CN115093356B - 一种铁死亡诱导剂的制备方法与应用 - Google Patents

一种铁死亡诱导剂的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物应用技术领域，公开了一种铁死亡诱导剂的制备方法与应用，具体公开了一种灵菌红素的制备方法，包括以下步骤：将式5所示的化合物与式11所示的化合物反应制得灵菌红素。本发明提供的灵菌红素制备方法不需要选用复杂的催化体系，制备步骤简单，降低了灵菌红素的制备成本。

Description

一种铁死亡诱导剂的制备方法与应用
技术领域
本发明属药物应用技术领域，具体涉及一种铁死亡诱导剂的制备方法与应用。
背景技术
铁死亡一种区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式。铁死亡的主要机制是，在二价铁或酯氧合酶(LOX)的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡；此外，还表现为抗氧化体系(谷胱甘肽系统)的调控核心酶GPX4的降低，铁死亡在癌症治疗中扮演着重要角色，已经证实有越来越多的化合物和治疗剂通过铁死亡来治疗肿瘤。
灵菌红素(Prodigiosin，分子式：C20H25N3O，CAS：82-89-3)是一种红色物质，可由粘质沙雷氏菌等细菌合成，具有抗癌、抗微生物、抗疟疾、抗霉和免疫抑制等多种生物活性作用。其中在抗癌方面具有很大的优势，因为其具有癌组织的高针对性和对正常细胞则表现的低毒害作用，是一种非常有潜力的抗癌物质。有文献报道灵菌红素在乳腺癌、肺癌、口咽癌等癌症中具有抗癌活性(Nisha, Kewal Kumar，Vipan Kumar；RSC Adv,2015,5,10899～10920)，但尚未有文献报道灵菌红素在铁死亡诱导中的应用。
相关技术中同样还公开了灵菌红素的合成方法，但合成过程中选用的催化体系复杂，因此，需要开发一种灵菌红素的制备方法。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种灵菌红素的制备方法。
本发明第二方面的目的，在于提供灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备铁死亡诱导剂中的应用。
本发明第三方面的目的，在于提供灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备细胞抑制剂中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备活性氧诱导剂中的应用。
本发明第五方面的目的，在于提供灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备铁积累诱导剂中的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备SLC7A11-GSH-GPX4信号通路抑制剂中的应用。
本发明第七方面的目的，在于提供一种铁死亡诱导剂。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种灵菌红素的制备方法，包括以下步骤：将式 5所示的化合物与式11所示的化合物反应制得灵菌红素；
优选地，所述式5所示的化合物与所述式11所示的化合物的摩尔比为 (2～4):1；进一步为(2～3):1；更进一步为2:1。
优选地，所述式5所示的化合物与式11所示的化合物反应过程中加入盐酸催化反应。
优选地，所述反应完全后对反应液进行旋干，并用色谱柱分离、洗脱。
优选地，所述式11所示的化合物由式10所示的化合物在碱性条件下反应制得，
进一步优选地，所述式11所示的化合物由式10所示的化合物在THF、MeOH 条件下与氢氧化锂反应制得。
进一步优选地，所述反应的条件为室温反应20～40min。
优选地，所述式10的化合物由式8所示的化合物和式9所示的化合物反应制得，
进一步优选地，所述式10所示的化合物由式8所示的化合物和式9所示的化合物的摩尔比为(1～3):1；更进一步为1.5:1。
进一步优选地，所述反应的条件为90～100℃反应1～2h。
进一步优选地，所述反应的原料还包括四三苯基膦钯、碳酸钠、二氧六环和二氧六环。
优选地，所述式8所示的化合物由式6所示的化合物和式7所示的化合物反应制得，
进一步优选地，所示式6所示的化合物和式7所示的化合物的摩尔比为 (2～3):1；更进一步为3:1。
优选地，所述式5所示的化合物由式4所示的化合物在碱性条件下，150～170℃反应1～2h制得，
优选地，所述式4所示的化合物由式3所示的化合物与硼氢化钠反应制得，
进一步优选地，所述式3所示的化合物与硼氢化钠的摩尔比为1:(7～8)更进一步有1:8。
优选地，所述式3所示的化合物由式1所示的化合物与式2所示的化合物反应制得，
进一步优选地，所述式1所示的化合物与式2所示的化合物的摩尔比为1: (1～3)；更进一步为1:1.2。
本发明第二方面，提供灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备铁死亡诱导剂中的应用。
灵菌红素或其药学上可接受的盐在诱导铁死亡中的应用。
优选地，菌红素或其药学上可接受的盐在体外非治疗目的地诱导铁死亡中的应用。
优选地，所述诱导铁死亡为诱导细胞铁死亡。
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地，所述菌红素或其药学上可接受的盐的浓度为2～50μM；进一步为5～40μM；更进一步为15～40μM。
优选地，所述药学上可接受的盐包括与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属和碱性氨基酸形成的盐；无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的至少一种；所述有机酸包括马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、己二酸、棕榈酸和单宁酸中的至少一种；所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种；所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种；所述碱性氨基酸包括赖氨酸。
本发明第三方面，提供灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备细胞抑制剂中的应用。
灵菌红素或其药学上可接受的盐在抑制细胞增殖和/或抑制细胞活性中的应用。
优选地，菌红素或其药学上可接受的盐在体外非治疗目的地抑制细胞增殖和 /或抑制细胞活性中的应用。
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地，所述菌红素或其药学要可接受的盐的浓度为2～50μM；进一步为 5～40μM；更进一步为15～40μM。
优选地，所述药学上可接受的盐包括与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属和碱性氨基酸形成的盐；无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的至少一种；所述有机酸包括马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、己二酸、棕榈酸和单宁酸中的至少一种；所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种；所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种；所述碱性氨基酸包括赖氨酸。
本发明第四方面，提供灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备活性氧诱导剂中的应用。
优选地，所述活性氧为细胞内活性氧。
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地，所述活性氧诱导剂为促进活性氧的产生及累积的诱导剂。
优选地，所述细胞内活性氧包括脂质活性氧和线粒体活性氧中的至少一种；进一步为脂质活性氧。
灵菌红素或其药学上可接受的盐在诱导活性氧增加中的应用。
优选地，灵菌红素或其药学上可接受的盐在体外非治疗目的地诱导活性氧增加中的应用。
优选地，所述菌红素或其药学上可接受的盐的浓度为2～50μM；进一步为 5～40μM；更进一步为15～40μM。
优选地，所述药学上可接受的盐包括与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属和碱性氨基酸形成的盐；无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的至少一种；所述有机酸包括马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、己二酸、棕榈酸和单宁酸中的至少一种；所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种；所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种；所述碱性氨基酸包括赖氨酸。
本发明第五方面的目的，在于提供灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备铁积累诱导剂中的应用。
灵菌红素或其药学上可接受的盐在诱导诱导铁积累中的应用。
优选地，灵菌红素或其药学上可接受的盐在体外非治疗目的地诱导铁积累中的应用。
优选地，所述铁积累诱导剂为亚铁离子蓄积诱导剂。
优选地，所述铁积累诱导剂用于诱导细胞内亚铁离子浓度的增加。
优选地，所述诱导铁积累为诱导细胞内亚铁离子浓度的增加。
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地，所述菌红素或其药学要可接受的盐的浓度为2～50μM；进一步为 5～40μM；更进一步为15～40μM。
优选地，所述药学上可接受的盐包括与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属和碱性氨基酸形成的盐；无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的至少一种；所述有机酸包括马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、己二酸、棕榈酸和单宁酸中的至少一种；所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种；所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种；所述碱性氨基酸包括赖氨酸。
本发明第六方面，提供灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备 SLC7A11-GSH-GPX4信号通路抑制剂中的应用。
灵菌红素或其药学上可接受的盐在抑制SLC7A11-GSH-GPX4信号通路中的应用。
优选地，灵菌红素或其药学上可接受的盐在体外非治疗目的地抑制 SLC7A11-GSH-GPX4信号通路中的应用。
优选地，所述抑制SLC7A11-GSH-GPX4信号通路为抑制细胞内 SLC7A11-GSH-GPX4信号通路。
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
优选地，所述灵菌红素或其药学上可接受的盐抑制SLC7A11和GPX4的表达。
优选地，所述灵菌红素或其药学上可接受的盐抑制SLC7A11和GPX4的蛋白表达和/或基因表达。
优选地，所述灵菌红素或其药学上可接受的盐的浓度为2～50μM；进一步为 5～40μM；更进一步为15～40μM。
优选地，所述药学上可接受的盐包括与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属和碱性氨基酸形成的盐；无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的至少一种；所述有机酸包括马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、己二酸、棕榈酸和单宁酸中的至少一种；所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种；所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种；所述碱性氨基酸包括赖氨酸。
本发明第七方面，提供一种铁死亡诱导剂，所述铁死亡诱导剂的唯一活性物质为灵菌红素或其药学上可接受的盐。
本发明的有益效果是：
本发明提供的灵菌红素制备方法不需要选用复杂的催化体系，制备步骤简单，降低了灵菌红素的制备成本。
本发明首次公开了灵菌红素在制备死亡诱导剂中的应用，这是基于发明人发现灵菌红素可以诱导铁积累，诱导细胞内脂质活性氧的堆积；同时，抑制 SLC7A11、GPX4的表达，进而抑制SLC7A11-GSH-GPX4信号通路。而铁积累是铁死亡发生的必要条件，铁离子主要通过催化脂质过氧化过程参与铁死亡的发生；脂质活性氧堆积是诱发铁死亡的重要标志；铁死亡的经典信号通路为 SLC7A11-GSH-GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶GPX4是这种细胞死亡形式的关键调节因子，其中Xc-系统中的SLC7A11是调控GPX4活性的关键蛋白，Xc-系统的抑制决定了GSH水平的下降和铁死亡的开始；因此，灵菌红素可以作为铁死亡诱导剂，并用于预防和/或治疗肿瘤，为制备一种新型铁死亡诱导剂提供了新思路。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的化合物3的核磁共振氢谱图。
图2为本发明实施例1制得的化合物3的核磁共振碳谱图。
图3为本发明实施例1制得的化合物4的核磁共振氢谱图。
图4为本发明实施例1制得的化合物5的核磁共振氢谱图。
图5为本发明实施例1制得的化合物5的核磁共振碳谱图。
图6为本发明实施例1制得的化合物8的核磁共振氢谱图。
图7为本发明实施例1制得的化合物8的核磁共振碳谱图。
图8为本发明实施例1制得的灵菌红素的核磁共振氢谱图。
图9为本发明实施例1制得的灵菌红素的核磁共振氢谱图放大图。
图10为灵菌红素对A549细胞毒性的影响图。
图11为灵菌红素诱导的A549细胞死亡结果图。
图12为蛋白免疫印迹结果图。
图13为灵菌红素对A549细胞脂质活性氧水平的影响图，其中左图为不同浓度的灵菌红素对A549细胞脂质活性氧水平的影响流式细胞图，右图为不同浓度灵菌红素对A549细胞脂质活性氧水平的影响的统计结果图；图中***表示p<0.001。
图14为灵菌红素对A549细胞中铁离子浓度的影响图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1
本实施例为灵菌红素的制备方法，包括以下步骤：
将三氯化铝(4.2g，2.0eq)溶于30mL 1,2-二氯乙烷(DCE)中，加入化合物2(3.3g,1.2eq)，搅拌15min，溶液颜色由绿变棕。然后将化合物1(2.0g， 1.0eq)溶于10mL DCE，缓慢加入体系，放热明显，继续反应1h，TLC监测个化合物耗尽；将反应液倒入冰中，用二氯甲烷(DCM)萃取，旋干后得到2.8g 白色固体(化合物3)。
化合物3的核磁共振氢谱图见图1，核磁共振碳谱图见图2。
核磁数据：1H NMR(400MHz，Chloroform-d)δ9.77(s,1H)，7.22(d,J＝2.5Hz, 1H)，4.34(q,J＝7.1Hz,2H),2.76(t,J＝7.5Hz,2H),2.59(s,3H),1.67(p,J＝7.5Hz, 2H),1.38(q,J＝6.8Hz,5H),0.93(t,J＝7.3Hz,3H)。
13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ197.7,161.3,139.6,122.3,120.4,116.8,60.9,40.1,26.8,22.7,14.5,14.2,14.1。
将化合物3(1.5g，1.0eq)溶于40mL异丙醇(IPA)中，加入硼氢化钠(1.5g， 8.0eq)，回流过夜，TLC监测各化合物耗尽；将反应液用冰水淬灭，用1N盐酸调酸性，DCM萃取，旋干后柱色谱分离产物，用石油醚(PE):乙酸乙酯(EA) ＝15:1洗脱，得到1.2g白色固体(化合物4)。
化合物4的核磁共振氢谱图见图3。
核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.13(s,1H),6.70(d,J＝2.6Hz, 1H),5.17(p,J＝6.2Hz,1H),2.35(t,J＝7.6Hz,2H),2.22(s,3H),1.52(p,J＝7.5Hz,2H),1.32(d,J＝6.2Hz,10H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H)。
将化合物4(1.1g，1.0eq)溶于10mL乙二醇中，加入NaOH(322mg，10.0eq)， 160℃反应1h，TLC监测各化合物耗尽；将反应液冷却至室温，水洗，EA萃取，旋干后柱色谱分离产物，用PE:EA＝20:1洗脱，得到0.35g紫色油状(化合物5)。
化合物5的核磁共振氢谱图见图4，核磁共振碳谱图见图5。
核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.71(s,1H),6.60(t,J＝2.7Hz, 1H),6.02(t,J＝2.8Hz,1H),2.42–2.36(m,2H),2.19(s,3H),1.54(t,J＝7.6Hz,2H),1.34(h,J＝3.7Hz,4H),0.92–0.88(m,3H)。
13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ123.3,119.9,114.9,109.0,31.9,31.2,26.0,22.8,14.3,11.1。
冰浴下，将化合物6(3.0mL，3.0eq)溶于10mL氯仿中，将三溴氧磷(6.3g， 2.5eq)溶于20mL氯仿中缓慢加入体系，保持温度搅拌1h；慢慢出现棕色固体，然后将化合物7(1.0mL，1.0eq)溶于10mL氯仿中慢慢滴入体系，升温至60℃反应过夜；TLC监测各化合物耗尽；将反应液冷却至室温，用2N氢氧化钠调 pH至碱性，水洗，DCM萃取，旋干后柱色谱分离产物，用PE:EA＝8:1洗脱，得到2.0g黄色油状(化合物8)。
化合物8的核磁共振氢谱图见图6，核磁共振碳谱图见图7。
核磁数据：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.99(s,1H),5.58(s,1H),4.10(q,J＝7.1 Hz,2H),3.75(s,3H),3.38(q,J＝7.2Hz,2H),1.28(td,J＝7.2,4.8Hz,6H)。
13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ165.8,138.7,133.6,120.8,96.5,58.0, 51.2,44.6,14.7,12.5。
将化合物9(316mg，1.5eq)、四三苯基膦钯(57mg，0.05eq)、碳酸钠(210 mg，2.0eq)溶于8mL二氧六环和1mL水中，氩气置换三次；将化合物8(258mg， 1.0eq)，溶于2mL二氧六环中加入体系，升温至100℃反应2h；TLC监测各化合物耗尽；将反应液冷却至室温，用2N HCl调PH至中性，水洗，EA萃取，旋干后得到粗品(化合物10)。
将化合物10(890mg)溶于5mL四氢呋喃(THF)和5mL MeOH中，加入氢氧化锂(446mg，10.0eq)，室温反应30min；TLC监测各化合物耗尽；将反应液旋干，加水析出棕色固体，过滤后用丙酮打浆，再过滤得到76mg棕黄色物质 (化合物11)。
将化合物5(86mg，2.0eq)、化合物11(54mg，1.0eq)溶于20mL甲醇中，滴入3N盐酸3～4滴催化反应，溶液变红，反应过夜；TLC监测各化合物耗尽；将反应液旋干，柱色谱分离产物，用PE:EA＝2:1洗脱，得到101mg红色固体(化合物12，即灵菌红素)。
化合物12(灵菌红素)的核磁共振氢谱图见图8和图9。
核磁数据：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.80(s,1H),6.66(d,J＝3.7Hz,2H),6.33 (s,1H),6.14(t,J＝3.1Hz,1H),6.06(s,1H),3.96(s,3H),2.21(t,J＝7.8Hz,2H), 1.77(s,3H),1.43(dd,J＝9.2,5.6Hz,2H),1.27(dd,J＝6.6,2.6Hz,4H),0.86(t,J＝ 6.8Hz,3H)。
实施例2灵菌红素对A549细胞的毒性实验
本实施例通过CCK-8方法，检测了灵菌红素对非小细胞肺癌细胞系A549细胞在24h内的细胞增殖抑制作用。
将A549细胞用1640培养基(含10v/v％胎牛血清和1w/v％青霉素/链霉素) 于5％CO2、37℃条件下的培养箱中培养；将生长良好的A549细胞以5000个细胞每孔接种于96孔板培养24h；用灵菌红素(终浓度分别为0μM、0.625μM、 1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM)处理A549细胞24h，每个浓度 3个复孔，使用CCK-8试剂盒(Beyotime，货号：C0037)检测96孔板中的A549 细胞的活性，并利用GraphPad prism软件(8.0.1版)非线性回归分析计算得出灵菌红素作用于A549细胞的IC50。
结果如图10所示，A549细胞的活性随着灵菌红素浓度增加而逐渐下降，呈现剂量性依赖，灵菌红素作用于A549细胞的IC50值为15.97μM。
实施例3灵菌红素对A549细胞的增殖的影响
为了探究灵菌红素是以何种方式导致A549细胞死亡，本实施例进行了细胞死亡分析。
将生长良好的A549细胞接种于12孔板中，每孔10×104个，于5％CO2、37℃恒温箱中培养24h；将细胞分为对照组(不做任何处理，正常培养)、灵菌红素处理组(仅添加终浓度为20μM的灵菌红素37℃孵育24h)、坏死性凋亡抑制剂 Nec-1与灵菌红素共同处理组(用终浓度为10μM的Nec-1处理细胞1h后再添加终浓度为20μM的灵菌红素37℃孵育24h)、凋亡抑制剂Z-VAD与灵菌红素共同处理组(用终浓度为10μM的Z-VAD处理细胞1h后再添加终浓度为20μM的灵菌红素37℃孵育24h)、自噬抑制剂Wort与灵菌红素共同处理组(用终浓度为5μM 的Wort处理细胞1h后再添加终浓度为20μM的灵菌红素37℃孵育24h)、铁死亡抑制剂DFO与灵菌红素共同处理组(用终浓度为10μM的DFO处理细胞1h 后再添加终浓度为20μM的灵菌红素37℃孵育24h)、铁死亡抑制剂Lip与灵菌红素共同处理组(用终浓度为1μM的Lip处理细胞1h后再添加终浓度为20μM 的灵菌红素37℃孵育24h)、铁死亡抑制剂Fer-1与灵菌红素共同处理组(用终浓度为5μM的Fer-1处理细胞1h后再添加终浓度为20μM的灵菌红素37℃孵育24h)，每个处理3个复孔，将12孔板置于电子显微镜下观察各处理组细胞的状态。
通过电子显微镜(20×)可以观察到，与对照组相比，20μM的灵菌红素导致 A549细胞死亡，而铁死亡抑制剂Lip、Fer-1能挽救灵菌红素诱导的细胞死亡(图 11)，表明灵菌红素通过铁死亡的细胞死亡方式抑制A549细胞的增殖。
实施例4灵菌红素诱导A549细胞发生铁死亡
将生长良好的A549细胞，按细胞数10×104个/孔的密度接种于12孔板中，置于恒温培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h。将A549细胞分为对照组(不做任何处理，正常培养)和灵菌红素处理组(灵菌红素的终浓度分别为5μM、10μM 和20μM)，继续培养24h；收集各组A549细胞，用胰酶消化；以每10个细胞加5μL细胞裂解液(按照RIPA裂解液(Solarbio，货号：R0020)说明书制备含有PMSF的细胞裂解液)，于冰上裂解10min；随后在4℃环境下12000rpm离心 10min，取出上清，得到各处理组的细胞的蛋白质；利用BCA蛋白质检测试剂盒(SangonBiotech，货号：20201ES76)测定各组所得到的蛋白质的含量；随后用12％的SDS-PAGE对各组蛋白质进行分离，并凝胶上的蛋白样品转印到硝酸纤维素膜上；将转印好的硝酸纤维素膜浸入5％的牛血清白蛋白(BSA)中室温封闭1h；然后将硝酸纤维素膜浸入一抗(GPX4、SLC7A11或GAPDH，均购买自Cell Signaling Technology)工作液(用5％BSA溶液1:1000配制)中，4℃下孵育过夜；取出硝酸纤维素膜，用TBST清洗膜三次后，在室温下将硝酸纤维素膜浸入辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody， CellSignaling Technology，货号为7074S)工作液(使用TBST稀释，稀释比例为1:4000)，孵育1h；取出硝酸纤维素膜，用TBST清洗三次；用BeyoECL Moon(Beyotime Biotechnology，货号为：P0018FS)进行显色。
铁死亡的经典信号通路为SLC7A11-GSH-GPX4，为了进一步探究灵菌红素诱导A549细胞发生铁死亡的分子机制，本实施例检测了SLC7A11-GSH-GPX4 通路相关蛋白的表达情况。蛋白印迹法结果显示，不同梯度浓度的灵菌红素(0μM、 5μM、10μM、20μM)作用于A549细胞24h后，SLC7A11、GPX4的蛋白表达随着灵菌红素浓度的增加而存在明显下调(图12)，表明灵菌红素可通过SLC7A11-GSH-GPX4途径诱导A549细胞发生铁死亡。
实施例5灵菌红素对A549细胞脂质过氧化水平的影响
将A549细胞接种于12孔板中，每孔10×104个，于37℃恒温箱中培养24h；用灵菌红素(终浓度分别为0μM、5μM、10μM、20μM)处理A549细胞24h后，加入脂质过氧化荧光探针C11-BODIPY 581/591(10μM，Abclonal，货号： RM02821)，置于37℃、5％CO2条件下培养1h；培养结束后，用PBS洗涤细胞两次，并用胰蛋白酶消化细胞；然后用含5％FBS的PBS悬浮细胞进行复苏；用流式细胞仪进行流式细胞分析，使用Graph pad prism软件(8.0.1版)对脂质过氧化水平进行数据处理。
结果显示如图13所示，A549细胞脂质活性氧(ROS)水平随着灵菌红素浓度增高而升高，表明灵菌红素导致A549细胞发生脂质过氧化蓄积，进而诱导 A549细胞发生铁死亡。
实施例6灵菌红素对A549细胞内亚铁离子水平的影响
将A549细胞接种于12孔板中，每孔10×104个，于37℃恒温箱中培养24h，分别用灵菌红素(终浓度为0μM、5μM、10μM、20μM)处理A549细胞24h后；随后加入亚铁离子探针FerroOrange(Dojindo，China)(终浓度为1μM)，在37℃、 5％CO2条件下培养30min；使用超转盘共聚焦显微镜观察结果。
结果显示，A549细胞活性亚铁离子探针的荧光强度随着灵菌红素浓度增高而逐渐增强(图14)，表明灵菌红素导致A549细胞亚铁离子水平升高，即灵菌红素诱导A549细胞中亚铁离子增加。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (2)

1.灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备铁死亡诱导剂中的应用。
2.灵菌红素或其药学上可接受的盐在制备铁积累诱导剂中的应用。
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