CN113018297A - 铁死亡诱导剂rsl3的应用及治疗肝癌药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种铁死亡诱导剂RSL3在治疗索拉非尼耐药肝癌中的应用，属于细胞生物学和医学技术领域。具体通过加入不同浓度的RSL3于HepG2和HepG2耐药细胞中，利用Cell Counting Kit‑8法检测细胞活力，我们发现与HepG2细胞相比，HepG2耐药细胞相对活力显著降低，RSL3可抑制肝癌耐药细胞的增殖。同时，对比HepG2与HepG2耐药细胞的脂质氧化物积累情况，加入RSL3后HepG2耐药细胞脂质氧化物显著增多，从而引发铁死亡。铁死亡诱导剂RSL3在治疗耐药肿瘤中具有良好的药用潜力。

Description

铁死亡诱导剂RSL3的应用及治疗肝癌药物
技术领域
本发明属于细胞生物学和医学技术领域，具体涉及RSL3在治疗耐药性肝癌细胞铁死亡的新方法。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率约占全球总数50％，肝癌发病早期症状不明显，多数患病者被确诊时已为中晚期，由于患病率高，多药耐药性(MDR)和肿瘤细胞转移增加，肝癌仍是全球普遍存在的医疗保健问题。2007年，索拉非尼(sorafenib)被FDA批准为肝癌不可切除和晚期的一线靶向药物，具有多激酶抑制活性从而抑制肿瘤血管生成、细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡。临床试验发现索拉非尼可延长肝癌患者生存时间和降低化疗治疗带来的身体损害，但存在耐药现象，具体的耐受机制尚不明确。因此，如何抑制肝癌细胞Sorafenib耐药的发生，提高其治疗效果，逐渐成为国内外科研工作者的研究热点。
铁死亡(Ferroptosis)是一种新定义的不依赖半胱天冬酶的调节型细胞死亡形式，不同于传统的凋亡和坏死，其特征是通过铁依赖性脂质过氧化作用产生致死性脂质过氧化物积累。最近的研究表明，促进铁死亡是逆转癌细胞耐药性的一种新型治疗方法，在癌症治疗中显示出巨大的潜力。强效的促铁死亡诱导剂RSL3是谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的抑制剂，靶向GPX4重新激活细胞中的促铁作用，参与了索拉非尼对肝癌的治疗作用，可诱导索拉非尼耐药细胞铁死亡。
发明内容
本发明涉及sorafenib耐药性肝癌细胞的新型治疗方法，实验结果表明，通过铁死亡诱导剂RSL3处理，耐药细胞活力显著降低，有效抑制肿瘤生长。
一种铁死亡诱导剂RSL3在制备治疗肝癌药物中的应用。所述的RSL3为谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)抑制剂，其化合物结构式为(a)；
Figure BDA0002308764480000021
RSL3通过直接结合或减少谷胱甘肽使得GPX4失活，诱导致死性脂质过氧化物积累来引发铁死亡，从而促进肝癌耐药性细胞凋亡和抑制肝癌耐药性细胞增殖。
一种治疗肝癌药物，包含铁死亡诱导剂RSL3。其中还添加有药物学上可接受的载体或助剂。
我们发现与HepG2细胞相比，HepG2耐药细胞相对活力显著降低，RSL3可抑制肝癌耐药细胞的增殖。同时，对比HepG2与HepG2耐药细胞的脂质氧化物积累情况，HepG2耐药细胞脂质氧化物加入RSL3后显著增多，从而引发铁死亡。铁死亡诱导剂RSL3在治疗耐药肿瘤中具有良好的药用潜力。
附图说明
图1 0.2μM RSL3处理48h HepG2和HepG2R细胞的生存能力
图2 RSL3加DMSO、Fer-1、Lip-1处理48h HepG2和HepG2R细胞的相对活力曲线。
图3 RSL3处理1-3h HepG2和HepG2R细胞BODIPYC11荧光染色图(
Figure BDA0002308764480000031
581/591C11染料为不饱和丁二烯基，蓝色代表细胞核，红色代表脂肪酸，绿色代表脂质氧化物)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1铁死亡诱导剂RSL3、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1和Liproxstatin-1及sorafenib溶液的制备。
RSL3、Ferrostatin-1(Fer-1)、Liproxstatin-1(Lip-1)与sorafenib均使用DMSO溶解，储存溶液浓度均为100mM。利用DMEM培养基将RSL3稀释至0.0020、0.0039、0.0078、0.0156、0.0313、0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000、2.0000μM；利用DMEM培养基将Fer-1和Lip-1分别稀释至0.4μM和0.5μM；利用DMEM培养基将sorafenib稀释至8μM。
实施例2 RSL3诱导索拉非尼耐药肝癌细胞铁死亡
HepG2和HepG2耐药细胞(HepG2耐药细胞的构建采用浓度梯度递增法，HepG2在含体积浓度10％FBS(胎牛血清)DMEM培养基，体积浓度5％CO2的空气、37℃的恒温箱中过夜培养，当细胞密度达到60-70％时加入sorafenib，初始sorafenib剂量为0.2μM，培养24h后dPBS清洗去除大部分死亡的细胞，更换DMEM培养液,待细胞生长稳定后增加药物剂量为0.3μM，按上述方法依次递增sorafenib剂量，历时8个月，sorafenib终止药物剂量为0.8μM，完成HepG2耐药细胞株的构建，此肝癌耐药细胞命名为HepG2R)以4×103/孔铺于含体积浓度10％FBS(胎牛血清)DMEM培养基的96孔板中，均分为36组，在体积浓度5％CO2的空气、37℃的恒温箱中过夜培养，在不同浓度铁死亡诱导剂RSL3(0.0020、0.0039、0.0078、0.0156、0.0313、0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000、2.0000μM，每组3个平行)中分别加入DMSO、Fer-1和Lip-1(它们在DMSO中的终体积含量均为0.5‰)，以仅含有DMSO的DMEM培养基为空白对照组，分别培养48h后，利用Cell Counting Kit-8法检测细胞存活能力，结果如图1所示，当加入0.2μM诱导剂RSL3培养48h后，HepG2耐药细胞与HepG2细胞相对活力显著降低，可抑制HCC耐药细胞的增殖。由图2可知，加入Fer-1(0.4μM)或Lip-1(0.5μM)处理可完全阻断HepG2耐药细胞中GPX4抑制诱导的细胞死亡，以上结果表明RSL3可作为HCC的Ferroptosis治疗新途径。
实施例3 RSL3促进索拉非尼耐药肝癌细胞的脂质过氧化物合成
将HepG2和HepG2R细胞以4×103个细胞接种在20mm培养皿中，并使用1μM RSL3处理1-3h，然后加入2μM
Figure BDA0002308764480000041
581/591C11和1μg/mL Hoechst染料孵育20min用于活细胞成像，dPBS洗涤一次，使用激光共聚焦以20×放大率对细胞成像。使用相同的仪器参数收集每个培养皿图像，以最大化比较条件之间结果的能力。结果如图3所示，与HepG2细胞相比，加入RSL3 1h后HepG2R细胞脂质过氧化物的积累明显增多，耐药细胞表现出比非耐药细胞对ferroptosis更高的敏感性，通过增加脂质氧化来触发细胞死亡。
综上所述，铁死亡诱导剂RSL3处理后，可增加索拉非尼耐药肝癌细胞的脂质过氧化物的积累，抑制耐药细胞的增值，从而达到治疗肝癌的目的。

Claims (6)

1.一种铁死亡诱导剂RSL3在制备治疗肝癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗肝癌药物为使得sorafenib耐药性肝癌细胞铁死亡的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的RSL3为谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)抑制剂，其化合物结构式为(a)；
Figure FDA0002308764470000011
。
4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于，RSL3通过直接结合或减少谷胱甘肽使得GPX4失活，诱导致死性脂质过氧化物积累来引发铁死亡，从而促进肝癌耐药性细胞凋亡和抑制肝癌耐药性细胞增殖。
5.一种治疗肝癌药物，包含铁死亡诱导剂RSL3。
6.根据权利要求5所述的治疗肝癌药物，其特征在于，其中还添加有药物学上可接受的载体或助剂。
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