细胞中NF-κB反应。C57BL/6小鼠i.v.注射50μL脂质体制剂。24小时后，去除脾并将其处理成细胞悬液。细胞在含有或不含100ng/mL LPS的培养基中培养24小时。获取核提取物并通过ELISA分析p50NF-κB的DNA结合。每列表示来自三只小鼠的核提取物的总和的p50/NF-kB的DNA结合水平。结果用来自用脂质体处理的小鼠的三次实验的均值和作为误差棒的SD表示。*p＜0.05，使用姜黄素(curcumin)和槲皮素(quecertin)脂质体后的LPS应答与使用空白脂质体后的应答相比较。
图3的图显示，结合了抗原的脂质体刺激引流LN中特异的T细胞应答，无论粒子中是否包含NF-κB抑制剂。在过继转移用CSFE标记的OVA特异性T细胞1天后，用50μL不同脂质体制剂处理BALB/c小鼠。72小时后，去除腹股沟淋巴结并将其处理成细胞悬液。然后用PE标记的KJ1-26抗体(其识别OVA特异性TCR)将细胞染色，并通过流式细胞术分析。圆圈内的点(R1)表示母细胞，而矩形内的点(R2)表示子细胞。这些直方图证明，用各种OVA制剂处理的小鼠的T细胞应答(线直方图)与以空白脂质体处理的小鼠(填补的直方图)的T细胞应答相比，其CFSE荧光强度降低(从右到左)。结果为两次独立实验代表性结果。
图4的图显示对通过脂质体递送的OVA和NF-κB抑制剂的OVA的回忆应答的抑制。在过继性转移OVA特异性的DO11.10T细胞后，Balb/c小鼠用OVA-CFA进行初始免疫(prime，也称为致敏)。7天后，小鼠用OVA-CFA(红线)，共包被(co-entrapping)OVA和Bay11-7082(蓝线)的脂质体，共包被OVA和榭皮素(棕线)的脂质体，共包被OVA和姜黄素(橙线)的脂质体或共包被OVA和QuilA(绿线)的脂质体处理。处理后7天，从腹股沟淋巴结收获T细胞，并将其在RPMI+10％FCS中培养。用[3H]胸苷的掺入显示读数，在与幼稚DC和以0-10ug/mL范围内变化的浓度的OVA肽(323-339)孵育后72小时，评价T细胞的增殖。显示来自三个重复孔的平均cpm和作为误差棒的SEM。结果为两次独立实验代表性结果。
图5的图显示包含抗原和NF-κB抑制剂的脂质体粒子以抗原特异性方式抑制关节炎。在注射mBSA至一个膝关节后，通过用完全弗氏佐剂中的mBSA，两周内两次，进行初始免疫和加强免疫来诱导产生抗原诱导关节炎(AIA)。6天后，当关节肿胀临床上充分表现后，用脂质体，或在Bay 11-7082存在下产生并用mBSA脉冲处理的DC进行s.c注射。4天后，通过卡尺读数进行关节肿胀评分。脂质体或者是空白的，或仅含有mBSA，或含有mBSA和姜黄素，或含有榭皮素和mBSA，或含有Bay 11-7082和mBSA，或仅含有姜黄素并将可溶性mBSA注射在附近，或仅含有mBSA并将可溶性Bay 11-7082注射在附近。**p＜0.001，***p＜0.0001与未处理的关节炎小鼠相比。重复3次，每组5只小鼠。
图6的图显示带有不同NF-κB抑制剂的脂质体中FITC-OVA的保留。仅包被FITC-OVA的脂质体(●)，共包被FITC-OVA和Bay 11-7082的脂质体(▲)，共包被FITC-OVA和榭皮素的脂质体(△)和共包被FITC-OVA和姜黄素脂质体(○)在37℃HEPES缓冲液pH 7.4中温育(A)或37℃HEPES缓冲液pH 7.4+10％FBS中温育(B)。FITC-OVA的释放通过荧光分光光度法监测28小时。数据表示3次实验的平均值和SD。
图7的图显示OVA-姜黄素-脂质体或OVA-姜黄素-微球诱导调节性T细胞。DO11.10小鼠用OVA和完全弗氏佐剂致敏，7天后注射姜黄素-OVA-脂质体或姜黄素-OVA聚合体微米粒子。7天后，纯化脾细胞并转移到致敏的BALB/c受体鼠体内。5天后杀死小鼠，用不同浓度的OVA肽再刺激脾细胞。
具体实施方式
1.定义
除非另有定义，此处所用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管与此处所描述的的方法和材料的相似的或相当的任何方法和材料都能用于实施或测试本发明，但此处所描述的为优选的方法和材料。为本发明的目的，对下述术语做如下定义。
此处使用的冠词“一种”和“一个”是指该冠词的一种或一种以上(即指至少一种)的语法对象。例如，“一种成分”意思是一个成分或一个以上的成分。
此处使用的词语“约”是指与指定的条件相比，变化达到30％，优选地达到20％，更优选地达到10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的条件(例如，剂量、浓度、时间等)。
术语“同时给药(administration concurrently)”或“同时使用(administeringconcurrently)”或“共同使用(co-administering)”等是指使用含有两种或更多活性成分的单个组合物，或将每种活性成分作为单独的组合物使用和/或通过单独的途径共同地或同时地或在足够短的时间内顺次递送以致于其效果与将所有所述活性成分作为单个组合物使用的效果相当。“同时地(simultaneously)”意思是活性试剂在基本相同的时间使用，优选地在同一制剂中一起使用。“同期地(contemporaneously)”意思是活性试剂使用的时间很接近，例如，在使用另一种试剂的约一分钟内到约一天内使用另一种试剂。任何同期的时间是可用的。然而，情况经常是当没有同时使用时，该试剂将在约1分钟内至约8小时内，优选地在约1至约4小时以下的时间内使用。当同时使用，该试剂适当地在同一位点对受治疗者使用。术语“同一位点”包含精确的位置，但能在约0.5至约15厘米以内，优选地在约0.5至约5厘米以内。此处使用的术语“单独地”意思是试剂的使用有一定的时间间隔，例如约1天至几周或几月的时间间隔。活性试剂可通过任意顺序使用。此处使用的术语“顺次”意思是该试剂按顺序使用，例如在数分钟、数小时、数天或数周的时间一个或数个时间间隔内按顺序使用。如果合适，活性试剂可以规律重复的循环使用。
此处使用的术语“无能(anergy)”是指免疫系统对指定的一种抗原或指定的一组抗原的被抑制的应答或无应答的状态。例如，当在最适的刺激条件下，T淋巴细胞和B淋巴细胞不能对其特异性抗原产生应答时，它们是无能的。
“抗原”的意思是能够诱导脊椎动物特别是哺乳动物免疫应答的全部或部分蛋白、肽或其他分子或大分子。这样的抗原也对使用蛋白、肽或其他分子或大分子免疫的动物的抗体有反应。
“抗原结合分子”意思是对靶抗原具有结合亲和力的分子。应理解，该术语扩展到表现出抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白来源的蛋白骨架。
“自体的”意思是来自同一生物体的某物(例如，细胞、组织等)。
此处使用的术语“同种异体的(allogeneic)”是指具有不同基因组成的细胞、组织、生物体等。
“同种异体抗原”意思是仅在一个物种的某些成员中发现的抗原，如血型抗原。相比而言，“异种抗原”是指在一个物种的成员中出现的而在另一物种的成员中不出现的抗原。相应地，“同种异体移植(allograft)”为同一物种成员间的移植，“异种移植(xenograft)”是指不同物种成员间的移植。
在本说明书全文中，除非上下文另有要求，词语“包含”、“包含”、“含有”应理解为是指包含所述的步骤或要素或一组步骤或一组要素但不排除任何其他步骤或要素或一组步骤或一组要素。
“相应的”或“相当的”意思是编码其氨基酸序列与靶抗原的氨基酸序列基本相似的抗原。一般而言，该抗原与至少一部分靶抗原表现出至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的相似性。
在调节免疫应答或治疗或预防疾病或病状的情况下，“有效量”的意思是以对上述调节、治疗或预防有效的单剂量或作为一系列剂量的一部分的方式，对有此需要的个体使用的组合物的量。有效量依待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类群、组合物的配制、医学状态的评价和其他相关因素的不同而不同。据预期，该剂量包含在能通过常规试验来确定的相当广泛的范围内。
此处所称的“免疫相互作用(immuno-interactive)”包含所指的分子间的任何相互作用、反应或其他形式的关联，特别是当其中一种分子是免疫系统的组分或其模拟物时。
应在其最广泛意义上理解在特定细胞产生的基因表达产物(例如，蛋白或转录本)的具体情境中所称的“水平或功能活性”，其包含单个细胞或多个细胞或细胞群产生的表达产物的水平或功能活性。因此，在后一种情况下，应理解该短语包含多个细胞或细胞群产生的蛋白的平均的水平或功能活性。
此处术语“患者”、“受治疗者”、“宿主”或“个体”可互换使用，是指任何希望得到治疗或预防的受治疗者，特别是脊椎动物受治疗者，更特别的是指哺乳动物受治疗者。本发明范围中，适当的脊椎动物包含但不限于脊索动物门(Chordata)的亚门(subphylum)的任何成员，这些成员包含灵长类、啮齿类(例如、小鼠大鼠、豚鼠)、兔类(例如、家兔、野兔)、牛类动物(例如牛)、羊(例如、绵羊)、山羊(例如、山羊)、猪(例如、猪)、马科动物(例如马)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、鸟类(例如鸡、火鸡、鸭类、鹅类、宠物鸟类如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如海豚、鲸)、爬行类动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼类。优选的受治疗者为需要治疗或预防与感兴趣的抗原的出现或异常表达相关的病状或疾病的人类。然而，应理解上述术语并不意味着出现症状。
“药学上可接受的载体”意思是可在局部或全身使用中安全使用的固体或液体填充剂，稀释剂或封装物质。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”此处可互换使用，是指氨基酸残基的聚合体或指其变体和合成类似物。因此，这些术语应用于天然存在的氨基酸聚合体，也适用于其中一个或多个氨基酸残基为合成的非天然存在的氨基酸(如相应天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合体。
“调节性淋巴细胞”意思是参与调节或抑制其他细胞的应答和作用的淋巴细胞，特别是指调节或抑制其他免疫细胞如B淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞的应答和作用的淋巴细胞。
“抑制作用(suppression)”、“抑制(suppressing)”等的意思是对一种抗原或一组抗原的免疫应答(包含B淋巴细胞性和T淋巴细胞性免疫应答)的任何减弱或调节。在一些具体实施方案中，减弱至少部分地由抑制性T淋巴细胞(例如，CD4+CD25+调节性T淋巴细胞)介导。
此处使用的术语“表面活性剂”是指优先吸附到两个不混溶相界面的任何试剂，如水和有机聚合体溶液界面，水/空气界面或有机溶剂/空气界面。表面活性剂一般具有亲水部分和疏水部分；因此，在吸附到微米粒子后，它们倾向于将不吸引相似包被粒子的部分呈现在外部环境中，从而降低了粒子聚集。表面活性剂也可促进治疗性或诊断性试剂的吸收并增加试剂的生物利用度。
此处使用的“包含表面活性剂”的粒子是指至少在该粒子表面有表面活性剂的粒子。该表面活性剂可在粒子形成时包含在整个粒子中或粒子表面，或在粒子形成后包被到粒子上。表面活性剂能通过吸附，离子或共价结合或通过周围基质的物理性“包埋”而包被到粒子表面。表面活性剂能，例如，包被到控制释放的粒子如聚合体微球(polymeric microspheres)中。
“治疗”、“处理”、“被治疗”等的意思是治疗性处理和预防性处理两者都包含。
2.组合物
本发明部分来自确定了将NF-κB抑制剂和抗原共使用(co-administration)于预先存在对抗原免疫应答的动物，在产生针对抗原的致耐受性应答中是无效的，其中抑制剂和抗原两者都为可溶性形式或其中一个为可溶性形式而另一个为粒子形式。相比之下，本发明人发现，NF-κB抑制剂和抗原以粒子形式使用可在动物中产生强烈的致耐受性应答。因此，本发明提供包含NF-κB途径抑制剂和抗原的组合物，所述抗原相当于与不希望产生的免疫应答相关的靶抗原，所述组合物用于在一系列病状(包含那些表现出变态反应、自身免疫性疾病或移植物排斥的病状)中诱导或刺激对靶抗原的耐受。
2.1粒子(Particles)
根据本发明，抑制剂和抗原(此处也称为“生物活性试剂”)包含在同一粒子或不同粒子中，或者与同一粒子或不同粒子相关。多种粒子可用于本发明，包含但不限于脂质体、胶团(micelles)、脂类粒子(lipidic particles)、陶瓷/无机粒子和聚合体粒子，并通常选自纳米粒子或微米粒子。粒子大小适于抗原递呈细胞的吞噬作用或胞吞作用。抗原递呈细胞包含专职的和功能型的抗原递呈细胞。专职的抗原递呈细胞包含但不限于巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、髓系细胞(包括单核细胞-粒细胞-DC前体)、边缘区Kupffer细胞、小神经胶质细胞、T细胞、朗格汉斯细胞和树突状细胞(包括指突状树突状细胞和滤泡树突状细胞)。功能型抗原递呈细胞包括但不限于激活的T细胞、星形胶质细胞、滤泡细胞、内皮和成纤维细胞。在一些具体实施方案中、抗原递呈细胞选自单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、树突状细胞或朗格汉斯细胞。在特定具体实施方案中，抗原递呈细胞表达CD11c并包括树突状细胞。在示例性例子中，粒子大小在约100μm以下，尽管粒子大到约30μm，小至数nm，但更适当地等于约1μm或在约1μm以下的范围。脂质体基本由磷脂双层形成的壳围绕水性核心组成。有利条件包含外层的亲油性，其“模拟”细胞外膜层从而相对容易地被多种细胞摄取。聚合体载体通常由微米/纳米微球(micro/nanospheres)和微米/纳米胶囊(micro/nanocapsules)组成，其由生物相容性聚合体(可以为可生物降解的，例如聚乳酸；或不可生物降解的，例如乙烯-醋酸乙烯共聚物)形成。聚合体装置的一些优点是易于制备和高负载能力，从纳米到微米直径大小的范围，及控制释放和降解谱。
在一些具体实施方案中，粒子在其表面包含抗原结合分子，该分子与一种标记进行免疫相互作用，该标记物在抗原递呈细胞(例如，树突状细胞)的表达水平比在非抗原递呈细胞的表达水平更高。这种类型的标记物的示例性例子包含MGL、DCL-1、DEC-205、巨噬细胞甘露糖R、DC-SIGN或其他DC或髓特异性(凝集素)受体，例如Hawiger et al.(2001，J Exp Med 194，769)，Kato et al.2003，J Biol Chem 278，34035)，Benito et al.(2004，J Am Chem Soc 126，10355)，Schjetne，et al.(2002，Int Immunol 14，1423)和van Vliet et al.，2006，Nat Immunol Sep 24；[Epub ahead of print])(van Vliet et al.，Immunobiology 2006，211：577-585)等人所公开。
可通过将一个或数个生物活性试剂与载体基质(例如，表面活性剂、赋形剂或聚合体材料)联合(combination)制备粒子。在一些具体实施方案中，基质为可生物降解的和生物相容性的，可选择地是能够为递送治疗性或诊断性试剂而以控制的速率进行生物降解的基质。粒子可用多种材料制备。有机材料、无机材料和聚合材料和非聚合材料都可使用。这种类型的示例性材料包含极性脂类、有机聚合体和单体、多糖和单糖、陶瓷/无机材料、多肽和蛋白质。其他适当的材料包含但不限于明胶、聚乙二醇、海藻糖、葡聚糖和壳聚糖。降解和释放时间在数秒至数月的粒子可根据一些因素(如粒子材料)进行设计和制备。
2.1.1聚合体粒子
聚合体粒子可由任何生物相容性性的，并且是所需的可生物降解的聚合体、共聚体或其混合制成。可对聚合体进行定制以优化粒子的不同特性，这些特性包含：i)被递送的生物活性试剂与聚合体，以使生物活性试剂具有稳定性并使其在递送后保留活性的聚合体之间的相互作用；ii)聚合体的降解率，从而也即是试剂释放的释放率谱；iii)通过化学修饰产生的表面特性和靶向能力；和iv)粒子的多孔性。
如聚酐的表面侵蚀聚合体(surface eroding polymer)可用于制成粒子。例如，可使用聚酐，如聚[(p-羧基苯氧基)-正己烷酸酐](PCPH)。美国专利No.4,857,311描述了可生物降解的聚酐。
在其他具体实施方案中，可使用大体积侵蚀聚合体(bulk eroding polymer)，如基于聚酯包括聚(羟基酸)或聚(酯)的聚合体。例如可使用聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、或其共聚体制成粒子。聚酯也可含有带电的或可功能化的基团，如氨基酸。在示例性例子中，有控制释放属性的粒子可用聚(D，L-乳酸)和/或聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(“PLGA”)制成。
其他聚合体包括聚(氰基丙烯酸烷基酯)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烷烯如聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸亚乙酯)、聚醋酸乙烯化合物如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙稀酯、丙烯酸和甲基丙烯酸聚合体、纤维素和其他多糖、和肽或蛋白质、或聚合体或其混合物。对于递送受控药物的不同应用，聚合体可对聚合体进行选择或修饰以使其具有适当的体内稳定性和降解率。
在一些具体实施方案中，粒子由功能化的聚合体如聚酯移植共聚体制成，如Hrkach et al.(1995，Macromolecules，28：4736-4739；and“Poly(L-Lactic acid-co-aminoacid)Graft Copolymers：A Class of Functional Biodegradable Biomaterials”inHydrogels and Biodegradable Polymers for Bioapplications，ACS Symposium SeriesNo.627，Raphael M.Ottenbrite et al.，Eds.，American Chemical Society，Chapter 8，pp.93-101，1996.)所述。
除可生物降解聚合体以外的材料可用于制成粒子。合适的材料包含各种不可生物降解的聚合体和各种赋形剂。粒子也可仅由生物活性试剂和表面活性剂制成。
聚合体粒子可通过使用单或双乳化溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂提取、溶剂蒸发、相分离、简单或复合凝聚，界面聚合作用和本领域普通技术人员熟知的其他方法制备。只要制备条件为制备所需直径的粒子进行了优化，粒子就可通过本领域已知的制备微球或微胶囊的方法制备。
文献中描述了已经开发的制备递送包被的试剂的微球的方法，例如，如Doubrow，M.，Ed.，“Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy，”CRCPress，Boca Raton，1992。.方法的描述还见于Mathiowitz and Langer(1987，J.Controlled Release 5，13-22)；Mathiowitz et al.(1987，Reactive Polymers 6，275-283)；and Mathiowitz et al.(1988，J.Appl.Polymer Sci.35，755-774)和美国专利No.5,213,812、美国专利No.5,417,986、美国专利No.5,360,610和美国专利No.5,384,133。对方法的选择依赖于聚合体的选择、大小、外形和所需的结晶度，如描述的那样(例如Mathiowitz et al.(1990，Scanning Microscopy 4：329-340；1992，J.Appl.Polymer Sci.45，125-134)；和Benita et al.(1984，J.Pharm.Sci.73，1721-1724))。
在溶剂蒸发中，如例如Mathiowitz et al.，(1990)，Benita和授权的Jaffe的美国专利No.4,272,398所描述，聚合体溶解在挥发性有机溶剂中，如二氯甲烷。可使用几种不同聚合体浓度，例如，在0.005和2.0g/mL之间的浓度。可溶形式或作为微米粒子分散的一个或多个生物活性试剂加入到聚合体溶液中，混合物在含有表面活性试剂如聚(乙烯醇)的水相中悬浮。水相可以是，例如是浓度为1％聚(乙烯醇)w/v的蒸馏水溶液。搅拌产生的乳液直至大部分有机溶剂蒸发，留下固体微球，其可用水洗并在冻干器中干燥过夜。通过这种方法可获得不同形态不同大小的微球(在0.1和1000μm之间)。
去除溶剂主要是为使用较不稳定的聚合体(如聚酐)而设计。在这种方法中，将试剂分散或溶解在选定聚合体于挥发性有机溶剂(如二氯甲烷)的溶液中。然后通过搅拌，将混合物在油(如硅油)中悬浮以形成乳液。24小时内，溶剂扩散到油相，乳液滴硬化成固体聚合体微球。与热熔微囊法(例如Mathiowitz et al.(1987，Reactive Polymers，6：275)描述)不同，可用这种方法用高熔点的和广的分子量范围的聚合体制备微球。通过这一过程能获得例如直径在1到300微米之间的微球。
对一些聚合体系统，通过单或双乳化技术制备的聚合体粒子的大小依赖于小滴的大小而变化。如果油包水乳液中的小滴对形成所需大小范围的粒子不合适，可通过例如乳液的超声或均质化或通过加入表面活性剂能制备更小的小滴。
如果通过上述任意方法制备的粒子大小范围在所需范围之外，能对粒子大小进行分类例如使用筛子，并可选地进一步根据密度使用本领域技术人员已知的技术对粒子进行分离。
可通过喷雾干燥法制备聚合体粒子。喷雾干燥法(如Sutton和Johnson在PCTWO 96/09814中所公开)公开了水溶性材料的平滑的球形微米粒子的制备方法，其中至少90％的粒子的平均大小是1至10μm。
2.1.2陶瓷粒子
也可将陶瓷粒子用于递送本发明的生物活性试剂。通常，这些粒子使用与熟知的溶胶-凝胶过程相似的方法制备，一般需要简单的条件和室温条件，例如Brinker et al.(“Sol-Gel Science：The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing；”Academic Press：San Diego，1990，p-60)和Avnir et al.(1994，Chem.Mater.6，1605)所描述。能制备所需的大小、形状和多孔性的陶瓷粒子，并且这些陶瓷粒子极其稳定。这些粒子也可有效保护掺入的分子(多肽、药物等)不被极端的pH和温度而诱导变性(Jain et al.，1998，J.Am.Chem.Soc.120，11092-11095)。此外，可容易地用不同基团将这些粒子的表面功能化(Lal et al.，2000，Chem.Mater.12，2632-2639；Badley et al.，1990，Langmuir，6，792-801)，因此为使其定向于体内所需位点，可将其结合到多种单克隆抗体和其他配体上。
已经描述了多种用于体内递送含有活性试剂的有效负载的陶瓷粒子。例如，英国专利1 590 574公开了在溶胶-凝胶基质中(incorporation)生物活性成分。国际公布WO 97/45367公开了一种通过溶胶-凝胶过程制备的可控制性溶解的硅干凝胶，其中通过浸渍(impregnation)将生物活性试剂掺入预熔结(pre-sinter)的粒子(1至500μm)或圆盘(disk)中从而加入至该硅干凝胶中。国际公布WO 0050349公开了通过溶胶-凝胶过程制备的可控制性生物降解的硅纤维，其中生物活性试剂在纤维的合成过程中掺入。美国专利申请公布20040180096描述了包被了生物活性物质的陶瓷纳米粒子。该陶瓷纳米粒子通过形成染料的胶束组合物而制备。陶瓷材料加入到胶束组合物中，该陶瓷纳米粒子通过碱解沉淀。美国专利申请公布20050123611公开了含有实质性地均质地分散在整个粒子中的活性材料的控制性释放的陶瓷粒子。这些粒子通过将表面活性剂和非极性溶剂混合制备反胶束溶液(reverse micelle solution)而制备；(b)在极性溶剂中溶解凝胶前体、催化剂、缩合剂和可溶性活性材料以制备前体溶液；(c)混合反胶束溶液和前体溶液以提供乳液和(d)在乳液中浓缩(condense)前体。美国专利申请公布20060210634公开了通过蒸发将生物活性物质吸附到含有金属氧化物(例如，氧化钛、氧化锆、氧化钪、二氧化铈和氧化钇)的陶瓷粒子上。Kortesuo等人(2000，Int J Pharm.May10；200(2)：223-229)公开了一种喷雾干燥法，该方法用于产生窄的粒子大小范围的的球状硅胶粒子，该球状硅胶粒子用于受控递送药物(如枸橼酸托瑞米芬和右美托咪定HCl)。Wang等人(2006，Int J Pharm.308(1-2)：160-167)描述了通过聚电解质多层膜联合多孔CaCO3微米粒子吸附和胶囊封装用于递送生物活性物质。
2.1.3脂质体
脂质体能用标准方法生产，这些标准方法如Kim等人(1983，Biochim.Biophys.Acta 728，339-348)；Liu等人(1992，Biochim.Biophys.Acta 1104，95-101)；Lee等人(1992，Biochim.Biophys.Acta.1103，185-197)、Brey等人(美国专利申请公布20020041861)、Hass等人(美国专利申请公布20050232984)、Kisak等人(美国专利申请公布20050260260)和Smyth-Templeton等人(美国专利申请公布20060204566)所报道。另外，可参考Copeland等人(2005，Immunol.Cell Biol.83：95-105)和Bramwell等人(2005，Crit Rev Ther Drug载体Syst.22(2)：151-214；2006，J Pharm Pharmacol.58(6)：717-728)的文章，其分别综述了用于递送抗原的基于脂类的粒子制剂和疫苗的粒子递送系统，后者包含制备带有蛋白的脂质体的方法。使用多种不同脂类成分的很多脂质体制剂被用于多种体外细胞培养和动物实验。鉴定出了确定脂质体属性的参数，并见于文献报道(例如，Lee et al.(1992，Biochim.Biophys.Acta.1103，185-197)；Liu et al.(1992，Biochim.Biophys.Acta，1104，95-101)；和Wang et al.(1989，Biochem.28，9508-951))。
在一些具体实施方案中，使用基于干燥的脂类膜的水合作用的制备方法，其中混合溶解在有机溶剂中的选择的脂类(和任何有机可溶性生物活性物)并使其在真空中在玻璃容器的底部干燥。脂类膜通过使用含有待包被的任何水溶性生物活性物的含水缓冲溶液通过温和振荡进行再水合。然后水合的脂类囊泡可进一步处理，通过挤压、进行一系列冻融循环或脱水并随后重新水合以促进生物活性物的包被。然后脂质体能通过离心或将其装载到根据大小进行排除的柱子上进行洗涤以从该脂质体制剂中去除未包被包被的生物活性物，并将其存放在4℃。脂质体制备的更详细的基本方法在Thierry等人(1992，Nuc.Acids Res.20：5691-5698)中有描述。
带有生物活性试剂的有效负载的粒子能使用如Pautot等人描述的过程制备备(2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100(19)：10718-21)。使用Pautot等人的技术，抗生物素蛋白链菌素包被的脂类(DPPC、DSPC和相似的脂类)能用于制备备脂质体。Needham等人(2001，Advanced Drug Delivery Reviews，53(3)：285-305)描述的药物包被技术能用于将一种或多种种活性试剂装载至这些囊泡上。
能通过下列步骤来制备脂质体：将含有各种脂类混合物的氯仿溶液暴露于高度真空中，然后用pH 4缓冲液对所得的脂类膜(DSPC/CHOL)进行水合，并在冻融过程后，将其挤压通过聚碳酸酯滤器。有可能使用DPPC加上DSPC或胆固醇以提高包被效率或增强稳定性等。通过加入碱化剂将囊泡外介质的pH值调至7.5，从而产生跨膜pH梯度。随后，生物活性试剂能通过在提高的温度下将小份生物活性试剂溶液加入到囊泡溶液中，以允许该生物活性试剂在脂质体内积累而被包被包被(例如，小分子的NF-κB途径抑制剂，例如它是一种弱碱)。
本发明的适于递送生物活性试剂的其他基于脂类的粒子如泡囊(niosome)在Copeland等人(2005，Immunol.Cell Biol.83：95-105)中有描述。
2.1.4弹道粒子(ballistic particle)
本发明的生物活性试剂可结合到(例如，通过包被或共轭结合)适合用于无针或“弹道“(红外线放散器(biolistic))递送的粒子上或与该粒子相关联。用于弹道递送的示例性粒子在下述文献中有描述，例如国际公布WO 02/101412、WO02/100380、WO 02/43774、WO 02/19989、WO 01/93829、WO 01/83528、WO00/63385、WO 00/26385、WO 00/19982、WO 99/01168、WO 98/10750和WO97/48485。然而，应理解这样的粒子并不限于用弹道递送装置使用，并还能通过可将粒子递送至免疫细胞的任何替代技术(例如，注射或显微操作针递送)使用。
可使用多种本领域已知的技术将活性试剂包被或化学耦联到载体粒子(例如，核心载体)上。在通常用于细胞内递送的粒子大小范围内选择具有适当密度的材料用作载体粒子。最适的载体粒子大小当然依赖于靶细胞的直径。示例性粒子的范围是约0.01至约250μm，约0.05至约50μm，以及约1至约10μm；粒子密度范围是约0.1至约25g/cm3。这种类型的粒子非限制性地包含金属粒子，如钨、金、铂和铱载体粒子。容易得到平均直径大小在0.5至2.0μm的钨粒子。也可使用金粒子或微晶金(例如，金粉A1570可从Engelhard Corp.，East Newark，N.J.获得)。金粒子大小一致(直径大小1-3μm的粒子可从Alpha Chemicals获得，一系列粒子大小包含0.95μm的粒子可从Degussa，South Plainfield，N.J.获得)，毒性低。微晶金粒子大小分布多样，通常的范围为0.1-5μm。微晶金不规则的表面使得可用本发明活性试剂进行高效包被。
已知并描述了许多用于将生物活性分子(例如，如蛋白和核酸的亲水性分子)吸附、耦联或结合到如金或钨粒子的粒子上的方法。在示例性例子中，这样的方法将预先确定剂量的金或钨与生物活性分子、CaCl2和精脒联合。在其他例子中，用乙醇将生物活性分子沉淀到金或钨粒子上(参见，例如，Jumar et al.，2004，PhysMed.Biol.49：3603-3612)。在包被过程中，将产生的溶液不断适当振荡以保证反应混合物的均匀性。在结合生物活性分子后，粒子可被转移，例如，转移到适当的膜上并使其在使用前干燥，包被到样品组件(module)或样品盒(cassette)表面，或装入用于特别的粒子介导的递送仪器的递送盒(delivery cassette)中。
配制的组合物可适当地使用标准方法制成粒子，如简单蒸发(空气干燥)、真空干燥、喷雾干燥、冻干(低压冻干)、喷雾冷冻干燥、喷雾包被、沉淀、超临界流体粒子形成等等。如果需要，产生的粒子能用国际公布WO 97/48485中描述的技术进行修饰。
2.1.5表面活性剂
能用于掺入到粒子中或用于制备粒子的表面活性剂包含磷酸甘油酯。示例性的磷酸甘油酯包含磷脂酰胆碱，如天然存在的L-α-二棕桐酰磷脂酰胆碱(“DPPC”)。表面活性剂通过，例如，降低粒子-粒子间相互作用，使得粒子表面粘性更低从而有利地改善表面属性。使用肺内源性表面活性剂可不需使用非生理性表面活性剂。
在粒子表面提供表面活性剂能降低粒子由于相互作用(如静电相互作用，范德华力和毛细管作用)而导致的聚集的倾向。粒子表面存在表面活性剂能使表面的不规则性(粗糙度)提高，因此通过降低可用的接近的粒子-粒子间的相互作用的表面积而改善雾化性能。
本领域已知的能用的表面活性剂包含任何天然存在的表面活性剂。其他示例性表面活性剂包含磷脂类，如双磷脂酰甘油(DPPG)或磷脂酰乙醇胺；脂肪醇或脂肪酸，如棕榈酸或油酸聚氧乙烯-9-月桂醚；山梨醇酯，如山梨醇三油酸酯(Span85)；胆酸盐；和两亲性聚合体，如泊洛沙姆(poloxamer)或蛋白质。
2.2NF-κB功能抑制剂
NF-κB功能抑制剂包含降低免疫细胞中，特别是降低抗原递呈细胞中NF-κB水平或功能活性的任何分子或化合物。在一些具体实施方案中，NF-κB功能抑制剂降低NF-κB途径的成员的水平或功能活性，该成员适当地选自BTK、LYN、BCRIgα、BCRIgβ、Syk、Blnk、PLCγ2、PKCβ、DAG、CARMA1、BCL10、MALT1、PI3K、PIP3、AKT、p38MAPK、ERK、COT、IKKα、IKKβ、IKKγ、NIK、RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB、p52、NIK、Leu13、CD81、CD19、CD21及其在补体和凝结级联中的配体、TRAF6、泛素连接酶、Tab2、TAK1、NEMO、NOD2、RIP2、Lck、fyn、Zap70、LAT、GRB2、SOS、CD3zeta、Slp-76、GADS、ITK、PLCγ1、PKCθ、ICOS、CD28、SHP2、SAP、SLAM或2B4。在这种类型的示例性例子中，NF-κB途径抑制剂降低RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB或p52中任意一个或多个的水平或功能活性。适当地，在这些具体实施方案中，NF-κB途径抑制剂阻断、抑制或拮抗成员的至少一种功能或活性。在其他具体实施方案中，NF-κB途径抑制剂增加NF-κB途径成员的水平或功能活性，所述成员适当地选自SHP1、SHIP、PIR-B、CD22、CD72、FcgRIIB、IκB、P100、CTLA4、PD-1、Cbl、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL或Csk。在这些具体实施方案中，NF-κB途径抑制剂增加、刺激或激动这些成员的至少一种的功能或活性。
已经描述了许多NF-κB功能抑制剂，其代表性例子列于下表中：
表1抑制NF-κB激活的抗氧化剂
| 分子 | 参考文献 |
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| 吡咯啉二硫氨基甲酸酯(PDTC) | Schreck et al.，J Exp Med.1992May1；175(5)：1181-94 |
| 槲皮素(低浓度) | Musonda &Chipman，Carcinogenesis.1998Sep；19(9)：1583-9；Shih et al.，Eur J Pharmacol.2004Aug2；496(1-3)：41-8 |
| 红酒 | Blanco-Colio et al.，Circulation.2000Aug 29；102(9)：1020-6；Cui &He，Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi.2004Mar；38(2)：103-6 |
| Ref-1(氧化还原因子1) | Ozaki et al.，FASEB J.2002Jun；16(8)：889-90.Epub 2002Apr 23 |
| Rg(3)，一种人参衍生物 | Keum et al.，Mutat Res.2003Feb-Mar；523-524：75-85 |
| 鱼藤酮 | Schulze-Osthoff et al.，EMBO J.1993Aug；12(8)：3095-104 |
| 罗红霉素 | Ueno et al.，Clin Cancer Res.2005Aug1；11(15)：5645-50 |
| S-烯丙基-半胱氨酸(SAC，大蒜化合物) | Geng et al.，Free Radic Biol Med.1997；23(2)：345-50 |
| 三白草中木脂素 | Lee et al.，Br J Pharmacol.2003May；139(1)：11-20.；Hwang et al.，Planta Med.2003Dec；69(12)：1096-101 |
| 螺内酯 | Han et al.，J Am Soc Nephrol.2006May；17(5)：1362-72.Epub 2006Mar 29 |
| 分子 | 参考文献 |
| 草莓提取物 | Wang et al.，J Agric Food Chem.2005May 18；53(10)：4187-93 |
| 紫杉醇 | Wang et al.，J Biomed Sci.2006Jan；13(1)：127-41.Epub 2005Nov 9 |
| 坦波尔 | Cuzzocrea et al.，Free Radic Res.2004Aug；38(8)：813-9 |
| 替泊沙林(5-(4-氯苯基)-N-羟基-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-1H-吡唑-3-丙酰胺) | Kazmi et al.，J Cell Biochem.1995Feb；57(2)：299-310.；Ritchie et al.，Int J Immunopharmacol.1995Oct；17(10)：805-12 |
| 维生素C | Staal et al.，AIDS Res Hum Retroviruses.1993Apr；9(4)：299-306；Son et al.，Arch Pharm Res.2004Oct；27(10)：1073-9 |
| 维生素B6 | Yanaka et al.，Int J Mol Med.2005Dec；16(6)：1071-5 |
| 维生素E衍生物 | Suzuki &Packer，Biochem Biophys Res Commun.1993May 28；193(1)：277-83 |
| a-生育酚琥珀酸酯(torphryl succinate) | Staal et al.，AIDS Res Hum Retroviruses.1993Apr；9(4)：299-306；Suzuki &Packer，Biochem Mol Biol Int.1993Nov；31(4)：693-700 |
| a-醋酸生育酚 | Suzuki &Packer，Biochem Biophys Res Commun.1993May 28；193(1)：277-83 |
| PMC(2，2，5，7，8-五甲基-6-羟基色原烷) | Suzuki &Packer，Biochem Biophys Res Commun.1993May 28；193(1)：277-83 |
| 益智酮A和B | Chun et al.，J Environ Pathol Toxicol Oncol.2002；21(2)：131-9 |
表2A REL/NF-κB的蛋白酶体和蛋白酶抑制剂
表2B IκBα磷酸化和/或降解抑制剂
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| BAY 11-7082 | IκBα磷酸化 | Pierce et al.J.Biol Chem1997；272，21096-21103BioMol，Plymouth Meeting，PA |
| BAY 11-7085 | IκBα磷酸化 | Pierce et al.J.Biol Chem1997；272，21096-21103BioMol，Plymouth Meeting，PA |
| 地氯雷他定 | 组胺H1受体 | Wu et al.，Int Arch Allergy Immunol.2004Dec；135(4)：313-8.Epub 2004Nov24 |
| 沙美特罗，氟替卡松丙酸(酯) | β2激动剂 | Baouz et al.，Int Immunol.2005Nov；17(11)：1473-81.Epub 2005Oct 6 |
| CPU0213 | 内皮素受体拮抗剂 | He et al.，Acta Pharmacol Sin.2006Sep；27(9)：1213-21 |
| 尔宾(Erbin)过量表达 | NOD2抑制剂 | McDonald et al.，J Biol Chem.2005Dec 2；280(48)：40301-9.Epub 2005Oct 3 |
| 来自担子菌的蛋白结合多糖 | LPS-CD14相互作用 | Asai et al.，FEMS Immunol Med Microbiol.2005Jan1；43(1)：91-8. |
| 卡拉挂林(Calagualine)(蕨衍生物) | IKK(TRAF2-NIK)上游 | Manna et al.，Cancer Lett.2003Feb 20；190(2)：171-82 |
| NS3/4A(HCV蛋白酶) | IKK的上游 | Karayiannis，J Hepatol.2005Oct；43(4)：743-5 |
| 高里(golli)BG21(髓磷脂碱性蛋白产物) | IKK的上游(PKC) | Feng et al.，J Neuroimmunol.2004Jul；152(1-2)：57-66 |
| NPM-ALK癌蛋白 | Traf2抑制 | Horie et al.，Cancer Cell.2004Apr；5(4)：353-64 |
| NS5A(丙肝病毒) | Traf2抑制 | Park et al.，J Biol Chem.2002Apr 12；277(15)：13122-8.Epub2002Jan 30 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| LY29和LY30 | PI3激酶抑制剂 | Choi et al.，FEBS Lett.2004Feb 13；559(1-3)：141-4 |
| 吴茱萸碱(吴茱萸成分) | AKT-IKK相互作用 | Takada et al.，J Biol Chem.2005Apr29；280(17)：17203-12.Epub2005Feb 14 |
| 利妥昔单抗(抗CD20抗体) | 上调Raf-1激酶抑制剂 | Jazirehi et al.，Cancer Res.2005Jan 1；65(1)：264-76 |
| ras的激酶抑制剂(KSR2) | MEKK3抑制剂 | Channavajhala et al.，Biochem Biophys Res Commun.2005Sep 9；334(4)：1214-8 |
| M2L(牛痘病毒) | ERK2抑制剂 | Gedey et al.，J Virol.2006Sep；80(17)：8676-85 |
| 法布罗(Pefabloc)(丝氨酸蛋白酶抑制剂) | IKK的上游 | Tando et al.，Digestion.2002；66(4)：237-45 |
| 罗卡酰胺(Rocaglamides)(Aglaia衍生物) | IKK的上游 | Baumann et al.，J Biol Chem.2002Nov22；277(47)：44791-800.Epub2002Sep 16 |
| 甜菜碱 | NIK/IKK | Hu et al.，J Biol Chem.2004Aug 20；279(34)：35975-83.Epub 2004Jun 18 |
| TNAP | NIK | Go et al.，JGerontol ABiol Sci Med Sci.2005Oct；60(10)：1252-64 |
| 格尔德霉素 | IKK复合物形成 | Chen et al.，Mol Cell.2002Feb；9(2)：401-10 |
| 葡萄籽原花青素 | IKKa活性 | Mantena &Katiyar，Free Radic Biol Med.2006May1；40(9)：1603-14.Epub 2006Jan 26 |
| MC160(接触传染软疣病毒) | IKKa活性 | Nichols &Shisler，J Virol.2006Jan；80(2)：578-86 |
| NS5B(丙肝蛋白) | IKKa活性 | Choi et al.，Mol Cell Biol.2006Apr；26(8)：3048-59 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 甜石榴提取物 | IKKa活性 | Afaq et al.，Photochem Photobiol.2005Jan-Feb；81(1)：38-45；Khan et al.，Carcinogenesis.2006Aug 18；[Epub ahead ofprint] |
| 粉防己碱(植物碱) | IKKa活性 | Ho et al.，Br J Pharmacol.2004Dec；143(7)：919-27.Epub 2004Oct 25 |
| BMS-345541(4(2′-氨基乙基)氨基-1，8-二甲基咪唑(1，2-a)喹噁啉) | IKKa和IKKb激酶活性 | Burke et al.，J Biol Chem.2003Jan 17；278(3)：1450-6.Epub 2002Oct 25；Yang et al.，2006 |
| 2-氨基-3-氰基-4-芳基-6-(2-羟基-苯基)吡啶衍生物 | IKKb活性 | Murata et al.，Bioorg Med Chem Lett.2003Mar10；13(5)：913-8，Murata et al.，Bioorg Med Chem Lett.2004Aug2；14(15)：4013-7，Murata et al.，Bioorg Med Chem Lett.2004Aug2；14(15)：4019-22 |
| 丙烯醛 | IKKb活性 | Vallacchi et al.，Antioxid Redox Signal.2005Jan-Feb；7(1-2)：25-31 |
| 大麻素 | IKKb活性 | Sancho et al.，Mol Pharmacol.2003Feb；63(2)：429-38 |
| AS602868 | IKKb活性 | Frelin et al.，Oncogene.2003Nov 6；22(50)：8187-94 |
| 眼镜蛇毒素 | IKKb活性和p50DNA结合 | Park et al.，Biochemistry.2005Jun 14；44(23)：8326-36 |
| 核心蛋白(丙型肝炎) | IKKb活性 | Joo et al.，J Virol.2005Jun；79(12)：7648-57；Shrivastava et al.，J Virol.1998Dec；72(12)：9722-8 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 二羟基苯基乙醇 | IKKb活性 | Guichard et al.，Carcinogenesis.2006Sep；27(9)：1812-27.Epub 2006Mar 7 |
| 除莠霉素A | IKKb活性 | Iwasaki et al.，FEBS Lett.1992Feb 24；298(2-3)：240-4；Mahon &O’Neill，Biochem Soc Trans.1995Feb；23(1)：111S；Ogino et al.，Mol Pharmacol.2004Jun；65(6)：1344-51 |
| 抑制剂22 | IKKb活性 | Baxter et al.，Bioorg Med Chem Lett.2004Jun7；14(11)：2817-22 |
| 异丹叶大黄素 | IKKb活性 | Li et al.，Free Radic Biol Med.2005Jan 15；38(2)：243-57 |
| 手霉素A | IKKb活性 | Bernier et al.，J Biol Chem.2006Feb 3；281(5)：2551-61.Epub 2005Nov 30；Frassanito et al.，Clin Exp Med.2005Mar；4(4)：174-82 |
| MLB120(小分子) | IKKb活性 | Nagashima et al.，Blood.2006Jun 1；107(11)：4266-73.Epub2006Jan 26 |
| 新型抑制剂 | IKKb活性 | Kamon et al.，Biochem Biophys Res Commun.2004Oct 8；323(1)：242-8 |
| vIRF3(KSHV) | IKKb活性 | Seo et al.，Oncogene.2004Aug 12；23(36)：6146-55 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 一氧化氮 | IKKb活性/IkB磷酸化 | Katsuyama et al.，Arterioscler Thromb Vasc Biol.1998Nov；18(11)：1796-802；Matthews et al.，Nucleic Acids Res.1996Jun15；24(12)：2236-42；Spieker &Liao，Methods Enzymol.1999；300：374-88；Reynaert et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2004Jun15；101(24)：8945-50.Epub2004Jun 7 |
| SC-514(小分子) | IKKb活性 | Kishore et al.，J Biol Chem.2003Aug29；278(35)：32861-71.Epub2003Jun 17 |
| 噻吩并吡啶 | IKKb活性 | Morwick et al.，J Med Chem.2006May 18；49(10)：2898-908 |
| 乙酰基乳香酸 | IKK活性 | Syrovets et al.，J Biol Chem.2005Feb 18；280(7)：6170-80.Epub 2004Dec 2；Syrovets et al.，J Immunol.2005Jan 1；174(1)：498-506 |
| 氨基嘧啶衍生物 | IKK活性 | Karin et al.，Nat Rev Drug Discov.2004Jan；3(1)：17-26 |
| 苯并咪唑衍生物 | IKK活性 | Karin et al.，Nat Rev Drug Discov.2004Jan；3(1)：17-26 |
| BMS-345541 | IKK活性 | Burke et al.，J Biol Chem.2003Jan 17；278(3)：1450-6.Epub 2002Oct 25. |
| β-咔啉 | IKK活性 | Yoon et al.，J Toxicol Environ Health A.2005Dec10；68(23-24)：2005-17 |
| CYL-19s和CYL-26z，两种合成的α-亚甲基-γ-丁内酯衍生物 | IKK活性 | Huang et al.，Carcinogenesis.2004Oct；25(10)：1925-34.Epub 2004Jun24 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| ACHP(2-氨基-6-[2-(环丙基甲氧基)-6-羟基苯基]-4-哌啶-4-尼古丁腈 | IKKb活性(ATP类似物) | Sanda et al.，Leukemia.2006Apr；20(4)：590-8 |
| 化合物A | IKKb活性(ATP类似物) | Ziegelbauer et al.，Br J Pharmacol.2005May；145(2)：178-92 |
| 夫拉平度(Flavopiridol) | IKK活性和RelA磷光体(phosphor) | Takada &Aggarwal，J Biol Chem.2004Feb6；279(6)：4750-9.Epub 2003Nov 20 |
| 环异戊烯炔(Cyclopentones) | IKKb活性 | Bickley et al.，Bioorg Med Chem.2004Jun15；12(12)：3221-7 |
| 脱氢抗坏血酸(维生素C) | IKKb活性 | Carcamo et al.，Mol Cell Biol.2004Aug；24(15)：6645-52 |
| IMD-0354 | IKKb活性 | Tanaka et al.，Blood.2005Mar15；105(6)：2324-31.Epub 2004Nov 23，Tanaka et al.，Cancer Res.2006Jan 1；66(1)：419-26；Inayama et al.，Am J Respir Crit Care Med.2006May1；173(9)：1016-22.Epub 2006Feb 2 |
| 杰斯同(Jesterone)二聚体 | IKKb活性；DNA结合 | Liang et al.，Mol Pharmacol.2003Jul；64(1)：123-31；Liang et al.，2006 |
| PS-1145(MLN1145) | IKKb活性 | Hideshima et al.，J Biol Chem.2002May10；277(19)：16639-47.Epub2002Feb 28 |
| 2-[(氨基羰基)氨基]-5-乙炔基-3-硫代苯基羧酰胺(TPCA-1) | IKKb活性 | Bonafoux et al.，Bioorg MedChem Lett.2005Jun2；15(11)：2870-5；Podolin et al.，2005 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(茛姜Languasgalanga) | IKK活性 | Ichikawa et al.，J Immunol.2005Jun 1；174(11)：7383-92；Ito et al.，Cancer Res.2005May 15；65(10)：4417-24 |
| 芹黄素(植物类黄酮素) | IKK活性 | Shukla &Gupta，Clin Cancer Res.2004May1；10(9)：3169-78；Yoon et al.，Mol Pharmacol.2006Sep；70(3)：1033-44.Epub2006Jun 16 |
| 豆蔻素 | IKK活性 | Lee et al.，J Pharmacol Exp Ther.2006Jan；316(1)：271-8.Epub 2005Sep 23 |
| CDDO-Me(合成三萜) | IKK活性 | Shishodia et al.，Clin Cancer Res.2006Mar15；12(6)：1828-38 |
| CHS 828(抗肿瘤药物) | IKK活性 | Olsen et al.，Int J Cancer.2004Aug 20；111(2)：198-205 |
| CML-1 | IKK活性 | Mo et al.，J Ethnopharmacol.2006Jul 11；[Epub ahead ofprint] |
| 化合物5(Uredio-硫代苯基羧酰胺衍生物) | IKK活性 | Roshak et al.，Curr Opin Pharmacol.2002Jun；2(3)：316-21 |
| 二烷基吡啶(Diaylpyridine)衍生物 | IKK活性 | Murata et al.，Bioorg Med Chem Lett.2003Mar10；13(5)：913-8 |
| 地奥配质(Diosgenin) | IKK活性 | Shishodia &Aggarwal，Oncogene.2006Mar9；25(10)：1463-73；Liagre et al.，Int J Mol Med.2005Dec；16(6)：1095-101 |
| E3-14.7K(腺病毒) | IKK活性 | Li et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.1999Feb 2；96(3)：1042-7 |
| E3-10.4K/14.5K(腺病毒) | IKK活性 | Friedman &Horwitz，J Virol.2002Jun；76(11)：5515-21 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| E7(人类乳头瘤病毒) | IKK活性 | Spitkovsky et al.，J Biol Chem.2002Jul 12；277(28)：25576-82.Epub 2002May 1 |
| 弗伦醌(Furonaphthoquinone) | IKK活性 | Shin et al.，Int Immunopharmacol.2006Jun；6(6)：916-23.Epub 2006Feb 3 |
| 香胶甾酮 | IKK活性 | Ichikawa &Aggarwal，Clin Cancer Res.2006Jan15；12(2)：662-8 |
| HB-EGF(肝素结合表皮生长因子样生长因子) | IKK活性 | Mehta &Besner，J Immunol.2003Dec 1；171(11)：6014-22 |
| 法卡多(Falcarindol) | IKK活性 | Shiao et al.，Br J Pharmacol.2005Jan；144(1)：42-51 |
| 肝细胞生长因子 | IKK活性 | Min et al.，Circ Res.2005Feb18；96(3)：300-7.Epub 2005Jan6；Gong et al.，JAm Soc Nephrol.2006Sep；17(9)：2464-73.Epub2006Aug 2 |
| 和厚朴酚 | IKK活性 | Tse et al.，Biochem Pharmacol.2005Nov 15；70(10)：1443-57.Epub 2005Sep 21 |
| 海泼德(Hypoestoxide) | IKK活性 | Ojo-Amaize et al.，Cell Immunol.2001May1；209(2)：149-57 |
| 吲哚羧酰胺衍生物 | IKK活性 | Karin et al.，Nat Rev Drug Discov.2004Jan；3(1)：17-26 |
| LF15-0195(15-脱氧斯婆琳(15-deoxyspergualine)类似物) | IKK活性 | Yang et al.，J Leukoc Biol.2003Sep；74(3)：438-47 |
| γ-倒捻子素(来自倒捻子(Garcinia mangostana)) | IKK活性 | Nakatani et al.，Mol Pharmacol.2004Sep；66(3)：667-74 |
| 加西农B(Garcinone B) | IKK活性 | Yamakuni et al.，Neurosci Lett.2006Feb 20；394(3)：206-10.Epub 2005Nov2 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| (氨基)咪唑基羧酰胺醛衍生物 | IKK活性 | Karin et al.，Nat Rev Drug Discov.2004Jan；3(1)：17-26. |
| 咪唑基喹啉-羧酰胺醛衍生物 | IKK活性 | Karin et al.，Nat Rev Drug Discov.2004Jan；3(1)：17-26 |
| 咖啡白脂 | IKK活性 | Kim et al.，Cancer Lett.2004Sep 30；213(2)：147-54 |
| 卡法根(胡椒属醉椒(Piper methysticum))衍生物 | IKK活性 | Folmer et al.，Biochem Pharmacol.2006Apr14；71(8)：1206-18.Epub 2006Feb 7 |
| 铅(Lead) | IKK活性 | Xu et al.，Cell Biol Toxicol.2006May；22(3)：189-98 |
| 轻度低温 | IKK活性 | Han et al.，J Cereb Blood Flow Metab.2003May；23(5)：589-98 |
| ML120B | IKK活性 | Catley et al.，Mol Pharmacol.2006Aug；70(2)：697-705.Epub2006May 10 |
| MX781(类维生素A拮抗剂) | IKK活性 | Bayon et al.，Mol Cell Biol.2003Feb；23(3)：1061-74 |
| N-乙酰基半胱氨酸 | IKK活性 | Oka et al.，FEBS Lett.2000Apr 28；472(2-3)：196-202 |
| 尼科旻(Nitrosylcobalamin)(维生素B12类似物) | IKK活性 | Chawla-Sarkar et al.，J Biol Chem.2003Oct10；278(41)：39461-9.Epub2003Jul 24 |
| NSAID | IKK活性 | Takada et al.，Oncogene.2004Dec 9；23(57)：9247-58 |
| 丙肝病毒NS5B | IKK活性 | Choi et al.，Mol Cell Biol.2006Apr；26(8)：3048-59 |
| PAN1(也称NALP2或PYPAF2) | IKK活性 | Bruey et al.，J Biol Chem.2004Dec10；279(50)：51897-907.Epub2004Sep 28 |
| 果胶(柑橘) | IKK活性 | Chen et al.，Biochem Pharmacol.2006Oct16；72(8)：1001-9.Epub 2006Aug 22 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 吡唑并[4，3-c]喹啉衍生物 | IKK活性 | Karin et al.，Nat Rev Drug Discov.2004Jan；3(1)：17-26 |
| 丕力农(Pyridooxazinone)衍生物 | IKK活性 | Karin et al.，Nat Rev Drug Discov.2004Jan；3(1)：17-26 |
| N-(4-羟基苯基)维甲酰胺 | IKK活性 | Shishodia et al.，Cancer Res.2005Oct 15；65(20)：9555-65 |
| 斯透旻(Scytonemin) | IKK活性 | Stevenson et al.，Inflamm Res.2002Feb；51(2)：112-4 |
| 鸡腰肉托果(Semecarpusanacardiu)提取物 | IKK活性 | Singh et al.，J Ethnopharmacol.2006Jun 2；[Epub ahead ofprint] |
| SPC-839 | IKK活性 | Palanki et al.，2002 |
| 莱菔硫烷和异硫氰酸苯酯 | IKK活性 | Xu et al.，Oncogene.2005Jun30；24(28)：4486-95 |
| 瑟万他(Survanta)(表面活性剂产品) | IKK活性 | Raychaudhuri et al.，Am J Respir Cell Mol Biol.2004Feb；30(2)：228-32.Epub 2003Aug 14 |
| 皮塔诺(Piceatannol) | IKK活性 | Islam et al.，Microbiol Immunol.2004；48(10)：729-36 |
| 白花丹素(5-羟基-2-甲基-1，4-萘醌) | IKK活性 | Sandur et al.，J Biol Chem.2006Jun23；281(25)：17023-33.Epub2006Apr 19 |
| IKKb肽至NEMO结合结构域 | IKK-NEMO相互作用 | May et al.，Science.2000Sep1；289(5484)：1550-4 |
| NEMO CC2-LZ肽 | NEMO寡聚化 | Agou et al.，2004 |
| AGRO100(G-四聚寡聚脱氧核苷酸，G-quadraplexoligodeoxynucleotide) | NEMO结合 | Girvan et al.，Mol Cancer Ther.2006Jul；5(7)：1790-9 |
| PTEN(肿瘤抑制剂) | 激活IKK | Gustin et al.，J Biol Chem.2001Jul 20；276(29)：27740-4.Epub 2001May 16 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 茶黄素(黑茶成分) | 激活IKK | Aneja et al.，Crit Care Med.2004Oct；32(10)：2097-103；Ukil et al.，Br J Pharmacol.2006Sep；149(1)：121-31.Epub2006Jul 31 |
| 提联因(Tilianin) | 激活IKK | Nam et al.，Atherosclerosis.2005May；180(1)：27-35.Epub2005Jan 19 |
| 睡茄交酯(Withanolide) | 激活IKK | Ichikawa et al.，Mol Cancer Ther.2006Jun；5(6)：1434-45 |
| 球姜酮 | 激活IKK | Takada et al.，Oncogene.2005Oct 20；24(46)：6957-69 |
| 水飞蓟宾 | IKKo活性；核转位 | Dhanalakshmi et al.，Oncogene.2002Mar7；21(11)：1759-67；Singh et al.，Oncogene.2005Feb 10；24(7)：1188-202 |
| 柳氮磺吡啶 | IKKa和IKKb激酶活性 | Wahl et al.，J Clin Invest.1998Mar 1；101(5)：1163-74：Weber et al.，Gastroenterology.2000Nov；119(5)：1209-18 |
| 柳氮磺吡啶类似物 | IKK激酶活性 | Habens et al.，Apoptosis.2005May；10(3)：481-91 |
| 槲皮素 | IKK活性 | Peet &Li，J Biol Chem.1999Nov 12；274(46)：32655-61 |
| 迷迭香酸 | IKK活性 | Lee et al.，Br J Pharmacol.2006Jun；148(3)：366-75 |
| 十字孢碱 | IKK活性 | Peet &Li，J Biol Chem.1999Nov 12；274(46)：32655-61 |
| γ-生育三烯酚 | IKK活性 | Shah &Sylvester，Exp Biol Med(Maywood).2005Apr；230(4)：235-41 |
| 蟛蜞菊内酯 | IKK活性 | Kobori et al.，Cell Death Differ.2004Jan；11(1)：123-30 |
| 桦木酸 | IKKa活性和p65磷酸化 | Takada &Aggarwal，J Immunol.2003Sep15；171(6)：3278-86 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 乌索酸 | IKKa活性和p65磷酸化 | Shishodia et al.，Cancer Res.2003Aug 1；63(15)：4375-83 |
| 沙利度胺(及沙利度胺类似物) | IKK活性 | Keifer et al.，J Biol Chem.2001Jun 22；276(25)：22382-7.Epub 2001Apr 10；Ge et al.，Blood.2006Aug 29；[Epub ahead of print] |
| 白介素-10 | 降低的IKKa和IKKb表达 | Tabary et al.，Am J Pathol.2003Jan；162(1)：293-302 |
| MC160(接触传染软疣病毒) | 降低的IKKa表达 | Nichols &Shisler，J Virol.2006Jan；80(2)：578-86 |
| 一氯胺和甘氨酸氯胺(NH2Cl) | 氧化IkB | Kim et al.，Biochim Biophys Acta.2005Dec15；1746(2)：135-42.Epub 2005Oct 28；Midwinter et al.，Biochem J.2006May 15；396(1)：71-8 |
| 茴香脑 | 磷酸化 | Chainy et al.，Oncogene.2000Jun 8；19(25)：2943-50 |
| 抗凝血酶III | 磷酸化 | Oelschlager et al.，Blood.2002Jun 1；99(11)：4015-20 |
| 蒿皂荚(Artemisiavestita) | 磷酸化 | Sun et al.，Int J Mol Med.2006May；17(5)：957-62 |
| 阿司匹林，水杨酸钠 | 磷酸化，IKKβ | Frantz &O′Neill，Science.1995Dec22；270(5244)：2017-9；Kopp &Ghosh，Science.1994Aug 12；265(5174)：956-9；Yin et al.，Nature.1998Nov5；396(6706)：77-80 |
| 齐多夫定(Azidothymidine，AZT) | 磷酸化 | Ghosh et al.，Blood.2003Mar15；101(6)：2321-7.Epub 2002Oct 24.；Kurokawa et al.，Blood.2005Jul 1；106(1)：235-40.Epub2005Mar 24 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 保肝宁(Baoganning) | 磷酸化 | Tan et al.，Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi.2005Sep；25(9)：804-7 |
| BAY-11-7082(E3((4-甲基苯基)-磺酰)-2-丙烯腈) | 磷酸化 | Pierce et al.，J Biol Chem.1997Aug22；272(34)：21096-103. |
| BAY-117083(E3((4-t-丁基苯基)-磺酰)-2-丙烯腈) | 磷酸化 | Pierce et al.，J Biol Chem.1997Aug22；272(34)：21096-103 |
| 苄基异硫氰酸酯(盐) | 磷酸化 | Srivastava &Singh，Carcinogenesis.2004Sep；25(9)：1701-9.Epub 2004Apr29 |
| 黑树莓提取物(花青素3-O-葡萄糖苷，花青素3-O-(2(G)-木糖鼠李糖苷)，花青素3-O-芸香糖苷) | 磷酸化 | Huang et al.，Cancer Res.2002Dec 1；62(23)：6857-63.；Hecht et al.，Carcinogenesis.2006Aug；27(8)：1617-26.Epub2006Mar 7 |
| 醉鱼草苷IV | 磷酸化 | Won et al.，Br J Pharmacol.2006May；148(2)：216-25 |
| 卡彭诺来B(Cacospongionolide B) | 磷酸化 | Posadas et al.，Br J Pharmacol.2003Apr；138(8)：1571-9 |
| 卡拉林(Calagualine) | 磷酸化 | Manna et al.，Cancer Lett.2003Feb 20；190(2)：171-82 |
| 一氧化碳 | 磷酸化 | Sarady et al.，Am J Respir Cell Mol Biol.2002Dec；27(6)：739-45 |
| 卡铂 | 磷酸化 | Singh &Bhat，Biochem Biophys Res Commun.2004May 28；318(2)：346-53 |
| 小豆蔻明 | 磷酸化 | Israf et al.，Mol Immunol.2007Feb；44(5)：673-9.Epub 2006Jun 13 |
| 绒毛膜促性腺激素 | 磷酸化 | Manna et al.，J Biol Chem.2000May 5；275(18)：13307-14 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 冬虫夏草素 | 磷酸化 | Kim et al.，Eur J Pharmacol.2006Sep 18；545(2-3)：192-9.Epub 2006Jun 28 |
| 环顶环氧菌素(Cycloepoxydon)；1-羟基-2-羟基甲基-3-戊-1-烯苯 | 磷酸化 | Gehrt et al.，J Antibiot(Tokyo).1998May；51(5)：455-63 |
| 巨细胞病毒 | 磷酸化 | Jarvis et al.，2006 |
| 迪叩生 | 磷酸化 | Kim et al.，Mol Pharmacol.2006Jun；69(6)：1783-90.Epub2006Mar 1 |
| 地塞比诺 | 磷酸化 | Juttler et al.，Neuropharmacology.2004Sep；47(4)：580-92 |
| 毛地黄毒苷 | 磷酸化 | Srivastava et al.，Proc Natl Acad Sci U SA.2004May18；101(20)：7693-8.Epub 2004May 10 |
| 二萜类(合成的) | 磷酸化 | Chao et al.，Chembiochem.2005Jan；6(1)：133-44 |
| 二十二碳六烯酸 | 磷酸化 | Chen et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci.2005Nov；46(11)：4342-7 |
| 痢疾阿米巴(Entamoebahistolytica) | 磷酸化 | Kammanadiminti &Chadee，J Biol Chem.2006Sep8；281(36)：26112-20.Epub2006Jul 13 |
| 广泛氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)，4-羟基诺尔(4-Hydroxynonenal)(HNE) | 磷酸化 | Brand et al.，Arterioscler Thromb Vasc Biol.1997Oct；17(10)：1901-9；Page et al.，J Biol Chem.1999Apr 23；274(17)：11611-8 |
| FHIT(脆性组氨酸三联蛋白) | 磷酸化 | Nakagawa &Akao，Exp Cell Res.2006Aug1；312(13)：2433-42.Epub 2006Apr 25 |
| 加贝酯(Gabexatemesilate) | 磷酸化 | Uchiba et al.，Crit Care Med.2003Apr；31(4)：1147-53 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| [6]-姜酚；卡司络(casparol) | 磷酸化 | Kime et al.，Oncogene.2005Apr 7；24(15)：2558-67.；Aktan et al.，planta Med.2006Jun；72(8)：727-34.Epub 2006May 29 |
| 格力克(Gleevec)(宜玛尼Imatanib) | 磷酸化 | Wolf et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2005Sep20；102(38)：13622-7.Epub2005Sep 8 |
| 鹿角草(Glossogynetenuifolia) | 磷酸化 | Wu et al.，J Biomed Sci.2004Mar-Apr；11(2)：186-99；Ha et al.，J Ethnopharmacol.2006Aug 11；107(1)：116-25.Epub 2006Apr 3 |
| 没药甾酮(Guggulsterone) | 磷酸化 | Shishodia &Aggarwal，J Biol Chem.2004Nov5；279(45)：47148-58.Epub2004Aug 17 |
| 氢醌 | 磷酸化 | Kerzic et al.，Toxicology.2003May 3；187(2-3)：127-37 |
| 布洛芬 | 磷酸化 | Palayoor et al.，Oncogene.1999Dec 2；18(51)：7389-94 |
| 靛玉红-3′-肟 | 磷酸化 | Mak et al.，Biochem Pharmacol.2004Jan1；67(1)：167-74 |
| 干扰素-α | 磷酸化 | Manna et al.，J Immunol.2000Nov 1；165(9)：4927-34 |
| 吸入的亚硝酸异丁酯 | 磷酸化 | Ponnappan et al.，Int Immunopharmacol.2004Aug；4(8)：1075-82 |
| 甘草(Licorce)提取物 | 磷酸化 | Kim et al.，Biochem Biophys Res Commun.2006Jul7；345(3)：1215-23.Epub 2006May 15 |
| 褪黑激素 | 磷酸化 | Alonso et al.，J Pineal Res.2006Aug；41(1)：8-14 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 氨甲蝶呤 | 磷酸化 | Majumdar &Aggarwal，J Immunol.2001Sep1；167(5)：2911-20；Yozai et al.，J Am Soc Nephrol.2005Nov；16(11)：3326-38.Epub 2005Sep 21 |
| 一氯胺 | 磷酸化 | Omori et al.，Free Radic Res.2002Aug；36(8)：845-52 |
| 甲磺酸卡萘司他 | 磷酸化 | Noguchi et al.，Int Immunopharmacol.2003Sep；3(9)：1335-44 |
| 夹竹桃苷 | 磷酸化 | Manna et al.，Cancer Res.2000Jul 15；60(14)：3838-47；Sreeivasan et al.，Biochem Pharmacol.2003Dec1；66(11)：2223-39 |
| ω3-脂肪酸 | 磷酸化 | Novak et al.，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2003Jan；284(1)：L84-9.Epub 2002Aug 30 |
| 潘度拉汀A(PanduratinA)(来自凹唇姜(Kaempferia panduraa)，姜科) | 磷酸化 | Yun et al.，planta Med.2003Dec；69(12)：1102-8 |
| 泼旁拉德M(Petrosaspongiolide M) | 磷酸化 | Posadas et al.，Biochem Pharmacol.2003Mar1；65(5)：887-95 |
| 银松素 | 磷酸化 | Lee et al.，planta Med.2006Jul；72(9)：801-6.Epub 2006Jun 19 |
| 悬钩子(Plagiusflosculosus)提取物聚乙炔洛克托(polyacetylenespiroketal) | 磷酸化 | Calzado et al.，Biochim Biophys Acta.2005Jun30；1729(2)：88-93 |
| 植酸(肌醇六磷酸) | 磷酸化 | Ferry et al.，Carcinogenesis.2002Dec；23(12)：2031-41 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 石榴(Pomegranate)果实提取物 | 磷酸化 | Ahmed et al.，J Nutr.2005Sep；135(9)：2096-102 |
| 前列腺素A1 | 磷酸化/IKK | Rossi et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.1997Jan21；94(2)：746-50；Rossi et al.，Nature.2000Jan6；403(6765)：103-8 |
| 20(S)-原人参三醇(人参皂甙的代谢产物) | 磷酸化 | Oh et al.，Cancer Lett.2004Mar 8；205(1)：23-9；Lee et al.，Planta Med.2005Dec；71(12)：1167-70 |
| 雷吉隆(Rengyolone) | 磷酸化 | Kim et al.，Biochem Pharmacol.2006Apr14；71(8)：1198-205.Epub 2006Feb 2 |
| 卡马拉素 | 磷酸化 | Kim et al.，Biochem Biophys Res Commun.2005Nov11；337(1)：110-5 |
| 柴胡皂苷-d(saikosaponin-d) | 磷酸化 | Leung et al.，Biochem Biophys Res Commun.2005Dec30；338(4)：1920-7.Epub 2005Nov11. |
| 盐水(低Na+等渗) | 磷酸化 | Tabary et al.，Biochem Biophys Res Commun.2003Sep 19；309(2)：310-6 |
| 丹参水溶性提取物 | 磷酸化 | Kim et al.，Clin Exp Immunol.2005Aug；141(2)：288-97. |
| 血根碱(血根碱，13-甲基-[1，3]-二噁茂苯并-[5，6-c]-1，3-二噁茂-4，5苯基蒽丁) | 磷酸化 | Chaturvedi et al.，J Biol Chem.1997Nov28；272(48)：30129-34 |
| 滨蒿内酯 | 磷酸化 | Jang et al.，Life Sci.2006May15；78(25)：2937-43.Epub 2005Dec 22 |
| 芝麻素酚糖苷 | 磷酸化 | Lee et al.，Neurosci Res.2006Oct；56(2)：204-12.Epub 2006Jul 13 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 水飞蓟素 | 磷酸化 | Manna et al.，J Immunol.1999Dec 15；163(12)：6800-9；Saliou et al.，FEBS Lett.1998Nov 27；440(1-2)：8-12 |
| SOCS1 | 磷酸化 | Kinjyo et al.，Immunity.2002Nov；17(5)：583-91；Nakagawa et al.，Immunity.2002Nov；17(5)：677-87 |
| 他汀类(Statins)(几种) | 磷酸化 | Hilgendorff et al.，Int J Clin Pharmacol Ther.2003Sep；41(9)：397-401；Han et al.，2004；Planavila et al.，Biochim Biophys Acta.2005Feb21；1687(1-3)：76-83 |
| 舒林酸 | IKK/磷酸化 | Yamamato et al.，J Biol Chem.1999Sep 17；274(38)：27307-14 |
| THI 52(1-萘基乙基-6，7-二羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉) | 磷酸化 | Kang et al.，Biochem Pharmacol.2003Feb1；65(3)：457-64 |
| 1，2，4--噻二唑衍生物 | 磷酸化 | Manna et al.，Int J Cancer.2005Feb 10；113(4)：549-60 |
| 维司力农 | 磷酸化 | Manna &Aggarwal，J Immunol.2000Jun1；164(11)：5815-25；Harada et al.，Int J Oncol.2005Dec；27(6)：1489-97 |
| 黄当归醇D | 磷酸化 | Sugii et al.，Biol Pharm Bull.2005Apr；28(4)：607-10. |
| YC-1 | 磷酸化 | Huang et al.，Mol Cancer Ther.2005Oct；4(10)：1628-35 |
| YopJ(假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)编码) | IkBa的去泛素酶化 | Schesser et al.，Mol Microbil.1998Jun；28(6)：1067-79；Zhou et al.，J Exp Med.2005Nov 21；202(10)：1327-32 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 对乙酰氨基酚 | 降解 | Mancini et al.，Neurosci Lett.2003Dec 19；353(2)：79-82 |
| 激活的蛋白C(APC) | 降解 | Yuksel et al.，Thromb Haemost.2002Aug；88(2)：267-73 |
| 甲草胺 | 降解 | Shimomura-Shimizu et al.，Biochem Biophys Res Commun.2005Jul8；332(3)：793-9 |
| a-黑色素细胞-刺激激素(a-MSH) | 降解 | Manna &Aggarwal，J Immunol.1998Sep15；161(6)：2873-80 |
| 阿曼托黄素 | 降解 | Banerjee et al.，Mol Cell Biochem.2002Sep；238(1-2)：105-10 |
| 茵陈蒿(Artemisiacapillaries Thunb)提取物 | 降解 | Hong et al.，Int J Mol Med.2004May；13(5)：717-20 |
| 四季蒿(Artemisiaiwayomogi)提取物 | 降解 | Kim et al.，Exp Biol Med (Maywood).2005Jan；230(1)：82-8 |
| L-抗坏血酸 | 降解 | Han et al.，J Cell Biochem.2004Oct 1；93(2)：257-70 |
| 樟芝(Antrodiacamphorata) | 降解 | Hseu et al.，Int Immunopharmacol.2005Dec；5(13-14)：1914-25.Epub2005Jul 18 |
| 桃叶珊瑚苷(Aucubin) | 降解 | Jeong et al.，Cytokine.2002Jun 7；18(5)：252-9. |
| 黄芩黄素 | 降解 | Ma et al.，Blood.2005Apr15；105(8)：3312-8.Epub 2004Dec 30 |
| β-拉帕醌 | 降解 | Manna et al.，Biochem Pharmacol.1999Apr1；57(7)：763-74 |
| 黑莓提取物 | 降解 | Pergola et al.，Nitric Oxide.2006Aug；15(1)：30-9.Epub2006Mar 6 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 1-溴丙烷 | 降解 | Yoshida et al.，Neurotoxicology.2006Jun 2；[Epub ahead of print] |
| 步长汤(Buchang-tang) | 降解 | Shin et al.，J Ethnopharmacol.2005Oct 31；102(1)：95-101 |
| 辣椒素(8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺) | 降解 | Singh et al.，J Immunol.1996Nov 15；157(10)：4412-20；Mori et al.，Cancer Res.2006Mar 15；66(6)：3222-9 |
| 梓苷 | 降解 | Kim et al.，Inflamm Bowel Dis.2004Sep；10(5)：564-72 |
| 环落棉酮(cyclolinteinone)(海绵二倍半萜) | 降解 | D′Acquisto et al.，Biochem J.2000Mar 15；346Pt 3：793-8 |
| DA-9601(青蒿草(Artemisia asiatica)提取物) | 降解 | Choi et al.，World J Gastroenterol.2006Aug14；12(30)：4850-8 |
| 二酰胺(酪氨酸磷酸酶抑制剂) | 降解 | Toledano &Leonard，Proc Natl Acad Sci U S A.1991May15；88(10)：4328-32；Singh &Aggarwal，J Biol Chem.1995May5；270(18)：10631-9. |
| 双氢青蒿素 | 降解 | Li et al.，Int Immunopharmacol.2006Aug；6(8)：1243-50.Epub 2006Apr 7 |
| 多巴酚丁胺 | 降解 | Loop et al.，Anesth Analg.2004Nov；99(5)：1508-15；内容表格。 |
| 二十二碳六烯酸 | 降解 | Weldon et al.，J Nutr Biochem.2006Jun 15；[印刷之前以电子出版物发表] |
| E-73(环己酰亚胺类似物) | 降解 | Sugimoto et al.，Biochem Biophys Res Commun.2000Oct 22；277(2)：330-3 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 依卡倍特钠 | 降解 | Kim et al.，Helicobacter.2003；8(5)：542-53 |
| 迷走神经电刺激 | 降解 | Guarini et al.，Circulation.2003Mar 4；107(8)：1189-94 |
| 大黄素(3-甲基-1，6，8-三羟基蒽醌) | 降解 | Kumar et al.，Oncogene.1998Aug 20；17(7)：913-8；Huang et al.，Biochem Pharmacol.2004Jul15；68(2)：361-71 |
| 麻黄(Mao) | 降解 | Aoki et al.，J Pharmacol Sci.2005Jul；98(3)：327-30.Epub2005Jul 9 |
| 牛尿酚 | 降解 | Kang et al.，Biochem Pharmacol.2005Dec19；71(1-2)：136-43.Epub 2005Nov 10 |
| 俄丝提恩(Erbstatin)(酪氨酸激酶抑制剂) | 降解 | Natarajan et al.，Arch Biochem Biophys.1998Apr1；352(1)：59-70 |
| 雌激素(E2) | 降解/以及各种其他步骤 | Sun et al.，Biochem Biophys Res Commun.1998Mar27；244(3)：691-5；Kalaitzidis &Gilmore，Trends Endocrinol Metab.2005Mar；16(2)：46-52；Steffan et al.，Curr Top Med Chem.2006；6(2)：103-11. |
| 依他尼酸 | 降解(和DNA结合) | Han et al.，2004 |
| 磷霉素 | 降解 | Yoneshima et al.，Int J Antimicrob Agents.2003Jun；21(6)：589-92 |
| 真菌胶霉毒素 | 降解 | Pahlet al.，Oncogene.1999Nov 22；18(49)：6853-66 |
| 加贝酯甲磺酸酯(盐) | 降解 | Yuksel et al.，J Pharmacol Exp Ther.2003Apr；305(1)：298-305 |
| 加拉伯姆(Gamisanghyulyunbueum) | 降解 | Shin et al.，Biol Pharm Bull.2005Jul；28(7)：1177-82 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 染料木黄酮(酪氨酸激酶抑制剂) | 降解；半胱天冬酶剪切IkBa | Natarajan et al.，Arch Biochem Biophys.1998Apr1；352(1)：59-70；Baxa &Yoshimura，Biochem Pharmacol.2003Sep15；66(6)：1009-18. |
| 京尼平 | 降解 | Koo et al.，Eur J Pharmacol.2004Jul 14；495(2-3)：201-8 |
| 光甘草定 | 降解 | Kang et al.，J Pharmacol Exp Ther.2005Mar；312(3)：1187-94.Epub2004Nov 10 |
| 格列美脲 | 降解 | Schiekofer et al.，Diabetes Obes Metab.2003Jul；5(4)：251-61 |
| 葡糖胺硫酸酯(盐) | 降解 | Largo et al.，Osteoarthritis Cartilage.2003Apr；11(4)：290-8 |
| γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 | 降解 | Manna et al.，Oncogene.1999Jul 29；18(30)：4371-82. |
| 谷氨酰胺 | 降解 | Singleton et al.，Shock.2005Dec；24(6)：583-9 |
| 谷米刚花塘(Gumiganghwaltang) | 降解 | Kim et al.，Biol Pharm Bull.2005Feb；28(2)：233-7 |
| 热休克蛋白-70 | 降解 | Chan et al.，Circulation.2004Dec 7；110(23)：3560-6.Epub2004Nov 22.；Shi et al.，Shock.2006Sep；26(3)：277-84 |
| 次氯酸盐 | 降解 | Mohri et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci.2002Oct；43(10)：3190-5. |
| IL-13 | 降解 | Manna &Aggarwal，J Immunol.1998Sep15；161(6)：2863-72 |
| 静脉内免疫球蛋白 | 降解 | Ichiyama et al.，Inflamm Res.2004Jun；53(6)：253-6.Epub2004May 12 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 异月桂色原烷醇(Isomallotochromanol)和异月桂色烯(isomallotochromene) | 降解 | Ishii et al.，Biochim Biophys Acta.2003Mar17；1620(1-3)：108-18 |
| K1L(牛痘病毒蛋白) | 降解 | Shisler &Jin，J Virol.2004Apr；78(7)：3553-60 |
| 地肤子果实(甲醇提取物) | 降解 | Shin et al.，Biol Pharm Bull.2004Apr；27(4)：538-43 |
| 来氟米特的代谢产物(A771726) | 降解 | Manna &Aggarwal，J Immunol.1999Feb15；162(4)：2095-102 |
| 洛萨汀(Losartin) | 降解 | Chen et al.，2002 |
| 低水平激光治疗 | 降解 | Rizzi et al.，Lasers Surg Med.2006Aug；38(7)：704-13 |
| LY294002(PI3-激酶抑制剂)[2-(4-吗啉基)-8-苯基色酮] | 降解 | Park et al.，Cell Biol Toxicol.2002；18(2)：121-30. |
| MC159(接触传染软疣病毒) | 降解IkBb | Murao &Shisler，2005 |
| 褪黑素 | 降解 | Zhang et al.，Eur J Pharmacol.2004Oct 6；501(1-3)：25-30 |
| 5′-甲硫腺苷 | 降解 | Hevia et al.，Hepatology.2004Apr；39(4)：1088-98. |
| 咪达唑仑 | 降解 | Kim et al.，Anesthesiology.2006Jul；105(1)：105-10 |
| 木鳖子皂苷I | 降解 | Hwang et al.，Biochem Biophys Res Commun.2005Nov 25；337(3)：815-23.Epub2005Sep 28. |
| 巴戟天(Morindaofficinalis)提取物 | 降解 | Kim et al.，J Pharm Pharmacol.2005May；57(5)：607-15 |
| 小鱼仙草(Mosladianthera)提取物 | 降解 | Lee et al.，Toxicol Appl Pharmacol.2006Jun 22；[Epubahead of print] |
| Murr1基因产物 | 降解 | Ganesh et al.，Nature.2003Dec 18；426(6968)：853-7. |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 多发性神经纤维瘤-2(NF-2；隼)蛋白 | 降解 | Kim et al.，Biochem Biophys Res Commun.2002Sep6；296(5)：1295-302 |
| 印榕仙人掌(Opuntiaficus indica va saboten)提取物 | 降解 | Lee et al.，2006 |
| 喷他汀(Penetratin) | 降解 | Letoya et al.，Mol Pharmacol.2006Jun；69(6)：2027-36.Epub2006Feb 27. |
| 过钒酸钠(酪氨酸磷酸酶抑制剂) | 降解 | Singh &Aggarwal，J Biol Chem.1995May5；270(18)：10631-9；Singh et al.，J Biol Chem.1996Dec 6；271(49)：31049-54 |
| 苯基胂化氧(PAO，酪氨酸磷酸酶抑制剂) | 降解 | Mahboubi et al.，J Pharmacol Exp Ther.1998May；285(2)：862-8；Singh &Aggarwal，J Biol Chem.1995May5；270(18)：10631-9 |
| β-苯基乙基(PEITC)和8-甲基亚磺酰辛基异硫氰酸酯(MSO)(水田芥) | 降解 | Rose et al.，Nitric Oxide.2005Jun；12(4)：237-43 |
| 苯妥英 | 降解 | Kato et al.，2005 |
| 桔梗皂苷(platycodin saponins) | 降解 | Ahn et al.，Life Sci.2005Apr1；76(20)：2315-28 |
| 多粘菌素B | 降解 | Jiang et al.，Chin Med J(Engl).2006Mar 5；119(5)：384-90. |
| 枳壳水果提取物 | 降解 | Shin et al.，Toxicol In vitro.2006Oct；20(7)：1071-6.Epub2006Mar 6 |
| 新生元益生菌(Probiotics) | 降解 | Petrof et al.，Gastroenterology.2004Nov；127(5)：1474-87. |
| 垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP) | 降解 | Delgado &Ganea，J Biol Chem.2001Jan5；276(1)：369-80 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 前列腺素15-脱氧-δ(12，14)-PGJ(2) | 降解 | Cuzzocrea et al.，Br J Pharmacol.2003Feb；138(4)：678-88；Chatterjee et al.，Cardiovasc Res.2004Feb 15；61(3)：630-43 |
| PS-341 | 降解/蛋白酶体 | Hideshima et al.，J Biol Chem.2002May10；277(19)：16639-47.Epub2002Feb 28 |
| 润拉辛(Resiniferatoxin) | 降解 | Singh et al.，J Immunol.1996Nov 15；157(10)：4412-20 |
| 萨巴三(Sabaeksan) | 降解 | Choi et al.，Exp Mol Pathol.2005Jun；78(3)：257-62.Epub2005Feb 17 |
| SAIF(啤酒酵母菌抗炎性因子) | 降解 | Sougioultzis et al.，Biochem Biophys Res Commun.2006Apr 28；343(1)：69-76.Epub2006Feb 23. |
| 倍半萜内酯(银胶菊内酯；麦角内酯；愈创木内脂) | 降解 | Hehner et al.，J Biol Chem.1998Jan 16；273(3)：1288-97；Whan Han et al.，Br J Pharmacol.2001Jun；133(4)：503-12.；Schorr et al.，Phytochemistry.2002Aug；60(7)：733-40 |
| ST2(IL-1样受体分泌型) | 降解 | Takezako et al.，Biochem Biophys Res Commun.2006Mar 10；341(2)：425-32.Epub2006Jan 11 |
| 戊硫代巴比妥 | 降解 | Loop et al.，Anesthesiology.2002May；96(5)：1202-13 |
| 提法尼(Tipifarnib) | 降解 | Xue et al.，J Pharmacol Exp Ther.2006Apr；317(1)：53-60.Epub 2005Dec 13 |
| 钛 | 降解 | Yang et al.，J Biomed Mater Res A.2003Sep15；66(4)：802-10 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| TNP-470(血管生成抑制剂) | 降解 | Mauriz et al.，Free Radic Res.2003Aug；37(8)：841-8 |
| 刺荨麻(大荨麻(Urticadioica))植物提取物 | 降解 | Riehemann et al.，FEBS Lett.1999Jan 8；442(1)：89-94 |
| 阴道毛滴虫(Trichomomasvaginalis)感染 | 降解 | Chang et al.，Mol Cells.2004Oct 31；18(2)：177-85 |
| 富含甘油三酯脂蛋白 | 降解 | Kumwenda et al.，Shock.2002Aug；18(2)：182-8 |
| U0126(MEK抑制剂) | 降解 | Takaya et al.，Am J Physiol Renal Physiol.2003May；284(5)：F1037-45.Epub2003Jan 7 |
| 熊去氧胆酸 | 降解 | Joo et al.，Arch Pharm Res.2004Sep；27(9)：954-60 |
| 苍耳(Xanthiumstrumarium L.)(甲醇提取物) | 降解 | Kim et al.，Biol Pharm Bull.2005Jan；28(1)：94-100 |
| 锌 | 降解 | Uzzo et al.，Carcinogenesis.2006Oct；27(10)：1980-90.Epub 2006Apr 10；Bao et al.，Toxicol Lett.2006Oct 25；166(3)：222-8.Epub2006Jul 18 |
| 接触传染软疣病毒MC159蛋白 | IkBβ降解 | Murao &Shisler，Virology.2005Sep 30；340(2)：255-64 |
| 血管活性肠肽 | 降解(和CBP-RelA相互作用) | Delgado &Ganea，J Biol Chem.2001Jan5；276(1)：369-80；Delgado，Biochem Biophys Res Commun.2002Oct11；297(5)：1181-5 |
| HIV-1Vpu蛋白 | TrCP泛素连接酶抑制剂 | Bour et al.，J Biol Chem.2001May 11；276(19)：15920-8.Epub 2001Feb 16 |
| 分子 | 抑制点 | 参考文献 |
| 艾泊农A单体(Epoxyquinone Amonomer) | IKKb/DNA结合 | Liang et al.，Biochem Pharmacol.2006Feb28；71(5)：634-45.Epub 2005Dec 19 |
| Ro106-9920(小分子) | IkBa泛素化抑制剂 | Swinney et al.，J Biol Chem.2002Jun28；277(26)：23573-81.Epub2002Apr 11 |
表3NF-κB的各种抑制剂
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| 小叶狗牙花提取物(Ervatamia microphylla) | 下调TNF-受体 | Gohda et al.，2003 Int J Oncol.23(5)：1373-9 |
| MOL 294(小分子) | NF-κB的氧化还原调节的激活 | Henderson et al.，J Immunol.2002Nov 1；169(9)：5294-9 |
| PEDF(色素上皮细胞衍生因子) | ROS产生 | Yamagishi et al.，J Mol Cell Cardiol.2004Aug；37(2)：497-506. |
| 紫苏素醇 | 钙途径 | Berchtold et al.，Cancer Res.2005Sep 15；65(18)：8558-66. |
| MAST205 | TRAF6结合 | Xiong et al.，J Biol Chem.2004Oct15；279(42)：43675-83.Epub2004Aug 11. |
| 大黄酸 | NF-κB的MEKK激活 | Martin et al.，Inflammation.2003Aug；27(4)：233-46；Domagala et al.，Biorheology.2006；43(3-4)：577-87. |
| 15-脱氧-前列腺素J(2) | NF-κB的PPARg激活 | Boyault et al.，FEBS Lett.2004Aug 13；572(1-3)：33-40. |
| 樟芝提取物 | IkBa上调 | Hsu et al.，Cancer Lett.2005Apr 18；221(1)：77-89. |
| 芹黄素(4′，5，7-三羟基黄酮) | IkBa上调 | Shukla & Gupta，Clin Cancer Res.2004May1；10(9)：3169-78. |
| β-淀粉状蛋白 | IkBa上调 | Bales et al.，Brain Res Mol Brain Res.1998Jun1；57(1)：63-72 |
| 人的母乳 | IkBa上调 | Minekawa et al.，Am J Physiol Cell Physiol.2004Nov；287(5)：C1404-11.Epub2004Jun 30 |
| 表面活性蛋白A(SP-A) | IkBa上调 | Wu et al.，Am J Respir Cell Mol Biol.2004Dec；31(6)：587-94.Epub 2004Aug 12 |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| DQ 65-79(II类HLA分子DQA03011的α-链的α螺旋65-79aa) | IkBa上调和IKK抑制 | Jiang et al.，J Immunol.2002Apr 1；168(7)：3323-8. |
| C5a | IkBa上调 | Riedemann et al.，Immunity.2003Aug；19(2)：193-202. |
| 糖皮质激素(地塞米松、强的松、甲基强的松龙) | IkBa上调 | Auphan et al.，Science.1995Oct 13；270(5234)：286-90；Brostjan et al.，J Biol Chem.1996Aug 9；271(32)：19612-6；Ray &Prefontaine，Proc Natl Acad Sci U S A.1994Jan18；91(2)：752-6；Scheinman et al.，Mol Cell Biol.1995Feb；15(2)：943-53. |
| IL-10 | IkBa上调 | Ehrlich et al.，Neuroreport.1998Jun 1；9(8)：1723-6；Lentsch et al.，J Clin Invest.1997Nov 15；100(10)：2443-8；Shames et al.，Shock.1998Dec；10(6)：389-94 |
| IL-13 | IkBa上调 | Ehrlich et al.，Neuroreport.1998Jun 1；9(8)：1723-6；Lentsch et al.，J Clin Invest.1997Nov 15；100(10)：2443-8；Manna &Aggarwal，J Immunol.1998Sep15；161(6)：2863-72. |
| IL-11 | IKKa；IkBa、IkBb上调 | Trepicchio &Dorner，Ann N Y Acad Sci.1998Sep29；856：12-21；Lgssiar et al.，Exp Biol Med (Maywood).2004May；229(5)：425-36. |
| α-蒎烯 | IkBa上调 | Zhou et al.，Acta Pharmacol Sin.2004Apr；25(4)：480-4. |
| NEF(HIV-1) | IkBa上调 | Qiao et al.，Nat Immunol.2006 |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| Mar；7(3)：302-10.Epub 2006Jan 22. | ||
| R-依托度酸 | IkBa上调 | Neri et al.，Br J Haematol.2006Jul；134(1)：37-44. |
| 维生素D | IkBa上调 | Cohen-Lahav et al.，Nephrol Dial Transplant.2006Apr；21(4)：889-97.Epub 2006Feb 2. |
| Fox1j | IkBb上调 | Lin et al.，2004 |
| 二噁英 | RelA核运输 | Ruby et al.，Mol Pharmacol.2002Sep；62(3)：722-8 |
| 藿香叶提取物 | 核转位 | Oh et al.，Arch Pharm Res.2005Mar；28(3)：305-10. |
| 海藻酸 | 核转位 | Jeong et al.，Clin Exp Allergy.2006Jun；36(6)：785-94. |
| 黄芪甙IV | 核转位 | Zhang et al.，Thromb Haemost.2003Nov；90(5)：904-14. |
| 阿伐他汀 | 核转位 | Haloui et al.，Eur JPharmacol.2003Aug8；474(2-3)：175-84. |
| 蓝金银花提取物 | 核转位 | Jin et al.，Exp Eye Res.2006May；82(5)：860-7.Epub 2005Nov23. |
| BMD(N(1)-苄基-4-甲基苯-1，2-二胺) | 核转位 | Shin et al.，Eur J Pharmacol.2005Oct 3；521(1-3)：1-8.Epub2005Sep 23. |
| 东亚钳蝎提取物 | 核转位 | Kim et al.，2005 |
| 犬瘟热病毒 | 核转位 | Friess et al.，J Comp Pathol.2005Jan；132(1)：82-9. |
| 西维因 | 核转位 | Shimomura-Shimizu et al.，Biochem Biophys Res Commun.2005Jul8；332(3)：793-9. |
| 南蛇藤醇 | 核转位 | Pinna et al.，Biochem Biophys Res Commun.2004 |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| Sep 24；322(3)：778-86. | ||
| 两歧五加(chiisanoside) | RelA核转位 | Won et al.，Biol Pharm Bull.2005Oct；28(10)：1919-24. |
| CP-1158 | 核转位 | Kim et al.，Eur J Pharmacol.2006Aug 14；543(1-3)：158-65.Epub 2006Jun 2. |
| 去羟基甲基环氧喹啉霉素(DHMEQ) | 核转位 | Chaicharoenpong et al.，Bioorg Med Chem.2002Dec；10(12)：3933-9 |
| 15-脱氧精胍菌素 | 核转位 | Hutchings et al.，Transpl Immunol.2003Jul-Sep；11(3-4)：335-44. |
| 双嘧达莫 | 核转位 | Weyrich et al.，Circulation.2005Feb 8；111(5)：633-42.Epub 2005Jan 24. |
| 双硫仑 | 核转位 | Wang et al.，Int J Cancer.2003Apr 20；104(4)：504-11. |
| 地尔硫卓 | 核转位；诱导p50二聚体转位 | Severa et al.，Biochem Pharmacol.2005Feb1；69(3)：425-32.Epub 2004Dec 9. |
| 毛萼乙素 | 核转位/DNA结合 | Wang et al.，Cell Death Differ.2006Jun 16；[印刷前以电子出版物发表]；Leung et al.，Mol Pharmacol.2006Aug 29；[印刷前以电子出版物发表] |
| 雌激素增强的转录 | 核转位 | Jin et al.，Cell Immunol.2003May；223(1)：26-34. |
| FAK相关的非激酶 | 核转位 | Qin &Liu，Acta Pharmacol Sin.2006Sep；27(9)：1159-64 |
| 神经节苷酯 | 核转位 | Caldwell et al.，J Immunol.2003Aug 15；171(4)：1676-83. |
| 糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(GILZ) | 核转位 | Riccardi et al.，Adv Exp Med Biol.2001；495：31-9. |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| 钩果草(Devil′s Claw)提取物 | 核转位 | Kaszkin et al.，Phytomedicine.2004Nov；11(7-8)：585-95. |
| 热休克蛋白72 | 核转位 | Meldrum et al.，Circ Res.2003Feb 21；92(3)：293-9 |
| 合素农(Hirsutenone) | 核转位 | Kim et al.，FEBS Lett.2006Jan 23；580(2)：385-92.Epub2005Dec 19 |
| 吲哚-3-原醇 | 核转位 | Rahman &Sarkar，Cancer Res.2005Jan 1；65(1)：364-71 |
| JM34(吗氯贝胺衍生物) | 核转位 | Carbonnelle et al.，2005 |
| JSH-23(4-甲基--(3-苯基-丙基)-苯-1，2-二胺 | 核转位 | Shin et al.，FEBS Lett.2004Jul 30；571(1-3)：50-4 |
| KIOM-79(组合的植物提取物) | 核转位 | Jeon et al.，J Ethnopharmacol.2006Apr 28；[印刷前以电子出版物发表] |
| KL-1156(6-羟基-7-甲氧基色满-2-羧酸苯胺) | 核转位 | Kim et al.，Biochem Biophys Res Commun.2004Dec3；325(1)：223-8. |
| 来普霉素B(LMB) | 核转位 | Rodriguez et al.，J Biol Chem.1999Mar 26；274(13)：9108-15. |
| 左旋咪唑 | 核转位 | Liu et al.，J Surg Res.2004Apr；117(2)：223-31. |
| MEB(2-(4-吗啡酚基)乙基盐酸丁酯) | 核转位 | Soderberg et al.，Int Immunopharmacol.2004Sep；4(9)：1231-9. |
| MNF(IkB样粘液瘤病毒) | 核转位 | Camus-Bouclainville et al.，J Virol.2004Mar；78(5)：2510-6. |
| 孟鲁司特 | 核转位 | Wu et al.，Can J Physiol Pharmacol.2006May；84(5)：531-7. |
| NLS细胞渗透肽(SN50) | 核转位 | Lin et al.，J Biol Chem.1995Jun 16；270(24)：14255-8. |
| 2′，8″-双芹菜素 | RelA核转位 | Woo et al.，Biol Pharm Bull.2006May；29(5)：976-80. |
| 努青(Nucling) | RelA核转位 | Liu et al.，Biochem J.2004 |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| May 15；380(Pt 1)：31-41. | ||
| o，o′-二肉豆寇酰二硫胺(BMT) | 核转位 | Shoji et al.，Biochem Biophys Res Commun.1998Aug28；249(3)：745-53. |
| 奥瑞果宁(Oregonin) | RelA核转位 | Lee et al.，Br J Pharmacol.2005Oct；146(3)：378-88 |
| 1，2，3，4，6-戊-O-没食子酰基-β-d-葡萄糖 | RelA核转位 | Kang et al.，Eur J Pharmacol.2005Nov 7；524(1-3)：111-9.Epub 2005Oct 25 |
| 桔梗根提取物 | RelA核转位 | Lee et al.，Int J Mol Med.2004Jun；13(6)：843-7 |
| 类鬼笔(毒)环肽 | 核转位 | Papakonstanti &Strounaras，Mol Biol Cell.2004Mar；15(3)：1273-86.Epub 2003Dec 29 |
| 胡椒碱 | 核转位 | Pradeep &Kuttan，Int Immunopharmacol.2004Dec20；4(14)：1795-803 |
| 匹伐他汀 | 核转位 | Wang et al.，Biol Pharm Bull.2006Apr；29(4)：634-9 |
| PN-50 | 核转位 | Letoha et al.，World J Gastroenterol.2005Feb21；11(7)：990-9 |
| 新生元益生菌(Probiotics) | RelA核转位 | Bai et al.，World J Gastroenterol.2004Feb1；10(3)：455-7. |
| RelA肽(P1和P6) | 核转位 | Takada et al.，J Biol Chem.2004Apr9；279(15)：15096-104.Epub2004Jan 7. |
| 视黄酸受体相关的孤儿受体-α | 核转位 | Migita et al.，FEBS Lett.2004Jan 16；557(1-3)：269-74 |
| 大黄水性提取物 | RelA核转位 | Moon et al.，Life Sci.2006Feb28；78(14)：1550-7.Epub 2005Nov 2 |
| 咯利普兰 | 核转位 | Sanchez et al.，J Neuroimmunol.2005Nov；168(1-2)：13-20.Epub |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| 2005Sep 22；Ikezoe et al.，Cancer Res.2004Oct 15；64(20)：7426-31. | ||
| 丹参(Salvia miltiorrhozaBunge)提取物 | 核转位 | Ding et al.，J Cardiovasc Pharmacol.2005Jun；45(6)：516-24 |
| SC236(选择性COX-2抑制剂) | 核转位 | Wong et al.，Oncogene.2003Feb 27；22(8)：1189-97 |
| 硒代蛋氨酸 | 核转位 | Cherukuri et al.，Cancer Biol Ther.2005Feb；4(2)：175-80.Epub 2005Feb 8 |
| 神奇化合物处方(ShenQicompound recipe) | RelA核转位 | Zhang et al.，Zhong Yao Cai.2006Mar；29(3)：249-53 |
| 苦参根提取物 | 核转位 | Kwon et al.，Clin Chim Acta.2004Oct；348(1-2)：79-86 |
| 素朴三(Sopoongsan) | 核转位 | Na et al.，Int Arch Allergy Immunol.2006；139(1)：31-7.Epub 2005Nov 3 |
| 异白芷内酯(菊(Heracleum laciniatum)的呋喃香豆素衍生物) | 核转位 | Yang et al.，Life Sci.2002Nov29；72(2)：199-213 |
| TAT-SR-IkBa；MTS-SR-IkBa | 核转位 | Blackwell et al.，Arthritis Rheum.2004Aug；50(8)：2675-84；Mora et al.，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2005Oct；289(4)：L536-44.Epub2005Jun 10 |
| 挥发性麻醉剂处理 | 核转位 | Lee et al.，Anesthesiology.2004Dec；101(6)：1313-24 |
| 勇佳汤(Younggaechulgam-tang) | 核转位 | Shin et al.，Immunopharmacol Immunotoxicol.2004；26(4)：545-58 |
| ZUD蛋白 | 激活NF-κB；结合p105/RelA | Zhang et al.，J Biol Chem.2004Apr23；279(17)：17819-25.Epub2004Feb 9 |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| ZAS3蛋白 | RelA核转位；DNA竞争 | Hong et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2003Oct14；100(21)：12301-6.Epub2003Oct 6 |
| 克拉霉素 | 核表达 | Ichiyama et al.，Antimicrob Agents Chemother.2001Jan；45(1)：44-7 |
| 氟伐他汀 | 核表达 | Azuma et al.，Cardiovasc Res.2004Dec 1；64(3)：412-20 |
| 来氟米特 | RelA核表达 | Yao et al.，Acta Pharmacol Sin.2004Jul；25(7)：915-20 |
| RASSF1A基因过量表达 | RelA核表达 | Deng et al.，Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban.2005Apr；30(2)：193-6 |
| 氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酸酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(OXPAPC) | RelA表达 | Li et al.，Zhonghua Yi Xue Za Zhi.2004Aug 2；84(15)：1235-9 |
| 3C蛋白酶(脊髓灰质炎病毒) | RelA表达(剪切) | Neznanov et al.，J Biol Chem.2005Jun 24；280(25)：24153-8.Epub 2005Apr 21. |
| 5F(来自半边旗草(Pterisyeminpinnata L)) | RelA表达 | He et al.，Zhong Yao Cai.2005Aug；28(8)：672-6 |
| AT514(赛氏菌缩肽) | RelA表达 | Escobar-Diaz et al.，Leukemia.2005Apr；19(4)：572-9 |
| 花楸混合皮质(Sorbuscommixta cortex)(甲醇提取物) | RelA表达 | Sohn et al.，Biol Pharm Bull.2005Aug；28(8)：1444-9 |
| 斑蝥素 | NF-κB表达 | He et al.，Ai Zheng.2005Apr；24(4)：443-7 |
| 山茱萸(Cornusofficinalis)提取物 | NF-κB表达 | Li et al.，Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.2005Nov；30(21)：1667-70 |
| 新霉素 | NF-κB表达 | Garcia-Trapero et al.，Neurol Res.2004Dec；26(8)：816-24 |
| 奥马曲拉、依那普利、CGS 25462 | NF-κB表达 | Pu et al.，J Hypertens.2005Feb；23(2)：401-9 |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| 抗肿瘤核糖核酸酶(豹蛙酶) | NF-κB表达 | Tsai et al.，Int J Oncol.2004Dec；25(6)：1745-52 |
| 芍药苷 | NF-κB表达 | Liu et al.，Brain Res.2006May 17；1089(1)：162-70.Epub2006May 5 |
| 雷帕霉素 | NF-κB表达 | Lawrence et al.，J Vasc Surg.2004Aug；40(2)：334-8 |
| 半叶马尾藻甲醇提取物 | NF-κB表达 | Na et al.，J Pharmacol Sci.2005Feb；97(2)：219-26.Epub2005Feb 5 |
| 绅附(Shenfu) | NF-κB表达 | Zhang et al.，Chin J Traumatol.2005Aug 1；8(4)：200-4 |
| 雷公藤多苷 | NF-κB表达 | Zhou et al.，Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi.2005Aug；25(8)：723-6 |
| 三氟柳 | 核表达 | Acarin et al.，Neurosci Lett.2000Jul 7；288(1)：41-4 |
| HSCO(肝癌蛋白) | 促进RelA出核 | Higashitsuji et al.，Cancer Cell.2002Oct；2(4)：335-46 |
| 穿心莲内酯 | 与p50的Cys-62共价结合 | Xia et al.，J Immunol.2004Sep 15；173(6)：4207-17 |
| 蜂毒(蜂毒素) | 通过结合至p50与DNA结合 | Park et al.，Arthritis Rheum.2004Nov；50(11)：3504-15 |
| 乙基丙酮酸酯(盐) | 通过RelA thru Cys-38与DNA结合 | Han et al.，J Pharmacol Exp Ther.2005Mar；312(3)：1097-105.Epub2004Nov 3 |
| 1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(盐) | DNA结合 | Ito et al.，Biochem Biophys Res Commun.2005Dec30；338(4)：1702-10.Epub 2005Nov 2 |
| 2-乙酰基氨基芴 | DNA结合 | Kang et al.，Cancer Lett.2004Jan 8；203(1)：91-8；Jeon et al.，Toxicol Lett.1999Feb 22；104(3)：195-202 |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| 放线瑞香宁(来自黄肉楠(Cinnamomuminsularimontanum)) | DNA结合 | Hsieh et al.，Food Chem Toxicol.2006Mar；44(3)：344-54.Epub 2005Sep 15 |
| 脂联素(Adiponectin) | DNA结合 | Ajuwon &Spurlock，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2005May；288(5)：R1220-5.Epub2004Dec 16 |
| ADP核糖基化抑制剂(烟酰胺、3-氨基苯甲酰胺) | DNA结合 | Le Page et al.，Biochem Biophys Res Commun.1998Feb 13；243(2)：451-7 |
| AIM2(在黑色素瘤蛋白中不存在)过量表达 | DNA结合 | Chen et al.，Mol Cancer Ther.2006Jan；5(1)：1-7 |
| 适度饮酒 | DNA结合 | Mandrekar et al.，Alcohol Clin Exp Res.2006Jan；30(1)：135-9 |
| 7-氨基-4-甲基香豆素 | DNA结合 | Kurokawa et al.，Eur J Pharmacol.2003Aug8；474(2-3)：283-93 |
| 氨力农 | DNA结合 | Chanani et al.，Circulation.2002Sep 24；106(12Suppl1)：I284-9. |
| 血管生成素-1 | DNA结合 | Jeon et al.，Circ Res.2003Apr4；92(6)：586-8 |
| 花青素(大豆) | DNA结合 | Kim et al.，FEBS Lett.2006Feb 20；580(5)：1391-7.Epub2006Jan26 |
| 山金车(Amica montana)提取物(杯菊倍半萜内酯) | DNA结合 | Kos et al.，planta Med.2005Nov；71(11)：1044-52 |
| 青蒿素 | DNA结合 | Aldieri et al.，FEBS Lett.2003Sep 25；552(2-3)：141-4；Wang et al.，Antimicrob Agents Chemother.2006Jul；50(7)：2420-7 |
| 心房利纳肽(ANP) | DNA结合；IkBa上调 | Gerbes et al.，Hepatology.1998Nov；28(5)：1309-17； |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
| Kiemer et al.，Biochem Biophys Res Commun.2002Aug 2；295(5)：1068-76. | ||
| 阿伐他汀(HMG-CoA还原酶抑制剂) | DNA结合 | Bustos et al.，J Am Coll Cardiol.1998Dec；32(7)：2057-64；Hernandez-Presa et al.，Am J Pathol.1998Dec；153(6)：1825-37 |
| AvrA蛋白(沙门氏菌) | DNA结合 | Collier-Hyams et al.，J Immunol.2002Sep15；169(6)：2846-50 |
| 黄芩黄素(5，6，7-三羟基黄酮) | DNA结合 | Suk et al.，J Pharmacol Exp Ther.2003May；305(2)：638-45.Epub2003Jan 21 |
| 班巴拉花生(Vignea subterranean) | DNA结合 | Na et al.，Biofactors.2004；21(1-4)：149-53 |
| 苯磷硫胺(硫胺素衍生物) | DNA结合 | Hammes et al.，Nat Med.2003Mar；9(3)：294-9.Epub 2003Feb 18 |
| β-连环蛋白 | DNA结合 | Deng et al.，Cancer Cell.2002Oct；2(4)：323-34 |
| β-拉帕醌(a 1，2-萘醌) | DNA结合 | Tzeng et al.，Am J Respir Crit Care Med.2003Jul1；168(1)：85-91.Epub 2003Apr30 |
| 胆绿素 | DNA结合 | Yamashita et al.，FASEB J.2004Apr；18(6)：765-7.Epub2004Feb 20 |
| 二酚A | DNA结合 | Kim &Jeong，Cancer Lett.2003Jun 30；196(1)：69-76 |
| 牛血清白蛋白 | DNA结合 | Zhang &Frei，Cardiovasc Res.2002Sep；55(4)：820-9 |
| 巴西绿蜂胶 | DNA结合 | Bae et al.，Eur J Pharmacol.2005Apr 25；513(3)：237-42.Epub 2005Apr 15； |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
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| 菠萝蛋白酶 | DNA结合 | Hou et al.，J Agric Food Chem.2006Mar 22；54(6)：2193-8 |
| 钙/钙调蛋白依赖性激酶激酶(CaMKK)(和通过伊屋诺霉素、UTP和毒胡萝卜素增加的细胞内钙离子) | DNA结合 | Chen et al.，J Biol Chem.2002Jul 5；277(27)：24169-79.Epub2002Apr25 |
| 骨化三醇(1a，25-二羟基维生素D3) | DNA结合 | Harant et al.，Eur J Biochem.1997Nov 15；250(1)：63-71 |
| 喜树碱 | DNA结合 | Hentze et al.，Hepatology.2004May；39(5)：1311-20 |
| 癌灌木(Cancer bush，Sutherlandia frutescens) | DNA结合 | Na et al.，Biofactors.2004；21(1-4)：149-53 |
| 卡洛芬 | DNA结合 | Bryant et al.，Am JVet Res.2003Feb；64(2)：211-5 |
| 辣椒素酯(capsiate) | DNA结合 | Sancho et al.，Eur J Immunol.2002Jun；32(6)：1753-63 |
| 羧甲司坦 | DNA结合 | Yasuda et al.，Eur Respir J.2006Jul；28(1)：51-8.Epub2006Mar 1 |
| 梓苷(茎树皮) | DNA结合 | Oh et al.，planta Med.2002Aug；68(8)：685-9 |
| 猫爪草(钩藤毛白杨；茜草科)；马卡(Maca) | DNA结合 | Aguilar et al.，J Ethnopharmacol.2002Jul；81(2)：271-6；Valerio &Gonzales，Toxicol Rev.2005；24(1)：11-35 |
| CD43过量表达 | DNA结合(RelA) | Laos et al.，Int J Oncol.2006Mar；28(3)：695-704 |
| 塞来考昔和吉西他滨 | DNA结合 | El-Rayes et al.，Mol Cancer Ther.2004Nov；3(11)：1421-6 |
| 车摇汤 | DNA结合 | Kim et al.，J Ethnopharmacol. |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
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| 壳聚糖 | DNA结合 | Seo et al.，Biol Pharm Bull.2003May；26(5)：717-21 |
| 肉桂醛、2-甲氧基肉桂醛、2-羟基肉桂醛 | DNA结合 | Reddy et al.，planta Med.2004Sep；70(9)：823-7；Lee et al.，Biochem Pharmacol.2005Mar 1；69(5)：791-9.Epub2005Jan 16 |
| 菊苣根(愈创木内酯8-去氧莴苣素) | DNA结合 | Cavin et al.，Biochem Biophys Res Commun.2005Feb18；327(3)：742-9 |
| 叶绿酸 | DNA结合 | Yun et al.，Int Immunopharmacol.2005Dec；5(13-14)：1926-35.Epub2005Jul 6. |
| 软骨素硫酸酯(盐)蛋白多糖降解产物 | DNA结合 | Rolls et al.，FASEB J.2006Mar；20(3)：547-9.Epub 2006Jan 5 |
| 克拉霉素 | DNA结合 | Miyanohara et al.，Laryngoscope.2000Jan；110(1)：126-31 |
| 氯喘克曼 | DNA结合 | Ianaro et al.，Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.2004Aug；370(2)：140-5.Epub 2004Jul 30 |
| 古柯乙烯 | DNA结合 | Tacker et al.，Clin Chem.2006Oct；52(10)：1926-33.Epub2006Aug 17 |
| 商售腹膜透析液 | DNA结合 | Douvdevani et al.，Kidney Int.1995Jun；47(6)：1537-45 |
| 化合物K(来自人参(Panax ginseng)) | DNA结合 | Park et al.，Biol Pharm Bull.2005Apr；28(4)：652-6. |
| 肉桂(cortex cinnamomi)提取物 | DNA结合 | Kwon et al.，World J Gastroenterol.2006Jul21；12(27)：4331-7 |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
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| 隐丹参醌 | DNA结合 | Zhou et al.，Biochim Biophys Acta.2006Jan；1760(1)：1-9.Epub 2005Oct 3. |
| 氰基胍CHS 828 | DNA结合 | Johanson et al.，Neuroendocrinology.2005；82(3-4)：171-6.Epub2006Feb 24 |
| 细胞松弛素D | DNA结合 | Kim et al.，J Biol Chem.2003Oct 24；278(43)：42448-56.Epub 2003Aug 7 |
| DA-9201(来自黑米) | DNA结合 | Lee et al.，Arch Pharm Res.2005Dec；28(12)：1350-7. |
| 丹参舒(Danshenshu) | DNA结合 | Jiang et al.，Zhonghua Shao Shang Za Zhi.2001Feb；17(1)：36-8 |
| (kB位点)诱饵寡核苷酸 | DNA结合 | Kupatt et al.，Gene Ther.2002Apr；9(8)：518-26；Morishita et al.，Nat Med.1997Aug；3(8)：894-9 |
| 二酰胺 | DNA结合 | Toledano &Leonard，Proc Natl Acad Sci U S A.1991May15；88(10)：4328-32 |
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| DIM/13C | DNA结合 | Li et al.，Front Biosci.2005Jan 1；10：236-43.Print 2005Jan 1 |
| 来自香茶冬凌草(Isodonrubescens)或叶苔(LiverwortJungermannia)的二萜类 | DNA结合 | Leung et al.，Mol Pharmacol.2005Aug；68(2)：286-97.Epub2005May 4；Kondoh et al.，planta Med. |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
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| DTD(4，10-二氯吡啶并[5，6：4，5]噻吩并[3，2-d′：3，2-d]-1，2，3-双三嗪) | DNA结合 | Rioja et al.，Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.2002May；365(5)：357-64.Epub2002Mar 19. |
| E1B(腺病毒) | DNA结合 | Limbourg et al.，J Biol Chem.1996Aug 23；271(34)：20392-8 |
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| 对映贝壳杉烯二萜类化合物(越南巴豆叶) | DNA结合 | Giang et al.，J Nat Prod.2003Sep；66(9)：1217-20 |
| 盐酸依匹斯汀 | DNA结合 | Kanai et al.，Int Arch Allergy Immunol.2006；140(1)：43-52.Epub 2006Mar 13 |
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| 盐酸非索那定 | DNA结合 | Asano et al.，Clin Exp Allergy.2004Dec；34(12)：1890-8 |
| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
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| FLN29过量表达 | DNA结合 | Mashima et al.，J Biol Chem.2005Dec16；280(50)：41289-97.Epub2005Oct 12 |
| FLICE样抑制性蛋白(FLIP) | DNA结合 | Bannerman et al.，Am J Pathol.2004Oct；165(4)：1423-31 |
| 氟尼辛葡胺 | DNA结合 | Bryant et al.，Am J Vet Res.2003Feb；64(2)：211-5 |
| 氟比洛芬 | DNA结合 | Fratelli et al.，Antioxid Redox Signal.2003Apr；5(2)：229-35 |
| 木蹄层孔菌甲醇提取物 | DNA结合 | Park et al.，Biol Pharm Bull.2004Oct；27(10)：1588-93 |
| 墨角藻聚糖 | DNA结合 | Haneji et al.，Nutr Cancer.2005；52(2)：189-201 |
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| 没食子酸 | DNA结合 | Kim et al.，Toxicol Sci.2006May；91(1)：123-31.Epub 2005Dec 1 |
| 灵芝(真菌干燥孢子或菌体) | DNA结合 | Sliva et al.，Biochem Biophys Res Commun.2002Nov8；298(4)：603-12. |
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| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
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| 哥林(Ghrelin) | DNA结合 | Li et al.，Circulation.2004May 11；109(18)：2221-6.Epub2004Apr26 |
| 吉佳托(Gigantol)(春兰(Cymbidium georingii)) | DNA结合 | Won et al.，Planta Med.2006Aug 21；[印刷前以电子出版物发表] |
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| 卤夫酮 | DNA结合 | Leiba et al.，J Leukoc Biol.2006Aug；80(2)：399-406.Epub2006Jun 12 |
| 热(发热样) | DNA结合 | Salanova et al.，FASEB J.2005May；19(7)：816-8.Epub 2005Mar 8 |
| 堆心菊灵(倍半萜内酯) | DNA结合 | Kim et al.，Eur J Pharmacol.2005Mar 28；511(2-3)：89-97 |
| 苏木因(植物化合物) | DNA结合 | Oh et al.，Atherosclerosis.2001Nov；159(1)：17-26 |
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| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
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| 抑制剂分子 | 抑制效应或抑制点 | 参考文献 |
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| 芒果苷 | 抑制RelA和RelB表达 | Leiro et al.，Int Immunopharmacol.2004Jun；4(6)：763-78 |
在特定具体实施方案中，NF-κB途径抑制剂是IκB磷酸化抑制剂，如BAY11-7082和BAY-11-7085(BioMol，Plymouth Meeting，PA)。
所需的NF-κB功能抑制剂对宿主是无毒的，副作用极小或可忽略。适当地，NF-κB抑制剂阻断替代的NF-κB途径，或阻断经典和替代NF-κB途径，例如，如在第[0008]段所描述的，(Martin E et al.，Immunity 2003，见上文).
2.3抗原
存在多种靶抗原，这些靶抗原与非所需或有害的免疫应答相关。根据本发明，联合使用至少相当于部分靶抗原的抗原与NF-κB抑制剂(例如，如2.2部分中所描述的抑制剂)以产生例如在2.1部分中所描述的粒子，以诱导对靶抗原的致耐受性免疫应答。示例性的靶抗原包含同种异体抗原和自身抗原或其肽片段(它们在MHC的环境中被递呈)，还有可溶性蛋白和不溶性复合物片段、粒子抗原、例如、细菌或寄生物、和变应原。因此，本发明的实施中可用的示例性抗原包含但不限于，是自身免疫应答的靶标的自身抗原、变应原和移植抗原。自身抗原的例子包含但不限于狼疮自身抗原、Smith、Ro、La、U1-RNP、硬皮病相关的肌原纤维蛋白；核抗原、组蛋白、糖蛋白gp70和全身性红斑狼疮相关的核糖体蛋白；原发性胆汁性肝硬变相关的丙酮酸脱氢酶二氢硫辛酸乙酰转移酶(dehydrolipoamideacetyltransferase)(PCD-E2)；斑形脱发相关的毛囊抗原；溃疡性结肠炎相关的人类原肌球蛋白异构体5(hTM5)；胰岛素依赖性糖尿病相关的胰岛素原、胰岛素、IA2和GAD65；
类风湿性关节炎相关的II型胶原、人软骨gp 39(HCgp39)和gp130-RAPS、dnaJp1、瓜氨酸化的蛋白和肽，例如瓜氨酸化的II型胶原、波形蛋白或纤维蛋白原；多发性硬化相关的髓磷脂碱性蛋白、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)；突眼性甲状腺肿相关的甲状腺刺激因子受体(TSH-R)；重症肌无力相关的乙酰胆碱受体(AchR)；乳糜泻相关的麦胶蛋白；组蛋白、PLP、6-磷酸葡萄糖异构酶、甲状腺球蛋白、各种tRNA合成酶、蛋白酶-3、髓过氧物酶等等。变应原的例子包含但不限于Fel d 1(即，家猫(Felis domesticus)的猫皮肤和唾液腺变应原，其氨基酸序列公开于国际公布WO 91/06571)、Der p I、Der pII、Der fI或Der fII(即，屋粉尘尘螨主要蛋白变应原，其氨基酸序列公开于国际公布WO 94/24281)。其他变应原可来自，例如下述来源：草，树和杂草(包含豚草)花粉；真菌和霉菌；食物如鱼类、贝类、螃蟹、龙虾、花生、坚果、小麦面筋、蛋、奶；刺痛昆虫如蜜蜂、黄蜂和大黄蜂和摇蚊(非咬蚊，non-biting midges)；其他昆虫，如苍蝇、果蝇、绵羊丽蝇、螺旋锥蝇、粮食象鼻虫、蚕、蜜蜂、非咬蚊幼虫、蜂蛾幼虫、粉虫、蟑螂和麦皮虫(Tenibrio molitor beetle)幼虫、蜘蛛和螨类(包含屋尘螨)；哺乳动物，如猫、狗、牛、猪、羊、马、兔、大鼠、豚鼠、小鼠和沙土鼠的皮屑、尿、唾液、血液或其他体液中发现的变应原；一般空气携带粒子；乳胶；和蛋白洗涤剂添加剂。移植抗原可以来源于供体细胞或组织，例如心、肺、肝、胰、肾脏、神经移植物的组分，或者在没有外源性抗原时，来源于携带了载有自身抗原的MHC的供体抗原递呈细胞。
抗原可从天然来源分离或通过本领域已知的重组技术制备。例如，肽抗原能从自需要进行修饰的免疫应答的细胞群或组织(例如，移植医学中同种异体移植的组织或细胞群)中获取的抗原递呈细胞的MHC或其他递呈分子上洗脱。洗脱下来的肽能用本领域已知的标准蛋白纯化技术进行纯化(Rawson et al.，2000，CancerRes 60(16)，4493-4498)。如果需要，纯化的肽能进行测序，和使用如下所述的标准蛋白合成技术生产该肽的合成版。或者，粗抗原制备物可从需要进行修饰的免疫应答的细胞群或组织中分离样品，并裂解样品，或使之处于导致凋亡细胞形成的条件下(例如，照射紫外线或γ射线、病毒感染、细胞因子或去除细胞培养基中的养分、过氧化氢培养、或用药物(如地塞米松、神经酰胺化疗剂)和抗激素剂(如醋酸亮丙瑞林或三苯氧胺))来产生。然后，裂解液或凋亡细胞可用作接触抗原递呈细胞的粗制抗原的来源。
当抗原已知时，可方便地通过标准的实验方案制备，例如下述文献中描述的实验方案：Sambrook，et al.，MOLECULAR CLONING.A LABORATORYMANUAL(Cold Spring Harbor Press，1989)，特别是第16和17部分；Ausubel et al.，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley & Sons，Inc.1994-1998)，特别是第10和16章；和Coligan et al.，CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE(John Wiley & Sons，Inc.1995-1997)，特别是第1，5和6章。通常，抗原可通过包含下述步骤的过程制备：(a)提供可表达靶抗原或其类似物或模拟物的表达载体；(b)将该载体引入适当的宿主细胞；(c)培养该宿主细胞以该载体表达重组多肽；和(d)分离该重组多肽。
或者，该抗原能用文献(例如，Atherton和Sheppard(Solid Phase PeptideSynthesis：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford，England，1989)或Roberge et al.(1995，Science 269：202))描述的方法使用溶液合成或固相合成方法来合成。
在一些具体实施方案中，抗原是一种或多种种肽的形式。通常，这样的肽具有至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30个氨基酸残基的长度，适当地，不多于约500、200、100、80、60、50、40个氨基酸残基的长度。在一些具体实施方案中，使用两个或更多的肽，所述的肽能为多个连续的相互重叠的肽(它们的序列至少覆盖靶抗原的一部分)的形式。适当地，该肽序列来自至少约30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的与靶抗原相当的序列。在一些具体实施方案中，所述多个连续的相互重叠的肽片段中的每个肽能为30-90个氨基酸的长度，例如，30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、81、85、86和90个氨基酸的长度。在各种具体实施方案中，所述的连续的相互重叠的肽片段的氨基酸序列具有约10至约15个氨基酸，例如10、11、12、13、14和15个氨基酸的多元重叠。生产这种肽抗原的示例性方法已被描述(例如，Astori et al.(2000 J.Immunol.165，3497-3505；和其引用的参考文献和美国专利申请公布No.2004/0241178)。该抗原可进行适当地修饰，例如，通过脂类修饰以改变其物理化学属性。
2.4辅助成分
在一些具体实施方案中，该粒子组合物进一步包含一种或多种免疫抑制性细胞因子，其适当地选自IL-1受体拮抗剂、IL-1RII、VEGF、IL-4、(人类或病毒的)IL-10、IL-13、TGF-β和FLT3配体或它们的功能性的、重组的或化学的等同物或同源物。
3.药物制剂
根据本发明，将2.2部分中描述的一种或多种NF-κB途径抑制剂和2.3部分中描述的一种或多种抗原用于产生所述粒子(例如2.1部分中描述的粒子)以用于修饰免疫应答，特别是用于诱导致耐受性应答(包含对一种或多种靶抗原的将要产生的和已产生的免疫应答的抑制)。因此，这些组合物可用于治疗或预防非所需的免疫应答，包含，例如，移植物排斥、移植物抗宿主疾病、变态反应、寄生物疾病、炎性疾病和自身免疫性疾病。根据本发明，能治疗或预防的移植物排斥的例子包含骨髓移植相关的排斥和如心脏、肝脏、胰脏、肾脏、肺、眼、皮肤等器官移植相关的排斥。变态反应的例子包含季节性呼吸性变态反应；对产花粉植物的变态反应如花粉症；过敏治疗，可通过降低血清IgE和嗜曙红细胞增多治疗的变态反应；哮喘；湿疹；动物变态反应，食物变态反应；乳胶变态反应；皮炎；或可通过变应性脱敏治疗的变态反应。本发明能治疗或预防的自身免疫性疾病包含，例如，牛皮癣、系统性红斑狼疮、重症肌无力、僵人综合征、甲状腺炎、西德纳姆舞蹈症、类风湿关节炎、糖尿病和多发性硬化症。炎性疾病的例子包含克罗恩病、慢性炎性眼病、慢性炎性肺疾病和慢性炎性肝脏疾病、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少症(leucopoenia)、溃疡性结肠炎、皮肌炎、硬皮病、混合性结缔组织病、肠易激综合症、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症、重症肌无力、Guillan-Barre综合征(抗磷脂综合征)、原发性黏液水肿、甲亢、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、阿狄森氏症、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、古德帕斯彻综合征、贝切特综合征、斯耶格伦综合征、类风湿关节炎、交感性眼炎、桥本氏病/甲状腺功能低下、腹腔疾病/皮炎疱疹、和脱髓鞘疾病、原发性胆汁性肝硬化、混合性结缔组织病、慢性活动性肝炎、格雷夫斯病/甲状腺功能亢进、硬皮病、慢性特发性血小板减少性紫癜、糖尿病神经病变和感染性休克。本发明也能治疗或预防的其他非所需的免疫反应，包含抗体与重组治疗性试剂，如血友病中抗因子VIII的抗体与因子VIII之间的免疫反应或糖尿病中的抗胰岛素抗体与胰岛素之间的免疫反应。
因此，上述组合物可用于预防或治疗患者非所需的或有害的免疫应答，这个过程包含给患者使用包含NF-κB途径抑制剂和相当于靶抗原的抗原的粒子形式的，可有效降低或抑制对该靶抗原的免疫应答的剂量的药物组合物。该药物组合物可包含药学上可接受的载体或稀释剂。在一些具体实施方案中，对产生非所需的或有害的免疫应答的个体使用该组合物。在其他具体实施方案中，对自身抗体阳性的有风险的个体，和/或对鉴定出HLA单倍型有风险，例如有患轻度I型糖尿病(与至少一种和所需两种或多种自身抗体阳性相关)风险的个体，(参见，例如，Scofield，R.H.，2004.Lancet 363，1544；Berglin et al.，2004，Arthritis Res Ther 6，R30336；Harrison et al.，2004，Diabetes Care 27，2348)，或带有一个或两个HLA易感基因和阳性抗CCP抗体的有患类风湿性关节炎风险的个体(Klarskog et al.2006，Arthritis Rheum.54：38)(Rantapaa-Dahlqvist S et al.2003，Arthritis Rheum.48：2741)使用该组合物。
适合用于本发明的药物组合物包含其中含有有效量的生物活性试剂(即，NF-κB途径抑制剂和抗原)以达到所欲达到目的的组合物。对患者使用的活性化合物的剂量应足以在患者体内随时间产生有益的应答，如减轻至少一种与非所需的或有害的免疫应答相关的症状，这些症状适当地与选自变态反应、自身免疫性疾病或移植物排斥的病状相关。使用的具有药学活性的的数量或剂量频率依赖于接受待治疗的受治疗者的各种条件，这些条件包含受治疗者的年龄、性别、体重及其一般健康状况。从这方面来说，使用的活性化合物的精确量依赖于执业者的判断。在确定治疗或预防非所需的或有害的免疫应答中使用的活性化合物的有效剂量的过程中，执业者可评价炎症、促炎性细胞因子水平、淋巴细胞增殖、细胞毒性T淋巴细胞的活性和调节性T淋巴细胞的功能。在任何情况下，本领域技术人员可容易地确定拮抗剂和抗原的适当剂量。
因此，粒子以与剂型相适应的方式，以有效的预防和/或治疗剂量对待治疗的受治疗者使用。要递送的组合物的量一般是每剂生物活性分子(例如，抗原或抑制剂)的范围是0.01μg/kg至100μg/kg，依赖于待治疗的受治疗者。在一些具体实施方案中，还依赖于计划的使用方式，含有NF-κB途径抑制剂的组合物一般含有的抑制剂是以重量计约0.1％至90％，约0.5％至50％，或约1％至约25％，其余的为适当的药学载体和/或稀释剂等等和抗原。抑制剂的剂量能依赖于多种因素，如使用方式、受影响的受治疗者的物种、年龄和/或个体状况。在其他具体实施方案中，还依赖于计划的使用方式，含有抗原的组合物一般包含抗原约0.1％至90％，约0.5％至50％，或约1％至约25％(以重量计)，其余的为适当的药学载体和/或稀释剂等等和NF-κB途径抑制剂。
依赖于治疗的特定情况，粒子可以适合全身、局部或局部区域的方式配制和使用。配制和使用的技术可在最新版的“Remington’s Pharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，中获得。适当的途径可以为例如，包含经口、直肠、经粘膜或经小肠使用；肠胃外递送，包含肌内、皮下、经皮、皮内、髓内递送(例如注射)、以及鞘内、直接(心)室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内递送(例如注射)。对于注射，本发明的粒子可以以水溶液配制，适当地以生理相容性缓冲液如Hanks’溶液、Ringer’s溶液或生理盐水缓冲液配制。对于经粘膜使用，在制备中使用适合透过屏障的通透剂，这样的通透剂(penetrant)一般是本领域已知的。
可以液体形式配制和使用本发明的组合物，该液体含有可接受的稀释剂(如盐水和无菌水)，或以乳液、乳霜或凝胶的形式配制和使用本发明的组合物，该乳液、乳霜或凝胶含有可接受的稀释剂或载体，从而带来所需质地、稠度、粘性和外观使用。可接受的稀释剂和载体为本领域技术人员熟知，包含但不限于乙氧基化和非乙氧基化的表面活性剂、脂肪醇、脂肪酸、碳氢油类(如棕榈油、椰子油和矿物油)、可可脂蜡、硅油、pH值平衡剂、纤维素衍生物、乳化剂(如非离子型有机和无机基质的乳化剂)、防腐剂、蜡酯、甾醇、甘油三酯、磷脂(如卵磷脂和脑磷脂)、多元醇酯、脂肪醇酯、亲水羊毛脂衍生物和亲水蜂蜡衍生物。
另外，本发明的粒子能容易地使用本领域熟知的药学上可接受的载体制成适于经口使用的剂量，这也是本发明粒子的优选方式。这样的载体使得本发明的化合物能配制成如片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等剂型使待治疗的患者口服咽下。这些载体可选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水或无热原水。
肠胃外使用的药学制剂包含所述粒子以水溶性形式存在的水溶液。此外，可将粒子的悬浮液制备成适当的油性注射悬浮液。适当的亲油性溶剂或载体包含脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三脂。水注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇、或右旋糖酐。可选地，悬浮液还可以包含适当的增加化合物的溶解度以允许制备高浓度溶液的稳定剂或试剂。
用于口服的药物制剂能通过将粒子与固体赋形剂结合，并加入适当的辅料(如果需要的话)，然后将这些颗粒的混合物加工成片剂或糖锭剂的核来获得。适当的赋形剂为，特别是，充填剂，如糖，包含乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇；纤维素酶制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。这样的组合物可通过任何药学方法制备，但所有的方法都包含使一种或多种如上所述的治疗试剂与载体相结合的步骤，该载体构成一种或多种必需组分。一般而言，本发明的药物组合物可通过本身已知的方式制备，例如，通过常规混合、溶解、造粒、制备糖锭、研磨、乳化、封装、包被或冻干的方法。
给糖锭剂核心提供适当的包衣剂。为此，可使用浓缩糖溶液，该溶液可选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、紫胶漆(lacquer)溶液、适当的有机溶剂或溶剂混合物。可向片剂或糖锭包衣剂中加入染料或色素用于鉴别或标记不同的粒子剂量组合。
能口服使用的药剂包含由明胶制成的推入-适合(push-fit)胶囊和由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的软的密封的胶囊。推入-适合胶囊能包含，其中活性成分与充填剂如乳糖，粘合剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁，以及(可选地)稳定剂混合。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮在适当的液体如脂肪油、液状石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。
本发明的粒子可在数小时、数天、数周或数月的期间使用，这依赖于几个因素，包括所治疗的神经疾病病状的严重性，是否考虑该疾病可能复发等等。使用可为持续性使用，例如，在数小时、数天、数周或数月等等的期间内连续输入。或者，使用可以为间断性使用，例如，粒子可在数天的期间内每天使用1次，数小时的期间内每小时1次，或任何其他被认为合适的类似方案。
本发明的组合物也可以鼻腔或肺的吸入性喷雾剂，或用于喷雾器的溶液，或作为吹入法用的精细粉末对呼吸道使用，其中本发明的组合物可单独使用或与惰性载体如乳糖联合使用，或与药学上可接受的其他赋形剂联合使用。在这种情况下，制剂的粒子有利地直径在50μm以下，适当地在10μm以下。
在一些具体实施方案中，粒子用于细胞的主动摄入使用，例如通过吞噬作用(例如在美国专利No.5,783,567(Pangaea)中所述)。在一些具体实施方案中，这些细胞的吞噬作用可通过使粒子大小通常维持在约20μm以下，优选地在约11μm以下而改善。
在特定的具体实施方案中，如果需要包含肝和脾的网状内皮细胞系统(RES)的吞噬细胞摄入粒子的话，粒子可直接递送到血流中(即通过静脉内或动脉内注射或灌注)包含。另外，通过皮下注射，可实现引流淋巴结的吞噬细胞的摄入。也能将粒子引入皮内(即，至皮肤的APC如树突状细胞和朗格汉斯细胞)，例如使用弹道或显微针递送。示例性的粒子介导递送技术包含包含爆炸、电或气体推进递送以驱动载体粒子向靶细胞移动，例如，美国专利Nos.4,945,050，5,120,657，5,149,655和5,630,796中所述。国际公布No.WO 2005/069736和WO 2005/072630和美国专利.6,503,231和5,457,041中公开了显微针递送的非限制性例子。
另一有用的递送途径(特别是对于编码诱导耐受的多肽的DNA)是通过胃肠道，例如口服。另外，能将粒子引入到粒子被肺泡巨噬细胞摄入的器官如肺(例如，通过吸入粉末化的微米粒子或含有该微米粒子的喷雾或气雾溶液)，或可通过鼻腔或颊部使用。一旦吞噬细胞吞噬了粒子，NF-κB途径抑制剂和抗原释放到细胞内。
因此，本发明提供诱导对抗原的耐受或无能，该抗原与非所需的或有害的免疫应答(包含但不限于自身免疫性疾病、变态反应和移植相关疾病)相关。因此，在一些具体实施方案中，通过与NF-κB抑制剂一同使用能诱导所需耐受的抗原，本发明提供诱导对自身抗原的耐受以治疗自身免疫性疾病，其中抗原和NF-κB抑制剂为粒子形式。在这一类型用途的示例性的例子中，在重症肌无力患者体内观察到直接抗乙酰胆碱受体(AChR)的自身抗体，因此，为治疗和/或预防重症肌无力，在本发明中，可将粒子形式的AchR-抗原或抗原表达载体与粒子形式的NF-κB抑制剂一同递送。
在其他具体实施方案中，非相同双胞胎的移植候选个体可能排斥移植入的细胞，组织或器官，因为植入的抗原对受体是外源的。对期望移植的受体个体的预先耐受消除或降低以后的排斥。通过对移植物的受体同时使用粒子形式的一种或多种移植抗原和粒子形式的NF-κB抑制剂达到降低或消除慢性抗排斥的治疗。
在进一步的具体实施方案中，个体对工业污染物或化学物(如可能在工作中遇到的工业污染物或化学物)的致敏表现出免疫应答的危害。需要预先使个体的免疫系统对化合物进行耐受以预防以后发生的与职业相关的免疫应答的发展。在这些情况下，一般需要将粒子形式的与个体的内源蛋白反应的化合物与粒子形式NF-κB抑制剂一起同时对个体使用。
值得注意的是，即使在致病的自身抗原未知的疾病中，使用粒子形式的发病学的解剖结构上邻近的抗原和粒子形式的NF-κB抑制剂可诱导旁观者抑制(bystander suppression)。例如，在类风湿性关节炎中观察到抗胶原的自身抗体，因此，可使用粒子形式的胶原或胶原编码基因(参见，例如，Choy(2000)Curr OpinInvestig Drugs 1：58-62)，和粒子形式的NF-κB抑制剂来治疗类风湿性关节炎。此外，以相似的方式，对β细胞自身抗原的耐受可用来预防1型糖尿病(参见，例如，Bach和Chatenoud(2001)Ann Rev Immunol 19：131-161)。
作为另一个例子，在自身免疫性脑脊髓炎和许多其他CNS疾病以及多发性硬化中，观察到直接抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的自身抗体(参见，例如，Iglesias et al.(2001)Glia 36：22-34)。因此，共同递送粒子形式的MOG抗原或MOG抗原表达构建体和粒子形式的NF-κB抑制剂可治疗或预防多发性硬化以及相关的中枢神经系统自身免疫性疾病。
为使本发明容易理解和产生实际的效果，现通过下述非限制性实施例描述特别优选的具体实施方案。
实施例
实施例1
通过脂质体的关节炎的抗原特异性抑制
材料和方法
试剂
异硫氰酸荧光素(FITC)、卵白蛋白(OVA)、甲基化牛血清白蛋白(mBSA)购自Sigma-Aldrich(Missouri，USA)。青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠盐和2-巯基乙醇购自
Invitrogen(California，USA)。完全弗氏佐剂(CFA)从Sigma-Aldrich(Missouri，USA)获得。二醋酸琥珀酰亚胺基羧基荧光素(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)从Molecular Probes(Oregon，USA)获得。藻红蛋白(PE)标记的KJ1-26抗体购自BD Pharmingen(California，USA)。抗小鼠MHC II-FITC购自Biolegend(California，USA)。OVA的CD4表位(序列323-339)从Auspep(Victoria，Australia)获得。所有其他的试剂至少是分析纯。
小鼠
雄性C57/B16和BALB/c小鼠从ARC获得，OVA特异性的TCR转基因品系，BALB/c背景的D011.10在昆士兰大学(University of Queensland)饲喂。CFSE来自Molecular Probes(Eugene，OR)。
将异硫氰酸荧光素与卵白蛋白交联
将50mg的FITC溶解在含有500mg的OVA的50mL碳酸盐缓冲液中(pH9.5，0.22mol/L)。轻轻搅拌混合物，使之在室温下，在黑暗中反应1小时，随后置于4℃过夜。通过多次用水稀释，和用10,000分子量界限膜(Millipore，Massachusetts，USA)用400mL超滤室(Millipore，Massachusetts，USA)用氮气加压至200kPa超滤，从交联的蛋白中去除缓冲盐和未结合的FITC。产生的FITC-卵白蛋白(FITC-OVA)溶液在丙酮干冰浴中冰冻和冻干(α2-4LD冻干器，MartinChrist，Germany)。使冻干的蛋白溶液的样品通过10,000分子量的界限滤器单元(Millipore，Massachusetts，USA)，并以10,000g离心20分钟(EBA 12R离心机，Hettich Zentrifugen，Germany)确定交联程度。在所有情况下，未结合FITC在总荧光中的贡献在1％以下。然后将交联的蛋白避光存储在4℃直至使用。
脂质体的制备和组成
脂质体通过常规的薄膜法制备。简而言之，在250mL圆底烧瓶中，将分别为100mg蛋卵磷脂(EPC)和0.35、1.42和1.75mg的Bay 11-7082、槲皮素或姜黄素(或其他所需抑制剂的量)一起溶解于10mL氯仿/乙醇溶剂混合物中(9∶1v/v)。脂类溶液在旋转蒸发器中真空40℃中干燥30分钟以产生薄的脂类膜。然后，将脂类膜在真空中再存放30分钟以去除残余的溶剂(α2-4LD冻干器Martin Christ，Germany)。加入2mL于pH 7.4的HEPES缓冲液的浓度为10mg/ml的卵白蛋白或mBSA，并在室温下手摇振荡以产生多层囊泡。在一些试验中，使用2mL浓度为10mg/mL的FITC-OVA。脂质体分散体在室温下进一步放置2小时以完成膨胀过程。然后，将粗制脂质体悬浮液在丙酮干冰浴中冰冻，并在温度为40℃的水浴中融解。重复5次冻融循环以增加蛋白的包被。
对于带有卵白蛋白的脂质体，使用10mL挤压器(Lipex挤压器，Northern LipidsInc，Vancouver，Canada)并用氮气加压，使脂质体通过800nm聚碳酸酯膜(Nucleopore Corp.，CA，USA)进行5个循环的高压挤压，然后通过400nm聚碳酸酯膜(Nucleopore Corp.，CA，USA)进行5个循环，以降低脂质体大小和层数(lamellarity)。对带有mBSA的脂质体，将脂质体通过400nm膜挤压10次。在进一步使用前，将脂质体在室温放置至少2小时以完成退火过程。如果需要，通过向最终脂质体制备物中加入15μL浓度为10mg/ml的DiI乙醇溶液获得荧光标记的脂质体。
通过在HEPES缓冲液中稀释脂质体，然后使用OptimaTM TLX Tabletop超速离心机(Beckman Coulter，USA)以100,000g(4℃，45分钟)超速离心，以有效去除未包被的NF-κB抑制剂和抗原。在使用前，将脂质体块重新在HEPES缓冲中分散。在这个过程之后的蛋白包被效率通常至少为20％，约60％(对于Bay)，对于槲皮素和姜黄素在80％以上。空的仅有NF-κB抑制剂或蛋白的脂质体通过上述的方法制备，只是不含相关的生物活性物质。
上述的蛋白抗原能用抗原性蛋白的肽表位替代，这些蛋白抗原能通过Liang etal.(2005，Int.J.Pharm.301：247-254)所描述的脂类修饰及冻干单相水合系统有效的包被在脂质体中。
通过流式细胞术和免疫荧光显微镜检测脂质体
在皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)或腹膜内(i.p.)注射DiI标记的脂质体或不进行注射的24小时后，去除脾和引流淋巴结。一部分冻在OCT中进行免疫荧光显微镜检。剩余部分中纯化细胞，用FITC交联的抗-I-A mAb染色，通过流式细胞术分析。
骨髓来源的DC的制备和使用
从鼠长骨收集和悬浮骨髓细胞，使之通过尼龙筛，通过聚蔗糖梯度离心分离单核细胞。使用适当的mAb，然后通过磁珠(MACS，Miltenyi Biotec，CA)免疫去除(immunodeplete)巨噬细胞、II+类细胞和淋巴细胞。BM细胞在加入了每种浓度为10ng/ml的GM-CSF和IL-4(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的XCell620(CSL)培养基中培养6-8天，每隔一天使用新鲜培养基。DC制备物一般含有80-90％CD11c+细胞。在约5μM BAY 11-7082(Bay，BioMol，Plymouth Meeting，PA)存在下，连续培养Bay处理的DC，然后将其暴露于100μM mBSA(Sigma)24小时，然后在标准盐水中洗涤和悬浮。诱导出关节炎后6天，在尾根s.c.使用5×105的Bay处理的DC。在诱导出关节炎后6天，脂质体以10mg/mL浓度悬浮，并将100μL通过i.v.或s.c.在尾根使用。在一些实验中，在尾根s.c.注射50μg可溶性mBSA或10μg Bay溶液，其位点在脂质体注射的附近。
包被NF-κB抑制剂和模型抗原的脂质体制剂的特征鉴定
NF-κB抑制剂和抗原在脂质体中的包被效率(％EE)
去除未包被的NF-κB抑制剂和抗原后，可通过测定方法确定脂质体中NF-κB抑制剂和抗原的量。包被效率以下式表达：
NF-κB抑制剂测定
对于Bay 11-7082，通过加入蛋白沉淀所需的20倍稀释的乙醇溶解脂质体。然后将产生的溶液在-20℃保存。在30分钟后，样品在4℃以最大速度离心10分钟(EBA 12R离心机，Hettich Zentrifugen，Germany)以去除沉淀的蛋白。然后根据已经确定的标准(考虑了所进行的稀释)来测定和计算所产生的上清中的Bay11-708的浓度(数据未显示)。对于槲皮素和姜黄素，加入于PBS pH 6.5中的5％w/v triton X-100溶解脂质体。然后，根据已确定的标准曲线(考虑了所进行的稀释)测定和计算所产生的溶液中的槲皮素或姜黄素的浓度。对测定进行的检验表明，抗原对每种NF-κB抑制剂所进行的定量分析没有显著干扰。
模型抗原的测定
通过稍有修改的标准二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定法确定脂质体中包被的模型抗原的量。简而言之，使用20倍稀释的乙醇或异丙醇分别溶解带有OVA或mBSA的脂质体，然后存放于-20℃。30分钟后，样品以最大速度4℃离心10分钟(EBA 12R离心机，Hettich Zentrifugen，Germany)。丢弃含有脂类和NF-κB抑制剂的上清。然后蛋白块存放于α2-4LD冻干器(α2-4LD冻干器，Martin Christ，Germany)以去除剩余的溶剂。加入100μL 2.5％w/v十二烷基磺酸钠(SDS)溶液(对于OVA)或水(对于mBSA)以重新溶解蛋白块。需要SDS帮助重新溶解OVA块。将产生的蛋白溶液与2mL BCA溶液(Pierce Biotechnology Inc.，USA)混合，并在37℃中温育30分钟。在温育后，使用Cary 50UV-VIS分光光度计(Varian，California，USA)在562nm波长测量溶液的吸光度。根据使用一系列在0.25mg/mL至2mg/mL范围的已知浓度的OVA或mBSA确定的OVA和mBSA溶液确定的标准曲线，计算OVA和mBSA的浓度。
粒子大小和ζ电势
在以HEPES缓冲液pH 7.4稀释后，通过光子相关光谱法(photon correlationspectroscopy)和微电泳(Zetasizer 3000，Malvem，UK)分别确定挤压和洗涤后的脂质体分散体的大小分布和ζ电势。
脂质体制剂的稳定性
制备的脂质体样品存放在4℃(通常的短期存放条件)，通过相关光谱法在7天中监测粒子大小和多分散指数(polydispersity index)。
包被在含有不同NF-κB抑制剂的脂质体中的抗原的保留
使用FITC-OVA研究脂质体内抗原的保留。制备脂质体制剂。用HEPES pH 7.4缓冲液或含有10％FBS的HEPES pH 7.4缓冲液稀释脂质体分散体，以获得1∶20的稀释因子。搅拌稀释的分散体，并使其在37℃温育。在确定的时间点，从稀释的分散体中取等份，并进行超速离心(100,000g，45分钟，4℃，OptimaTM TLXTabletop超速离心机，Beckman Coulter，USA)，以分离从脂质体中释放的FITC-OVA。在使用3mL HEPES pH 7.4缓冲液稀释后，将0.6mL 5％w/v的于PBSpH 6.5中的triton X-100加入到0.4mL含有释放的FITC-OVA上清液中。然后，通过荧光分光光度法在492nm激发波长和518nm发射波长(RF-1501荧光分光光度计，Shimadzu，Japan)分析所产生溶液的荧光强度，并与使用相同条件处理但没有进行包被的FITC-OVA释放的分离的脂质体中包被的总FITC-OVA的荧光强度相比较。
含有NF-κB抑制剂的脂质体处理的小鼠中NF-κB的活性
制备带有NF-κB抑制剂的脂质体。使用50μL含有NF-κB抑制剂(包含Bay11-7082，槲皮素和姜黄素，终浓度分别为0.5，2和2mM)的脂质体制剂在尾根皮下注射到几组C57BL/6小鼠(n＝3)中，对照小鼠接受空载体脂质体的sc注射。24小时后，去除ILN并压过70μm细胞过滤器。细胞用加入100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10mM丙酮酸钠、20mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和50μM2-巯基乙醇的RPMI+10％FCS(完全RPMI)洗涤并以2×106细胞/mL的浓度重悬浮。然后与100ng/mL的LPS一起温育，或单独温育。温育24小时后，用前述方法(Pettit，A.R.，C.Quinn，K.P.MacDonald，L.L.Cavanagh，G.Thomas，W.Townsend，M.Handel，and R.Thomas.1997.Nuclear localization of RelB is associatedwith effective antigen-presenting cell function.J Immunol 159：3681-3691)制备核提取物。
简而言之，收获(2×106细胞)，洗涤细胞，并使其重悬浮于含有10mM氯化钾(KCl)、0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1mM乙二醇-双(-氨基乙基醚)-N，N，N，N-四乙酸(EGTA)、0.1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)和1％v/v蛋白酶抑制剂的鸡尾酒的400μL冰冷10mM HEPES缓冲液pH 7.9中。将细胞冰浴15分钟，然后加入25μL冷的10％诺乃洗涤剂(Nonidet)P-40(Sigma，USA)，并使用台式振荡器剧烈振荡10秒。将匀浆于4℃，10,000rpm离心30秒(Mikro 20，Hettich Zentrifugen，Germany)，丢弃含有细胞质部分的上清液。然后，将核沉淀块重悬浮于50μL含有0.4M氯化钠(NaCl)，1mM EDTA，1mM EGTA，0.1mM DTT，1mM PMSF和1％v/v蛋白酶抑制剂鸡尾酒的20mMHEPES pH 7.9冰冷缓冲液中。将管在4℃剧烈摇动15分钟，然后4℃ 12,000rpm离心5分钟(Mikro 20，Hettich Zentrifugen，Germany)。上清液作为核成分收集并保存在-70℃直至使用。蛋白酶抑制剂鸡尾酒是抑肽酶、亮肽素和胃酶抑素-A以片剂提供(Complete Mini TabletTM，Roche Diagnostics，Switzerland)的混合物，其制备根据生产商的说明。使用BD的NF-κB转因子家族比色试剂盒(BDBiosciences)，根据生产商的说明，用ELISA检测P50/NF-κB的DNA结合。产生的颜色通过多阶段平板读出器(Labsystems，Illinois，USA)检测。
体内使用共包被NF-κB抑制剂和抗原的脂质体后，特异性耐受的诱导：OVA
特异性T细胞模型
共包被OVA和NF-κB抑制剂的脂质体对OVA特异性T细胞的刺激
从幼稚DO11.10小鼠(OVA特异性TCR转基因小鼠)收获脾和ILN，并压过70μm细胞过滤器。将细胞以1×107cell/mL悬浮在温的PBS中，并与等体积10μM CFSE混合，并在37℃温育10分钟。CFSE溶液中的细胞通过450xg在4℃离心5分钟和用冰冷RPMI+10％FCS洗涤两次，以2.5×107cells/mL的密度重悬浮。200μL细胞悬浮液通过尾静脉注射到受体BALB/c小鼠体内。24小时后，在尾根皮下注射50μL的包被OVA和NF-κB抑制剂的脂质体制剂(表1中报道的制剂)。空脂质体，OVA脂质体和CFA中的OVA用作对照。注射后72小时去除ILN，并将其处理成单细胞悬液。然后用KJ1-26-PE抗体(DO11.10细胞特异性抗体)将细胞染色以用于流式细胞术分析。
用OVA-肽抗原再刺激后，脂质体中与OVA共包被的NF-κB抑制剂对OVA特异性T细胞活性的影响
从幼稚DO11.10小鼠收获脾和ILN，并压过70μm细胞过滤器。将200μL细胞悬浮液以2.5×107细胞/mL的密度通过尾静脉注射到受体BALB/c小鼠体内。转移后24小时，通过在尾根皮下注射于CFA中OVA致敏小鼠。7天后，小鼠用50μL共包被OVA和NF-κB抑制剂的脂质体制剂在尾根皮下注射(表4)。注射后7天，去除ILN，并将其处理成单细胞悬液。T细胞通过使用尼龙毛柱富集，然后450xg离心5分钟洗涤。T细胞以2×106细胞/mL的浓度重悬浮在完全RPMI中。将100μL T细胞悬液培养在圆底96孔微滴定板(Techno Plastic Products，Switzerland)中，并用自幼稚小鼠的脾中纯化的CD11c+细胞进行再刺激，该纯化使用CD11c微珠和LS柱(Miltenyi，Germany)通过阳性免疫选择进行。将浓度在0-2000ng/mL范围的OVA肽加入到含T细胞的孔中，使肽的终浓度在0-1000ng/mL，终体积为200μL。将滴定板在37℃和5％CO2中温育3天。在培养的最后18个小时加入[3H]胸苷，通过测定[3H]胸苷的摄取测量T细胞的增殖。然后使用自动96孔收获器(Packard Instruments，Connecticut，USA)，将细胞收集到玻璃纤维滤纸上。用TopCount NXT闪烁计数器(Packard Instruments，Connecticut，USA)通过液体闪烁计数确定[3H]胸苷的摄入。增殖通过三个孔平均的cpm±SEM报告。
表4
共包被OVA和NF-κB抑制剂的脂质体的组成
*从100mg EPC去除游离药物后重新分散在2mL HEPES pH 7.4中制备的脂质体中OVA和NF-kB的平均终浓度。
体内使用共包被NF-κB抑制剂和抗原的脂质体后特异性耐受的诱导：抗原诱
导关节炎(AIA)模型
诱导关节炎前21天，通过在每个腋下皮内注射于50μL盐水中的100μg mBSA(在50μLCFA中乳化)免疫C57BL/6小鼠。同时，腹膜内注射于200μL盐水中400ng百日咳毒素。7天后，在尾根皮下注射加强剂量的于50μL盐水中的100μgmBSA(在50μL CFA中乳化)。在第21天，通过在右膝关节腔关节内注射于10μL盐水中的60μg mBSA诱导关节炎，左膝关节用10μL盐水处理作为对照。在第27天，每组小鼠(n＝10)在尾根皮下注射50μL不同脂质体制剂(表5)。未处理小鼠和接受50μL空脂质体的小鼠作为对照。
表5
共包被mBSA和NF-κB抑制剂的脂质体的组成
*从100mg EPC去除游离药物后重新分散在2mL HEPES pH 7.4中制备的脂质体中mBSA和NF-kB的平均终浓度。
在单独的实验中，对数组小鼠进行皮下注射50μL姜黄素-OVA脂质体(表1中的组合物)、50μL姜黄素-mBSA脂质体(表5中的组合物)或50μL包被在脂质体中的姜黄素(无抗原)，同时使用50μL 2.5mg/mL浓度的mBSA溶液。从诱导关节炎的那天起，使用游标卡尺(Mitutoyo corp，Japan)每3-4天测量每只小鼠膝关节的肿胀，测量至13天，并以百分数表示右和左膝关节的直径的差别，其中每只小鼠中两膝的最大差别等于100％。在第33天，通过颈脱位法杀死小鼠并去除膝上的皮肤。比较注射抗原和盐水的膝之间关节肿胀的严重性，以临床得分表示。得分评级为1至5，其中1＝盐水和抗原的膝之间没变化，2＝关节的轻微变色，3＝关节变色和轻度侧肿和变色，4＝关节变色和中度侧肿和变色以及5＝严重关节变色韧带处不可见和严重侧肿和变色。
统计分析
本章中报告组间数据的显著性差异通过未配对Student’s t-检验(当进行两个比较时)或方差分析(当进行多个比较时)来确定。p值低于0.05则认为有显著性差异。
结果
淋巴器官中MHC II+类吞噬细胞摄入脂质体并将抗原递呈到特异性T细胞
体内脂质体的分布受给药途径，粒子大小和脂类组成的影响(Oussoren，C.，andG.Storm.2001.Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration.Adv Drug Deliv Rev 50：143-156)。至今为止，作为疫苗接种的脂质体给药途径，静脉注射(i.v.)和皮下注射(s.c.)已被广泛研究。通过静脉注射的脂质体递送到全身各个器官，通常迅速在肝和脾中积累，而通过皮下注射的则保留在注射位点并被浸润的抗原递呈细胞捕获，然后迁移到局部引流淋巴结，或通过皮肤的引流淋巴管直接到达驻留淋巴结APC(Oussoren，C.，M.Velinova，G.Scherphof，J.J.vander Want，N.van Rooijen，and G.Storm.1998.Lymphatic uptake and biodistribution ofliposomes after subcutaneous injection.IV.Fate of liposomes in regional lymph nodes.Biochim Biophys Acta 1370：259-272；Metselaar，J.M.，M.H.Wauben，J.P.Wagenaar-Hilbers，O.C.Boerman，and G.Storm.2003.Complete remission ofexperimental arthritis by joint targeting of glucocorticoids with long-circulatingliposomes.Arthritis Rheum 48：2059-2066；Allen，T.M.，C.B.Hansen，and L.S.Guo.1993.Subcutaneous administration of liposomes：a comparison with the intravenousand intraperitoneal routes of injection.Biochim Biophys Acta 1150：9-16)。已经发现，用亲水性聚合体如聚乙二醇包被脂质体表面，可避免肝迅速摄入脂质体，延长脂质体在血流中的循环时间(Torchilin，V.P.2005.Recent advances with liposomes aspharmaceutical carriers.Nat Rev Drug Discov 4：145-160)。
为了进行耐受，需要用脂质体将它们包被的成分递送到吞噬细胞，包含DC前体和一些驻留在或迁移到淋巴器官(如脾和淋巴结)的DC。将挤压通过400nm滤膜的荧光标记的EPC脂质体通过尾静脉静脉注射到或在尾根部皮下注射到小鼠体内，以研究是否该脂质体能够靶向于淋巴器官中的APC。考虑到DiI的多种优点，包含强荧光、低毒性、容易的标记过程，高度稳定性的整合到脂质体膜中和抗细胞膜间转移，DiI被用作荧光标记(Claassen，E.1992.Post-formation fluorescentlabelling of liposomal membranes.In vivo detection，localisation and kinetics.JImmunol Methods 147：231-240)。为评价APC摄入DiI标记的脂质体，注射后24小时收集脾(对于i.v.注射)和局部淋巴结(对于s.c.和i.p.注射)，处理成细胞悬液，然后进行II类MHC(其由包含B细胞，DC和巨噬细胞的APC表达)染色，或进行CD11c(由DC表达)染色。
在被引流淋巴结或脾中的MHC II类+和CD11c+细胞摄入后，DiI脂质体可见(图1，A-C)。在i.v.或s.c.注射后，脂质体被脾中CD11b+和F480+的巨噬细胞和CD11c+DC摄入(图1，D-H))。
用含有NF-κB抑制剂的脂质体处理的小鼠体内NF-κB的活性
为检测包含在脂质体中的NF-κB抑制剂对NF-κB激活的作用，对几组C57BL/6小鼠(n＝3)用包被了不同NF-κB抑制剂的OVA脂质体进行sc或iv注射，注射后24小时，分离脾中的细胞，然后进一步单独培养或与LPS共同培养24小时。使用ELISA，通过检测核提取物中p50/NF-κB与共有寡核苷酸的DNA结合，确定核NF-κB的活性(图2)。因为APC高表达p50，所以在本测定中检测了核p50，即使没有将MHC-II+细胞从引流淋巴结中纯化出来，因而该方法也应当是确定NF-κB活性的敏感方法。
离体不经LPS处理的情况下，用脂质体处理的小鼠获得的细胞表现出低水平的p50DNA结合。如所预期的，自接受空脂质体的小鼠体内获得的细胞中，LPS促进了p50DNA结合。相比而言，LPS处理后，自用包被有槲皮素或姜黄素的脂质体注射的小鼠体内获得的细胞没有对LPS应答的p50DNA结合的增加。这些结果表明，包被有槲皮素或姜黄素的脂质体在体内递送后能够阻断APC的NF-κB活性。共包被NF-κB抑制剂和抗原的脂质体的体内特异性耐受的诱导：OVA特异性T细胞模型。
共包被OVA和NF-κB抑制剂的脂质体对OVA特异性T细胞的刺激
为确定包被在脂质体制剂中的OVA是否能够在体内被APC递呈到OVA特异性T细胞，将共包被OVA和NF-κB抑制剂但无DiI的脂质体在尾根皮下注射到幼稚Balb/c小鼠体内(该小鼠已被过继性转移CFSE标记的DO11.10OVA特异性的TCR转基因的T细胞)。脂质体注射72小时后，用DO11.10T细胞特异性的PE标记的KJ126抗体将从受体小鼠中去除的ILN的细胞染色。CFSE是细胞质染料，在母细胞分裂时，平等分配到子细胞中。因此，可通过流式细胞术测定OVA特异性T细胞的CFSE荧光强度的降低，来确定T细胞的增殖。
在注射空脂质体的小鼠中，通过母群的CFSE稀释测定的T细胞的增殖是可忽略不计的。相比而言，相比之下注射OVA-CFA或OVA-脂质体的小鼠中，72小时中T细胞分裂活跃(图3)。这些结果清楚的证明，包被在脂质体内的OVA可在体内递送至APC，在那里它被加工并递呈到T细胞，导致抗原特异性增殖。对于注射包被OVA脂质体的小鼠和注射共包被OVA和NF-κB抑制剂的脂质体的小鼠，其引流淋巴结中的T细胞增殖性应答没有区别(图3)。
使用包被OVA和NF-κB抑制剂的脂质体导致的体内T细胞扩增与以前使用体内稳定状态下使用DEC-205交联抗原对靶DC的研究类似。内化了DEC-205抗原的未成熟DC能够首先诱导T细胞的增殖，但在一周内，大部分T细胞不能对以前交联体中提供的抗原进行应答(Mahnke，K.，Y.Qian，J.Knop，and A.H.Enk.2003.Induction of CD4+/CD25+regulatory T cells by targeting of antigens toimmature dendritic cells.Blood 101：4862-4869；Hawiger，D.，K.Inaba，Y.Dorsett，M.Guo，K.Mahnke，M.Rivera，J.V.Rauetch，R.M.Steinman，and M.C.Nussenzweig.2001.Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady stateconditions in vivo.J Exp Med 194：769-780)。这种延迟的T细胞应答的抑制是由于未成熟DC诱导外周调节性T细胞，通过效应T细胞的无能和删除序列导致抗原特异性耐受(Mahnke，K.，Y.Qian，J.Knop，and A.H.Enk.2003.Induction ofCD4+/CD25+regulatory T cells by targeting of antigens to immature dendritic cells.Blood 101：4862-4869；Lohr，J.，B.Knoechel，E.C.Kahn，and A.K.Abbas.2004.Roleof B7in T cell tolerance.J Immunol 173：5028-5035)。
在以OVA-肽抗原再刺激后，脂质体中与OVA共包被的NF-κB抑制剂对OVA
特异性T细胞活性的影响
本发明的发明人试验了共包被OVA和NF-κB抑制剂的脂质体是否能够诱导抗原特异性耐受。为进行这一试验，将DO11.10OVA特异性TCR转基因的T细胞转移到BALB/c小鼠体内。用OVA和CFA诱导OVA特异性免疫应答18小时后，这些小鼠被致敏。致敏后7天，用仅含有OVA或含有OVA和NF-κB抑制剂的脂质体制剂皮下注射小鼠。7天后，去除腹股沟淋巴结，并用尼龙毛柱富集T细胞。使用[3H]胸苷掺入作为读数，在用不同浓度的OVA肽脉冲处理的幼稚同系基因型小鼠中纯化的脾DC再刺激T细胞，然后评价T细胞的OVA特异性免疫应答(图4)。
与阳性对照OVA-CFA相比，对OVA脂质体和包被NF-κB抑制剂的OVA脂质体的OVA特异性应答被抑制了。在使用包被槲皮素或姜黄素的OVA脂质体的小鼠中，T细胞增殖被最大程度地抑制，而在单独使用OVA脂质体或使用了包被Bay 11-7082的OVA脂质体的小鼠体内，抑制程度较低。这些结果进一步提示，与高亲脂性抑制剂姜黄素和槲皮素相比较，脂质体保留Bay11-7082的低效率可能使Bay11-7082被递送到靶细胞的效率降低。
这些结果提示，用OVA肽再刺激后T细胞应答的抑制可能是由于诱导调节性T细胞的效应。此外，在本测定中，靶APC中阻断NF-κB激活的能力与抗原特异性T细胞抑制的程度相关，提示脂质体能够共递送抗原和NF-κB抑制剂至体内APC，从而抑制APC的NF-κB活性，伴有相关抗原特异性T细胞耐受。
脂质体对关节炎的抗原特异性抑制等同于NF-kB抑制剂处理的DC的抑制
为评价脂质体在关节炎抑制中的效力，在对一个膝关节注射mBSA后，在两周内，两次用完全弗氏佐剂中的mBSA初始免疫和加强免疫来诱导抗原诱导的关节炎(AIA)。6天后，当关节肿胀在临床上充分地表现出来，将在Bay11-7082存在下并在以mBSA脉冲处理下产生的DC，或脂质体s.c.注射到关节炎小鼠体内。4天后，通过游标读数确定关节肿胀得分。脂质体为空的，仅含有mBSA，或含有mBSA和姜黄素，或含有槲皮素和mBSA，或含有Bay11-7082和mBSA，或仅含有姜黄素的脂质体及在附近注射可溶性mBSA，或仅含有mBSA的脂质体及在附近注射可溶性Bay11-7082(图5)。这些数据表明，含有抗原和NF-κB抑制剂两者结合在一个粒子中的两种脂质体对抑制急性炎性关节炎有等同的效力。然而，即使另一成分s.c.注射在附近组织，仅含有这些成分之一的脂质体在抑制关节炎中也没有效果。
包被有选定NF-κB抑制剂和模型抗原的脂质体的特征鉴定
脂质体是递送选定NF-κB抑制性化合物(特别是如果NF-κB抑制性化合物是亲脂化合物时)的可能的载体。为了通过在体内使NF-κB抑制剂靶向于吞噬性的DC前体从而产生对特异性抗原的免疫耐受，本发明的发明人旨在将抗原共包被在带有NF-κB的脂质体中。选定了一些NF-κB抑制剂用于掺入脂质体中，这些NF-κB抑制剂包含Bay11-7082、姜黄素和槲皮素。后两个比Bay11-7082更具有亲脂性，因此对脂质体的脂双层具有更高的亲和力，预期会更好地被保留。姜黄素(1，7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮)是从姜黄(Curcuma longa，turmeric)根茎分离的酚的天然产物，已经表明其表现出抗炎和抗突变活性，和抗氧化属性，该属性归因于在多个细胞类型中抑制几个信号转导途径，这些信号转导途径包含p38MAP激酶和NF-κB(Kim，G.Y.，K.H.Kim，S.H.Lee，M.S.Yoon，H.J.Lee，D.O.Moon，C.M.Lee，S.C.Ahn，Y.C.Park，and Y.M.Park.2005.Curcumin inhibitsimmunostimulatory function of dendritic cells：MAPKs and translocation of NF-kappaBas potential targets.J Immunol 174：8116-8124)。槲皮素是在水果如杏和芒果中发现的主要的黄酮类物质，有相似属性(Kim，B.H.，S.M.Cho，A.M.Reddy，Y.S.Kim，K.R.Min，and Y.Kim.2005.Down-regulatory effect of quercitrin gallate on nuclearfactor-kappa B-dependent inducible nitric oxide synthase expression inlipopolysaccharide-stimulated macrophages RAW 264.7.Biochem Pharmacol69：1577-1583)。
50mg/mL浓度的EPC中生产的脂质体用作此处报道的研究的基本制剂。因此，首次研究了共包被亲水性抗原(特别是OVA和mBSA)和选定的亲脂性NF-κB抑制剂在这些脂质体中的可行性。通过常规的薄膜法制备了多层脂质体，并使之进行冻融循环以增加亲水性大分子的包被效率。然后，将产生的脂质体样品挤压通过400nm滤膜以降低随后体内评价的粒子的大小。
共包被(co-encapsulation)对脂质体内NF-κB抑制剂和抗原的包被效率的影响
对共包被NF-κB抑制剂和抗原的脂质体的包被效率，大小分布，ζ电势和亲水性抗原的保留的特征进行了鉴定。尽管对亲脂性化合物有高包被，通过常规薄膜法制备的不进行冻融循环的脂质体表现出对亲水性分子的相对低的包被效率。例如，以前的使用同样的条件和EPC脂类浓度包被FITC-OVA的实验报道了包被效率在5％以下(Copland，M.J.，M.A.Baird，T.Rades，J.L.McKenzie，B.Becker，F.Reck，P.C.Tyler，and N.M.Davies.2003.Liposomal delivery of antigen to humandendritic cells.Vaccine 21：883-890)。相比之下，在本研究中，加入重复5次的冻融循环将OVA的包被提高到几乎20％。这些结果证明，在制备过程中加入冻融循环大大地增加了亲水性化合物的包被效率。
mBSA的包被效率(约25％)比OVA的包被效率稍高。推测这可能是由于BSA的甲基化增加了它的亲脂性。这一增加的亲脂性因而可能在与OVA相比的mBSA的高包被中起了作用。此外，以前报道不同来源的白蛋白与脂质体的相互作用的程度不同(Dimitrova，M.N.，H.Matsumura，A.Dimitrova，and V.Z.Neitchev.2000.Interaction of albumins from different species with phospholipid liposomes.Multiple binding sites system.Int J Biol Macromol 27：187-194)。这是由于氨基酸序列的不同导致蛋白质的表面属性不同因而导致蛋白-脂质体相互作用的不同。
观察到，与NF-κB抑制剂共包被所导致的OVA或mBSA包被的没有统计显著性差异(p＞0.05)，尽管在所有情况下在共包被NF-κB的脂质体中OVA的包被与不含抑制剂的那些脂质体相比稍高。此外，当比较带有相同的NF-κB抑制剂的脂质体时，不论是与OVA还是与mBSA制备的脂质体制剂，NF-κB抑制剂的包被效率没有显著性不同(p＞0.05)。高亲脂性化合物槲皮素和姜黄素的包被效率(log P＞3)在80％以上，而亲脂性较低的Bay11-7082的包被效率(1.63的logP)较低，在约60％。
已预期，抗原和NF-κB抑制剂在脂质体包被中无相关性。亲脂性NF-κB抑制剂似乎包被在脂双层中，与磷脂的脂肪链通过疏水性相互作用产生相互作用，其极性功能基团与磷脂的极性头部相互作用。相比之下，尽管一些与脂双层表面之间的相互作用似乎是蛋白的表面活性性质的结果，预期亲水性抗原是包被在水性结构域中。因此，在脂质体中包被时，亲脂性NF-κB抑制剂和亲水性抗原之间很可能没有多少相互作用，导致就各自的包被效率而言也缺少相互影响。这些结果证明，脂质体适合于共递送NF-κB抑制剂和抗原，它们在亲水/亲脂性和分子大小两方面都有很大不同。
共包被对包被抗原和NF-κB抑制剂的脂质体的粒子大小、多分散性和ζ电势
的影响
除了槲皮素，共包被mBSA和NF-κB抑制剂的脂质体粒子大小为约350nm。这与包被NF-κB抑制剂而不带有抗原的脂质体大小相似而没有统计差异(p＞0.05)。然而，不考虑包被的NF-κB抑制剂，包被OVA的脂质体的粒子大小比包被的mBSA脂质体(对于不带有NF-κB抑制剂的脂质体为409.9±16.9vs 328.7±22.0nm)和不带有抗原的脂质体的粒子大小稍大。注意到用OVA制备的脂质体更不易挤压，因而简单挤压通过400nm膜(10循环)的方案对于OVA脂质体来说更改为顺次通过首先是800nm膜(5循环)然后是400nm膜(5循环)。
共包被槲皮素和抗原的脂质体比共包被其他NF-κB抑制剂和抗原的脂质体具有更大的粒子大小(p＜0.05)。观察到粒子大小增加的原因可能是由于槲皮素插入到双层中，影响了双层脂类的包装参数，以及槲皮素通过氢键与脂类极性头部基团的相互作用。
包被OVA或mBSA的脂质体的ζ电势没有显著性差异(p＞0.05)。此外，与仅包被NF-κB抑制剂的脂质体相比，包被抗原不影响这些脂质体制剂的ζ电势(p＞0.05)。同样，考虑到抗原在脂质体的内部水性结构域的位置，预期，包被抗原不会改变脂质体表面电荷因而不会影响ζ电势。然而，电势缺少变化提示在离心去除未包被的抗原后，两个抗原都不能明显吸附到脂质体的外表面。
总起来说，这些结果表明，与仅包被NF-κB抑制剂的脂质体相比，掺入两种抗原中的任何一种抗原到带有NF-κB抑制剂的脂质体中，在大小，大小分布和ζ电势方面不会有显著改变。
共包被NF-κB抑制剂和抗原的脂质体制剂的稳定性
研究了在4℃保存7天的共包被抗原和NF-κB抑制剂的脂质体在粒子大小方面的稳定性(进行体内评价前所需的用于存储制剂的条件)。结果表明，在这样的条件下保存至少7天，共包被抗原和NF-κB抑制剂的脂质体完全是稳定的。因此，所有脂质体制剂在制备7天内在4℃下保存和使用。
含有不同NF-κB抑制剂的脂质体中被包被的抗原的保留
当脂质体用作载体体内递送生物活性化合物时，包被在水性核心的亲水性化合物，特别是小分子，在给药(例如，通过静脉注射)后可很快丢失，这是因为脂质体与血清成分(如脂蛋白)之间的相互作用(Jones，M.N.，and A.R.Nicholas.1991.The effect of blood serum on the size and stability of phospholipid liposomes.Biochim Biophys Acta 1065：145-152；Harashima，H.，T.M.Huong，T.Ishida，Y.Manabe，H.Matsuo，and H.Kiwada.1996.Synergistic effect between size andcholesterol content in the enhanced hepatic uptake clearance of liposomes throughcomplement activation in rats.Pharm Res 13：1704-1709；Maurer，N.，D.B.Fenske，and P.R.Cullis.2001.Developments in liposomal drug delivery systems.Expert OpinBiol Ther 1：923-947)。已经表明，由于磷脂从脂质体膜转移到高密度(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)上，脂质体能去稳定，导致包被的药物的泄露(Allen，T.M.1981.A study of phospholipid interactions between high-density lipoproteins and smallunilamellar vesicles.Biochim Biophys Acta 640：385-397；Scherphof，G.，F.Roerdink，M.Waite，and J.Parks.1978.Disintegration of phosphatidylcholine liposomes inplasma as a result of interaction with high-density lipoproteins.Biochim Biophys Acta542：296-307；Hunter，J.A.，Z.Shahrokh，T.M.Forte，and A.V.Nichols.1982.Aggregation of low density lipoproteins with unilamellar phosphatidylcholine vesicles.Biochem Biophys Res Commun 105：828-834)。据报道，在温育的培养基中仅存在10％的FBS就能剧烈诱导脂质体成分的泄露，因而能用来显示脂质体的血清稳定性(Allen，T.M.，and L.G.Cleland.1980.Serum-induced leakage of liposome contents.Biochim Biophys Acta 597：418-426)。
脂质体易于在血清中去稳定特别受脂质体膜流动性的影响。据报道，由具有高Tc的饱和磷脂(如DSPC)构成的脂质体具有增强的稳定性，因而在血浆中溶质的泄露减少(Hao，Y.L.，Y.J.Deng，Y.Chen，X.M.Wang，H.J.Zhong，and X.B.Suo.2005.In vitro and in vivo studies of different liposomes containing topotecan.Arch Pharm Res 28：626-635；Clary，L.，G.Verderone，C.Santaella，and P.Vierling.1997.Membrane permeability and stability of liposomes made from highly fluorinateddouble-chain phosphocholines derived from diaminopropanol，serine or ethanolamine.Biochim Biophys Acta 1328：55-64；Senior，J.，and G.Gregoriadis.1982.Stability ofsmall unilamellar liposomes in serum and clearance from the circulation：the effect ofthe phospholipid and cholesterol components.Life Sci 30：2123-2136；Gregoriadis，G.，and J.Senior.1980.The phospholipid component of small unilamellar liposomescontrols the rate of clearance of entrapped solutes from the circulation.FEBS Lett119：43-46)。也已经表明，在脂质体制剂中加入胆固醇可通过脂类的包装密度提高双层的稳定性(Allen，T.M.，and L.G.Cleland.1980.Serum-induced leakage ofliposome contents.Biochim Biophys Acta 597：418-426，Kirby，C.，J.Clarke，and G.Gregoriadis.1980.Effect of the cholesterol content of small unilamellar liposomes ontheir stability in vivo and in vitro.Biochem J 186：591-598)。此外，已经表明，脂质体结构中胆固醇的存在抑制磷脂向HDL的转移(Damen，J.，J.Regts，and G.Scherphof.1981.Transfer and exchange of phospholipid between small unilamellarliposomes and rat plasma high density lipoproteins.Dependence on cholesterol contentand phospholipid composition.Biochim Biophys Acta 665：538-545)。
在本研究中，模型脂质体制剂由不含胆固醇的EPC构成。因此决定，要确定血清存在时，脂质体制剂是否稳定以及是否能够保留其内容物，特别是包被的抗原。用FITC-OVA作为在带有不同NF-κB抑制剂的脂质体中包被的抗原，将脂质体悬浮在加入了10％FBS的HEPES pH 7.4缓冲液中。FITC-OVA的释放在37℃监测28小时，并与在同样条件下在不含FBS的缓冲液中温育的脂质体相比较。
图6显示了带有各种NF-κB抑制剂的脂质体中FITC-OVA的释放谱。在10％FBS存在下，37℃温育28小时后，90％以上的FITC-OVA保留在脂质体中，与共包被的NF-κB抑制剂无关。此外，脂质体在含FBS和不含FBS的温育中没有显著性差异。在与FBS共同温育时包被抗原在脂质体中令人满意的保留可由于抗原的大分子结构阻碍其扩散出脂质体。
实施例2
抗原相关的脂质体或抗原相关的微球通过诱导调节性T细胞诱导抗原特异性抑制
材料和方法
试剂
通过将卵白蛋白、姜黄素、PLGA和聚乙烯醇(PVA)结合，然后13500rpm混匀，接着以800rpm搅拌制备聚(d，l-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球。密度离心后，将粒子分散在5％w/v蔗糖溶液中，调整其大小并将其冻干。在使用前，粒子在PBS中复原。OVA-姜黄素脂质体用如实施例1的描述制备。
试验抗原特异性抑制的体内模型
用OVA和完全弗氏佐剂(CFA)致敏DO11.10小鼠，7天后注射姜黄素-OVA脂质体或姜黄素-OVA微球。7天后，纯化这些小鼠的脾细胞，并转移到7天前已用OVA和CFA致敏的BALB/c受体体内。5天后杀死受体小鼠，用不同浓度的OVA肽再刺激脾细胞。
结果
抗原相关的脂质体或抗原相关的微球通过诱导调节性T细胞诱导抗原特异性抑制
接受来自OVA/CFA致敏小鼠的OVA特异性DO11.10T细胞的OVA/CFA致敏小鼠的脾细胞对OVA肽再刺激有很好的应答(图7，红线)。相比之下，当DO11.10T细胞的供体已用OVA/CFA致敏，然后用OVA-姜黄素脂质体(绿线)或微球(蓝线)处理时，受体小鼠的脾细胞应答被抑制了。作为阴性对照，未致敏小鼠的脾细胞对OVA肽的应答很差(黑线)。这些数据表明，包被OVA和NF-kB抑制剂的脂质体或微球都可导致对OVA的以前已致敏的应答的抑制。抑制能通过T细胞从一个动物到下一个动物转移——表明已经诱导出调节性T细胞(Martin E，O’Sullivan BJ，Low P and R Thomas.Antigen-specific suppression of a primedimmune response by dendritic cells mediated by regulatory T cells secretinginterleukin-10.Immunity 2003.18：155-67.)。
此处引用的每个专利，专利申请和出版物的公开内容通过引用完全合并于此。
此处引用的任何参考文献不应解释为承认该参考文献对本申请是可获得的“现有技术”。
本说明书自始至终的目的是为了描述本发明的一些具体实施方案，而不是将本发明限制到任何一个具体实施方案或特征的特定集合。因此，本领域技术人员将会理解，根据本发明的公开，能对示例性的特定具体实施方案进行各种修饰和改变而不脱离本发明的范围。所有这样的修饰和改变都包含在所附权利要求的范围之中。
Claims (20)
1.一种粒子在制备用于抑制受治疗者对靶抗原的免疫应答的药物中的应用，其中所述粒子包含NF-κB途径的抑制剂和相当于至少一部分靶抗原的抗原，其中粒子是脂质体或聚合体粒子。
2.根据权利要求1所述的应用，其中抗原选自变应原、自身抗原或同种异体抗原。
3.根据权利要求1所述的应用，其中抗原选自蛋白抗原、脂类抗原、糖脂抗原或糖类抗原。
4.根据权利要求2所述的应用，其中抗原是与自体免疫性疾病相关的自身抗原，所述自体免疫性疾病选自牛皮癣、系统性红斑狼疮、重症肌无力、僵人综合征、甲状腺炎、西德纳姆舞蹈症、类风湿关节炎、糖尿病和多发性硬化症。
5.根据权利要求4所述的应用，其中自身抗原选自狼疮自身抗原、Smith、Ro、La、U1-RNP、肌原纤维蛋白；核抗原、组蛋白、糖蛋白gp70或核糖体蛋白；丙酮酸脱氢酶二氢硫辛酸乙酰转移酶(PCD-E2)；毛囊抗原；人类原肌球蛋白异构体5(hTM5)；胰岛素原、胰岛素、IA2或GAD65；II型胶原、人软骨gp39(HCgp39)或gp130-RAPS、dnaJp1、瓜氨酸化的蛋白或肽、瓜氨酸化的II型胶原、瓜氨酸化的波形蛋白、瓜氨酸化的纤维蛋白原；髓磷脂碱性蛋白、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)；甲状腺刺激因子受体(TSH-R)；乙酰胆碱受体(AchR)；麦胶蛋白；组蛋白、PLP、6-磷酸葡萄糖异构酶、甲状腺球蛋白、各种tRNA合成酶、蛋白酶-3或髓过氧物酶。
6.根据权利要求2所述的应用，其中抗原是与变态反应相关的变应原，所述的变态反应选自花粉症、哮喘、湿疹、动物变态反应、食物变态反应、乳胶变态反应、或皮炎。
7.根据权利要求6所述的应用，其中变应原选自Fel d1、Der p I、Der p II、Der fI、DerfII；草、树和杂草花粉来源的变应原；真菌、霉菌；蟹、龙虾、花生、坚果、小麦面筋、蛋、奶；蜜蜂、黄蜂、摇蚊、家蝇、果蝇、绵羊丽蝇、螺旋锥蝇、谷物象鼻虫、蚕、非咬蚊幼虫、蜂蛾幼虫、粉虫、蟑螂、黄粉虫幼虫、甲虫和蜘蛛、哺乳动物的皮屑、尿、唾液、血液或其他体液、一般空气播散的粒子、胶乳；或蛋白洗涤剂添加剂。
8.根据权利要求2的应用，其中所述抗原是与器官相关的移植抗原，所述器官选自心脏、肝脏、胰腺、肾、肺、眼和皮肤。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述的移植抗原来源于选自心、肺、肝、胰、肾、神经移植物组分的供体细胞或组织，或者来源于在没有外源性抗原时，携带了载有自身抗原的MHC的供体抗原递呈细胞。
10.根据权利要求1所述的应用，其中所述的抗原为非核酸形式。
11.根据权利要求1所述的应用，其中所述NF-κB途径抑制剂降低NF-κB途径成员的水平或功能活性，所述NF-κB途径成员选自BTK、LYN、BCR Igα、BCRIgβ、Syk、Blnk、PLCγ2、PKCβ、DAG、CARMA1、BCL10、MALT1、PI3K、PIP3、AKT、p38MAPK、ERK、COT、IKKα、IKKβ、IKKγ、NIK、RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB、p52、NIK、Leu13、CD81、CD19、CD21及其在补体和凝结级联中的配体、TRAF6、泛素连接酶、Tab2、TAK1、NEMO、NOD2、RIP2、Lck、fyn、Zap70、LAT、GRB2、SOS、CD3ζ、Slp-76、GADS、ITK、PLCγ1、PKCθ、ICOS、CD28、SHP2、SAP、SLAM或2B4。
12.根据权利要求8所述的应用，其中所述NF-κB途径抑制剂降低RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB或p52中任意一个或多个的水平或功能活性。
13.根据权利要求1所述的应用，其中所述NF-κB途径抑制剂增加NF-κB途径成员的水平或功能活性，所述NF-κB途径成员选自SHP1、SHIP、PIR-B、CD22、CD72、FcgRIIB、IκB、P100、CTLA4、PD-1、Cbl、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL或Csk。
14.根据权利要求1所述的应用，其中所述NF-κB途径抑制剂为非核酸形式。
15.根据权利要求1所述的应用，其中所述NF-κB途径抑制剂选自槲皮素、姜黄素或Bay11-7082。
16.根据权利要求1所述的应用，其中粒子与药学上可接受的载体或稀释剂共同配方。
17.根据权利要求1至16任一项所述的应用，其中药物被配方成通过注射、局部应用或包含持续释放的给药模式的鼻或口途径，以有效抑制对靶抗原免疫应答的一段时间和剂量使用。
18.根据权利要求1至16任一项所述的应用，其中药物被配方成经系统给药。
19.根据权利要求1至16任一项所述的应用，其中药物被配方成经皮下给药。
20.根据权利要求1至16任一项所述的应用，其中药物被配方成经皮内给药。
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