CN113616793B - Traf6抑制剂在作为和/或制备铁死亡诱导剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物技术领域,公开了TRAF6抑制剂在作为和/或制备铁死亡诱导剂中的应用。本发明首次公开了TRAF6抑制剂在作为和/或制备铁死亡诱导剂中的应用,这是基于发明人发现TRAF6抑制剂可以诱导铁积累,诱导细胞内活性氧、脂质活性氧以及线粒体活性氧的堆积,诱导线粒体损伤;同时,抑制C‑Myc、Cyclin D1、GPX4、SLC7A11、FTH1的表达;因此,TRAF6抑制剂可以作为铁死亡诱导剂,并用于预防和/或治疗肿瘤。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域,具体涉及TRAF6抑制剂在作为和/或制备铁死亡诱导剂中的应用。
背景技术
2012年在研究erastin杀死RAS突变的肿瘤细胞作用机制时发现一种铁依赖性的细胞死亡形式—铁死亡,其主要是细胞内“铁”依赖脂质氧自由基异常增高、氧化还原稳态失衡而致。铁死亡具有高代谢相关性和多靶点的特性,开辟了靶向治疗研究的新领域。铁死亡的主要特点是亚铁离子积累和膜上过氧化脂质的聚集。细胞内的游离铁与过氧化氢发生Fenton反应,催化羟基自由基生成,导致磷脂膜的组分——多不饱和脂肪酸过氧化,引起膜不稳定甚至破裂,最终导致细胞死亡的过程。经典的铁死亡调控依赖于谷光甘肽过氧化物酶GPX4对过氧化脂质的中和作用,细胞通过Xc系统转运胞外胱氨酸或转硫途径直接提供半胱氨酸用于谷光甘肽的合成,在NADPH辅助下氧化还原型谷光甘肽的转换促进GPX4的循环利用。铁死亡不仅作为应激反应参与某些病理过程,还对部分肿瘤抑制因子(如BAP1、p53)的抗癌作用有一定贡献。在固有或获得性耐药的肿瘤细胞中显示出对铁死亡的高度敏感,并与肿瘤免疫治疗的效果息息相关。因此,全面认识肿瘤铁死亡的调控机制具有重要的治疗意义和广泛的应用前景。
冬凌草素(Oridonin)又称冬凌草甲素,是一种从冬凌草中提取出的介壳杉烯四环二萜类化合物,是冬凌草发挥作用的主要成分之一。目前冬凌草甲素作为TRAF6抑制剂在制备铁死亡诱导剂中的应用尚未见报道。
发明内容
本发明第一个方面的目的,在于提供TRAF6抑制剂在制备铁死亡诱导剂中的应用。
本发明的第二方面的目的,在于提供TRAF6抑制剂在制备铁积累诱导剂中的应用。
本发明的第三方面的目的,在于提供TRAF6抑制剂在制备活性氧诱导剂中的应用。
本发明的第四方面的目的,在于提供TRAF6抑制剂在制备C-Myc抑制剂中的应用。
本发明的第五方面的目的,在于提供TRAF6抑制剂在制备Cyclin D1抑制剂中的应用。
本发明的第六方面的目的,在于提供TRAF6抑制剂在制备GPX4抑制剂中的应用。
本发明的第七方面的目的,在于提供TRAF6抑制剂在制备SLC7A11抑制剂中的应用。
本发明的第八方面的目的,在于提供TRAF6抑制剂在制备FTH1抑制剂中的应用。
本发明的第九方面的目的,在于提供TRAF6抑制剂在制备线粒体损伤诱导剂中的应用。
本发明的第十方面的目的,在于提供TRAF6抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第十一方面的目的,在于提供冬凌草甲素或其衍生物在制备TRAF6抑制剂中的应用。
本发明的第十二方面的目的,在于提供冬凌草甲素或其衍生物在制备TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路抑制剂中的应用。
为了实现上述目的,本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供TRAF6抑制剂在制备铁死亡诱导剂中的应用。
TRAF6抑制剂在诱导铁死亡中的应用。
优选地,TRAF6抑制剂在体外非治疗目的地诱导铁死亡中的应用。
优选地,所述诱导铁死亡为诱导细胞铁死亡。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地,所述TRAF6抑制剂的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
本发明的第二个方面,提供TRAF6抑制剂在制备铁积累诱导剂中的应用。
优选地,所述铁积累诱导剂为亚铁离子蓄积诱导剂。
优选地,所述铁积累诱导剂用于诱导细胞内亚铁离子浓度的增加。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
TRAF6抑制剂在诱导铁积累中的应用。
优选地,TRAF6抑制剂在体外非治疗目的地诱导铁积累中的应用。
优选地,所述诱导铁积累为诱导细胞内亚铁离子浓度的增加。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地,所述TRAF6抑制剂的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
本发明的第三个方面,提供TRAF6抑制剂在制备活性氧诱导剂中的应用。
优选地,所述活性氧为细胞内活性氧。
优选地,所述细胞内活性氧包括脂质活性氧和线粒体活性氧中的至少一种;进一步为脂质活性氧。
优选地,所述活性氧诱导剂为促进活性氧的产生及累积的诱导剂。
TRAF6抑制剂在诱导活性氧增加中的应用。
优选地,TRAF6抑制剂在体外非治疗目的地诱导活性氧增加中的应用。
优选地,所述TRAF6抑制剂的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
本发明的第四个方面,提供TRAF6抑制剂在制备C-Myc抑制剂中的应用。
优选地,所述C-Myc抑制剂为抑制C-Myc蛋白表达的抑制剂。
优选地,所述C-Myc抑制剂用于抑制细胞内C-Myc蛋白表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
TRAF6抑制剂在抑制C-Myc表达中的应用。
优选地,TRAF6抑制剂在体外非治疗目的地抑制C-Myc表达中的应用。
优选地,所述抑制C-Myc表达为抑制细胞内C-Myc蛋白表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地,所述TRAF6抑制剂的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
本发明的第五个方面,提供TRAF6抑制剂在制备Cyclin D1抑制剂中的应用。
优选地,所述Cyclin D1抑制剂为抑制Cyclin D1蛋白表达的抑制剂。
优选地,所述Cyclin D1抑制剂用于抑制细胞内Cyclin D1蛋白表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
TRAF6抑制剂在抑制Cyclin D1表达中的应用。
优选地,TRAF6抑制剂在体外非治疗目的地抑制Cyclin D1表达中的应用。
优选地,所述抑制Cyclin D1表达为抑制细胞内Cyclin D1蛋白表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地,所述TRAF6抑制剂的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
本发明的第六个方面,提供TRAF6抑制剂在制备GPX4抑制剂中的应用。
优选地,所述GPX4抑制剂为抑制GPX4蛋白表达的抑制剂。
优选地,所述GPX4抑制剂用于抑制细胞内GPX4蛋白表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
TRAF6抑制剂在抑制GPX4表达中的应用。
优选地,TRAF6抑制剂在体外非治疗目的地抑制GPX4表达中的应用。
优选地,所述抑制GPX4表达为抑制细胞内GPX4蛋白表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地,所述TRAF6抑制剂的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
本发明的第七个方面,提供TRAF6抑制剂在制备SLC7A11抑制剂中的应用。
优选地,所述SLC7A11抑制剂为抑制SLC7A11蛋白表达的抑制剂。
优选地,所述SLC7A11抑制剂用于抑制细胞内SLC7A11蛋白表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
TRAF6抑制剂在抑制SLC7A11表达中的应用。
优选地,TRAF6抑制剂在体外非治疗目的地抑制SLC7A11表达中的应用。
优选地,所述抑制SLC7A11表达为抑制细胞内SLC7A11蛋白表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地,所述TRAF6抑制剂的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
本发明的第八个方面,提供TRAF6抑制剂在制备FTH1抑制剂中的应用。
优选地,所述FTH1抑制剂为抑制FTH1蛋白表达的抑制剂。
优选地,所述FTH1抑制剂用于抑制细胞内FTH1蛋白表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
TRAF6抑制剂在抑制FTH1表达中的应用。
优选地,TRAF6抑制剂在体外非治疗目的地抑制FTH1表达中的应用。
优选地,所述抑制FTH1表达为抑制细胞内FTH1蛋白表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地,所述TRAF6抑制剂的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
本发明的第九个方面,提供TRAF6抑制剂在制备线粒体损伤诱导剂中的应用。
优选地,所述线粒体损伤诱导剂用于诱导细胞内线粒体损伤。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
TRAF6抑制剂在诱导线粒体损伤中的应用。
优选地,TRAF6抑制剂在体外非治疗目的地诱导线粒体损伤中的应用。
优选地,所述诱导线粒体损伤为诱导细胞内线粒体损伤。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地,所述TRAF6抑制剂的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
本发明的第十个方面,提供TRAF6抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地,所述肿瘤为肺癌;进一步为非小细胞肺癌。
根据本发明的第一个方面到第十个方面,所述TRAF6抑制剂为抑制TRAF6表达的试剂。
优选地,所述TRAF6抑制剂不包括冬凌草甲素。
优选地,所述试剂为靶向TRAF6的siRNA。
优选地,所述TRAF6的PDB ID为1LB6。
优选地,所述TRAF6的登录号为:Q3MV19(UniProt数据库)。
优选地,所述靶向TRAF6的siRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地,所述冬凌草甲素(Oridonin)的分子式为C20H28O6,分子量为364.44,CAS号为28957-04-2。
本发明的第十一个方面,提供冬凌草甲素或其衍生物在制备TRAF6抑制剂中的应用。
优选地,所述TRAF6抑制剂为抑制TRAF6表达的试剂;进一步为抑制TRAF6蛋白表达的试剂。
冬凌草甲素或其衍生物在抑制TRAF6表达中的应用。
优选地,冬凌草甲素或其衍生物在体外非治疗目的地抑制TRAF6表达中的应用。
优选地,所述抑制TRAF6表达为抑制细胞内TRAF6蛋白的表达。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地,所述冬凌草甲素的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
本发明的第十二个方面,提供冬凌草甲素或其衍生物在制备TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路抑制剂中的应用。
冬凌草甲素或其衍生物在抑制TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路中的应用。
优选地,冬凌草甲素或其衍生物在体外非治疗目的地抑制TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路中的应用。
优选地,所述抑制TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路为抑制细胞内TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路。
优选地,所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地,所述冬凌草甲素的浓度为2~15μM;进一步为5~10μM;更进一步为10μM。
根据本发明的第十一个方面和第十二个方面,所述冬凌草甲素(Oridonin)的分子式为C20H28O6,分子量为364.44,CAS号为28957-04-2。
根据本发明的第十一个方面和第十二个方面,所述衍生物包括冬凌草甲素在药学上可以接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。
本发明的有益效果是:
本发明首次公开了TRAF6抑制剂在制备铁死亡诱导剂中的应用,这是基于发明人发现TRAF6抑制剂可以诱导铁积累,诱导细胞内活性氧、脂质活性氧以及线粒体活性氧的堆积,诱导线粒体损伤;同时,抑制C-Myc、Cyclin D1、GPX4、SLC7A11、FTH1的表达;而铁积累是铁死亡发生的必要条件,铁离子主要通过催化脂质过氧化过程参与铁死亡的发生;脂质活性氧堆积是诱发铁死亡的重要标志;SLC7A11可以通过介导胱氨酸摄取和谷氨酸释放促进谷胱甘肽的合成,保护细胞免受氧化应激,维持细胞的氧化还原平衡,阻止脂质过氧化诱导的细胞死亡,GPX4在产生脂质信使分子的通路中发挥重要功能,主要负责降解脂质过氧化物,移除毒性的中间产物,GPX4的功能一旦被抑制,就会触发铁死亡;FTH1是铁蛋白复合物的一个21kDa亚基,具有互补的Fe2+调节功能。它能在细胞中捕获Fe2+离子,并将其转化为Fe3 +,减少活性氧的产生;因此,FTH1对于维持Fe2+稳态和防止Fe2+过载至关重要;而Fe2+释放和铁蛋白降解可通过铁蛋白自噬参与细胞功能障碍过程,通过释放足够水平的铁引起ROS形成和脂质过氧化,引发铁死亡;因此,TRAF6抑制剂可以作为铁死亡诱导剂,并用于预防和/或治疗肿瘤。
本发明还公开了冬凌草甲素或其衍生物可以抑制TRAF6表达和TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路,可作为TRAF6抑制剂。
附图说明
图1是TRAF6抑制剂(TRAF6-siRNA)对H358细胞中TRAF6、C-Myc、Cyclin D1、GPX4、SLC7A11、FTH1蛋白表达影响的免疫印迹结果图:其中,A是TRAF6抑制剂(TRAF6-siRNA)对TRAF6、C-Myc、Cyclin D1蛋白表达影响的免疫印迹结果图;B是TRAF6抑制剂(TRAF6-siRNA)对TRAF6、FTH1、SLC7A11、GPX4蛋白表达影响的免疫印迹结果图。
图2是TRAF6抑制剂(TRAF6-siRNA)对H358细胞中铁浓度的影响图。
图3是TRAF6抑制剂(TRAF6-siRNA)对H358细胞中脂质活性氧含量的影响图;其中,A是TRAF6抑制剂(TRAF6-siRNA)对H358细胞中脂质活性氧含量影响的流式细胞图;B是TRAF6抑制剂(TRAF6-siRNA)对H358细胞中脂质活性氧含量影响的统计结果图;***表示p<0.001。
图4是冬凌草甲素对H358细胞中PD-L1含量的影响图:其中,A是不同浓度的冬凌草甲素对H358细胞中PD-L1含量影响的流式细胞图;B是不同浓度的冬凌草甲素对H358细胞中PD-L1含量影响的统计结果图;C是IFN-γ及IFN-γ与冬凌草甲素的混合物对H358细胞中PD-L1含量影响的流式细胞图;D是FN-γ及IFN-γ与冬凌草甲素的混合物对H358细胞中PD-L1含量影响的统计结果图;*表示p<0.05;**表示p<0.01;***表示p<0.001。
图5是冬凌草甲素对H358细胞中TRAF6、C-Myc、PD-L1表达影响的免疫印迹结果图。
图6是冬凌草甲素和TRAF6的对接结合模式图及2D相互作用图:其中,条带表示TRAF6;棍状模型表示冬凌草甲素;虚线表示氢键相互作用;实线表示疏水作用。
图7是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中活性氧含量的影响图;其中,A是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中活性氧含量影响的流式细胞图;B是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中活性氧含量影响的统计结果图;**表示“与空白对照组相比,p<0.01”。
图8是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中脂质活性氧含量的影响图;其中,A是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中脂质活性氧含量影响的流式细胞图;B是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中脂质活性氧含量影响的统计结果图;*表示“与空白对照组相比,p<0.05”;****表示“与空白对照组相比,p<0.0001”。
图9是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中线粒体活性氧含量的影响图;其中,A是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中线粒体活性氧含量影响的流式细胞图;B是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中线粒体活性氧含量影响的统计结果图;*表示“与空白对照组相比,p<0.05”;**表示“与空白对照组相比,p<0.001”。
图10是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中铁浓度影响的结果图。
图11是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中GPX4、SLC7A11和FTH1表达影响的免疫印迹结果图。
图12是TRAF6抑制剂(冬凌草甲素)对H358细胞中线粒体形态的影响图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所采用的原料,除特殊说明外,均通过常规手段制备或者通过商业渠道购买。
本实施例中的试剂或试剂的制备方法如下:
冬凌草甲素储存液配制:用电子天平称取冬凌草甲素粉末放置于无菌离心管中,然后加入二甲基亚砜(DMSO)进行溶解,配制成浓度为20mM的储存液。
实施例1 TRAF6抑制剂诱导铁死亡
(1)细胞转染:将H358细胞以8×104/mL的密度接种于12孔板中,每孔体积为1mL,将细胞培养至70%~80%细胞融合进行转染:用Lipofectamine 2000(Invitrogen,USA)对细胞进行TRAF6-siRNA或NC-siRNA转染(阴性对照NC-siRNA和TRAF6-siRNA购于SangonBiotech(Shanghai,China),其中,TRAF6-siRNA的序列为TGGATTCTACACTGGCAAA,SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:1中T等同于U),NC-siRNA和TRAF6-siRNA的终浓度为10nM;最后在转染48h的细胞中分析靶蛋白表达水平,挑选成功转染的细胞用于后续实验。
(2)Western Blot检测TRAF6、C-Myc、Cyclin D1、GPX4、SLC7A11、FTH1的表达:分别用RIPA裂解液裂解成功转染TRAF6-siRNA或NC-siRNA的细胞,收集细胞蛋白;将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,置于转膜仪转膜;转膜后分别孵育一抗TRAF6(abcam,ab40675)、C-Myc(CST,18583)、Cyclin D1(CST,55506)、GPX4(CST,52455)、SLC 7A11(ABclonal,A13685)、FTH1(CST,4393)、GAPDH(Sangon Biotech,D110016),4℃孵育过夜;第二天洗膜后加入稀释(1:4000)的二抗(Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody(抗兔二抗,HRP标记),CST,7074S),室温孵育1h;二抗孵育完成后,显影仪显影;结果如图1所示:H358细胞转染TRAF6-siRNA后,细胞中TRAF6蛋白表达显著下调,表明TRAF6被成功敲除;细胞中的GPX4、FTH1、C-Myc、Cyclin D1、SLC7A11蛋白表达下降。
(3)铁浓度测定:将H358细胞以8×104个/mL的密度接种于6孔板中,在37℃,5%CO2培养箱内培养过夜;次日对H358细胞进行siRNA转染(TRAF6-siRNA或NC-siRNA),转染48小时后将含有细胞亚铁离子荧光探针FerroOrange(1μmol/L,Dojindo,Japan)的无血清培养基添加到细胞中,37℃,5%CO2培养箱中孵育30分钟,最后在荧光共聚焦显微镜(FV3000,Olympus,Japan)下观察细胞,结果如图2所示:H358细胞转染TRAF6-siRNA后,细胞中Fe2+上升。
(4)荧光探针C11-BODIPY 581/591(爱博泰克,武汉)检测细胞内脂质活性氧的形成:将H358细胞以8×104个/mL的密度接种于6孔板中,在37℃,5%CO2培养箱内培养过夜;次日对H358细胞进行siRNA转染(TRAF6-siRNA或NC-siRNA),转染48小时后加入10μM C11-BODIPY 581/591探针,并于37℃、5%CO2培养箱中孵育1小时;孵育结束后,用PBS清洗细胞两次以去除多余的染料;然后用胰蛋白酶消化细胞,并将细胞重悬于含5%的PBS中,最后通过流式细胞术进行分析;结果如图3所示:H358细胞转染TRAF6-siRNA后,细胞中脂质过氧化水平上升。
因此,H358细胞转染TRAF6-siRNA后,细胞中GPX4、FTH1、SLC7A11蛋白表达下降,Fe2+上升,脂质过氧化水平上升,可见,沉默TRAF6可促进肺癌细胞中铁死亡的发生,TRAF6可作为肺癌铁死亡的一个抑制基因,TRAF6抑制剂可诱导铁死亡。
实施例2冬凌草甲素Oridonin作为TRAF6抑制剂诱导铁死亡
(1)PD-L1荧光抗体检测细胞内PD-L1含量:将H358细胞以1×105/mL的密度接种于12孔板中,每孔体积为1mL,并于5%CO2的37℃培养箱中培养过夜,第二天分别进行如下处理:1)分为空白对照组(Control)以及冬凌草甲素(Oridonin)组(终浓度分别为2.5、5、10μM);和2)分为空白对照组(Control),γ干扰素(IFN-γ,终浓度为20ng/mL)组以及IFN-γ(终浓度为20ng/mL)+冬凌草甲素(Oridonin,终浓度为10μM)组进行给药处理,每种处理三个复孔,给药刺激结束后(24h)将细胞与PD-L1荧光抗体(BioLegend,393606)在4度冰箱中孵育30min;最后用PBS清洗细胞,重悬细胞后在流式细胞仪上检测荧光并分析,结果如图4所示:H358细胞经冬凌草甲素(Oridonin)处理后,细胞内PD-L1含量降低,同时冬凌草甲素可逆转γ干扰素引起的PD-L1表达升高。
(2)Western Blot检测铁死亡相关蛋白TRAF6、C-Myc、PD-L1的表达:将H358细胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的1640培养基中,并于5%CO2的37℃培养箱中培养,将H358细胞以1×105/mL的密度接种于12孔板中,每孔体积为1mL,分别进行如下处理:空白对照组(Control)、设置冬凌草甲素(Oridonin)以2.5、5、10μM三个浓度梯度,刺激24小时,24h后用预冷的PBS洗涤细胞两次,随后用RIPA裂解液裂解,收集细胞蛋白。将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,置于转膜仪转膜。转膜后分别孵育一抗TRAF6(abcam,ab40675)、C-Myc(CST,18583)、PD-L1(ABclonal,A1645)、GAPDH(Sangon Biotech,D110016),4℃孵育过夜;第二天洗膜后加入稀释(1:4000)的二抗(Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody,CST,7074S),室温孵育1h;二抗孵育完成后,显影仪显影,结果如图5所示:H358细胞经冬凌草甲素(Oridonin)处理后,TRAF6、C-Myc、PD-L1表达量降低,表明冬凌草甲素(Oridonin)可以明显抑制TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路的表达。
同时,通过计算机虚拟筛选,发现冬凌草甲素(Oridonin)是一个TRAF6抑制剂,分子对接结果显示冬凌草甲素(Oridonin)可以共价靶向到TRAF6的口袋(如图6所示)。可见,冬凌草甲素可以作为TRAF6抑制剂,明显抑制TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路的表达。
(3)流式细胞术检测细胞内活性氧、脂质活性氧及线粒体活性氧
荧光探针DCFH-DA(碧云天,上海)检测细胞内活性氧的形成:将H358细胞以1×105/mL的密度接种于12孔板中,每孔体积为1mL,并于5%CO2的37℃培养箱中培养过夜,第二天分别进行如下处理:空白对照组(Control)、冬凌草甲素(Oridonin)以2.5、5、10μM三个浓度梯度,每种处理三个复孔,共刺激24小时,24小时后将细胞与终浓度为10μM的DCFH-DA在37℃、5%CO2培养箱中孵育30min;最后用PBS清洗细胞,重悬细胞后在流式细胞仪上检测荧光并分析,结果如图7所示:在冬凌草甲素(Oridonin)刺激下,H358细胞内活性氧含量随着冬凌草甲素(Oridonin)浓度的增加而增加。
荧光探针C11-BODIPY 581/591(爱博泰克,武汉)检测细胞内脂质活性氧的形成:将H358细胞以1×105/mL的密度接种于12孔板中,每孔体积为1mL,并于5%CO2的37℃培养箱中培养过夜,第二天分别进行如下处理:空白对照组(Control)、冬凌草甲素(Oridonin)以2.5、5、10μM三个浓度梯度,每种处理三个复孔,共刺激24小时,24小时后将细胞与终浓度为10μM的C11-BODIPY 581/591于37℃、5%CO2培养箱中孵育1小时。孵育结束后,用PBS清洗细胞两次以去除多余的染料;然后用胰蛋白酶消化细胞,并将细胞重悬于含5%的PBS中,最后通过流式细胞术检测荧光并分析,结果如图8所示:在冬凌草甲素(Oridonin)刺激下,H358细胞内脂质活性氧随着冬凌草甲素(Oridonin)浓度的增加而增加。
荧光探针MitoROSTM 580(AAT Bioquest)检测细胞内线粒体活性氧的形成:将H358细胞以1×105/mL的密度接种于12孔板中,每孔体积为1mL,并于5%CO2的37℃培养箱中培养过夜,第二天分别进行如下处理:空白对照组(Control)、冬凌草甲素(Oridonin)以2.5、5、10μM三个浓度梯度,每种处理三个复孔,共刺激24小时,24小时后将细胞与终浓度为10μM的MitoROSTM于37℃、5%CO2培养箱中孵育1小时。孵育结束后,用PBS清洗细胞两次以去除多余的染料;然后用胰蛋白酶消化细胞,并将细胞重悬于含5%的PBS中,最后通过流式细胞术检测荧光并分析,结果如图9所示:在冬凌草甲素(Oridonin)刺激下,H358细胞内线粒体活性氧随着冬凌草甲素(Oridonin)浓度的增加而增加。
活性氧堆积是诱发铁死亡的重要标志,表明冬凌草甲素(Oridonin)可有效诱导非小细胞肺癌H358细胞内活性氧、脂质活性氧及线粒体活性氧增加,诱导铁死亡发生。
(4)铁浓度的测定:在6孔板中接种1x105个/孔H358细胞,37℃、5%CO2培养箱中培养24小时;设置三个实验组,其中第一组为空白对照组(Control),第二组加入冬凌草甲素Oridonin(10μM),第三组加入铁死亡诱导剂Erastin(10μM),并继续培养24h;24h后,弃去培养基上清,用无血清培养基洗涤细胞3次,随后每孔加入1mL配制好的含有1μM FerroOrange探针的培养基在37℃培养箱中孵育30min,30min后使用共聚焦荧光显微镜拍照,结果如图10所示:加入冬凌草甲素(Oridonin)后H358细胞中铁离子荧光强度明显比空白对照组(Control)强,表明冬凌草甲素(Oridonin)可以诱导H358细胞中铁离子含量增加;同时,加入冬凌草甲素(Oridonin)后H358细胞中铁离子荧光强度比加入Erastin后强,表明冬凌草甲素诱导铁离子含量增加的效果优于Erastin。
(5)Western Blot检测铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11和FTH1的表达:将H358细胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的1640培养基中,并于5%CO2的37℃培养箱中培养,将H358细胞以1×105/mL的密度接种于12孔板中,每孔体积为1mL,分别进行如下处理:空白对照组(Control)、设置冬凌草甲素(Oridonin)以2.5、5、10μM三个浓度梯度,刺激24小时,24h后用预冷的PBS洗涤细胞两次,随后用RIPA裂解液裂解,收集细胞蛋白。将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,置于转膜仪转膜。转膜后分别孵育一抗GPX4(CST,52455)、SLC7A11(ABclonal,A13685)、FTH1(CST,4393)、GAPDH(Sangon Biotech,D110016),4℃孵育过夜;第二天洗膜后加入稀释(1:4000)的二抗(Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody,CST,7074S),室温孵育1h;二抗孵育完成后,显影仪显影,结果如图11所示:冬凌草甲素(Oridonin)处理后的H358细胞中铁死亡标志性蛋白GPX4、FTH1表达下调。
(6)透射电镜观察线粒体形态变化:在6孔板中接种H358细胞2×105个/孔,37℃、5%CO2培养箱中培养24小时;设置两个实验组,其中第一组为空白对照组(Control),第二组加入冬凌草甲素Oridonin(10μM),继续培养24h;24h后弃去培养液,加入PBS清洗1次,随后用胰蛋白酶消化30秒,并快速加入血清中止消化作用,而后带液体一起转入1.5mL圆底的EP管中低速离心,1000转/分钟,离心5分钟,离心后去除上清,沿壁缓慢加入电镜固定液,每管1mL。4℃下固定过夜送检,检测结果如图12所示:用冬凌草甲素(Oridonin)处理后的H358细胞中线粒体比对照组线粒体有明显的变化,冬凌草甲素(Oridonin)处理的细胞质内线粒体发生浓缩,内膜嵴变少甚至消失,外膜密度增加。
综上所述,冬凌草甲素可以作为TRAF6抑制剂,明显抑制TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路的表达,有效诱导非小细胞肺癌H358细胞内活性氧、脂质活性氧及线粒体活性氧增加,铁离子含量增加,铁死亡标志性蛋白GPX4、FTH1表达下调,使内线粒体发生浓缩,内膜嵴变少甚至消失,外膜密度增加,诱导铁死亡发生;即冬凌草甲素Oridonin可以作为TRAF6抑制剂诱导铁死亡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)
广东湛江海洋医药研究院
<120> TRAF6抑制剂在作为和/或制备铁死亡诱导剂中的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggattctac actggcaaa 19
Claims (4)
1.TRAF6抑制剂在制备体外实验用铁死亡诱导剂中的应用,所述抑制剂为靶向TRAF6的siRNA。
2.TRAF6抑制剂在制备体外实验用铁积累诱导剂中的应用,所述抑制剂为靶向TRAF6的siRNA。
3.TRAF6抑制剂在(f1)~(f3)中任一种中的应用;
(f1)制备体外实验用GPX4抑制剂;
(f2)制备体外实验用SLC7A11抑制剂;
(f3)制备体外实验用FTH1抑制剂;
所述抑制剂为靶向TRAF6的siRNA。
4.冬凌草甲素或其药学上可接受的盐在(h1)~(h2)中任一种中的应用;
(h1)制备体外实验用TRAF6抑制剂;
(h2)制备体外实验用TRAF6/PD-L1/c-Myc信号通路抑制剂。
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