CN114853788A - 一种铁死亡诱导剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种铁死亡诱导剂及其制备方法和用途,属于药物领域。所述铁死亡诱导剂具有良好生物安全性、良好的光热效应和良好的诱导肿瘤细胞铁死亡活性。所述铁死亡诱导剂在含有低剂量铁以及激光照射条件下,能诱导肿瘤细胞铁死亡,具有良好的抗肿瘤效应。
Description
技术领域
本发明属于药物领域,具体涉及一种铁死亡诱导剂及其制备方法和用途。
背景技术
作为一种不依赖于半胱天冬酶的调节细胞死亡形式,铁死亡能够触发抗癌免疫反应。然而,受限于不明确的机制,缺乏合理放大铁死亡介导的免疫疗法治疗癌症的理论指导。
自2012年首次发现铁死亡以来,各种铁死亡诱导剂,也称为RAS选择性致死(RSL)化合物(例如Erastin和RSL3),已被设计并应用于临床。这些化合物可以激活铁死亡并导致铁依赖性氧化死亡,从而抑制肿瘤生长。然而,目前的铁死亡诱导剂通常溶解度不理想,生物相容性有限,抗肿瘤活性差,在实践中需要大剂量重复给药。这可能会给正常器官带来毒副作用的潜在安全隐患。
因此,探索新的具有安全且疗效优越的铁死亡诱导剂具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供以下技术方案。
第一方面,提供一种式A所示化合物或其药学上可接受的盐。
一种式A所示化合物或其药学上可接受的盐,
其中,n为2、3、4、5、6、7、8、9或10;
R1选自氢、氟、氯、溴或碘,R2选自C5-20烷基。
在一些实施方式中,一种式A所示化合物或其药学上可接受的盐,
其中,n为2、3、4、5、6、7、8、9或10;
R1选自C5-20烷基,R2选自氢、氟、氯、溴或碘。
所述C5-20烷基可以包括选自C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18烷基、C19烷基或C20烷基。
所述C5-20烷基可以为直链烷基、支链烷基或环烷基。
式A所示化合物中的被R1和R2取代的噻吩确保了光敏剂增强的光致非辐射衰减效应和高光热转换效率,这有助于在NIR-II(近红外二区)激光诱导的温和热疗下与超低剂量的内源性铁(0.53mg/kg)催化Fenton(芬顿)反应。消除肿瘤。此外,铁死亡后的肿瘤细胞可上调ATP和ecto-CRT的表达,激活树突状细胞,促进CD8+T细胞向肿瘤内浸润,释放IFNγ,增强肿瘤细胞对铁死亡的敏感性。
在一些实施例中,所述式A所示化合物包括:式BDTCl-TQE所示化合物或式BDT-TQE所示化合物,
其中,n为2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施例中,n为3、4、5或6。
第二方面,提供一种第一方面所述式A所示化合物及其药学上可接受的盐的制备方法。
一种第一方面所述式A所示化合物及其药学上可接受的盐的制备方法,其包括:
式B所示化合物和式C化合物在催化剂存在的条件下,于溶剂i中反应,得到式A所示化合物,其中,R1选自C5-20烷基,R2选自氢、氟、氯、溴或碘。
在本发明的一些实施方式中,一种第一方面所述式A所示化合物及其药学上可接受的盐的制备方法,其包括:
式B所示化合物和式C化合物在催化剂存在的条件下,于溶剂i中反应,得到式A所示化合物,其中,R2选自C5-20烷基,R1选自氢、氟、氯、溴或碘。
所述C5-20烷基可以包括选自C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18烷基、C19烷基或C20烷基。
所述C5-20烷基可以为直链烷基、支链烷基或环烷基。
所述催化剂可以包括选自三(二亚苄基丙酮)二钯和三邻甲苯基磷。
所述溶剂i可以包括选自甲苯。
所述反应的反应温度可以为100℃-120℃。在一些实施例中,所述反应的反应温度为110℃。
第三方面,提供一种药物组合物。
一种药物组合物,其包括:铁的氧化物和第一方面所述式A所示化合物或其药学上可接受的盐。所述药物组合物可以在光照条件下,可以诱导肿瘤细胞铁死亡。
在一些实施方式中,一种药物组合物,其包括:铁的氧化物和第一方面所述式A所示化合物或其药学上可接受的盐,以及药学上可接受的辅料或载体。
所述铁的氧化物包括选自四氧化三铁。
在一些优选的实施例中,所述式A化合物为式BDTCl-TQE所示化合物,式BDTCl-TQE所示化合物含氯取代基团,有利于促进扭转分子内电荷转移(TICT)效应和光致非辐射衰减(PNRD)特性,光照射时有利于在肿瘤组织加热至43℃时加速芬顿反应,导致肿瘤细胞铁死亡并诱导免疫原性细胞死亡(ICD),从而增强CD8+T细胞的浸润,同时,这些特征性生物应答过程可以进一步增强肿瘤细胞对铁死亡的敏感性,从而形成有效的铁死亡介导的免疫治疗的正反馈回路。
第四方面,提供一种纳米颗粒。
一种纳米颗粒,其包括:铁的氧化物和权利要求1-2任一项所述式A所示化合物或其药学上可接受的盐,任选地,以及药学上可接受的载体。
在一些优选的实施例中,所述式A化合物为式BDTCl-TQE所示化合物,式BDTCl-TQE所示化合物含氯取代基团,有利于促进扭转分子内电荷转移(TICT)效应和光致非辐射衰减(PNRD)特性,光照射时有利于在肿瘤组织加热至43℃时加速芬顿反应,导致肿瘤细胞铁死亡并诱导免疫原性细胞死亡(ICD),从而增强CD8+细胞毒性T细胞的浸润,同时,这些特征性生物应答过程可以进一步增强肿瘤细胞对铁死亡的敏感性,从而形成有效的铁死亡介导的免疫治疗的正反馈回路,进而提高纳米颗粒的抗肿瘤效应。
所述药学上可接受的载体可以包括选自两亲聚合物,类脂质和脂质中的至少一种。
所述两亲聚合物可以包括聚乙二醇衍生物。
所述聚乙二醇衍生物可以包括选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇可以包括选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
所述铁的氧化物和所述纳米颗粒的质量比可以为1mg/g~50mg/g。在一些实施例中,所述铁的氧化物和所述纳米颗粒的质量比为1mg/g~40mg/g。在一些实施例中,所述铁的氧化物和所述纳米颗粒的质量比为1mg/g~30mg/g。在一些实施例中,所述铁的氧化物和所述纳米颗粒的质量比为1mg/g~20mg/g。在一些实施例中,所述铁的氧化物和所述纳米颗粒的质量比为1mg/g~10mg/g。在一些实施例中,所述铁的氧化物和所述纳米颗粒的质量比为5mg/g~10mg/g。在一些实施例中,所述铁的氧化物和所述纳米颗粒的质量比为7mg/g~10mg/g。
第五方面,提供一种第四方面所述纳米颗粒的制备方法。
一种第四方面所述纳米颗粒的制备方法,其包括:将铁的氧化物溶解于溶剂ii中,得到混合液1,将式A所示化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体溶解于溶剂iii中,得到混合液2,将混合液1和混合液2混合,超声,再与水混合,超声,透析,得到所述纳米颗粒。
所述溶剂ii可以包括选自氯仿。
所述溶剂iii可以包括选自四氢呋喃。
第六方面,提供一种前述化合物、药物组合物或纳米颗粒的用途。
一种第一方面所述式A化合物或其药学上可接受的盐、第三方面所述药物组合物、第四方面所述纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
有益效果
相比现有技术,本发明的某一个实施例具有以下至少一种有益效果:
(1)本发明所提供的式A所示化合物中的氯取代噻吩取代确保了增强了光敏剂的光致非辐射衰减效应和高光热转换效率,这有助于在NIR-II(近红外二区)光激发诱导的温和热疗下,与超低剂量的内源性铁(0.53mg/kg)催化Fenton(芬顿)反应。消除肿瘤。此外,铁死亡后的肿瘤细胞可上调ATP和ecto-CRT的表达,激活树突状细胞,促进CD8+T细胞向肿瘤内浸润,释放IFNγ,增强肿瘤细胞对铁死亡的敏感性。相比现有技术的其他铁死亡诱导剂,本发明所提供的式A所示化合物具有更强的抗肿瘤活性。
(2)本发明所提供的式A所示化合物、药物组合物或纳米颗粒,可以在生物安全适用范围的近红外二区激光照射条件下,诱导肿瘤细胞铁死亡。
(3)本发明所提供的式A所示化合物、药物组合物或纳米颗粒中,所述式A化合物优选为式BDTCl-TQE所示化合物,式BDTCl-TQE所示化合物含氯取代基团,有利于促进扭转分子内电荷转移(TICT)效应和光致非辐射衰减(PNRD)特性,光照射时有利于在肿瘤组织加热至43℃时加速芬顿反应,导致肿瘤细胞铁死亡并诱导免疫原性细胞死亡ICD,从而增强CD8+T细胞的浸润,同时,这些特征性生物应答过程可以进一步增强肿瘤细胞对铁死亡的敏感性,从而形成有效的铁死亡介导的免疫治疗的正反馈回路,值得注意的是,这种温和光热疗下的精准肿瘤治疗具有有效降低传统热疗中热扩散风险和过量剂量正常铁死亡策略中系统性副作用的优势。
(4)与传统的化学动力学抗肿瘤治疗中报道的高剂量铁(75mg/kg)不同,本发明所提供的式A化合物可以在超低剂量内源性铁(如0.53mg/kg)的条件下充分消融肿瘤组织而不会复发。
附图说明
图1为实施例1中式BDT-TQE所示化合物的氢谱图。
图2为实施例2中式BDTCl-TQE所示化合物的氢谱图。
图3为实施例4中BTD-TQE和BTDCl-TQE的吸收光谱图。
图4为实施例4中BTD-TQE和BTDCl-TQE的Stokes位移与取向极化率(Δf)的关系图。其中,X轴为取向极化率(Δf),Y轴为Stokes位移,BTD-TQE的曲线方程为Y=1.394X+0.931;BTDCl-TQE的曲线方程为Y=2.191X+0.450。
图5为实施例4中相对发射强度(I/I0)与四氢呋喃溶液中含水比例的关系曲线图。
图6为实施例6中有激光和无激光照射条件下不同浓度的BTDCl-TQE纳米颗粒或BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒的细胞毒性和抗肿瘤活性统计图。BT图表示加入不同浓度的BTDCl-TQE纳米颗粒进行培养的有激光和无激光照射条件下的细胞活力;BT图表示加入不同浓度的BTDCl-TQE纳米颗粒进行培养的有激光和无激光照射条件下的细胞活性。横轴表示加入纳米颗粒的浓度,纵轴为细胞活性。
图7为实施例7中不同组别的ROS表达量结果统计图。横轴为不同组别;纵轴为ROS表达的平均荧光强度。
图8为实施例7中不同组别的LPO表达量结果统计图。横轴为不同组别;纵轴为LPO表达的平均荧光强度。
图9为实施例7中不同组别的ATP表达量结果统计图。横轴为不同组别;纵轴为ATP荧光强度相对总荧光强度的百分比。
图10为实施例7中不同组别的ROS表达和LPO表达的共聚焦成像图。其中,绿色荧光为ROS表达的荧光染色,红色荧光为LPO表达荧光染色,Merge为ROS和LPO表达的共聚焦成像叠加图。
图11为实施例7中不同组别的Ecto-CRT在4T1细胞中的成像图。其中,蓝色荧光为细胞核所染DAPI的荧光,红色荧光为ecto-CRT表达的荧光染色。
图12为实施例8中不同组别的肿瘤体积大小变化图。其中,a图为不同组别从0天到27天的肿瘤体积大小变化趋势图;b图为给药后第27天分离得到的肿瘤图。
图13为实施例8中不同组别在不同处理(给药并激光照射或不照射)后24小时的肿瘤组织的代表性H&E染色显微观察图。
图14为实施例8中不同组别的LPO表达的共聚焦成像图,其中,蓝色荧光为细胞核所染DAPI的荧光,红色荧光为LPO表达荧光染色。
图15为实施例8中不同组别的ecto-CRT表达的共聚焦成像图,其中,红色荧光为ecto-CRT表达荧光染色。
图16为实施例8中不同组别的LPO表达和ecto-CRT表达结果统计图。横轴为不同组别;纵轴为LPO表达或ecto-CRT表达的平均荧光强度。
图17为实施例8中不同组别的肿瘤附近淋巴结中表达CD86+和MHC II+的DC细胞流式分选结果图。
图18为实施例8中不同组别的脾脏中表达CD8+和CD3+的T细胞六十分选结果图。
图19为实施例8中不同组别的肿瘤附近淋巴结中表达CD86+和MHC II+的DC细胞数量检测结果统计图。横轴为不同组别,纵轴为表达CD86+和MHC II+的DC细胞占细胞总数的百分比。
图20为实施例8中不同组别的脾脏中表达CD8+的T细胞数量的检测结果统计图。横轴为不同组别,纵轴为表达CD8+的T细胞占细胞总数的百分比。
图21为实施例8中不同组别的肿瘤组织中的CD8+T细胞数量统计图。横轴为不同组别,纵轴为CD8+表达的平均荧光强度。
图22为实施例8中不同组别的肿瘤组织中的CD8表达的荧光显象图。其中,蓝色荧光为细胞核所染DAPI的荧光,红色荧光为CD8表达的荧光染色。
图23为实施例8中不同组别的肿瘤组织中的CD4表达的荧光显象图。其中,蓝色荧光为细胞核所染DAPI的荧光,绿色荧光为CD4表达的荧光染色。
图24为实施例5中BTDCl-TQE纳米颗粒在连续激光照射(1064nm,1W/cm2)下超过五个激光开/关循环的温度变化趋势。
图25为实施例1中式BDT-TQE所示化合物的MALDI-TOF MS谱图。
图26为实施例1中式BDT-TQE所示化合物的GPC谱图。
图27为实施例2中式BDTCl-TQE所示化合物的MALDI-TOF MS谱图。
图28为实施例2中式BDTCl-TQE所示化合物的GPC谱图。
图29为实施例8中BT-Fe组和PBS组的组织学分析明场显微镜观测图。
图30为实施例8中BT-Fe组和PBS组的血液生化检查结果统计图。
图31为实施例8中BT-Fe组和PBS组的血液常规检查结果统计图。
上述各统计图中,*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001。
术语说明
在本发明的描述中,需要理解的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
本发明中,“药学可接受的”的意思为:在充分的医学判断范围内,适于与人和低等动物组织接触而不存在不适宜的毒性、刺激性、过敏反应及类似反应、而且具有相当的合理获益/风险比率的物质或化合物。
本发明所述术语“内源性铁”是指注射进体内的纳米颗粒中的铁与生物体的质量比。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
属于“Pd2(dba)3”表示三(二亚苄基丙酮)二钯。
本发明中,类似“式A化合物”、和“式A所示的化合物”和“化合物A”的表述,表示的是同一个含义,其他化合物的命名以此类推。
术语“with laser”表示“有激光照射”。“without laser”表示“无激光照射”。“concentration”表示浓度。
术语“Merge”表示叠加图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面进一步披露一些非限制实施例,对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
材料和仪器:所有试剂都是购买和使用的,无需进一步纯化。使用CDCl3作为溶剂和四甲基硅烷作为内标,在Bruker 400上记录1H NMR光谱。吸收和光致发光(PL)光谱分别在Shimadzu UV-2600光谱仪和Hitachi F-4600荧光光谱仪上记录。1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG 2000)购自西安瑞喜生物技术有限公司;Pluronic F-127是来自Sigma-Aldrich的商业产品。四氧化三铁(Fe3O4)购自南京东纳生物科技有限公司。胎牛血清(FBS)和RPMI 1640购自Gibco TM。磷酸盐缓冲盐水(PBS,1×)、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶-EDTA(0.5%胰蛋白酶和5.3mM EDTA四钠)购自Biological Industries(BI)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)、ATP Assay Kit、ROS AssayKit和含有triton X-100的免疫染色透化缓冲液购自Beyotime Biotechnology。用于免疫染色的CD4抗体、CD8抗体和ecto-CRT抗体、山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG购自Abcam。用于流式细胞术的CD11c抗体、CD86抗体、MHC II抗体、CD3抗体、CD8抗体和IFNγ来自BioLegend。4T1(小鼠乳腺癌)细胞购自ATCC美国典型生物资源保藏中心。Balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
“PBS”表示磷酸缓冲盐溶液;“ROS”表示活性氧;“LPO”表示脂质过氧化产物;“ecto-CRT”表示细胞膜钙网蛋白;“MHC II”表示主要组织相容性复合体;“APC”表示别藻蓝蛋白荧光染料;“PE”表示藻红蛋白荧光染料;“ATP”表示三磷酸腺苷。“mM”表示毫摩尔每升;“M”表示摩尔每升。
实施例1:式BDT-TQE所示化合物的制备
取式D所示化合物(1eq)、式C化合物(1eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0.1eq)和三邻甲苯基磷(0.4eq),溶解于甲苯(100mM)中,回流反应2天,冷却至室温,然后倒入甲醇中。过滤,沉淀用甲醇和丙酮洗涤,用氯仿萃取,萃取后的氯仿真空干燥后得到式BDT-TQE所示化合物(0.56eq,产率56%)。取所得BDT-TQE所示化合物,检测氢谱、GPC(凝胶渗透色谱)和MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱),氢谱谱图如图1所示,MALDI-TOF MS谱图如图25所示,GPC谱图如图26所示。根据MALDI-TOF MS谱图和GPC谱图可知式BDT-TQE所示化合物中n为4~7。
实施例2:式BDTCl-TQE所示化合物的制备
取式E所示化合物(1eq)、式C化合物(1eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0.1eq)和三邻甲苯基磷(0.4eq),溶解于甲苯(100mM)中,回流反应2天,冷却至室温,然后倒入甲醇中。过滤,沉淀用甲醇和丙酮洗涤,用氯仿萃取,萃取后的氯仿真空干燥后得到式BDTCl-TQE所示化合物(0.55eq,产率55%)。取所得BDTCl-TQE所示化合物,、GPC(凝胶渗透色谱)和MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱),氢谱谱图如图2所示,MALDI-TOF MS谱图如图27所示,GPC谱图如图28所示。根据MALDI-TOF MS谱图和GPC谱图可知式BDT-TQE所示化合物中n为4~7。
实施例3:纳米颗粒的制备
BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒的制备:将四氧化三铁溶解在氯仿中,得到浓度为1mg/mL的四氧化三铁氯仿混合液。BDTCl-TQE化合物(1.0mg)、DSPE-PEG2000(2mg)和F-127(20mg)溶解在THF(0.98mL)中,获得混合物1,再加入0.2mL的四氧化三铁氯仿混合液,超声分散,得到混合液2。将1mL混合液2加入超纯水(9mL)中。在使用探头超声仪以20%输出(VCX150,Sonics)超声处理2分钟后,产生BTDCl-Fe纳米颗粒,得到混合液3,混合液3再用MilliQ水进一步透析过夜以消除残留的投入的物料和溶剂,并使用Amicon Ultra-16离心过滤器浓缩BTDCl-TQE-F纳米颗粒并收集以供进一步使用。
BTD-TQE-Fe纳米颗粒的制备:按上述BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒的制备方法,将BDTCl-TQE-Fe化合物换为BDT-TQE化合物,得到BTD-TQE-Fe纳米颗粒。
BTDCl-TQE纳米颗粒的制备:将BDTCl-TQE化合物(1.0mg)、DSPE-PEG2000(2mg)和F-127(20mg)溶解在THF(0.98mL)中,获得混合物1。将1mL混合液1加入超纯水(9mL)中。在使用探头超声仪以20%输出(VCX150,Sonics)超声处理2分钟后,产生BTDCl-TQE纳米颗粒,得到混合液3,混合液3再用MilliQ水进一步透析过夜以消除残留的投入的物料和溶剂,并使用Amicon Ultra-16离心过滤器浓缩BTDCl-TQE纳米颗粒并收集以供进一步使用。检测其流体动力学直径,结果为23.9±1.0nm。
BTD-TQE纳米颗粒的制备:按上述BTDCl-TQE纳米颗粒的制备方法,将BDTCl-TQE化合物换为BDT-TQE化合物,得到BTD-TQE纳米颗粒。检测其流体动力学直径,结果为27.7±1.7nm。
实施例4:吸收光谱、消光系数、聚合物的扭曲分子内电荷转移(TICT)效应检测以及相对发射强度(I/I0)与水分数的关系
吸收光谱:取BTD-TQE和BTDCl-TQE分别溶解于三氯甲烷中,得到浓度为10μg/mL的BTD-TQE三氯甲烷溶液和浓度为10μg/mL的BTDCl-TQE三氯甲烷溶液,检测其吸收光谱,结果如图3所示,BTDCl-TQE化合物和BTD-TQE化合物的最大吸收峰分别为1035nm和1100nm。
消光系数:进一步计算(取最大吸收处的吸光值除以化合物的浓度和比色皿狭缝长度),结果表明,BTDCl-TQE和BTD-TQE在对应最大吸收处的消光系数分别为12.6L/g/cm和10.3L/g/cm,而在1064nm处的值分别为12.2L/g/cm和9.9L/g/cm。该结果表明BTDCl-TQE的氯取代可以有效地提高SP的吸收率。氯化不仅可以提高吸收系数,还可以增加电荷迁移率。
相对发射强度(I/I 0)与水分数的关系:
将BTDCl-TQE化合物和BTD-TQE化合物分别溶解在含有不同水比例(10%-100%的水)的四氢呋喃溶液中,得到BTDCl-TQE化合物或BTD-TQE化合物浓度为10μg/mL的溶液。测量发射强度,分别与不含水溶液的发射强度做比值得到相对发射强度。该结果表明BTDCl-TQE随聚集会产生明显的聚集诱导荧光淬灭,增加非辐射跃迁。
结果如图5所示。
氯化对聚合物的扭曲分子内电荷转移(TICT)效应的影响:
将BTDCl-TQE和BTD-TQE分别溶解在不同极性的溶剂(四氢呋喃,二氯甲烷,三氯甲烷,甲苯,二甲基甲酰胺)中,得到浓度为10μg/mL的溶液,随后测量吸收和发射光谱。
在增加溶剂取向极化率后,BTD-TQE和BTDCl-TQE都显示出超色吸收和发射波长。我们根据Lippert-Mataga关系绘制了BTD-TQE和BTDCl-TQE的Stokes位移与Δf值的变化:
在这个等式中,σa-σf是吸收和发射最大值之间的能量差(即斯托克斯位移),μ和μ*分别是分子在S0和S1状态下的偶极矩,a是材料所在的腔半径,h是普朗克的常数,c是光速,Δf是溶剂取向极化率。结果见图4。
结论:
结果表明BTDCl-TQE的氯取代可以有效地提高化合物对光的吸收率和电荷迁移率。
在水份逐渐增加的过程中,两个化合物观察到典型的聚集引起的荧光猝灭效应。其中,BTDCl-TQE的荧光强度降低了80%以上,因为Cl原子可以诱导暗TICT状态的形成,从而导致显着的荧光衰减。相反,BTD-TQE的荧光强度仅降低了约50%。
BTDCl-TQE的Stokes位移与Δf值的斜率比BTD-TQE的斜率大约1.6-flod(图4),这意味着BTDCl-TQE对溶剂极性变化更敏感,因为氯取代增强的TICT效应。
此外,在四氢呋喃(THF)和具有不同水份的THF/水混合物中研究了BTD-TQE和BTDCl-TQE的光学性质(图5),以阐明它们在聚集状态下的光物理性质。随着水份逐渐增加,BTD-TQE和BTDCl-TQE观察到典型的聚集引起的荧光猝灭效应。另外,BTDCl-TQE的荧光强度降低了80%以上,因为Cl原子可以诱导暗TICT状态的形成,从而导致显着的荧光衰减。而BTD-TQE的荧光强度降低了约50%。
基于上述发现,表明BTDCl–TQE中的氯取代基可以有效地提高质量吸收系数并增强TICT效应,从而有利于化合物的光热性能。
实施例5:光热效应检测
在连续激光(1064nm)下分别照射BTDCl-TQE纳米颗粒悬浮液(以BTDCl-TQE化合物重量计算,浓度为200μg/mL)、BTD-TQE纳米颗粒悬浮液(以BTD-TQE化合物重量计算,浓度为200μg/mL)和BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒悬浮液(以BTDCl-TQE化合物重量计算,浓度为200μg/mL),并通过红外热像仪记录水溶液的温度。在溶液温度达到稳定状态后停止照射。将溶液冷却至环境温度并绘制曲线。然后根据以下等式计算光热转换效率(PTCE):
t=τs×(-lne) (3)
h:传热系数;
S:容器的表面积,cm2;
TMax:最大稳态温度,℃;
TSurr:环境的周围温度,℃;
QDis:由溶剂和容器介导的激光散发的热量(14mW);
I:入射激光功率,W/cm2;
A1064:样品在1064nm处的吸光度;
m:用于溶解光热剂的去离子水的质量(0.2g);
Cp:用于溶解光热剂的去离子水的热容量(4.2J/g);
τs:系统传热的时间常数;
t:冷却过程的时间,秒;
θ:基于温度的无量纲参数;
T:冷却过程中的温度,℃。
结果:在NIR-II激光照射下1064nm(1W/cm2)10min时,BTDCl-TQE纳米颗粒混悬液温度升高至66.2℃,BTD-TQE纳米颗粒混悬液温度升高至64.0℃。因此,BTDCl-TQE纳米颗粒和BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒的光热转换效率为75%±4%;BTD-TQE纳米颗粒的光热转换效率为66%±3%。此外,BTDCl-TQE纳米颗粒在连续激光照射(1064nm,1W/cm2)下超过五个激光开/关循环表现出优异的光稳定性(见图24)。
这些结果清楚地表明BTD-TQE纳米颗粒和BTDCl-TQE纳米颗粒具有极好的光热转换能力,这有利于在相对较低的功率密度下激光照射时在局部组织中产生热量。
实施例6:体外毒性和抗肿瘤活性检测
无激光照射条件下的体外毒性:通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定法评估4T1(小鼠乳腺癌)细胞的细胞活力。4T1细胞以5,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。培养24小时后,将每孔的培养基分别更换为100μL含有以BTDCL-TQE化合物重量计的浓度为0、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的BTDCl-TQE纳米颗粒或BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒的新鲜培养基。再过24小时后,加入CCK-8溶液,37℃孵育2小时,然后用酶标仪记录每孔450nm处的吸光度。并且使用未处理的纯细胞作为对照计算相对细胞活力。
激光照射条件下的体外毒性:通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定法评估4T1(小鼠乳腺癌)细胞的细胞活力。4T1细胞以5,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。培养24小时后,将每孔的培养基分别更换为100μL含有以BTDCL-TQE化合物重量计的浓度为0、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的BTDCl-TQE纳米颗粒(BT)或BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒(BT-Fe)的新鲜培养基,培养12小时,然后用1064nm激光照射30分钟。再过12小时后,加入CCK-8溶液,37℃孵育2小时,然后用酶标仪记录每孔450nm处的吸光度。并且使用未处理的纯细胞作为对照计算相对细胞活力。
结果:无激光照射条件下的体外毒性的结果如图6中“不光照”所示,激光照射条件下的体外毒性结果如如图6中“光照”所示。结果表明,0-100μg/mL的BTDCl-TQE纳米颗粒或BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒在无激光照射条件下无明显的毒性;在有激光照射的条件下,50μg/mL和100μg/mL的BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒会诱导肿瘤细胞死亡。结果表明,BTDCl-TQE纳米颗粒或BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒在无激光照射条件下无明显的细胞毒性,在有激光照射条件下,BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒会诱导肿瘤细胞死亡,具有优异的抗肿瘤活性。
实施例7:抗肿瘤机理研究
分组:
i)PBS组:采用PBS进行培养,不进行光照照射;
ii)PBS光照照射组:采用PBS进行培养,并采用光照(1064nm,43℃,30分钟)进行照射;
iii)BTDCl-TQE纳米颗粒组(BT组):采用BTDCl-TQE纳米颗粒进行培养,不进行光照照射;
iv)BTDCl-TQE纳米颗粒照射组(BT照射组):采用BTDCl-TQE纳米颗粒进行培养,并采用光照(1064nm,43℃,30分钟)进行照射;
v)BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒组(BT-Fe组):采用BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒进行培养,不进行光照照射;
vi)BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒照射组(BT-Fe照射组):采用BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒进行培养,并采用光照(1064nm,43℃,30分钟)进行照射。
细胞内ROS和LPO的共聚焦成像:4T1细胞以40,000个细胞/室的密度接种在特殊的共聚焦室中。在37℃培养24小时后,将每孔中的培养基更换为1mL含有浓度为100μg/mL的PBS(PBS组或PBS照射组)的新鲜培养基或1mL含有以BTDCL-TQE化合物重量计的浓度为100μg/mL的BTDCl-TQE纳米颗粒(BT组或BT照射组)或BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒(BT-Fe组或BT-Fe照射组)的新鲜培养基。用新鲜培养基处理的细胞作为对照。共孵育12小时后,PBS照射组、BT照射组和BT-Fe照射组用光辐照(1064nm,43℃,30分钟),PBS组、BT组和BT-Fe组不辐照处理小室。随后,将细胞用1×PBS洗涤3次,然后分别与二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA;10mM)的ROS指示剂共培养30分钟或Bodipy TM 665/676的LPO指示剂共培养1小时。在通过共聚焦显微镜成像之前,将细胞用1×PBS洗涤3次。结果如图7、图8和图10所示。
细胞外ATP的检测:4T1细胞以5,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。培养24小时后,将每孔中的培养基更换为100μL含有PBS浓度为100μg/mL的PBS(PBS组或PBS照射组)的新鲜培养基或100μL含有以BTDCL-TQE化合物重量计的浓度为100μg/mL的BTDCl-TQE纳米颗粒(BT组或BT照射组)或BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒(BT-Fe组或BT-Fe照射组)的新鲜培养基。再培养12小时后,PBS照射组、BT照射组和BT-Fe照射组用光辐照(1064nm,43℃,30分钟),PBS组、BT组和BT-Fe组不辐照处理小室。收集培养基,按照厂家说明,用ATP Assay Kit测定细胞的ATP分泌水平。结果如图9所示。
Ecto-CRT在4T1细胞中的成像:4T1细胞在37℃的特殊共聚焦室(40,000个细胞/室)中培养。培养24小时后,将每孔中的培养基更换为1mL含有PBS浓度为100μg/mL的PBS(PBS组或PBS照射组)的新鲜培养基或1mL含有以BTDCL-TQE化合物重量计的浓度为100μg/mL的BTDCl-TQE纳米颗粒(BT组或BT照射组)或BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒(BT-Fe组或BT-Fe照射组)的新鲜培养基。用新鲜培养基处理的细胞作为对照。共孵育12小时后,PBS照射组、BT照射组和BT-Fe照射组用光辐照(1064nm,43℃,30分钟),PBS组、BT组和BT-Fe组不辐照处理小室。37℃再培养12小时后,用1×PBS洗涤细胞3次,然后用4%PFA固定10分钟。将固定的细胞与抗钙网蛋白抗体在PBS(1:200)中室温孵育2小时,然后用1×PBS洗涤3次以去除多余的抗体溶液。然后在PBS(1:200)中将细胞与Alexa Fluor 555偶联的二抗一起孵育。2小时后,洗涤细胞,并与4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)一起温育8分钟。成像前,用1×PBS洗涤细胞以去除游离DAPI。结果如图11所示。
结果:结果表明,在仅用BT-Fe或轻度热疗不足以杀死肿瘤细胞。如图10所示,第vi组(BT-Fe照射组)的细胞表现出明显的红色荧光,这代表了BT-Fe在激光照射下诱导的高水平LPO。与对照组i)组相比,vi)组的ROS和LPO指标的平均荧光强度中分别增强了约7.7倍和约6.9倍(图7和图8)。此外,我们通过分析三磷酸腺苷(ATP)和细胞膜钙网蛋白(ecto-CRT)的表达水平,研究了我们的铁死亡诱导剂在诱导免疫原性细胞死亡(ICD)方面的潜力。第vi)组的细胞外ATP浓度是其他组的约20倍(图9)。用BT-Fe辐照处理后,还可以观察到第vi)组中ecto-CRT的表达明显上调(图11),平均荧光强度比对照组高约6.5倍。因此,我们证明在第vi组铁浓度增加和光照照射引起的轻度高温的协同作用下,BTDCl-TQE-Fe促进了铁死亡过程,导致细胞内ROS和LPO增加。然后,死亡的癌细胞可以产生过量的ATP和ecto-CRT以触发ICD进行有效的抗癌治疗。
实施例8:体内抗肿瘤活性研究
分组:
i)PBS组:静脉注射PBS,不进行光照照射;
ii)PBS照射组:静脉注射PBS,并采用光照(1064nm,43℃,30分钟)进行照射;
iii)BTDCl-TQE纳米颗粒组(BT组):静脉注射200μL BTDCl-TQE浓度为1mg/mL的BTDCl-TQE纳米颗粒溶液,不进行光照照射;
iv)BTDCl-TQE纳米颗粒照射组(BT照射组):静脉注射200μL BTDCl-TQE浓度为1mg/mL的BTDCl-TQE纳米颗粒溶液,并采用光照(1064nm,43℃,30分钟)进行照射;
v)BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒组(BT-Fe组):静脉注射200μL BTDCl-TQE浓度为1mg/mL的BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒溶液(该注射量下,每kg小鼠的约注射0.53mg铁),不进行光照照射;
vi)BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒照射组(BT-Fe照射组):静脉注射200μL BTDCl-TQE浓度为1mg/mL的BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒溶液(该注射量下,每kg小鼠的约注射0.53mg铁),并采用光照(1064nm,43℃,30分钟)进行照射。
每个雌性Balb/c小鼠在左侧皮下接种2×105个4T1细胞。当肿瘤达到合适的体积时,将24只小鼠随机按上述分组分为6组进行不同的处理。分别给小鼠静脉注射200μL PBS、BTDCl-TQE纳米颗粒或BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒。12小时后,对ii、iv、vi组小鼠进行1064nm激光照射30min。不同治疗后,每2天用数显卡尺测量肿瘤,然后根据以下公式计算肿瘤体积:体积=(肿瘤长度)×(肿瘤宽度)2/2。相对肿瘤体积确定为V/V0(V0是初始体积)。此外,每2天还记录小鼠的体重,在第27天结束观察,分离小鼠肿瘤,检测各组小鼠的肿瘤的ROS、LPO(结果如图14和图16所示)和Ecto-CRT(结果如图15和图16所示)的表达。
组织学分析:对于体内毒性研究,在静脉注射后第7天收集小鼠的主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)。将组织固定在4%多聚甲醛(PFA)中,切片进行H&E染色,然后使用明场显微镜(Olympus,Japan)进行观察。结果见图29。由结果可知,BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒并无明显毒性。
血液生化和血液常规检查:第7天处死BT-Fe组的健康Balb/c小鼠采血。用相同体积的1×PBS处理的健康小鼠作为对照。测定血清生化数据(结果见图30),包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TCH)、总蛋白(TP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、尿素(Urea)和肌酐(CR),用于肝功能分析和肾功能。此外,对于血常规分析(结果见图31),小鼠的白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、中性粒细胞(Neu)、淋巴细胞(Lym)和血小板(PLT)通过自动动物五分类测量血细胞分析仪DF-52Vet(Dymind Biotechnology Co.,Ltd,China)。
评估体内免疫反应:在不同处理(给药并激光照射或不激光照射)后24小时收集小鼠肿瘤及肿瘤附近的淋巴结和脾脏,用于流式细胞术分析(BD FACSCanto SORP),检测各组小鼠的肿瘤的表达CD4+和CD8+的T细胞数量,检测肿瘤附近的淋巴结中的CD86+、MHC II+(主要组织相容性复合体)数量和脾脏中CD8+和CD3+数量。根据制造商的说明,免疫细胞在分析前用相应的抗体进行标记。并对所收集的肿瘤组织切片进行H&E染色,然后使用明场显微镜(Olympus,Japan)进行观察(结果如图13所示)。
结果:
由图12和图13可知,vi组的肿瘤体积不增长,vi组具有良好的抗肿瘤效应。
来自第vi组的组织中的平均LPO和ecto-CRT表达水平比对照组i高约12.5和约9.4倍(图14、图15和图16)。这些结果表明体内轻度热疗和内源性铁的协同作用显着增加了铁死亡。诱导免疫原性细胞死亡(ICD)效应的后续激活意味着轻度热疗增强的铁死亡策略可能触发癌症免疫治疗。在典型的ICD过程中,释放的损伤相关分子模式(DAMP),如ATP和ecto-CRT,可以刺激专业抗原呈递细胞(APC)。例如,DAMP可以促进树突状细胞(DC)的成熟,树突状细胞是APC的主要类型。然后成熟的DC将肿瘤相关抗原呈递给T细胞,以促进活化的表达CD8+的T细胞浸润到肿瘤组织中,从而释放IFNγ使肿瘤对铁死亡敏感。总之,体外结果表明,我们使用BT-Fe作为诱导剂的温和热疗增强铁死亡策略可能涉及治疗肿瘤的正反馈抗癌机制。
免疫抑制性肿瘤微环境(TME)在癌症治疗中臭名昭著,极大地限制了免疫治疗的治疗效果。我们分析了不同组中成熟DC的数量。CD86和主要组织相容性复合物II类(MHCII)被选为成熟树突状细胞的标志物。vi组的肿瘤附近淋巴结中CD86+和MHC II+的表达比对照组i组高约5.3倍(图17和图19),这可归因于轻度后肿瘤细胞上的高水平ecto-CRT热疗增强的铁死亡。随后,这些成熟的DC可以激活T细胞以产生有效的表达CD4+和CD8+的T细胞来杀死肿瘤细胞。结果,在第vi组的脾脏中检测到更多的表达CD8+的T细胞(图18和图20)。与对照组i相比,在来自组vi的肿瘤组织中可以观察到CD4+T细胞和CD8+T细胞数量增加了约7.1倍和约19.5倍(图21、图22和图23)。因此,我们在BT-Fe辅助下的策略可以有效地逆转肿瘤微环境,从而改善免疫反应。更重要的是,浸润的CD8+T细胞可以使肿瘤细胞对铁死亡敏感,从而提高杀伤效率,这表明该策略得到了具有深远抗肿瘤能力的正反馈回路机制的支持。
由组织学分析结果(图29)和血液生化和血液常规检查结果(图30和图31)可知,BTDCl-TQE-Fe纳米颗粒并无明显毒性。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明内。
Claims (10)
4.一种药物组合物,其包括:铁的氧化物和权利要求1-2任一项所述式A所示化合物或其药学上可接受的盐,任选地,以及药学上可接受的辅料或载体。
5.一种纳米颗粒,其包括:铁的氧化物和权利要求1-2任一项所述式A所示化合物或其药学上可接受的盐,任选地,以及药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的纳米颗粒,所述药学上可接受的载体包括选自两亲聚合物,类脂质和脂质中的至少一种;和/或
所述两亲聚合物包括聚乙二醇衍生物;和/或
所述聚乙二醇衍生物包括选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇;和/或
所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇包括选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
7.根据权利要求5-6任一项所述的纳米颗粒,所述铁的氧化物和所述纳米颗粒的质量比为1mg/g~50mg/g或者5mg/g-10mg/g。
8.一种权利要求5-7任一项所述纳米颗粒的制备方法,其包括:将铁的氧化物溶解于溶剂ii中,得到混合液1,将式A所示化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体溶解于溶剂iii中,得到混合液2,将混合液1和混合液2混合,超声,再与水混合,超声,透析,得到所述纳米颗粒。
9.根据权利要求8所述的制备方法,所述溶剂ii包括选自氯仿;
所述溶剂iii包括选自四氢呋喃。
10.一种权利要求1-2任一项所述式A化合物或其药学上可接受的盐、权利要求4所述药物组合物、权利要求5-7所述纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
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