CN112451675A - 一种治疗乳腺癌的增效组合药物 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及治疗肿瘤的增效药物，具体涉及一种四氧化三铁纳米粒和自噬抑制剂组成的治疗乳腺癌的增效组合药物。本发明的组合药物通过四氧化三铁纳米粒的光热转化能力对肿瘤细胞进行热杀伤，同时诱导肿瘤细胞自噬水平的上调，联用细胞自噬抑制剂，使肿瘤细胞内自噬水平维持在高度活化状态，诱导肿瘤细胞自噬性死亡，从而增强对肿瘤的杀伤作用。本发明能降低光热治疗的激光照射剂量和照射时间，减少对正常组织的潜在损害，同时能解决光热治疗不彻底产生的肿瘤复发问题。本发明在综合治疗转移性乳腺癌具有潜在的应用价值。

Description

一种治疗乳腺癌的增效组合药物

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及治疗肿瘤的增效药物，具体涉及一种四氧化三铁纳米粒和自噬抑制剂组成的治疗乳腺癌的增效组合药物。

背景技术

资料显示，近年来乳腺癌已成为女性发病率最高的恶性肿瘤，为我国女性第六位恶性肿瘤死亡原因。目前临床治疗乳腺癌的传统方法有手术切除、化学疗法、放射疗法等，但这些传统疗法均面临着一定的挑战和局限性，如手术切除的有创性和高风险性使其具有严格的适应症和适应人群；放射疗法和化学疗法缺少选择性，具有较大的副作用且面临着肿瘤细胞的耐药等问题。有研究显示，光热治疗(photothermal therapy,PTT)是利用可将一定波长的光能转换为热能的光热转化材料(photothermal transduction agents,PTAs)，在近红外激光的局部照射下，将肿瘤部位加热至有效治疗温度，以达到对肿瘤细胞的热杀伤作用，是一种新兴的肿瘤微创治疗手段，与传统的治疗方法相比，PTT副作用低，可控性与选择性高，已成为抗肿瘤领域的一大研究热点，但其中，激光穿透能力有限导致PTT往往无法有效消融位于较深处的肿瘤，继而可能引发肿瘤残留、复发等问题，成为了PTT发展和应用的一大阻碍。

2012年，四氧化三铁纳米粒(iron oxide nanoparticles，IONPs)首次被报道具有将近红外光能转化为热能的能力，自此，铁基纳米材料的光热转化能力被发掘，包括本课题组在内的多个研究组均报道了IONPs可作为高转化效率的PTAs，且与传统的PTAs相比，IONPs热稳定性高、粒径形状可控、生物相容性较好、可降解性、具有核磁显像的诊断能力、使用相对安全性等优势，业内关注其将作为一种集显像与治疗于一体的新型多功能光热材料。

研究表明，自噬是真核细胞内重要的溶酶体依赖过程，指真核细胞在应激条件下形成吞噬泡并将胞质内的某些蛋白及受损细胞器等物质逐渐包裹在其中形成完整的具有双层膜结构的自噬小体(Autophagosome)，继而与溶酶体融合形成自噬溶酶体(Autolysosome)最终一同被降解的细胞过程，在胞质内成分控制和维持细胞内环境稳态中发挥着重要的作用；而另一方面，自噬的持续或过度活化会使细胞无法维持基本结构，诱发自噬性细胞死亡。纳米材料作为外源性物质被内吞入胞后会影响细胞自噬水平，例如IONPs在胞内的氧化应激反应影响AMPK-AKT-mTOR通路并上调细胞自噬水平，进而选择性地对肺癌细胞A549产生细胞毒作用，然而，至于IONPs光热效应对肿瘤细胞自噬水平的影响尚未见有研究阐述。

基于多种疾病的发生与自噬功能紊乱有密切的关系，因此，本领域研究人员关注通过干预自噬过程进而扰乱自噬通路，将作为治疗自噬相关疾病的潜在治疗手段；尤其对于增殖异常快速的肿瘤细胞，其营养供应不足，表现出高于正常细胞的自噬水平，因此更容易受到自噬通路的调控。目前用于调控自噬过程的药物包括自噬激动剂和自噬抑制剂，其中自噬抑制剂包括自噬前端抑制剂，如阻碍自噬小体形成的选择性PI3K抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)，和自噬末端抑制剂，如通过阻碍自噬小体与溶酶体的融合而扰乱自噬过程的氯喹(chloroquine，CQ)和巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)，其中CQ还具有改变肿瘤微环境的能力，促进肿瘤血管正常化，提高化疗药物的蓄积进而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，已被批准为临床使用药物，具有更好的安全性和应用潜能。

基于现有技术的基础以及针对PTT消融不彻底、容易复发的现状，本申请的发明人拟提供新的治疗肿瘤的增效药物，尤其是四氧化三铁纳米粒和自噬抑制剂组成的治疗乳腺癌的增效组合药物。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的基础以及针对PTT消融不彻底、容易复发的现状，提供新的治疗肿瘤的增效药物，尤其是四氧化三铁纳米粒和细胞自噬抑制剂组成的治疗乳腺癌的增效组合药物。

本发明的治疗乳腺癌的增效组合药物，由四氧化三铁纳米粒和一种或多种细胞自噬抑制剂和组成；其中，通过四氧化三铁纳米粒IONPs的光热效应和自噬抑制剂联合用于乳腺癌的治疗，在IONPs发挥光热细胞毒作用杀伤肿瘤细胞的同时，利用IONPs的光热效应诱导肿瘤细胞自噬通路上调，其中，安全剂量的细胞自噬抑制剂使肿瘤细胞维持在超高度活化的自噬水平，从而诱导自噬性细胞死亡；本发明的组合药物能发挥协同抗肿瘤疗效，通过自噬性细胞死亡杀伤在一定程度上解决PTT无法完全消融细胞的问题。

本发明中，IONPs具有良好的安全性，在近红外区具有优良的光热转化能力，在808nm激光照射下具有将光能转化为热能的作用。

本发明中，细胞自噬抑制剂包括自噬前段抑制剂和自噬末端抑制剂。

本发明中，所述的细胞自噬抑制剂选自氯喹(Chloroquine，CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)、巴佛洛霉素A1。

本发明中，所述的组合药物中的药物联用可用于干预的肿瘤不限于乳腺癌，还可以应用于黑色素瘤、头颈部肿瘤等浅表肿瘤。

本发明进行了体外评价实验，用Western blot、共聚焦显微镜和透射电子显微镜评价IONPs光热效应对肿瘤细胞自噬水平的影响，结果显示，IONPs材料未对肿瘤细胞自噬水平产生影响，而激光照射后，IONPs的热效应诱导肿瘤细胞自噬水平的上调；随后对IONPs光热效应联用自噬抑制剂的体外药效学进行评价，MTT法测细胞活性，结果显示，自噬抑制剂的联用能有效增强IONPs的光热细胞毒作用，且这种协同作用未在自噬相关基因ATG-5沉默后显现，从侧面印证了所述的组合药物中的药物联用作用与自噬通路的紊乱有关。

本发明通过构建MCF-7皮下瘤为模型，评价了IONPs光热效应联用自噬抑制剂的体内抗肿瘤疗效，体内药效学评价显示，相比于单纯的IONPs的光热治疗，联用自噬抑制剂CQ后可以显著提高抑瘤疗效，进一步验证了IONPs光热效应联用自噬抑制剂的协同抗肿瘤疗效。

本发明提供了四氧化三铁纳米粒和自噬抑制剂组成的治疗乳腺癌的增效组合药物，其中，通过四氧化三铁纳米粒IONPs的光热效应联合细胞自噬抑制剂用于乳腺癌的治疗，在IONPs发挥光热细胞毒作用杀伤肿瘤细胞的同时，利用IONPs的光热效应诱导肿瘤细胞自噬通路上调，其中，安全剂量的细胞自噬抑制剂使肿瘤细胞维持在超高度活化的自噬水平，从而诱导自噬性细胞死亡；本发明的组合药物能发挥协同抗肿瘤疗效，通过自噬性细胞死亡杀伤在一定程度上解决PTT无法完全消融细胞的问题。

本发明优点还有，能降低光热治疗的激光照射剂量和照射时间，减少对正常组织的潜在损害，同时能解决光热治疗不彻底产生的肿瘤复发问题。本发明在综合治疗转移性乳腺癌具有潜在的应用价值。

附图说明

图1.Western blot评价IONPs对自噬相关蛋白的影响，其中，

(A)IONPs长时间孵育对MCF-7自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达量的影响及(B)定量结果；

(C)IONPs光热效应对MCF-7自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达量的影响及(D)定量结果；

(E)IONPs光热效应联用自噬抑制剂对MCF-7自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达量的影响及(F)定量结果。

图2.GFP-LC3荧光蛋白聚集情况的共聚焦显微镜图。

图3.自噬小体累计情况的TEM图，其中，

(A)未用激光处理的IONPs组(B)激光处理后的IONPs组。

图4.IONPs光热效应联用自噬抑制剂的体外药效评价，其中，

(A)IONPs光热效应联用自噬抑制剂的细胞毒结果；(B)IONPs光热效应联用自噬抑制剂对MCF-7细胞凋亡影响的流式结果。

图5.自噬相关基因ATG-5沉默后对IONPs光热效应联用自噬抑制剂的光热细胞毒作用的影响评价，其中，

(A)Western blot对siRNA沉默ATG-5的表征结果，(B)ATG-5沉默后对IONPs联用自噬抑制剂的细胞毒作用。

图6.IONPs光热效应联用自噬抑制剂的体内药效学评价，其中，

(A)治疗期间各组肿瘤的生长大小变化趋势，(B)治疗期间各组肿瘤的离体照片，(C)治疗期间各组肿瘤的平均重量结果，(D)治疗期间各组荷瘤裸鼠的体中变化情况。

具体实施方式

实施例1 IONPs光热效应对肿瘤细胞自噬水平的调节

Western blot：将对数生长期的MCF-7细胞以30×104的细胞密度接种于六孔板中，常规培养24h后，吸弃培养基，按以下各组进行不同处理：(1)长时间IONPs孵育组：分别加入含有20μM CQ、50μg Fe/ml IONPs的完全培养基共同孵育48h后，用细胞刮刀将培养皿中的细胞连同培养液一同转入离心管中，4℃下1500rpm离心5min收集细胞，并用回温的PBS洗涤两次；(2)激光照射组：加入含有50μg Fe/ml IONPs的完全培养基共同孵育2h后，使用808nm激光以3W/cm2的功率分别照射3min、5min、7min，继续常规培养24h，同上法收集细胞；(3)IONPs光热效应联用自噬抑制剂联用组：自噬抑制剂组分别加入含有20μM CQ、10mM 3-MA、20nM Bafilomycin A1的完全培养基共同孵育24h；激光照射联用自噬抑制剂组细胞样品中加入含有50μg Fe/ml IONPs和20nM Bafilomycin A1的完全培养基共同孵育2h后，使用808nm激光以3W/cm2的功率照射4min。继续常规培养24h，同上法收集细胞；

共聚焦显微镜：将MCF-7/GFP-LC3细胞以10×104的细胞密度接种于共聚焦皿中，培养24h后，弃去培养基，分别加入含有20μM CQ、50μg Fe/ml IONPs的完全培养基，其中激光照射组在加入纳米粒2h后，使用808nm激光以3W/cm2的功率分别照射3min、5min；随后继续培养24h，用共聚焦显微镜观察绿色荧光分布情况；

透射电子显微镜：将MCF-7细胞接种于细胞培养皿中，常规培养24h后，吸弃上层培养基，加入含有50μg Fe/ml IONPs的完全培养基，继续常规培养24h或808nm激光以3W/cm2的功率照射、5min后继续培养24h后，吸弃上层培养基，用回温的PBS洗涤细胞两次，用2.5％戊二醛固定后制样，用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)观察细胞内自噬小体的累积情况；

结果如图1(A)和图1(B)所示，MCF-7细胞与自噬抑制剂CQ共同孵育48h后，LC3-Ⅱ表达量显著增高，表明细胞内自噬小体大量累积，验证了方法的可靠性；而与IONPs共同孵育48h后，LC3-Ⅱ的表达量并未有明显变化，表明实验浓度下(50μg Fe/ml)的IONPs与细胞长时间孵育不对肿瘤细胞自噬水平产生明显影响；激光照射组的Western blot结果如图1(C)和图1(D)所示，光照组细胞的LC3-Ⅱ表达量均有显著性增多，且随着光照时间的延长，LC-Ⅱ表达量略微增加，表明IONPs的光热效应可以在一定程度上诱导MCF-7细胞自噬水平的上调；PTT联用自噬抑制剂的Western blot结果如图1(E)和图1(F)所示，IONPs光热效应联用Bafilomycin A1自噬抑制剂组的LC3-Ⅱ表达量相比于Bafilomycin A1孵育组、激光处理组均有升高，表明在IONPs诱导自噬水平上调后，加之Bafilomycin A1的末端阻断作用，细胞内自噬小体数量进一步增加；

经单纯高剂量光照或单纯IONPs处理后(如图2所示)，细胞中的绿色荧光分布情况与Ctrl组结果类似，呈弥散状，表明细胞中未出现明显的自噬小体聚集，即单纯激光处理或单纯的IONPs处理未对细胞自噬水平产生明显调节作用；当IONPs在激光下发挥光热作用时，观察到细胞内出现了点簇状绿色斑点，且随着激光作用时间的延长，绿色斑点数量随之增多，表明IONPs的光热作用能够诱导细胞中自噬小体的累积，诱导自噬通路上调；

MCF-7细胞与IONPs共孵育后(如图3(A)所示)，箭头所示区域为大部分IONPs聚集在溶酶体中，而并未观察到细胞内出现双层膜的自噬小体；经激光处理后(如图3(B)所示)，IONPs仍大部分聚集在溶酶体中，且细胞内出现大量自噬小体(红色圆圈部分)和自噬小体与溶酶体融合后形成的自噬溶酶体(黄色圆圈部分)，表明与实验浓度下的IONPs共孵育后，MCF-7细胞自噬水平并未出现明显上调，而IONPs的光热效应则能在一定程度上诱导MCF-7细胞自噬水平上调。

实施例2

本药物组合物IONPs光热效应联用自噬抑制剂对肿瘤细胞的细胞毒作用

IONPs光热效应联用自噬抑制剂的细胞毒实验：将对数生长期的MCF-7细胞以2×104的细胞密度接种于96孔板中，常规培养24h后，弃去上层培养基，分别加入含有50μg Fe/ml IONPs及20μM CQ、2mM 3-MA的完全培养液共同孵育2h后，使用808nm激光以3W/cm2的功率分别照射4min，继续常规培养24h后，采用MTT法测定IONPs光热效应联用不同自噬抑制剂的细胞毒作用，其中MTT法步骤包括：吸弃上层培养基，加入150μL含有0.5mg/ml MTT试剂的无血清DMEM培养基，37℃避光孵育4h后弃去上清，每孔加入150μL DMSO，100rpm避光振荡15min以溶解结晶，随后用酶标仪于570nm处测定吸光度值(A570)，并计算细胞存活率；

细胞凋亡实验：将对数生长期的MCF-7细胞以适当密度接种于6孔板中，培养24h后，用回温的PBS轻柔洗涤细胞2次，分别加入含有IONPs的完全培液(50μg Fe/mL)、含有20μM CQ和IONPs的完全培液，共同孵育2h后，激光照射4min(808nm，3W/cm2)；37℃继续培养24h后，收集培液，PBS洗涤细胞2遍，收集洗液后，刮取细胞，并将其与上述收集的培液合并，离心收集细胞，同时设置细胞对照组，IONPs对照组及同剂量激光对照组，按上述方法进行相同操作，收集细胞后，参照Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒进行细胞染色，流式细胞计数仪检测；

siRNA转染实验：取1.5μL 20μM siRNA储液，加至预先加入500μL

的六孔板中，混匀后，每孔加入5μL Lipofectamine RNAiMAX转染介质，晃动六孔板使之混匀，室温下共孵育10-20min，用无抗体的完全培养基稀释MCF-7细胞，以30×104的细胞密度接种至六孔板，孵育24h后，弃上层培养基，加入无抗体培养基继续培养24h后，用细胞刮刀将培养皿中的细胞连同培养液一同转入离心管中，4℃下1500rpm离心5min收集细胞，并用回温的PBS洗涤两次；细胞样品经过细胞裂解、Bradford法蛋白定量后，按照Western Blot标准操作方法，对自噬相关蛋白浓度进行测定，其中一抗稀释2000倍，二抗稀释5000倍；

自噬相关基因ATG-5沉默后的细胞毒实验：取1.5μL 20μM siRNA-1储液，按上述方法进行siRNA转染。孵育24h后，弃去上层培养基，分别加入含有20μM CQ、50μg Fe/ml IONPs的无抗体培养基，其中光照组在加入IONPs 2h后，使用808nm激光以3W/cm2的功率照射4min，继续培养24h后，采用MTT法测定不同处理后的细胞活性；

结果显示：光热效应联用不同自噬抑制剂MTT细胞毒实验结果如图4(A)所示，CQ、3-MA与IONPs光热效应联用处理细胞后，显著增强对细胞的杀伤作用，表明无论是自噬通路上游抑制剂还是下游抑制剂，与光热效应联用后均能发挥协同抗肿瘤作用；

流式结果如图4(B)所示，经光热处理后，IONPs光热效应组处于凋亡晚期(Q2)的细胞百分比显著增多，表明IONPs在该条件下所产生的光热细胞毒性与细胞凋亡通路相关；进一步加入CQ抑制细胞自噬后，增强了IONPs光热效应对MCF-7细胞凋亡的诱导作用；

基因沉默的Western Blot结果如图5(A)所示，siRNA-1能有效且高效沉默自噬相关基因ATG-5的表达；MTT细胞毒实验结果(如图5(B)所示)表明，PTT联用自噬抑制剂CQ组相较于激光照射组，细胞活性显著性降低，表明自噬抑制剂CQ与IONPs的光热效应联用后，能有效增强其细胞毒性；ATG-5沉默后的MCF-7细胞经激光照射处理后，相较于正常MCF-7细胞激光处理组，细胞活性显著降低，表明IONPs光热效应诱导上调的自噬对细胞具有保护作用。

实施例3体内抗肿瘤实验

取15只荷MCF-7皮下瘤裸鼠，待肿瘤体积达100mm3左右，随机将裸鼠分为三组，IONP/CQ组腹腔注射10mg/Kg CQ，2h后使用5％水合氯醛生理盐水溶液麻醉裸鼠，瘤内注射25μL IONPs(20μg Fe)；IONP组给予同样剂量IONPs；Ctrl组不做处理，使用808nm激光照射器，以2W/cm2的光照功率对三组裸鼠的肿瘤部位进行连续照射4min。继续在SPF级清洁度的环境下饲养，以光照处理当天记为第0天，每两天对IONP/CQ组腹腔注射10mg/Kg CQ，每两天用数字游标卡尺测量肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线，第10天时处死各组裸鼠，并剥离肿瘤，拍照并称取肿瘤重量，从第0天开始，每两天记录每只裸鼠体重，并绘制体重曲线；

结果显示(如图6(A)所示)，自第0天起Ctrl组裸鼠肿瘤生长未受到明显抑制，表明单纯的激光未起到抗肿瘤作用，IONP组和IONP/CQ组的肿瘤体积生长较Ctrl组受到了明显抑制作用，且从第4天开始，IONP/CQ组的肿瘤体积与IONP组相比明显减小，有统计学差异，且从第4天开始，IONP组裸鼠的肿瘤体积明显增大，出现反跳现象，而IONP/CQ组并未出现反跳迹象，表明自噬抑制剂的联用可以延后肿瘤复发；如图6(B)和图6(C)所示，IONP组与IONP/CQ组的肿瘤明显小于Ctrl组，且IONP/CQ组与IONP组肿瘤体积明显较小；各组裸鼠肿瘤重量与肿瘤体积生长曲线结果一致；

本发明的体内抗肿瘤实验结果表明，IONPs光热治疗具有抗肿瘤疗效，且自噬抑制剂CQ与IONPs光热效应联合干预能明显增强对肿瘤细胞的杀伤作用，产生协同抗肿瘤作用；如图6(D)所示三组裸鼠体重曲线，表明各组裸鼠体重在干预过程中均稳步上升，未出现明显下降趋势，表明IONPs与CQ联用及整体干预方案的安全性，对动物的正常生长无明显副作用。

Claims (7)

1.一种治疗乳腺癌的增效组合药物，其特征在于，由四氧化三铁纳米粒IONPs和一种或多种细胞自噬抑制剂和组成。

2.根据权利要求1所述的治疗乳腺癌的增效组合药物，其特征在于，所述的四氧化三铁纳米粒IONPs在808nm的近红外光照射下发挥光热转化能力。

3.根据权利要求1所述的治疗乳腺癌的增效组合药物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂包括细胞自噬前段抑制剂和细胞自噬末端抑制剂。

4.根据权利要求1所述的治疗乳腺癌的增效组合药物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自氯喹(Chloroquine，CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)或巴佛洛霉素A1。

5.按权利要求1所述的治疗乳腺癌的增效组合药物，其特征在于，所述的组合药物采用联合给药的方式使用。

6.根据权利要求2所述的治疗乳腺癌的增效组合药物，其特征在于，所述的四氧化三铁纳米粒IONPs的光热转化能力发挥对肿瘤细胞的热杀伤作用。

7.根据权利要求2所述的治疗乳腺癌的增效组合药物，其特征在于，所述的四氧化三铁纳米粒IONPs的光热转化能力促进肿瘤细胞自噬水平上调。

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